Purα蛋白在抑制淀粉样前体蛋白编码基因表达中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了Purα蛋白在抑制淀粉样前体蛋白(APP)编码基因表达中的应用，利用Purα蛋白，可以有效结合APP编码基因启动子的5‘UTR区域，并抑制Egr-1因子的正调控作用，从而降低了淀粉样前体蛋白(APP)的形成，可用于与淀粉样前体蛋白异常表达相关的疾病的防治。
【专利说明】Pura蛋白在抑制淀粉样前体蛋白编码基因表达中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体地说，本发明公开了Pura蛋白，以及编码此多肽 的多核苷酸序列对淀粉样前体表达的调控作用。
【背景技术】
[0002] 淀粉样前体蛋白（AmyloidPrecursorProtien，简称APP)是一种广泛存在于体 内的跨膜蛋白。它的异常代谢可以生成42个氨基酸组成的多肽（AmyloidPP印tide，简 称A0)，这种多肽在神经系统内的聚集可以产生Senileplaque,而这种plaque由于可引 起神经组织的兴奋性毒性的增强，激发炎症反应和炎性因子的浸润，并且可以阻断和破坏 神经元之间的联系，被认为是Alzheimer's病形成的主要原因。APP的代谢异常，如过表 达，可以产生早发性Alzheimer病的症状，所以对APP基因表达和调控方面的研究，对于治 疗Alzheimer病的发生和发展有着很重要意义。
【发明内容】
[0003] 申请人:通过长期研究发现，Pura蛋白和Egr-1蛋白（其序列表SEQIDN0 :3所 示的氨基酸序列、编码序列如序列表SEQIDN0 :4)是APP的编码基因表达过程中两个重要 的调控因子。Pura蛋白对APP的表达有明显的负调控作用，而Egr-1蛋白则表现出强烈的 正调控作用。两种因子共同作用，则Pura蛋白可以完全抑制Egr-1因子的正调控作用，也 就是说Pura蛋白的结合位点与Egr-1蛋白的结合位点在APP的编码基因启动子区域是重 合的。
[0004] 基于上述研究成果， 申请人:完成了本发明。
[0005] 首先，本发明公开了Pura蛋白在抑制淀粉样前体蛋白编码基因表达中的应用， 在该作用中，Pura蛋白结合APP编码基因启动子的5 'UTR区域9063-9077:ggCggcgg tggcggc，并抑制Egr-1因子的正调控，Pur a蛋白包括序列表SEQ ID NO :1所示的氨基酸 序列。
[0006] 由于Pura蛋白有效抑制APP的表达，因此本发明还公开了Pura蛋白作为拮抗 剂或抑制剂，在诊断或治疗与抑制淀粉样前体蛋白异常表达相关的疾病中的应用。
[0007] 如 申请人:在【背景技术】部分所提到的，上述疾病，主要为阿尔茨海默氏病，目前本领 域技术人员普遍认为该疾病与APP的过表达高度相关。
[0008] 进一步的，本发明还公开了诊断或治疗与抑制淀粉样前体蛋白异常表达相关的疾 病的药物组合物，包含上述的Pura蛋白与药学上可接受的载体。
[0009] 本发明还公开了编码Pura蛋白的多核苷酸，具有序列表SEQIDN0 :2的核苷酸 序列。
[0010] 基于上述多核苷酸，本发明还公开了一种含有外源多核苷酸的重组载体，由多核 苷酸与质粒、病毒或表达载体构建而成的重组载体。
[0011] 本领域技术人员熟知上述重组载体的构建方法，是将编码Pura蛋白的多核苷酸 序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。其中所用的载体指本 领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转 录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于17启动子 的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的PMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆 状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组 表达载体。
[0012] 为了构建上述重组表达载体，可以使用生物学领域任何已知的方法，这些方法包 括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等，通过将编码Pura蛋白的DNA序列 有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有： 大肠杆菌的lac或trp启动子；噬菌体的PL启动子，和其它一些已知的可控制基因在原核 细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。
[0013] 在上述基础上，本发明还公开了含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，选自 于下列一种宿主细胞：(a)用所述重组载体转化或转导的宿主细胞；或（b)用所述的多核苷 酸转化或转导的宿主细胞。
[0014] 利用上述的宿主细胞，选择合适的培养基进行培养，，即可分离纯化获得Pura蛋 白。
[0015] 上述的宿主细胞指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是 高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒 沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9 ;动物细胞如CH0、C0S或 Bowes黑素瘤细胞等。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1显示了在EMSA实验中，Egr_l、Pura以及同时加入Egr-1和Pura对APP表 达的影响，其中A为单独加入不同量的Egr-1和Pura的电泳结果，B为同时加入不同量的 Egr-1和Pura以及分别加入Egr-1和Pura的电泳结果，C为上述结果的量化放大图像。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1
[0018] 通过LuciferaseAssay,显示Pura蛋白和Egr-1蛋白是APP基因表达过程中两 个重要的调控因子，其中，Pura蛋白对APP的表达有明显的负调控作用，而Egr-1蛋白则 表现出强烈的正调控作用。两种因子共同作用，则Pura蛋白完全抑制Egr-1因子的正调 控作用，说明两种因子之间存在着对APP基因的调控作用存在着一定的机制。
[0019] 为了进一步弄清楚这两种因子相互作用的机制，利用电子计算机辅助分析对APP 启动子的DNA序列进行了分析，发现在APP启动子的5'UTR区域存在着符合Pura蛋白结 合特征的区域（GGN)n，而此区域在在物理位置上与Egr-1的结合位点是重合的。以APP全 长序列定位的话，Pura蛋白结合位点为9063-9077部分，即启动子序列（（为APP编码序 列的部分序列，从8201-9147,即-800/+147)，序列5显示的为该部分序列）中的ggcggcgg tggcggc部分，Egr-1 结合位点为（9063-9079):ggcggcggtggcggcgc和（9066-9082): ggcggtggcggcgcggg,与Pura位点重合。也就是说，Pura蛋白的结合位点位于启动子的 +63-+77处，这里有一个（GGN)n的区域，而Egr-1的结合位点则位于+63-+79和+66-+82 处，二者大部分是重合的。
[0020] 在上述基础上，利用PCR法对这一部位进行了缺失突变，设计PCR引物，分别对APP 启动子-170-+62和+83-+147进行扩增，得到两个APP启动子的片段，然后再得用引物将这 两个片段连接起来，就形成了+63-+S2部位缺失的片段，然后将所完成的APP启动子缺失突 变体克隆到PGL3 Basic载体中，构建成含有缺失突变的APP启动子报道质粒进行进一步的 验证。
[0021] 同时， 申请人:研究了去除Pura和Egr-1结合位点的效果，发现去除后这两种转录 因子对APP启动子的调控作用消失，EMSA(凝胶迁移或电泳迁移率实验，采用Promega公司 的试剂盒）研究结果也证实两种转录因子对APP启动子的结合存在着竞争性的作用。
[0022] 参考图1-A所示我们可以看到，加入Pura蛋白后，由于Pura蛋白与APP编码DNA 结合抑制了其表达，导致电泳迁移率显著降低；参考图1-B我们可以看到，相对于只加入 Egr-1，同时加入Pura和Egr-1，电泳迁移率明显降低，说明在APP表达中，Pura蛋白完全 抑制Egr-1因子的正调控作用。参考图1-C显示了上述结果的清晰电泳图像。
【权利要求】
1. Pur a蛋白在抑制淀粉样前体蛋白编码基因表达中的应用，所述Pur a蛋白结合APP 编码基因启动子的5 'UTR区域9063-9077 :ggcggcgg tggcggc，并抑制Egr-1因子的正调 控，所述Pur a蛋白包括序列表SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。 2. Pur a蛋白作为拮抗剂或抑制剂，在诊断或治疗与抑制淀粉样前体蛋白异常表达相 关的疾病中的应用。
3. -种诊断或治疗与抑制淀粉样前体蛋白异常表达相关的疾病的药物组合物，包含 Pur a蛋白与药学上可接受的载体。
4. 一种多核苷酸，编码Pur a蛋白，具有序列表SEQ ID NO :2的核苷酸序列。
5. -种含有外源多核苷酸的重组载体，由权利要求5所述的多核苷酸与质粒、病毒或 表达载体构建而成的重组载体。
6. -种含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，其特征在于选自于下列一种宿主细 胞：(a)用权利要求5所述的重组载体转化或转导的宿主细胞；或（b)用权利要求4所述的 多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
【文档编号】G01N33/68GK104387464SQ201410581731
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】崔建奇 申请人:宁夏医科大学