专利名称：离体培养金丝桃再生植株的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养工厂化快速育苗及分子育种技术领域，更具体涉及一种离体 培养金丝桃再生植株的方法。
背景技术：
金丝桃为金丝桃属(i/y; en'cwm L.),藤黄科(aMs/ace说)植物，其花色丰富多彩，浆果 绚丽多姿。
近年来在国内外花卉市场上切枝观果切花金丝桃在新型切花中非常流行，主要用于插花 中的配材。市场上观果类金丝桃主要为H /H'rc7'mww;丑/ram;fewww，仏om/rarae附ww和//. /"o必raw等种间或种内的杂交后代，如'魅力红，系列(//;ye/"/cww'Magical Red，)；天姿 粉系列(H'Pinky Flair')、夭姿甜心系列(ZTSugar Flair')等。目前在栽培过程中，特别是 许多在非洲、南美洲等热带地区种植的品种，由于土壤中根结线虫的危害，严重破坏了植株 的根系，使金丝桃的产量和观果价值大大降低，严重影响观果金丝桃的切花应用价值。传统 的杀虫剂不仅价格昂贵，无法有效防治线虫，且使用时破坏生态环境，无法满足日益重视的 环保要求。另一方面，由于金丝桃是多年生植物，通过移植或轮作等栽培学方法也不能从根 本上解决病虫害问题，而温室无土栽培对能源损耗提出较高要求。因此，目前对线虫的控制 仍缺乏安全和有效的解决方法。
利用生物技术进行品种改良，获得具强抗病抗虫和高观赏价值的品种是目前金丝桃育种 的主要目标。金丝桃再生体系的建立对提高育种效率及遗传转化和创新种质资源创新奠定了 基础。
国内外对金丝桃属植物再生体系的研究较少。国内主要集中在药用植物贯叶连翘(/6^er/a^ pw/oraft/m)的快繁及愈伤诱导方面，而国外也以贯叶连翘的研究居多。CelWrov6 (1992)等 人将切割后的胚用浓度为2.22Kitn或4.40nm BA处理形成的愈伤能高效的生芽；Sonja Gadzovska (2005)利用贯叶金丝桃种子萌发形成的试管苗获得茎尖外植体再诱导生成大量不 定芽。Eliane Romanato Santar6m和Leandro Vieira Astarita (2003)等人利用贯叶金丝桃的茎 段器官发生诱导丛生芽。Murch(2000)等对贯叶金丝桃(if.perforatum 'Anthos')用下胚轴 作为外植体诱导芽的再生。但均无无采用叶片作为外植体进行再生的报道。
迄今为止，对观赏类的切枝观果切花金丝桃的再生尚未有人研究报道。本发明首次以观 赏类的切枝观果切花金丝桃的叶片为外植体，建立直接再生体系，为遗传转化奠定基础，为金丝桃定向育种提供技术支撑。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种离体培养金丝桃再生植株的方法，该方法简单易行，操作 方便，再生频率高，可加快切枝观果切花金丝桃的分子育种材料的制备。 本发明的技术方案如下
一种离体培养金丝桃再生植株的方法，其步骤是
(1) 将金丝桃的茎段灭菌后再切割成1-2 cm的带芽茎段，接种于附加有7.5g/L琼脂和 3g/L蔗糖的MS基本培养基上进行继代培养得到金丝桃无菌苗；
(2) 切取继代培养了 40-45天的步骤(1)的金丝桃无菌苗的叶片接种于MS再生培养基 内，使其近轴面朝向所述的再生培养基上，暗培养15-25天后转入光照下培养24—26天，得 到金丝桃再生芽；
(3) 将步骤(2)的金丝桃再生芽切下接种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的MS基本培 养基中继代培养，获得完整再生植株；
其中
所述的MS再生培养基为MS基本培养基+噻重氮苯基脲0.08-0.8mg/L + a—萘乙酸 0.01-0.05mg/L+滤纸(双圈牌9cm定量滤纸，作滤纸桥用，即将该滤纸平铺在盛有培养基的 培养皿内，其上接种外植体)，调培养基的pH至5.8-6.0，在12rC高压蒸汽灭菌18-22min;
所述的培养材料均置于24-26'C、光照时间为14h/d、光照强度为2500Ix的条件下培养。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
1、 本发明的试验材料不同于前人研究用的药用和普通观花金丝桃，属于切枝观果类的金 丝桃切花品种。
2、 本发明以切枝观果类的金丝桃切花品种金丝桃叶片为外植体，材料生长周期短，方便 易得，操作简单。
3、 本发明一次直接再生培养即可得到高频再生芽，无需更换培养基和继代培养，60天后 就可在叶柄、叶脉处产生高频再生芽。
4、 由于未经脱分化的细胞直接分化芽，因此体细胞无性系变异小，能较好地保持金丝桃 的遗传稳定性，对于分子育种，也可使外源基因得到稳定遗传。
图l为离体培养金丝桃'Hyp3，品种40天后的再生情况图 'Hyp3，叶片在MS+TDZO.lmg/1+NAAO.Olmg/l培养基上先黑暗培养15d后转入光照培养
图2为离体培养金丝桃<Hyp4'品种40天后的再生情况图 'Hyp4，叶片在MS+TDZO.lmg/1+NAAO.Olmg/l培养基上先黑暗培养15d后转入光照培
养
图3为离体培养金丝桃'Hyp7'品种40天后的再生情况图 'Hyp7'叶片在MS+TDZ0.1mg/I+NAA0.01mg/l培养基上先黑暗培养15d后转入光照培
养
图4为离体培养金丝桃'Hyp3'品种60天后的再生情况图
'Hyp3，叶片在MS+TDZO.lmg/1+NAAO.Olmg/I培养基上先黑暗培养20d后转入光照培
养
图5为离体培养金丝桃'Hyp3'品种花果生长情况图
具体实施例方式
实施例1:
(1) 以市场上公开销售的的观赏类的切花(切枝观果)金丝桃，品种为'魅力红，(母pm'c卿 'Magical Red')系列三个品种金丝桃即'魅力红'3号(代码为'Hyp3，)，'魅力红'4号 ('Hyp4')和'魅力红'7号('Hyp7')。外植体金丝桃的茎段按照常规灭菌方法灭菌后接
种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的MS基本培养基(参见李明浚编译，植物组织培养，中 国农业出版社，1992，下同)中进行继代培养；
(2) 配制再生培养基MS基本培养基+噻重氮苯基脲(TDZ，浓度依次设定为0.05， 0.1， 0.5mg/L) +01—萘乙酸(NAA，浓度依次设为O.Ol， 0.05， O.lmg/L) +滤纸(双圈牌9cm定 量滤纸，每一培养皿平铺一片所述的滤纸，下同)，附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖，调pH至 5.8-6.0，在12rC高压蒸汽灭菌20min (在超净工作台中完成TDZ和滤纸的加入)，备用；
(3) 在超净工作台内，以继代培养了 4045天的步骤(1)的金丝桃无菌苗为试验材料， 切取茎段为外植体，接种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的的MS基本培养基内，使其近轴面 朝向所述的培养基，暗培养天数依次设定为15、 20、 25天后转入光照下培养，约25天开始 有再生芽的形成(见图1，图2，图3)。设计噻重氮苯基脲(TDZ，浓度依次设定为0.05， 0.1， 0.5mg/L) a—萘乙酸(NAA，浓度依次设为0.01, 0.05， O.lmg/L)、暗培养时间(设 定为15、 20、 25天)，三因素三水平的正交试验。40天统计其再生率(计算公式再生率=(再 生不定芽的叶片数/接种叶片数)X100。/。)。在MS基本培养基附加TDZO. lmg/L, NMO. 01mg/L， 7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的暗培养15天的再生培养培养基中，'Hyp3'的最高再生率为50%'
'Hyp7，的最高再生率为48. 1%。在MS基本培养基附加TDZO. 5mg/L+NAA0. Olmg/L+暗培养20天的再生培养基中，^yp4'的最高再生率为68. 75%;
(4)将步骤(3)的再生芽切下接种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的MS基本培养基中继 代培养30-40天后，获得完整再生植株。
培养条件24-26'C、光照时间为14h/d、光照强度为2500k。 在本实施例中，步骤(1)中所述获得金丝桃无菌苗(或称无性系)的步骤如下 试验材料购自湖北省武汉市花卉中心的切枝观果金丝桃'魅力红，(i/;^m'cM/w 'Magical Red')系列的三个品种，分别为'魅力红，3号(代码为'Hyp3')，'魅力红，4号('Hyp4')和 '魅力红'7号('Hyp7，)，取其幼嫩茎段，先在1%洗衣粉漂洗10 min，再在自来水中冲洗30 min， 然后在超净工作台上用浓度为75%酒精消毒30s后，用0.01g/L的升汞消毒6 min，最后用无 菌水冲洗3-5次，将金丝桃茎段切割成1-2 cm的带芽茎段接种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗 糖的MS基本培养基上进行初代培养，培养条件为24-26'C、光照时间为14h/d,光照强度为 25001x，培养7天后得到无菌苗，大约两个月建立所述的无性系。
实施例2:
(1)以金丝桃'Hyp3'品种的无菌苗(无菌苗的培养步骤见实施例l)作为试验材料， 接种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的MS基本培养基中进行继代培养；
(2) 配制再生培养基MS基本培养基，附加7.5g/L琼脂，3g/L蔗糖的，噻重氮苯基脲 (浓度依次设为0.08、 0.10、 0.30、 0.50、 0.80mg/L) ， NAA (浓度设定为0.01 mg/L) +滤
纸1片(放置方法见实施例1);调培养基的pH至5.8-6.0,在121'C高压蒸汽灭菌20min (在 超净工作台中完成TDZ和滤纸的加入)，备用。
(3) 在超净工作台中，以步骤(1)继代培养了 40-45天金丝桃无菌苗为试验材料，切取 其顶端4片幼嫩叶片为外植体(切除叶端后将其近轴面朝向培养基)接种于附加7.5g/L琼脂 和3g/L蔗糖的MS基本培养基内，暗培养15天后转入光照下培养，约25天开始有再生芽形 成(见图4)。 60天统计再生率(再生率K再生不定芽的叶片数/接种叶片数)X100。/。)。本实 施例金丝桃离体培养植株再生率依次为40.0%、 24.1%、 30.0%、 40.0%、 50.0%。
(4) 将步骤(3)的再生芽切下接种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的MS基本培养基 中继代培养30-40天后，获得完整再生植株。
培养条件同实施例l。
实施例3:
(1)以金丝桃'Hyp3，品种的无菌苗(来源见实施例1的无菌苗(系)部分)作为试验材料，接种于附加7.5g/L琼脂，3g/L蔗糖的MS基本培养基中进行继代培养。
(2) 配制再生培养基MS基本培养基，附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的，噻重氮苯基 脲(浓度依次设为0.08、 0.10、 0.30、 0.50、 0.80) mg/L +， NAA (浓度设为O.Ol) mg/L+滤 纸l片(使用方法见实施例1);调培养基的pH至5.8-6.0，在121'C下高压蒸汽灭菌20min。
(在超净工作台中完成TDZ和滤纸的加入)，备用。
(3) 在超净工作台的无菌条件下，以继代培养了 40-45天金丝桃无菌苗为试验材料，切 取顶端4片幼嫩叶片为外植体(切除叶端后将其近轴面朝向再生培养基)接种于附加7.5g/L 琼脂和3g/L蔗糖的MS再生培养基内，暗培养20天后转入光照下培养，约25天开始有再生 芽形成(见图4)。 60天统计再生率(再生率气再生不定芽的叶片数/接种叶片数)X 100%)。 在本实施例中金丝桃离体培养植株再生率依次为40.0%、 90.0%、 76.67%、 79.31%、 83.3°/0。
(4) 将步骤(3)的再生芽切下接种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的MS基本培养基中 继代培养30-40天后，获得完整再生植株。之后将获得的再生植株按照常规的移栽方法移栽 于田间，第二年5月即开花观果(图5)。
上述培养条件同实施例l。 参考文献
1. E. (5elldrov4j K. Kim能ov6， R. Brutovskd. Multiple shoot formation and phenotypic changes of Ro regenerantsin外per/cw附L. Acta Biotechnologia 12 (1992), 445~452.
2. S丄Murch, KL. Choffe. Thidiazuron-induced plant regeneration from hypocotyl cultures of St. John's wort (fi^ji e〃'cw附戸/^加謂.cv 'Anthos'). Plant Cell Report, 2000: 576-581.
3. Eliane Romanato Santar6m , Leandro Vieira Astarita. Multiple shoot formation in i^pm'cwm /7e7^njm加L. and hypericin production. Braz J. Plant Physiol, 2003, 15(1): 43-47.
4. Sonja Gadzovska^ St6phane Maury. Identification and quantification of hypericin and pseudohypericin in different /^m'cw/n pe^/brato附L in vitro cultures. Plant Physiology and Biochemistry, 2005: 591~601。
权利要求
1、一种离体培养金丝桃再生植株的方法，其步骤是1)将金丝桃的茎段灭菌后再切割成1-2cm的带芽茎段接种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的MS基本培养基上进行继代培养得到金丝桃无菌苗；2)切取继代培养了40-45天的步骤1)的金丝桃无菌苗的叶片接种于MS再生培养基内，使其近轴面朝向所述的MS再生培养基上，暗培养15-25天后转入光照下培养24-26天，得到金丝桃再生芽；3)将步骤2)得到的金丝桃再生芽切下接种于附加7.5g/L琼脂和3g/L蔗糖的MS基本培养基中继代培养，获得完整再生植株；其中所述的MS再生培养基为MS基本培养基+噻重氮苯基脲0.08-0.8mg/L+α-萘乙酸0.01-0.05mg/L+滤纸1片作滤纸桥，调培养基的pH至5.8-6.0，在121℃高压蒸汽灭菌18-22min，备用；所述的培养材料均置于24-26℃，光照时间为14h/d，光照强度为2500lx的条件下培养。
全文摘要
本发明属于植物组织培养技术领域。公开了一种离体培养金丝桃再生植株的方法。步骤是A将预先培养的金丝桃不同品种的无菌苗接种于MS基本培养基中继代培养；B配制再生培养基MS基本培养基+噻重氮苯基脲0.08-0.8mg/L+α-萘乙酸0.01-0.05mg/L+滤纸作滤纸桥；C在无菌条件下，以继代培养了40-45天金丝桃无菌苗的叶片为外植体接种于MS在再生培养基中，使其近轴面朝向所述的再生培养基，暗培养15-25天后转入光照下培养，24-26天后，获得再生芽；D将步骤C的再生芽切下接种于MS基本培养基中继代培养，获得完整再生植株。本发明简单易行，操作方便，再生频率高，可加快切花金丝桃的遗传转化和的分子育种材料的制备。
文档编号A01H4/00GK101584300SQ200910088199
公开日2009年11月25日 申请日期2009年7月13日 优先权日2009年7月13日
发明者峰 刘, 张晓慧, 桂大萍, 王彩云, 王海菲, 黄丽莉 申请人:华中农业大学