栽培番茄scf复合体亚单位cul1蛋白序列及其核酸序列的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种分子生物学【技术领域】的栽培番茄SCF复合体亚单位CUL1蛋白序列及其核酸序列；本发明涉及的栽培番茄SCF复合体亚单位CUL1蛋白序列如SEQ?ID?NO.3所示；本发明还涉及编码前述CUL1蛋白序列的核酸序列。利用本发明的CUL1蛋白基因，可以筛选出与之相关或者发生相互作用的物质、受体、抑制剂以及拮抗剂等；利用本发明可以通过基因工程手段过表达或低表达该基因，进一步研究由S-核酸酶介导的自交不亲和机制，对获得能够克服远缘杂交不亲和的野生番茄品种以及番茄品种的改良具有重要的理论支撑。
【专利说明】栽培番茄SCF复合体亚单位CUL1蛋白序列及其核酸序列
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种栽培番茄SCF复合体亚单位CULl蛋白序列及其核酸序列。
【背景技术】
[0002]番爺(Solanum Iycopersicum),属于爺科番爺属，是世界重要的蔬菜作物和经济作物之一，现被广泛栽培于世界各地。据联合国粮农组织2013年统计数据显示，2011年全球番茄种植面积4.73X IO6公顷，总产量达1.59X IO8吨，生产总值为5.82X 101°美元，在全球粮农产品中占第八位。
[0003]在番茄栽培生产中，由于叶霉病，灰霉病，以及各种虫害的发生，常给番茄产量和质量造成严重影响。野生种及其近缘野生种具有多种特质，为改良育种提供了丰富的资源，但由于多数野生种番茄的果实较少，产量低，风味差，且在保种上有一定的难度，无法直接应用于生产，因此通过远缘杂交将野生番茄的优良性状转移到栽培番茄中成为育种的主要技术。
[0004]自交不亲和性是广泛存在于开花植物的种内生殖障碍。番茄由于同时存在自交不亲和自交亲和两种生殖机制，因此成为研究自交不亲和的模式植物。严格的自交不亲和性以及相应的与普通番茄种间杂交的单侧不亲和性，成为番茄遗传研究和育种工作最大的障碍。因此对于番茄自交不亲和机制的研究越来越多。目前研究发现茄科、蔷薇科、玄参科均是由雌配子决定因子S —核酸酶和花粉决定因子SLF介导的一类自交不亲和。SLF是F-box家族的一员，参与SCF 复合体的组成，已成为研究最深而且最多的一个亚基，在拟南芥已发现的SLF基因已有700多种。
[0005]泛素介导的蛋白水解是生物体中蛋白质调控的重要环节，是生物代谢的调控中心。而SCF复合体是泛素降解系统中最大的一类E3泛素连接酶复合体，通过介导多种信号蛋白和调控蛋白的泛素化来调控细胞周期、信号转导、转录水平，是多种生物代谢的关键调控因子。SCF复合体属于RING类的泛素连接酶，广泛存在于真核生物中，是植物中最大的一类多亚基E3酶，由⑶L1、SKPU RBXUF-Box四个亚基组成。⑶LI是SCF复合体的中心，具有桥梁的作用，通过一侧的长柄状结构与SKPl结合通过SKPl接头作用与F-Box家族蛋白连接，另一侧的球状区域与RBXl形成一个二亚基催化中心，利用RBXl的RING锌指结构与E2泛素结合酶相作用，最后完成底物蛋白的识别和泛素化。目前发现真核生物中CUL蛋白存在五个同源家族。CULl蛋白是CUL家族中最早被分离出来的一类，目前已在许多物种中的被克隆分离出来，如拟南芥、矮牵牛、梨、金鱼草。⑶LI蛋白由N端415个氨基酸以及C端360个氨基酸组成，N端具有由五个螺旋组成的三个重复区域，C端由4HB (4螺旋束)组成且高度保守，从4HB开始的200个碱基被认为是CUL蛋白家族的同源区域(包含H24螺旋、部分折叠片，WH-A区域)。
[0006]目前的研究已经对于SCF复合体在自交不亲和中的的作用和功能已经有了部分证据。通过研究对比栽培番茄中的⑶LI基因组成，有助于加深对自交不亲和和单侧杂交不亲和机制的认识，进而为克服远缘杂交，改良番茄育种提供了理论基础。经现有技术文献检索，尚未发现与本发明相同或者相似的技术主题。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种栽培番茄SCF复合体亚单位CULl蛋白序列及其核酸序列。本发明公开了栽培番茄中SCF复合体E3泛素连接酶亚基CULl的编码序列；利用本发明公开的基因序列，通过转基因手段过表达或低表达该基因，可以进一步研究对于S —核酸酶介导的自交不亲和机制，同时对于番茄远缘杂交不亲和具有重要的理论支撑，进而对于番茄品种的形状改良具有重要的意义。
[0008]本发明是通过以下技术方案实现的，
[0009]第一方面，本发明涉及一种分离的栽培番茄CLN1621F E3泛素连接酶SCF复合体亚单位⑶LI蛋白序列，所述蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
[0010]第二方面，本发明还涉及一种编码前述⑶LI蛋白序列的核酸序列。
[0011]优选地，所述核酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]优选地，所述核酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]第三方面，本发明还涉及一种编码前述的CULl蛋白序列的核酸序列的用途，所述用途是利用基因工程手段或者干扰手段，调控所述核酸序列的表达，进而引起S-核酸酶介导的自交不亲和机制，获得改良的番茄品种。
[0014]本发明具有以下有益效果:利用本发明的CULl蛋白，可以筛选出与之相关或者发生相互作用的物质、受体、抑制剂以及拮抗剂等；利用本发明可以通过基因工程手段，进一步研究由S-核酸酶介导的自交不亲和机制，对于番茄品种的改良具有重要的意义。
[0015]同时，对于本领域技术人员而言，当明确本发明的核酸序列后，与SEQ ID N0.1第1-5494位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID N0.1中从核苷酸第1-5494位的核苷酸序列杂交；这些序列显然也属于本发明的保护范畴；此外，具有SEQ ID N0.2所示的cDNA序列以及SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，也应在本发明的保护范畴。
[0016]本发明根据茄科基因序列数据库，运用生物信息学手段，通过序列比对和电子拼接，设计出合适的引物，利用分子克隆的方法，克隆出栽培番茄CLN162IF中E3泛素连接酶SCF复合体亚单位⑶LI蛋白基因；在番茄中⑶LI基因有19个外显子和18个内含子组成，但在第七个外显子中含有一个终止密码子，产生了长度为252氨基酸的蛋白。
[0017]此外本发明涉及大肠杆菌DH5 a BL-21菌株，该菌已在萨姆布鲁克J，拉塞尔DW.分子克隆实验指南[Μ]。黄培棠，王嘉玺，朱厚础，等译.第三版.北京:科技出版社，2002，中公开。大肠杆菌DH5aBL-21菌株、pMD19-T Simple载体、胶回收试剂盒等均可通过商业渠道取得。
[0018]在本发明中，“分离的”、“纯化的” DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
[0019]在本发明中，术语“E3泛素连接酶SCF复合体亚单位⑶LI蛋白编码序列”指编码具有E3泛素连接酶SCF复合体亚单位⑶LI蛋白活性的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与栽培番茄E3泛素连接酶SCF复合体亚单位⑶LI相同功能蛋白的SEQ ID N0.2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
[0020]在本发明中，术语“E3泛素连接酶SCF复合体亚单位⑶LI蛋白”指能够参与E3泛素连接酶SCF复合体组成的CULl蛋白。该术语还包括具有与栽培番茄E3泛素连接酶SCF复合体亚单位CULl相同功能的、SEQ ID N0.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
[0021 ] 本发明的E3泛素连接酶SCF复合体亚单位⑶LI蛋白的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与E3泛素连接酶SCF复合体亚单位CULl蛋白相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗E3泛素连接酶SCF复合体亚单位CULl蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0022]在本发明中，“E3泛素连接酶SCF复合体亚单位⑶LI蛋白”指与SEQ ID N0.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0023]表1
[0024]
【权利要求】
1.一种分离的栽培番茄CLN1621F E3泛素连接酶SCF复合体亚单位⑶LI蛋白序列，其特征在于，所述蛋白序列如SEQ ID N0.3所示。
2.一种编码如权利要求1所述的CULl蛋白序列的核酸序列。
3.如权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID N0.2所示。
4.如权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID N0.1所示。
5.一种编码如权利要求1所述的CULl蛋白序列的核酸序列的用途，其特征在于，所述用途是利用基因工程手段或者干扰手段，调控所述核酸序列的表达，进而引起S-核酸酶介导的自交不亲和机制，获得改良的番茄品种。
【文档编号】C12N9/00GK103695378SQ201310686929
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】赵凌侠, 高美凤, 彭会珍, 陈露露, 瞿海鸥 申请人:上海交通大学