专利名称：通过过表达编码tfl-1 样蛋白的多核苷酸而具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法
技术领域：
本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及通过调节植物中编码TFLl样(Ierminal Flower H)多肽的核酸的表达来增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有经 调节的TFL1_样多肽编码核酸表达的植物，所述植物相对于相应的野生型植物或其他对照 植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了可以用于实施本发明方法的、迄今未知的 TFL1_样编码核酸和包含其的构建体。此外，本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及通过调节植物中编码R5PI(D_核 糖-5-磷酸异构酶)的核酸的表达来改善多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有经 调节的R5PI多肽编码核酸表达的植物，所述植物相对于相应的野生型植物或其他对照植 物具有改善的产量相关性状。本发明还提供了可以用于本发明方法的构建体。 此外，本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及通过增加植物中编码含锌指(aif) 结构域的A20/AN1多肽的核酸的表达来增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有 增加的编码Sif A20/AN1多肽的核酸序列的表达的植物，所述植物相对于对照植物具有增 强的产量相关性状。本发明还提供了可以用于本发明方法的核酸序列、多肽序列和构建体。此外，本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及通过增加植物中编码植物同源域 锌指(PHD-zf)多肽的核酸序列的表达来增强多种植物种子产量相关性状的方法。本发明 还涉及具有增加的编码PHD-zf多肽的核酸序列的表达的植物，所述植物相对于对照植物 具有增强的种子产量相关性状。本发明此外还涉及核酸序列、包含所述核酸序列的核酸构 建体、载体和植物。此外，本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及通过调节植物中编码REF/ALY(RNA 和输出因子结合蛋白，ENA and Export Factor-binding protein ；也称为ALY)的核酸的表 达来增强产量相关性状的方法。本发明还涉及具有经调节的编码REF/ALY多肽的核酸的表 达的植物，所述植物相对于相应的野生型植物或其他对照植物具有改善的产量相关性状。 本发明还提供了用于本发明方法的构建体。
背景技术：
不断增长的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地推动了提高农业效率研究之势。 传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望特征的植物。然而，此类选育 技术有若干缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常含有异质的遗传 组分，这些异质的遗传组分可能不总是导致期望的性状自亲本植物传递。分子生物学的进 展已经使人类能够修饰动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般 为DNA或RNA的形式)以及随后将遗传物质引入植物。此类技术有能力输送具有多种改良 的经济、农业或园艺性状的作物或植物。具有特别经济利益的性状是增加的产量。产量通常定义为作物的可测量的具有经 济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产量直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构造(例如，分枝的数量)、种子生产、叶子衰老等等。根的发育、 营养吸收、胁迫耐受性和早期活力也可以是决定产量的重要因素。因此优化上述因素可以 促进作物产量的增加。种子产量是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言 至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半 以上，或是通过对种子本身的直接消耗，或是通过对饲养自加工的种子的肉类产品的消耗。 它们也可以是工业加工中所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的枝条 和根的来源)和胚乳(萌发期和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及 许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳可以同化糖 类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以充盈籽粒。对于饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草，植物生物量为产量。在粮食作物中，许多 产量替代参数(proxy)被使用。其中主要的是估算植物大小。根据物种以及发育阶段的不 同，可以通过许多方法测量植物大小，包括植物总干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体 积、植物高度、莲座(rosette)直径、叶长、根长、根质量、分蘖数和叶数。许多物种在给定的 发育阶段在植物不同部分的大小之间维持保守的比例。利用这些比速增长关系可以从这 些尺寸测量结果中的一个外推至另一个(如Tittonell等2005 Agric Ecosys & Environ 105 :213)。早期发育阶段时的植物大小通常将与发育后期的植物大小有关。具有更大叶面 积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更 多(Fasoula & iTollenaar 2005 Maydica 50 :39)。这还不包括植物为最初实现该较大大小 所已经具有的微环境或遗传优势的潜在延续。对于植物大小和生长速率，存在着强遗传组 分(如ter Meege等2005 Plant Physiology 139 :1078)，因此对于许多不同基因型，植 物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小有关(Hittalmani等2003 Theoretical Applied Genetics 107 :679)。由此，可以使用标准环境作为田间作物在不同 地点和时间所遭遇到的多样动态环境的替代。对于许多作物而言，另一重要的性状是早期活力。提高早期活力是温带和热带稻 类栽培种的现代稻类育种项目的重要目标。长根对于水栽稻的土壤锚固至关重要。在直接 向涝地里播种稻米的情况下，以及在植物必须迅速透水出苗的情况下，较长的枝条均与活 力有关。在进行条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于优良的出苗至关重要。改造植 物早期活力的能力在农业上将具有极其重要的意义。例如，一直以来早期活力弱限制了在 欧洲大西洋地区引入基于玉米带种质的玉米(玉蜀黍，ka mays L.)杂交种。收获指数为种子产量与地上干重的比值，其在许多环境条件下相对稳定，因此在 植物大小和粮食产量之间通常能够获得比较稳固的相关性(例如Rebetzke等2002 Crop Science 42:739)。这些程序固有地联系在一起，因为大多数粮食生物量取决于植物叶和 莲当前或C存的光合作用生产力(Gardener等1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press，68_73页)。因此，对植物大小的选择，甚至是在发育早期阶段的 选择，已经用作为未来潜在产量的指标(如Tittonell等2005 Agric Ecosys & Environ 105 :213)。当测试遗传差异对胁迫耐受性的影响时，温室或植物培养室与田地相比具有固 有的优势即能够使土壤性能、温度、水和养分可利用率以及光强度标准化。不过，因不良授 粉(由缺乏风力或昆虫导致)或因空间不足以让成熟根或冠层生长等等而对产量造成的人为局限性，会限制这些受控环境在测试产量差异中的应用。因此，在培养室或温室中在标准 条件下测量早期发育阶段的植物大小，是指示潜在遗传产量优势的标准方法。再一重要的性状为提高的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是全世界作物损失的 主要原因，使大多数主要作物植物平均产量降低50%以上(Wang等，Planta (2003) 218 1-14)。非生物胁迫可以因为干旱、盐度、极端温度、化学毒性及氧化胁迫引起。提高非生物 胁迫植物耐受性的能力将对全世界农场主带来重大的经济利益，并将使人们能够在否则将 不可能进行作物栽培的地区和不利条件下进行作物栽培。因此通过优化上述因素之一可以增加作物产量。视最终用途而定，对某些产量性状的修饰可能优于对其他产量性状的修饰。例如， 对于诸如饲料或木材生产或者生物燃料源等应用，可能期望植物营养部分的增加，而对于 诸如面粉、淀粉或油料生产等应用，可能特别期望种子参数的增强。即便是在种子参数之 中，取决于应用，一些参数也可能优于其它参数。多种机制可以促成增加的种子产量，无论 是以增加的种子大小还是以增加的种子数量的形式。增强植物产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是修饰植物的内在生长 机制，如细胞周期或者参与植物生长或防御机制的多种信号传递路径。现已发现，可通过在植物中调节TFLl-样编码核酸在植物中的表达来改善植物的 产量相关性状。此外，现已发现，可通过在植物中调节R5PI (D-核糖-5-磷酸异构酶)编码核酸在 植物中的表达来改善植物的多种产量相关性状。此外，现已发现，可以通过增加编码含锌指(Sif)结构域的A20/AN1多肽的核酸序 列在植物中的表达，相对于对照植物而增强植物的多种产量相关性状。增强的产量相关性 状包括如下一种或多种增强的早期活力、增加的地上生物量、增加的每株植物的种子总产 量、增加的饱满种子数、增加的种子饱满率和增加的收获指数。此外，现已发现，可通过增加编码植物同源域锌指(PHD-zf)多肽的核酸序列在植 物中的表达，相对于对照植物而增强植物的多种种子产量相关性状。增强的种子产量相关 性状包括如下一种或多种增加的植株高度、增加的种子饱满率、增加的每圆锥花序的花数 和增加的千粒重(TKW)。此外，现已发现，可通过调节编码REF/ALY (RNA和输出因子结合蛋白；也称为ALY) 的核酸在植物中的表达，改善植物的多种生长特征。背景1. TFLl-样多肽开花植物的成功繁殖涉及从营养期至生殖期的过渡(Baurle和Dean，2006 Cell, 125,655-664.)。开花的开启涉及发育信号和环境信号的整合，从而导致花分生组织的产 生。花分生组织产生自茎分生组织，茎分生组织具有在植物中提供关键生长点的干细胞。花 从花分生组织的产生依赖于在分生组织活性与器官发生之间维持适当的平衡。在花发育过 程中，该平衡向器官发生偏移，从而造成花分生组织终止在产生遗传决定的花数量后。导致 果实和/或种子产生的繁殖的成功完成还需要雄性和雌性器官的协同发育来实现授粉和 结籽。数打基因影响植物从营养期至花期的过渡以及成功的繁殖，但只有少数基因已经被 证实在这些过程中起着至关重要的作用。PEBP(磷脂酰乙醇胺结合蛋白)基因家族的成员对开花时间的控制和花序分生组织的命运决定和植物结构起作用。PEBP基因家族是一组高度保守的蛋白质，已在广泛生物(包括细菌、酵母、线虫、 植物、果蝇和哺乳动物)的许多组织中获得鉴定。在植物中，PEBP基因家族由3个主要的 同源类型(所谓的TFLl-样、MFT-样和FT-样亚家族)组成(Chardon和Damerval，J Mol Evol. 2005,61(5) :579-90)。尽管由PEBP基因家族编码的蛋白质在氨基酸序列上高度保 守，但TFLl-样和FT-样亚家族的成员以相反的方式起作用。TFL是开花的抑制剂然而FT 是激活物(Kardailsky 等(1999) Science 286,1962-1965 ；Kobayashi, ^ (1999) Science 286,1960-1962)。虽然如上所述，但功能获得研究已经将TFLl和FT的功能差异归因于蛋 白质序列而非表达模式(Kardailsky，等，1999 ；Kobayashi 等，1999 ；Ratcliffe，等(1998) Development 125，1609-1615)。结构研究鉴定了明确区分FT和TFL功能性同源物的保守 关键残基(Ahn等2006. ΕΜΒ0, 25,605-614)。已从几种植物物种鉴定和克隆了 TFLl-样基 因(也称为TFL基因)，包括金鱼草基因的同源CENTRORADIALIS(CEN)基因和来自玉蜀黍 的几种同源物(Danilevskaya 等 2008 Plant Physiol. 2008 ；146(1) :250-64.)。在拟南芥 中，TFLl-样家族由3个基因，TFL1、ATC(拟南芥Centroradialis同源物)和BFT(FT的兄 弟)，组成。已描述了拟南芥中这些TFLl-样同种型的特定表达模式。然而，在转基因植物 中过表达时引起的相似作用显示了 TFLl和ATC之间的功能冗余性(Mimida等2001 Genes Cells. 20016(4) :327-36)。最近在葡萄基因组中鉴定到的TFLl-样同源基因聚类在与拟南 芥 BFT、TFL1 和 ATC 相关的 3 个亚进化枝中(Carmona 等 2007，Plant Mol Biol (2007)63 637-650)。葡萄中存在的所有TFLl-样同种型都在与TFLl相似的位置上具有保守的带电 荷残基His88和Aspl44以及具有特征性氨基酸三联体ENE、END和DNG (分别对于VvTFLlA、 VvTFLIB 和 VvTFLIC)。Igasaki 等 2008 (Plant Cell Physiol. 49(3) J91-300)用于分类 FT/TFL1家族成员的系统发生分析，揭示BFT进化枝和TFLl进化枝中的蛋白质彼此之间的 关系比与MFT(FT的母亲(Mother))或FT进化枝之任一的关系更近。在病毒来源启动子的控制之下稻TFL1/CEN同源物在稻植物中的组成型过表达延 长了植物的营养生长期。此外，圆锥花序形态的改变和圆锥花序发育的延迟导致了未成熟 花的产生，阻碍授粉和结籽(Nakawaga 2002, The Plant Journal，(2002)，四，743-750)。已 描述了通过操纵植物中TFLl水平来改变开花时间、增加营养生长和/或改变分枝的几种其 他手段和方法(专利申请US2006/0070141、专利US 657；3430和US6025543)。然而，这些实 验未导致种子相关性状的增强。为了将这样的技术应用于具有农艺学重要性的种子作物例 如小麦、大麦、稻、饲料草和其他单子叶植物，一方面需要防止推定的、因例如花和其他生殖 器官的延迟成熟(阻止结籽)而引起的对种子生产的负面影响，另一方面期望改善种子相 关性状例如种子的数量、种子饱满性(seed filling)和收获的种子的重量。令人惊讶地，现已发现，调节编码TFLl-样多肽的核酸的表达可以产生相对于对 照植物具有增强的产量相关性状，特别是增加的植物种子产量的植物。根据一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强产量相关性状的方法， 包括调节编码TFLl-样多肽的核酸在植物中的表达。2.核糖-5-磷酸异构酶(R5PI)核糖-5-磷酸异构酶(R5PI)是催化核糖_5_磷酸至核酮糖_5_磷酸的可逆转化 的酶。
核糖-5-磷酸异构酶广泛地存在于所有活细胞中。在植物中，核糖-5-磷酸是定 位在细胞溶胶中和定位在质体中的氧化戊糖磷酸途径的产物，而核酮糖-5-磷酸是叶绿 体中卡尔文循环的一个必需部分。与之相符地，在植物细胞的细胞溶胶中以及在叶绿体 中都存在核糖-5-磷酸异构酶的同种型。在叶绿体中，已显示该酶在五酶蛋白质复合物 (five-enzyme protein complex)中起作用。许多化合物最终来源于R5P，例如3PGA，3-磷酸甘油酸；Xyl_5P，木酮糖5-磷酸； 和Rul，^DisP,核酮糖1，5- 二磷酸。因此R5PI酶在植物细胞代谢中起着中心作用，对核酸、 辅酶例如NADH、NADPH、FAD、维生素B12、和其他芳香族化合物的合成具有影响。已经报导了核糖5-磷酸异构酶中的突变在拟南芥中减少纤维素的合成(Howies 等；2006)。令人惊讶地，现已发现，调节编码R5PI多肽的核酸的表达可产生相对于对照植物 具有增强的产量相关性状的植物。根据一个实施方案中，提供了用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方 法，其包括调节编码R5PI多肽的核酸在植物中的表达。3.含铎指iZnfl结构域的A20/AN1多肽蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用是许多蛋白质的基本功能。蛋白质已形 成了多种不同方式来结合其他分子。称为锌指结构域(aiF)的锌结合重复序列是一个这样 的分子支架。已发现含锌指结构域的蛋白质在真核细胞中起着调节不同信号转导途径和控 制程序例如发育和程序化细胞死亡的重要作用。锌指结构域使得不同蛋白质能够与DNA、 RNA或其他蛋白质相互作用或与之结合，锌指结构域存在于许多不同生物的蛋白质组中。存 在许多类型的含锌指结构域的蛋白质(按照结合锌原子的半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His) 残基的数目和顺序分类)。—类含锌指结构域的蛋白质是A20/AN1亚家族，其特征在于存在至少2个锌指结 构域A20锌指结构域(通常在C端)和ANl锌指结构域(通常在N端)。A20锌指结构域 最先因其在哺乳动物系统中调节免疫应答的作用而被鉴定(Opipari等(1990) J boil Chem 265 :14705-14708)。其可以通过多个Cys2/Cys2锌指基序的存在来表征，其结合单个锌原 子并通过显示遍在蛋白连接酶活性而参与泛素信号转导(Hishiya等Q006)EMBO J 25: 554-564)。ANl锌指结构域最早作为ANl (非洲爪蟾中的泛素样蛋白)C端上的锌指被鉴定 (Linnen等(1993) Gene 128 =181-188) 其特征在于6个保守Cys和2个His (可能潜在地 配位2个锌原子)的存在。在植物中，编码SiF A20/AN1蛋白的基因属于多基因家族，在拟南芥中至少14个 成员，在稻中至少18个成员，在白杨中至少19个成员以及在展叶剑叶藓(Wiyscomitrella patens)中至少 10 个成员(Shubha & Tyagi (2008) Funct Integr Genomics)。这些多肽 的结构域组织分析显示结构域组织的广泛多样性，鉴定到多至17种不同的类型。其中一种 类型是一类包含A20锌指结构域和ANl锌指结构域之各至少一个的多肽(ShiAha & Tyagi (2008)同上引文)。用在组成型泛素启动子控制之下的稻Sif A20/AN1多肽(OsSAPS)转化的转基因 稻和烟草植物，在种子萌发/幼苗期展示了增加的对盐、干旱和冷胁迫的耐受性。转基因稻 植物在开花期耐受盐和干旱，且与未受胁迫的转基因植物相比较，无产量损失(Karmeganti& Gupta O008) Plant Mol Biol 66:445-462)。在欧洲专利申请EP1033405中，拟南芥Sif A20/AN1多肽被鉴定为SEQ ID NO: 10503，相应的核酸序列为SEQ ID N0:10502。在美国专利US7214786中，小麦Sif A20/AN1 多肽被鉴定为211，164个序列中的SEQID NO :10787。令人惊讶地，现已发现，增加编码含锌指(Sif)结构域的A20/AN1多肽的核酸序列 的表达可产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方 法，其包括增加编码含锌指(Znf)结构域的A20/Am多肽的核酸序列在植物中的表达。增 加的产量相关性状包括如下一种或多种增加的早期活力、增加的地上生物量、增加的每株 植物的种子总产量、增加的饱满种子数量、增加的种子饱满率和增加的收获指数。4. PHD-zf 多肽在真核基因组中含锌指(Zf)结构域的蛋白质属于最丰富的蛋白质。锌指蛋白可 以以模块结构域与其他保守结构相组合的形式结合DNA、RNA、其他蛋白质或脂质。归因于该 组合多样性，锌指超家族的不同成员作用于许多不同的细胞过程，包括转录调控、mRNA稳定 性和加工、以及蛋白质周转。锌指结构域是相对小的蛋白质基序，结合一个或多个锌离子， 所述锌离子通过半胱氨酸和组氨酸四面体配位。含锌指结构域的蛋白质可被分类成进化和功能趋异的蛋白质亚家族。这些亚家族 之一是植物同源域锌指(PDH-zf)结构域家族——按照首先发现它们时它们所在的该类蛋 白质(植物同源结构域)进行的命名(Aasland &Stewart (1995) Trends Biochem Sci 20: 56-9)。PHD是主要存在于参与真核转录调控的蛋白质中的大约50个氨基酸的基序。特征 性序列特征是保守Cys4-HisCp3锌结合基序。PDH结构域配位2个锌原子。称为Alfin-I (紫花苜蓿-诱导的_1)的一个组成成员最初通过在耐盐的与正常 的紫花苜蓿细胞之间差示筛选cDNA文库而分离(Bastola，等(1998)Plant Mol Biol 38: 1123-35)。推测Alfin-I PHD结构域以EDTA敏感性方式起着结合DNA的作用，从而推断结 合需要锌(Bastola，等，1998，同上)。在拟南芥中鉴定了 8个PDH_zf编码基因(Riechmarm， J.L.，等，(2000) Science 290 :2105-10)，在稻中鉴定了至少9个，在玉蜀黍中鉴定了 13个。PHD-zf结构域包含在细胞核蛋白质中发现的C4HC3锌指样基序，该基序据认 为参与染色质介导的转录调控，更具体地在GNGGTG或GTGGNG的核心六聚体基序上结合 DNA (Bastola，等，1998)。在该PHD-zf结构域中，Trp残基是高度保守的。PHD-zf多肽也包 含与其他蛋白质相互作用的DNA结合蛋白的特征性酸性区域。Winicov和Bastola使用组成型35S启动子过表达Alfin-Ι，显示转基因紫花 苜蓿植物除了叶子比未转化的植物的叶子略宽外，生长正常，无显著的表型(Winicov & Bastola(1999)Plant Physiol 120 :473-480)。相反地，以反义方向过表达Alfin-I 的转基 因植物在土壤中生长更差，表明Alfin-I是正常植物生长所必需的。已显示，Alfin-I通过 35S启动子的组成型表达确实增加转基因植物的盐耐受性(Winicov & Bastola(1999)同 上)。对这些转基因植物的进一步表征显示，在正常和盐胁迫的土壤中根生长均得到了增强 (Winicov (2000)Planta 210 :416-22)。Winicov报导了这些转基因紫花苜蓿植物的枝条重 量的轻微增加。在国际专利申请W099/53016中，描述了编码PHD_zf多肽的核酸序列和包含此类核酸序列的构建体。显示了相对于对照植物具有增强的盐耐受性的、过表达 PHD-zf(Alfin-l)的转基因植物。这些植物还可以通过在正常和含盐土壤中增强的根生长 来表征。令人惊讶地，现已发现，增加编码本文中定义的PHD-zf多肽的核酸序列在植物中 的表达，可以产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物增强植物的种子产量相关性状的 方法，其包括增加编码如本文中定义的PHD-zf多肽的核酸序列在植物中的表达。增加的种 子产量相关性状包括如下一种或多种增加的植物高度、增加的种子饱满率、增加的每圆锥 花序的花数量和增加的千粒重(TKW)。5. REF/ALY 多肽活细胞中蛋白质的生物合成通过多步骤过程发生，所述过程包括将基因转录成信 使RNA (mRNA)和随后将这样的mRNA翻译成蛋白质。在真核生物中，基因表达需要将mRNA从 细胞核中其转录位置向外运输至细胞质，在细胞质中其被翻译。存在数百个控制基因表达 的基因，其中只有少数已经被证实，当在植物中调节其表达时，对有意义的农业产业性状具 有有益影响(Vinocur 禾口 Altman, 2005, Current Opinion in Biotechnology 16,123-132 ； Gutterson 禾口 Reuber 2004. Current Opinion in Plant Biology,7,465-471)。特别地，REF/ALY蛋白参与转录共激活和mRNA的细胞核出核转运。REF/ALY蛋白是 跨界保守的。酵母基因组编码单个REF/ALY蛋白，而高等真核生物含有小家族的编码REF/ ALY蛋白的基因。ALY蛋白是大约30-kD的蛋白质并且具有高度保守的结构域结构。这由 连接在2个可变区侧翼的短N端和C端基序组成，所述可变区含有埋在非保守氨基酸序列 中的可变数量的Arg-Gly-Gly(RGG)重复序列。该蛋白质的中心结构域包含RNA结合结构 域(也称为RNA识别基序[RRM])，其含有两个更为高度保守的亚结构域RNPl和RNP2。在拟南芥中，REF/ALY蛋白家族的4个成员中，2个已经通过它们结合 PARP (聚-ADP-核糖聚合酶)，一种参与控制基因组完整性、染色质结构、DNA修复和细胞 死亡的蛋白质，的能力被表征(Storozhenko等2001. J. Exp. Bot. 52，1375-1380)。此外， 该家族的另一个成员据报导与番茄丛矮病毒的P19蛋白相互作用(mirig等2004，Plant Physiology 第 135 卷，pp. 2411-2423)。令人惊讶地，现已发现，调节编码REF/ALY多肽的核酸的表达可产生具有增强的 产量相关性状的植物。根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方 法，其包括调节编码REF/ALY多肽的核酸在植物中的表达。定义多肽/蛋白质术语“多肽”和“蛋白质”在文中可互换使用，是指通过肽键连接起来的、任意长度 的氨基酸的聚合物。多丰亥苷it/ ^ii / mmmn / m^mmn术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在文中可互换 使用，是指任何长度的无支链形式的核苷酸聚合物，所述核苷酸可以为核糖核苷酸或脱氧 核糖核苷酸或者两者的组合。
对照棺物选择适宜的对照植物是实验设置的常规部分，并且可以包括相应的野生型植物或 不含目的基因的相应植物。对照植物一般与待评估植物为相同的植物物种，或者甚至为同 一品种。对照植物还可以是待评估植物的无效合子。无效合子是因分离而失去转基因的个 体。如本文所用的“对照植物”不仅指完整植物，而且还指植物部分，包括种子和种子部分。同源物蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋 白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与其源自的未修饰蛋白质具有相似的生物活 性和功能活性。缺失是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。插入是指在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末 端和/或C-末端融合，以及单个或多个氨基酸的序列内插入。一般，氨基酸序列内的插入将 小于N-或C-末端的融合，约1到10个残基左右。N-或C-末端融合蛋白或肽的实例包括 在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、 (组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、 Tag · 100表位、c-myc表位、FLAG 表位、lacZ、CMP (钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质 C表位和VSV表位。取代是指蛋白质中的氨基酸用具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、 形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其他氨基酸替换。氨基酸取代一般是单 残基的取代，但是视施加于多肽上的功能性限制而定也可以是成簇取代；插入通常在大约 1到10个氨基酸残基的数量级。氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守取代表在本领 域公知(参见例如 Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (编辑)禾口下表 1)。表1 保守氨基酸取代的实例
权利要求
1.相对于对照植物增强植物产量相关性状的方法，其包括调节编码TFLl-样， Terminal Flowerl-样多肽，的核酸在植物中的表达，和任选地选择具有增加的种子产量的 植物。
2.根据权利要求1的方法，其中所述TFLl-样多肽包含序列，所述序列按照递增的优选 次序具有(i)磷脂酰乙醇胺结合蛋白(ΡΕBP)结构域(pfam中的结构域登录号PFAM01161)，优 选如表A的任一多肽中存在的，更优选如SEQ ID NO 2的氨基酸66至88之间包括的序列 所代表的，甚至更优选如SE Q ID NO :26(P. trichocarpa_575797_BFT)中存在的；和(ii)在与SEQID NO :2的氨基酸残基His86 (H86)等同的位置上的保守组氨酸(His或 H)或优选地酪氨酸(Tyr或Y)残基、以及在与SEQ ID NO 2的氨基酸残基Aspl42 (D142)等 同的位置上的保守天冬氨酸(D)或优选地谷氨酸(Glu)残基。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述调节的表达通过向植物中引入和表达编码 TFLl-样多肽的核酸来实现。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码TFLl-样多肽的核酸编码表Al所 列的任一蛋白质，或是这样的核酸的部分，或是能够与这样的核酸杂交的核酸。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸序列编码表Al所给出的任一蛋 白质的直向同源物或旁系同源物。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照 植物增加的生物量，优选地枝条和/或根生物量。
7.根据权利要求1的方法，其中所述增强的产量相关性状选自种子产量、每株植物的 种子数量、每圆锥花序的饱满种子数量和收获指数。
8.根据权利要求1至7的任一项的方法，其中在非胁迫条件下或在干旱胁迫生长条件 下获得所述增强的产量相关性状。
9.根据权利要求3至8的任一项的方法，其中所述核酸有效连接于组成型启动子，优选 G0S2启动子，最优选来自稻的G0S2启动子。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述编码TFLl-样多肽的核酸是植物来 源的，优选来自双子叶植物，更优选来自杨柳科，最优选来自毛果杨。
11.可根据前述权利要求中任一项的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植 物或其部分含有编码TFLl-样多肽的重组核酸。
12.包含如下之任一的分离的核酸分子(i)SEQID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO :31 或 SEQID NO :117 所示的核酸；(ii)与(i)SEQID NO =IUSEQ ID NO :13,SEQ ID NO :31 或 SEQ ID NO :117 互补的核 酸或其片段；(iii)编码TFLl-样多肽的核酸，所述核酸按照递增的优选次序与(i)SEQID NO=IU SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :31 或 SEQ IDNO :117 具有至少 90%、91 %、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或更高序列同一性；(iv)能够在严格条件下与上述(i)、(ii)或(iii)所给出的任一核酸杂交的核酸。
13.分离的多肽，其包含⑴按照递增的优选次序与(i)SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :32 或 SEQID而118具有至少97%、98%、99%或100%的序列同一性的氨基酸序列；和/或(ii)(i)所给出的任一氨基酸序列的衍生物。
14.构建体，其包含(i)编码权利要求1、2或13中定义的TFLl-样多肽的核酸或权利要求12的核酸； ( )能够驱动(a)中核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地(iii)转录终止序列。
15.根据权利要求14的构建体，其中所述控制序列之一为组成型启动子，优选G0S2启 动子，最优选来自稻的G0S2启动子。
16.根据权利要求14或15的构建体在制备相对于对照植物具有增加的种子产量的植 物的方法中的用途。.
17.转化了权利要求14或15的构建体的植物、植物部分或植物细胞。
18.产生相对于对照植物具有增加的产量，优选地增加的种子产量，的转基因植物的方 法，所述方法包括(i)在植物中引入和表达编码如权利要求1、2或13中所定义的TFLl-样多肽的核酸或 根据权利要求12的核酸；和( )在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞；和任选地 (iii)选择具有增加的种子产量的植物。
19.相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量，的转基因植物、或源自所 述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述增加的产量因编码如权利要求1、2或13中所定 义的TFLl-样多肽的核酸的被调节的表达而引起。
20.根据权利要求11、17或19的转基因植物、或源自其的转基因植物细胞，其中所述植 物是作物植物或单子叶植物或谷类植物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱 和燕麦。
21.根据权利要求20的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为枝条生物质和/或种子。
22.从权利要求20的植物和/或从权利要求21的植物可收获部分产生的产品。
23.编码TFLl-样多肽的核酸在相对于对照植物增加种子产量中的用途。
全文摘要
本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及通过调节编码TFL1样(Terminal Flower Like 1)多肽的核酸在植物中的表达来增强各种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码TFL1样多肽的核酸的经调节表达的植物，该植物相对于相应的野生型植物或对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供可以用于实施本发明方法的、迄今未知的TFL-1样编码核酸、和含有其的构建体。
文档编号C07K14/415GK102143971SQ200980134433
公开日2011年8月3日 申请日期2009年7月2日 优先权日2008年7月4日
发明者A·I·桑兹莫林纳罗, C·勒佐, V·弗兰卡德, Y·海茨费尔德 申请人:巴斯夫植物科学有限公司