专利名称：海膜愈伤组织育苗方法
技术领域：
本发明涉及一种大型海藻海膜的育苗技术，具体地说是利用愈伤组织进行海膜幼苗培育的方法。
背景技术：
海膜是一种可食用海藻，并可作为提取藻胶的原料。目前藻体的获得主要是采集自然资源，人工养殖还未进行。主要是因为海膜的孢子产量比较低，人工培养的孢子苗量少，不能形成养殖规模。对它的苗种培育可采用与高等植物组织类似的组织培养技术。大型海藻的组织培养虽然起始于五十年代，但由于海藻具有许多不同于高等植物的特性，使得组织培养研究进展相对缓慢。与高等植物相比，海藻组织培养的相对困难在于1.获得无菌材料困难海藻的表面寄生物多，且生长牢固，必须采用剧烈的刷洗，而海藻的外表细胞无角质层类的保护层，很容易受损伤；同时由于寄生的微生物种类多，数量大，所用的消毒剂和抗生素的量需加大，极易造成外植体畸形或死亡；2.海藻的基础研究落后，缺乏控制起生长和分化的知识。由于愈伤组织继代培养的条件控制存在一定的技术难度，虽然通过诱导可以获得愈伤组织，但在尝试将这种愈伤组织与外植体分离后，愈伤组织一般不能继续生长。国内外的研究工作主要集中于大型海藻的切段(块)、细胞和原生质体培养及愈伤组织的生理生化特性分析方面。
发明内容
为了克服上述不足，本发明提供的是一种诱导海膜产生愈伤组织，对愈伤组织进行分离培养和快速扩增，利用培养的愈伤组织进行育苗的方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是一种海膜愈伤组织育苗方法，首先诱导海膜藻体产生愈伤组织；然后分离这种愈伤组织，将其置于适宜条件下使其不断扩增，快速繁殖，产生大量的愈伤组织，在实验室保存并继代培养这种愈伤组织作为苗种；最后进行育苗，育苗时将愈伤组织捣碎后喷附在附着基上，控制条件，使其发育成完整的幼苗，从而达到育苗的目的。具体如下首先诱导海膜藻体产生愈伤组织，通过物理伤害诱导愈伤组织的产生，采集海膜藻体，进行物理伤害，将其置于PES培养液内，温度为15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光强为20～80μmol photons(光子)·m-2s-1，培养时间为2～3周，长出愈伤组织；然后分离这种愈伤组织，在室内保存并继代培养这种愈伤组织作为苗种，将其置于PES培养液内，温度为15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光强为20～80μmol光子·m-2s-1，对这种愈伤组织进行悬浮培养，待愈伤组织生长到2～10毫米时，将其捣碎并置于PES培养液内，温度为15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光强为20～80μmol光子·m-2s-1，每1～2周更换一次培养液，使其不断扩增，快速繁殖，产生大量的愈伤组织；最后进行育苗，育苗时将愈伤组织捣碎后喷附在附着基上，温度为15-28℃，光周期L∶D＝12∶12，光强为100～300μmol光子·m-2s-1，使其发育成完整的幼苗。
本发明在育苗过程中，先静置培养5～14天后，丝状体即可附着于附着基上，然后开始流水培养25～45天后即可见到肉眼可见的小苗；附着基采用竹片或玻璃片；育苗时将大量培养的愈伤组织置于组织捣碎机中，用10000-12000转/分捣碎30～50秒，至愈伤组织成为短的数个细胞的丝状体，所述丝状体长度为50～200μm。
本发明通过物理伤害诱导愈伤组织的产生，不需要添加激素。在有菌和液体环境中进行愈伤组织的诱导，不需要无菌和固体培养。
本发明通过调控光照、温度等环境条件使愈伤组织能够快速增长，不需要添加激素和有机物质。在有菌的条件下进行，不需要无菌培养条件。
本发明通过将愈伤组织捣碎、静置使之附着于附着基上，在合适条件下即可再生出幼苗，不需要添加激素或其它物质，不需要无菌操作。
本发明的原理在于本发明通过在特定条件下对海膜进行诱导，使之产生丝状的愈伤组织；分离这种愈伤组织，根据实验掌握了光照、温度、营养盐等条件对这种愈伤组织的影响，从而实现了愈伤组织的继代培养和保存；对这种愈伤组织进行悬浮培养，使之快速扩增，产生大量愈伤组织。将悬浮培养的愈伤组织喷洒在附着基上，静水培养使其附着后改为流水培养，并改变培养条件诱导其再生成苗。这种方法可以作为一种有效可行的海膜的育苗方法。应用本发明，可以不受海膜成熟时间限制随时为生产提供种苗，并且由于愈伤组织再生苗不经过有性生殖，因此不会产生性状分离，有利于良种品质的选育。本发明技术含量高，稳定可靠，易于应用。
本发明具有如下优点1、本发明愈伤组织诱导和培养的方法简易，操作方便。
2、本发明不需要采集孢子，并可以在实验室内保存种质，不依赖自然资源。
3、本发明育苗方式与孢子采苗方式相比不受海藻成熟时间限制，可随时为生产提供苗种。
4、本发明育苗方式不经过有性生殖，不会产生性状分离，有利于良种的选育。
具体实施例方式
实施例1采集海膜叶状体。经无菌海水冲洗5遍后，用刀片切成3毫米大小的小块，置于盛有20毫升PES培养液(Provasoli′s enriched seawater)的培养皿内，在20℃，光周期12∶12h＝L∶D，光强50μmol photons(光子)·m-2s-1下培养。两周到三周后，切块边缘长出丝状的愈伤组织。在显微镜下用刀片切割这种愈伤组织，置于150毫升三角瓶中对这种愈伤组织进行悬浮培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。待愈伤组织生长到直径5毫米大小后，将其捣碎，每两周更换一次培养液，在室内保存，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。大量培养时，将保存的愈伤组织接种至10升培养瓶中，用空气压缩泵进行充空气培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。育苗时将大量培养的愈伤组织置于组织捣碎机中，用10000转/分捣碎30秒，至愈伤组织成为短(100μm左右)的数个细胞的丝状体后，喷于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附着基的育苗池中，于20℃，光周期12∶12h＝L∶D，200μmol photons·m-2s-1光强下静置培养。7天左右后丝状体即可附着于附着基上，然后开始流水培养。一个月后即可见到肉眼可见的小苗。
实施例2采集海膜叶状体。经无菌海水冲洗5遍后，用刀片切成3毫米大小的小块，置于盛有20毫升PES培养液(Provasoli′s enriched seawater)的培养皿内，在25℃，光周期12∶12h＝L∶D，光强20μmol photons·m-2s-1下培养。两周到三周后，切块边缘长出丝状的愈伤组织。在显微镜下用刀片切割这种愈伤组织，置于150毫升三角瓶中对这种愈伤组织进行悬浮培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。待愈伤组织生长到直径2毫米大小后，将其捣碎，每周更换一次培养液，在室内保存，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。大量培养时，将保存的愈伤组织接种至10升培养瓶中，用空气压缩泵进行充空气培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。育苗时将大量培养的愈伤组织置于组织捣碎机中，用11000转/分捣碎20秒，至愈伤组织成为短(200μm左右)的数个细胞的丝状体后，喷于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附着基的育苗池中，于25℃，光周期12∶12h＝L∶D，100μmol photons·m-2s-1光强下静置培养。14天左右后丝状体即可附着于附着基上，然后开始流水培养。45天后即可见到肉眼可见的小苗。
实施例3采集海膜叶状体。经无菌海水冲洗5遍后，用刀片切成3毫米大小的小块，置于盛有20毫升PES培养液(Provasoli′s enriched seawater)的培养皿内，在15℃，光周期12∶12h＝L∶D，光强80μmol photons·m-2s-1下培养。两周到三周后，切块边缘长出丝状的愈伤组织。在显微镜下用刀片切割这种愈伤组织，置于150毫升三角瓶中对这种愈伤组织进行悬浮培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。待愈伤组织生长到直径10毫米大小后，将其捣碎，每周更换一次培养液，在室内保存，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。大量培养时，将保存的愈伤组织接种至10升培养瓶中，用空气压缩泵进行充空气培养，培养的温度、培养液、光强和光周期同上述诱导愈伤组织相同。育苗时将大量培养的愈伤组织置于组织捣碎机中，用12000转/分捣碎50秒，至愈伤组织成为短(50μm左右)的数个细胞的丝状体后，喷于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附着基的育苗池中，于15℃，光周期12∶12h＝L∶D，300μmol photons·m-2s-1光强下静置培养。5天左右后丝状体即可附着于附着基上，然后开始流水培养。40天后即可见到肉眼可见的小苗。
实施例4采集海膜盘状体。经无菌海水冲洗5遍后，用刀片切成2毫米大小的小块，置于盛有20毫升PES培养液(Provasoli′s enriched seawater)的培养皿内，在20℃，光周期12∶12h＝L∶D，光强50μmol photons·m-2s-1下培养。两周到三周后，切块边缘长出丝状的愈伤组织。在显微镜下用刀片切割这种愈伤组织，置于150毫升三角瓶中对这种愈伤组织进行悬浮培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。待愈伤组织生长到直径5毫米大小后，将其捣碎，每两周更换一次培养液，在室内保存，培养的温度、培养液、光强和光周期同上述诱导愈伤组织相同。大量培养时，将保存的愈伤组织接种至10升培养瓶中，用空气压缩泵进行充空气培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。育苗时将大量培养的愈伤组织置于组织捣碎机中，用10000转/分捣碎30秒，至愈伤组织成为短(100μm左右)的数个细胞的丝状体后，喷于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附着基的育苗池中，于20℃，光周期12∶12h＝L∶D，200μmol photons·m-2s-1光强下静置培养。7天左右后丝状体即可附着于附着基上，然后开始流水培养。一个月后即可见到肉眼可见的小苗。
实施例5采集海膜盘状体。经无菌海水冲洗5遍后，用刀片切成1毫米大小的小块，置于盛有20毫升PES培养液(Provasoli′s enriched seawater)的培养皿内，在25℃，光周期12∶12h＝L∶D，光强20μmol photons·m-2s-1下培养。两周到三周后，切块边缘长出丝状的愈伤组织。在显微镜下用刀片切割这种愈伤组织，置于150毫升三角瓶中对这种愈伤组织进行悬浮培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。待愈伤组织生长到直径2毫米大小后，将其捣碎，每周更换一次培养液，在室内保存，培养的温度、培养液、光强和光周期同上述诱导愈伤组织相同。大量培养时，将保存的愈伤组织接种至10升培养瓶中，用空气压缩泵进行充空气培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。育苗时将大量培养的愈伤组织置于组织捣碎机中，用12000转/分捣碎20秒，至愈伤组织成为短(200μm左右)的数个细胞的丝状体后，喷于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附着基的育苗池中，于25℃，光周期12∶12h＝L∶D，100μmol photons·m-2s-1光强下静置培养。14天左右后丝状体即可附着于附着基上，然后开始流水培养。45天后即可见到肉眼可见的小苗。
实施例6采集海膜盘状体。经无菌海水冲洗5遍后，用刀片切成1毫米大小的小块，置于盛有20毫升PES培养液(Provasoli′s enriched seawater)的培养皿内，在15℃，光周期12∶12h＝L∶D，光强80μmol photons·m-2S-1下培养。两周到三周后，切块边缘长出丝状的愈伤组织。在显微镜下用刀片切割这种愈伤组织，置于150毫升三角瓶中对这种愈伤组织进行悬浮培养，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。待愈伤组织生长到直径10毫米大小后，将其捣碎，每周更换一次培养液，在室内保存，培养的温度、培养液、光强和光周期与上述诱导愈伤组织的条件相同。大量培养时，将保存的愈伤组织接种至10升培养瓶中，用空气压缩泵进行充空气培养，培养的温度、培养液、光强和光周期同上述诱导愈伤组织相同。育苗时将大量培养的愈伤组织置于组织捣碎机中，用10000转/分捣碎50秒，至愈伤组织成为短(50μm左右)的数个细胞的丝状体后，喷于底部放有竹片、玻璃片等表面光滑的附着基的育苗池中，于28℃，光周期12∶12h＝L∶D，300umol photons·m-2s-1光强下静置培养。5天左右后丝状体即可附着于附着基上，然后开始流水培养。40天后即可见到肉眼可见的小苗。
权利要求
1.一种利用愈伤组织进行海膜幼苗培育的方法，其特征在于首先诱导海膜藻体产生愈伤组织，通过物理伤害诱导愈伤组织的产生，采集海膜藻体，进行物理伤害，将其置于PES培养液内，温度为15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光强为20～80μmol光子·m-2s-1，培养时间为2～3周，长出愈伤组织；然后分离这种愈伤组织，在室内保存并继代培养这种愈伤组织作为苗种，将其置于PES培养液内，温度为15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光强为20～80μmol光子·m-2s-1，对这种愈伤组织进行悬浮培养，待愈伤组织生长到2～10毫米时，将其捣碎并置于PES培养液内，温度为15～25℃，光周期L∶D＝12∶12，光强为20～80 μmol光子·m-2s-1，每1～2周更换一次培养液，使其不断扩增，快速繁殖，产生大量的愈伤组织；最后进行育苗，育苗时将愈伤组织捣碎后喷附在附着基上，温度为15-28℃，光周期L∶D＝12∶12，光强为100～300μmol光子·m-2s-1，使其发育成完整的幼苗。
2.按照权利要求1所述利用愈伤组织进行海膜幼苗培育的方法，其特征在于在育苗过程中，先静置培养5～14天后，丝状体即可附着于附着基上，然后开始流水培养25～45天后即可见到肉眼可见的小苗。
3.按照权利要求1或2所述利用愈伤组织进行海膜幼苗培育的方法，其特征在于在育苗过程中，附着基采用竹片或玻璃片。
4.按照权利要求1所述利用愈伤组织进行海膜幼苗培育的方法，其特征在于育苗时将大量培养的愈伤组织置于组织捣碎机中，用10000-12000转/分捣碎30～50秒，至愈伤组织成为短的数个细胞的丝状体。
5.按照权利要求4所述利用愈伤组织进行海膜幼苗培育的方法，其特征在于所述丝状体长度为50～200μm。
全文摘要
一种利用愈伤组织进行海膜幼苗培育的方法，通过在特定条件下对海膜进行诱导，使之产生丝状的愈伤组织。分离这种愈伤组织，根据实验掌握了光照、温度、营养盐等条件对这种愈伤组织的影响，从而实现了愈伤组织的继代培养和保存。对这种愈伤组织进行悬浮培养，使之快速扩增，产生大量愈伤组织。将悬浮培养的愈伤组织喷洒在附着基上，静水培养使其附着后改为流水培养，并改变培养条件诱导其再生成苗。这种方法可以作为一种有效可行的海膜的育苗方法。应用本发明，可以不受海膜成熟时间限制随时为生产提供种苗，并且由于愈伤组织再生苗不经过有性生殖，因此不会产生性状分离，有利于良种品质的选育。本发明技术含量高，稳定可靠，易于应用。
文档编号A01G33/00GK1739338SQ20041005031
公开日2006年3月1日 申请日期2004年8月25日 优先权日2004年8月25日
发明者胡晓燕, 殷明焱, 夏娃 申请人:中国科学院海洋研究所