专利名称：Unc5cl及其编码蛋白的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症治疗及诊断领域，特别涉及UNC5CL作为一个新的潜在抑癌基因及其编码蛋白在制药中的应用。
背景技术：
UNC5CL(unc_5homolog C-Iike),最初命名为 ZUD(ZU5 and death domaincontaining protein),是本发明人利用死亡结构域(death domain, DD)的氨基酸序列以tBLASTn检索人EST数据库得到的一种新的编码含有死亡结构域蛋白的基因。UNC5CL基因位于人6号染色体6p21. 1，编码蛋白518个氨基酸，在氨基酸水平与小鼠UNC5CL有近83%的序列同源性，与神经轴突导向分子Netrin-I受体家族(UNC5H)成员的胞质部分同源性较高，达到40%，与其中一个受体UNC5C/H3的胞质内段同源性最高，因此，被正式命名为 UNC5CL (unc-5homolog C-like)。其编码产物位于细胞质内，通过与NF-kappa B信号通路P65和pl05分子结合发挥其抑制NF-kappa B活化的作用。UNC5CL在人体组织中高表达于肾、肝、胰腺等组织。其是否还参与其他生理或病理过程不是很清楚。
发明内容
本发明的目的在于研究UNC5CL在肾癌中的表达特点、研究UNC5CL的新功能并提供UNC5CL的新应用。在本发明中，所述UNC5CL基因为在GenBank的登记号为匪173561. I的基因。所述UNC5CL蛋白为所述UNC5CL基因所编码的蛋白。本发明研究了 UNC5CL在肾癌细胞系、配对的肾癌和癌旁组织中的表达特点，发现UNC5CL在肾癌来源的细胞系中表达下调或缺失，其在肾癌组织中的表达明显低于癌旁组织。本发明还进一步进行免疫组化实验，提示UNC5CL蛋白在肾癌组织中表达下调。本发明还通过实验证实通过在UNC5CL表达下调或缺失的肾癌细胞系(786_0)中恢复UNC5CL的表达，可抑制细胞增殖和细胞迁移；另外，在肾癌细胞系如786-0以及A498中恢复UNC5CL，可抑制肿瘤细胞的克隆形成率。因此,可确定,UNC5CL是一个抑癌基因，并可作为癌症的临床诊断和/或预后判断的辅助指标，另外UNC5CL基因或UNC5CL蛋白在治疗和/或抑制肿瘤中具有重要应用价值。根据本发明的实验研究发现，本发明提供了 UNC5CL基因或其编码的蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。具体而言，所述癌症为肾癌。本发明还提供了 UNC5CL基因或其编码的蛋白在抑制肿瘤细胞的生长和/或肿瘤细胞迁移中的应用。本发明通过实验证实，UNC5CL基因或其编码的蛋白能够抑制肿瘤细胞的生长和增殖、抑制肿瘤细胞的克隆形成并能抑制肿瘤细胞迁移。具体而言，所述肿瘤细胞为肾癌细胞。在本发明的一个具体实施方案中，所述细胞迁移为纤粘连蛋白诱导的肾癌细胞的迁移。根据本发明的具体实施方案，本发明所述的UNC5CL在具体应用时，可以包含于载体中。所述载体可以为真核表达载体或病毒，优选为腺病毒。例如，在本发明的一个具体实施方案中，是通过腺病毒Ad-UNC5CL而明显抑制肿瘤细胞的增殖或迁移。
图IA是Basic-PCR分析中的凝胶电泳照片，通过针对UNC5CL特异性引物，对肾癌(Ca.)以及癌旁组织(八(1」.)(^嫩进行检测，说明^05(^ mRNA在配对的肾癌组织中表达下调，其中GAPDH为系统内参基因。图IB显示对30例肾癌以及癌旁配对组织(Tl T30)的实时定量PCR分析结果，其中纵轴表示相对于内参基因GAPDH，UNC5CL的表达水平。通过对每份组织中UNC5CL与GAPDH的检测值之比进行比较，说明UNC5CL mRNA在配对的肾癌组织中表达下调。图2是免疫组化分析中的组织染色照片，通过UNC5CL的抗体，分别对肾癌以及癌 旁组织进行染色，进一步证明UNC5CL蛋白在配对的肾癌组织中表达下调。箭头所指的就是UNC5CL阳性区，我们发现在正常以及癌旁组织中，UNC5CL主要分布于肾小管胞质中。图3是在受感染后不同时间的细胞数量图，说明UNC5CL具有抑癌功能，能够抑制786-0肾癌细胞系的增殖。图3中的A、B、C分别代表着细胞感染后24小时、48小时以及72小时后检测增殖的结果；图3中的D是通过针对UNC5CL特异性抗体检测不同滴度的病毒感染效果。图4显示平板克隆形成实验的结果，说明细胞在转染空载体(pcDNA3)以及pRK-C-Flag-UNC5CL(pcDNA3-UNC5CL)时，在增殖过程中存在着差异。图5显示软琼脂克隆形成实验结果，其中纵轴表示克隆形成数。说明UNC5CL能抑制肾癌细胞系(786-0、A498和Os-RC-2)的克隆形成。Ad-GFP表示可以表达绿色荧光蛋白的腺病毒，作为对照组;Ad-UNC5CL表示表达UNC5CL蛋白的腺病毒，为实验组。图6显示细胞迁移实验结果，说明UNC5CL能够抑制786-0和A498肾癌细胞系的迁移。图7是Transwell小室实验的结果，进一步说明UNC5CL可以抑制A498肾癌细胞系的迁移以及侵袭。图8显示实时PCR结果，通过检测786-0肾癌细胞系中NF_kappaB下游基因的表达，来分析UNC5CL抑制肾癌细胞增殖以及迁移的机制。图中纵轴同样表示每种基因相对于内参基因GAPDH的表达量。附图中，Ca.表示肾癌组织；Adj.表示癌旁组织；HEK293表示人胚肾细胞系；Hela表示宫颈癌细胞系；786-0、A498和0s-RC-2表示肾癌细胞系；Ad_GFP表示可以表达绿色荧光蛋白的腺病毒；Ad-UNC5CL表示表达UNC5CL蛋白的腺病毒；Mock表示空载体转染。另外，p> 0. 05 时，标“ns”;p < 0. 05 时，标“ * ”;p < 0. 01 时，标“ * ”;p < 0. 001
时，标*表示差异的显著程度，ns表示无显著差异。
具体实施例方式下面将结合具体实施例进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL)Press, 2001)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中，所用原始试剂和材料均可商购获得，主要试剂和材料为Cell Counting Kit_8(CCK_8)购自 Dojindo 公司；TRIZ0L 试剂购自 Invitrogen公司；ffizard Plus Miniprep DNA Purification System、 Reverse TranscriptionSystem、EcoRI、HindIII、T4DNA ligase、高保真DNA聚合酶购自Promega公司；人胚肾细胞系HEK293、宫颈癌细胞系Hela、肾癌细胞系786-0、A498、0s_RC_2购自ATCC或北京协和医学院细胞库。以上细胞系均使用10% FBS/RPMI-DMEM(4. 5g/l葡萄糖，4mM L-谷氨酸，IOOU/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素)培养。30例人原发肾癌和癌旁配对组织由北京大学第三医院泌尿外科提供。组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司。实施例1UNC5CL在肾癌组织中表达下调I.细胞或组织的RNA提取
按照TRIZOL (InvitiOgen)试剂的说明书，分别提取细胞或组织总RNA，并将其用紫外分光光度计定量。取 I U g 总 RNA,利用 Reverse Transcription System(Promega)通过Oligo dT合成第一链cDNA。2. RT-PCR 反应体系取I μ I上述cDNA产物作模板进行PCR扩增。反应中所用引物序列如表I所示，反应条件如表2所列，用GAPDH作为系统内参。本实施例从30例肾癌以及癌旁配对组织(Tl Τ30)中提取RNA，制备cDNA。利用BIO-RAD荧光定量PCR系统进行实时定量PCR检测。所有的cDNA模板均稀释100倍，在20 μ I的实时定量PCR扩增体系中，加入8μ I稀释的cDNA模板及相应的引物(表l)，cDNA首先在95°C变性10分钟，然后按照95°C 15秒、60°C I分钟的条件进行扩增。其中扩增GAPDH作为内参对照基因。表I :PCR反应所用引物序列
基因名上游引物下游引物
UNC5CL5，-TCC ACCTCTTCCGCTTCTAC-3， 5，-TCCCTGGAGGCTGCTTTC-3，
(SEQ ID NO: I)(SEQ ID NO:2)
GAPDH5，- ATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3，5，-GATGACCTTGCCC AC AGCCT-3， (SEQ ID NO:3)(SEQ ID NO:4)表2 PCR反应条件
基因名预变性变性退火延伸轮数延伸
UNC5CL94°C 5min94°C30s 58°C 30s72°C30s 3572°C 7min
GAPDH94°C 5min94°C30s 58°C 30s72°C30s 2472°C 7min3.免疫组化分析
组织芯片经过脱蜡，梯度酒精水化，在柠檬酸钠缓冲液中煮沸15min进行抗原修复，用3% H2O2室温避光孵育20min去除内源性过氧化物酶，用正常羊血清工作液室温封闭30min，然后滴加山羊抗人UNC5CL多克隆抗体(Abcam)至终浓度I : 50，于37°C反应lh。用同样浓度的正常山羊IgG作为阴性对照。用PBS充分洗涤后滴加HRP标记的羊抗兔小鼠抗山羊二抗(中杉金桥)室温反应30分钟，用PBS洗涤三次，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，最后中型树胶封片于显微镜下观察并记录结果。结果显示对收集到的30例配对肾癌以及癌旁组织进行RT-PCR检测以及实时PCR检测，发现UNC5CL在肾癌中表达下调，如图IA以及图IB所示。实时PCR分析结果显示在30例配对肾癌和癌旁组织中，UNC5CL在癌旁与癌表达差异大于2倍以上的有19例，其中差异在10倍以上的有10例，介于2倍与10倍之间的有9例。UNC5CL在癌旁与癌表达差异小于2倍的标本有11例。进一步通过免疫组化分析发现，在配对的癌组织中，UNC5CL明显表达下调，见图2。实施例2UNC5CL具有抑制肿瘤细胞的增殖和迁移功能 I. pcDNA3-UNC5CL真核表达载体的构建具体的构建方法是以EST克隆(GenBank 登录号BI762014，购买自美国ResearchGenetics公司)为模板，PCR扩增UNC5CL的开放读码框，通过特异性引物(上游5’ -GCAAGCTTGCCACCATGTGCCCCCAGGAGAGT-3’，下游5’ -CGGAATTCGAGCTTCTCGTCCAGC-3’)高保真PCR扩增UNC5CL的开放读码框，以Hindlll+EcoRI双酶切，胶回收后，以T4DNA连接酶连接至经Hindlll+EcoRI双酶切后的pcDNA3上，转化，提取质粒，双酶切鉴定、测序鉴定正确的克隆大提质粒后备用。2.腺病毒Ad_UNC5CL载体的构建和病毒的包装设计上游带EcoRI、下游带SalI的引物，以pcDNA3_UNC5CL原始质粒为模板高保真PCR扩增UNC5CL基因。引物序列如下上游UNC5CL-EcoRI-1605-F 5，-CGGAATTC GCCACCATGTGCCCCC-3，；下 #:UNC5CL-SalI_1605-R:5，-ACGCGTCGACTCATTTGTCATCATCG-3 ’ ；PCR产物回收后进行EcoRI+Sal I双酶切，胶回收；腺病毒载体PDC316EcoRI+SalI双酶切，胶回收。T4DNA连接酶连接两片段，转化，质粒双酶切鉴定，测序鉴定大提质粒后备用。Ad-UNC5CL以及对照空载体病毒Ad-null (Mock)、Ad_GFP乃委托本元正阳公司重组、包装、纯化获得，TCID50亦由该公司测定。具体步骤如下(I)双质粒共转染293细胞，同源重组产生重组腺病毒转染前一天，将293细胞接种于六孔板中，每孔5 X IO5个细胞，培养基为DMEM+10% Hyclone胎牛血清，置于37°C含5% CO2的培养箱中培养过夜。转染当天换液，用新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的80% 90%时,取骨架质粒和穿梭质粒,用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转染。每个转染孔取骨架质粒4 μ g，穿梭质粒I μ g，混和均匀。质粒用300 μ I的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。取10 μ I的脂质体用300 μ I的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。将两者混和，室温避光放置30min。然后将混合物加入到细胞中。转染后第二天，将长满的细胞传代于25cm2细胞培养瓶中，用含5%胎牛血清的DMEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底时，再传入75cm2细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将出毒的细胞培养瓶先后置于-70°C冰箱和37°C水浴锅中反复冻融三次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液于3000rpm离心5min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为第一代毒种(P1)，作为随后大量病毒扩增的毒种。(2)病毒的扩增、纯化在25cm2细胞瓶中培养293细胞，待细胞生长至90%满时，取上述第一代毒种500 μ I接种于细胞上，待细胞完全病变时按前述方法冻融细胞三次，离心收集病毒上清液，此即为第二代毒种(Ρ2)。在I个75cm2方瓶中接种4Χ IO6个293细胞，培养过夜，待细胞生长至90%满时，取2ml P2代毒种接种至培养瓶内，24小时后，显微镜下观察发现有60%细胞病变，44小时后细胞完全病变。收获病变细胞混悬液后，冻融三次，离心，取上清，按同样方法接种于另外4个75cm2方瓶中，44小时完全出毒，收获病毒，用于接种转瓶。在每个转瓶中接种I. 8X108个293细胞，共接种10个转瓶，等细胞生长至90%融合时，按IOml/转瓶(MOI约为I)接种第2步收获的病毒上清，染毒后70小时收获病变细胞混悬液。将混悬液于3000rpm离心IOmin,弃上清,细胞沉淀用Tris缓冲液重悬,反复冻融三次，于6000rpm进行离心,取上清，用DNase酶消化后,用O. 45 μ m的滤膜过滤,然后进行柱纯化。离子交换纯化后，然后再用分子筛进一步纯化，将纯化后的病毒保存于腺病毒保存液中，经除盐处理后用O. 22UM—次性滤器过滤出菌，用从而得到无菌的纯化病毒，分装保存于_70°C冰箱中，短期内(I 2周)使用可保存于4°C。(3)病毒滴度的测定用IOX的病毒裂解液裂解纯化病毒样品，测定的0D260和0D280值，按照公式VP/ml = 0D260X1. I X 1012，计算得到每ml制品中的病毒颗粒数(V. P. /ML)，用经典方法测定病毒制品的TCID50值，具体方法是培养293细胞，待细胞生长密度约为80% 90%时，消化细胞并计数细胞数量。用含有5% FBS的DMEM培养液制备细胞悬液，每板需要Ilml浓度为lX105/ml的细胞悬液。按每孔100 μ I (即IXlO4个细胞)加入2个96孔板。制备感染样品，无菌操作进行第一组稀释对高浓度样品106开始连续8个稀释梯度，对低浓度样品104开始连续8个稀释倍数，再进行第二组稀释，小心操作，以免将两组样品稀释液混淆。接种样品将96孔板中的11、12两列各加入100 μ I5 % FBS的DMEM，做阴性对照。依次加入96孔板中的A-H排，各加100 μ I标记为8个连续梯度稀释的样品溶液。盖上第一个板并在37°C CO2培养箱中培养。同样步骤操作第二块板。盖上第二个板并在37°C CO2培养箱中培养(注样品稀释梯度可随具体情况调整)，将96孔板置于37°C CO2培养箱中培养10天。从第3天到第10天观察细胞状况。第10天分析、记录CPE结果CPE应在10天之内出现。第10天在显微镜下观察每孔CPE情况，并与 阴性对照的一排对比，记录每排样品的阳性孔数。如有一个板被污染，实验必须重做。结果计算在第10天，(a)至少有一个样品稀释液在12个孔内CPE都是明显的。(b)至少有一个样品稀释液最少有3个但不多于9个孔内有明显的CPE。(c)至少有一个样品稀释液在12个孔内都是明显无CPE。病毒活性计算公式对于100 μ I样品，滴度T = 101+d(s_°_5)，d =Iogltl稀释度=1(对于10倍的稀释度而言)，s=阳性比率之和(从第一个10倍稀释度算起)，将 TCID50/ml 转换成 PFU/ml T = aX 10bTCID50/ml = aX 10b-°_7PFU/ml，两次重复实验得到的滴度值应相差< 10°_7。3.细胞系的感染以及转染细胞(786-0，A498，0s-RC-2)在感染前一天以适宜密度接种于96孔板、12孔板、6孔板或60mm细胞培养皿中，18 22小时后进行细胞计数，用不同的MOI值感染细胞。吸去原细胞培养上清，加入半量新鲜完全培养基，而后在加入腺病毒的第一小时里每15分钟轻轻晃动培养皿，一小时后补足培养基。
待转染的细胞(HEK293，Hela)提前24小时接种于6孔板中，转染前将培养基换成Opti-MEM 培养基，将含有 12μ I 的 lipofetamine2000 的 Opti-MEM 培养基 2504 μ I 与含有4 μ g质粒DNA (pcDNA3或pcDNA3_UNC5CL)的Opti-MEM培养基混合，室温30分钟后，滴加入培养基中，4 6小时后换为普通培养基。24小时后观察。4. CCK-8法检测细胞增殖能力将腺病毒感染后的细胞按照2000细胞/孔的密度接种于96孔板中，每组细胞设3个平行复孔，分别于0h、24h、48h、72h加入10μ I的CCK-8试剂，于37°C在5% CO2下孵育2小时后，用ELISAReader 450nm测量光密度值。图3显示的是24h (图3A)、48h (图3B)和72h(图3C)的细胞增殖情况。5.平板克隆形成实验分别将转染pcDNA3的细胞(对照组)以及转染pcDNA3_UNC5CL的细胞(实验组)按每孔1000个、2000个以及10000个细胞接种到6孔板中，24小时后将培养基换成含 有G418的普通培养基培养，每三天换一次液，14天后使用预冷的甲醇固定，O. 005结晶紫染色。其结果如图4所示。6.软琼脂克隆形成实验将腺病毒感染后的细胞，用O. 25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至IX IO6细胞/L。用蒸馏水分别制备出I. 2%和O. 7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40°C中使之不凝固。按I : I比例使1.2%的琼脂糖和2 X DMEM培养基(含有2 X抗生素和20 %的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入直径为6cm的平皿中(IOcm平皿加7 IOml),冷却凝固，可作底层琼脂置于CO2温箱中备用。按I : I比例使O. 7%的琼脂糖和2XDMEM培养基在无菌试管中相混以后，再将感染Ad-GFP的细胞(对照组)以及感染Ad-UNC5CL的细胞(实验组)分别加入I. 5ml的刚刚配好的混合物中，充分混匀，注入铺有I. 2%琼脂糖底层平皿中，逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37°C、5% CO2的温箱中培养10 14天。把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。其结果如图5所示。7.迁移和划痕实验米用孔径为8μηι 的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)的 24-wellTranswell (Corning 公司)进行趋化性迁移实验(chemotaxis assay)。将 f ibronectin (纤粘连蛋白)(BD-Pharmingen公司)涂于聚碳酸酯膜的下层，倒置放于孵箱中孵育I小时；如检测细胞的侵袭能力时，I小时后再将上层小室中铺100 μ I Matrix-geUlmg/ml)，再在37°C>5% CO2孵箱中孵育4 5小时。收获对数生长期的细胞，用无血清DMEM洗细胞2遍，调整细胞密度至I X 106/ml，50 μ I/孔，每种细胞设3个平行复孔，下层中加入20% NCS的DMEM培养基600 μ I。于37°C在5% CO2下孵育20小时后，收膜，用甲醇固定细胞，Giemsa染色20分钟，用棉签轻轻刮去上层未迁移的细胞，用PBS洗3遍，光学显微镜下观察。每孔随机选取3个高倍镜视野进行计数，对每种细胞3个平行复孔9个高倍镜视野的计数值取算术平均数进行统计(结果见图7)。划痕实验在6孔板中进行，将感染后的细胞铺于孔中直至长满一层，使用无菌枪头将细胞划痕，用PBS洗3次，孵育至相应时间点后在镜下进行观察照相，结果如图6所示。8.对NF-kappaB下游影响增殖和迁移功能的基因表达水平的RT-PCR分析
对786-0细胞系的RNA提取和cDNA制备同前所述，RT-PCR的反应体系同前，测试的基因以及对应的所用引物和条件如下表3和表4所示，其结果示于图8中。表3:PCR 引物
权利要求
1.UNC5CL基因在制备治疗癌症的药物中的应用。
2.UNC5CL基因编码的蛋白在制备治疗癌症的药物中的应用。
3.如权利要求I或2所述的应用，其中，所述治疗癌症为抑制肿瘤细胞的生长、抑制肿瘤细胞的迁移、抑制肿瘤细胞的成瘤性或其任意组合。
4.如权利要求3所述的应用，其中，所述肿瘤细胞为肾癌细胞。
5.如权利要求3所述的应用，其中，所述迁移为细胞外基质纤粘连蛋白诱导的肾癌细胞的迁移。
6.如权利要求I 5中任一项所述的应用，其中，所述UNC5CL基因包含于载体中。
7.如权利要求6所述的应用，其中，所述载体为真核表达载体或病毒，且优选为腺病毒。
8.一种用于癌症诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有用于在PCR中合成UNC5CL基因DNA链和/或其cDNA链的PCR引物。
9.一种用于癌症诊断和/或预后的试剂盒，所述试剂盒含有抗UNC5CL蛋白的抗体。
10.如权利要求8或9所述的试剂盒，其中所述癌症为肾癌。
全文摘要
本发明提供了UNC5CL基因及其编码蛋白的应用，具体涉及UNC5CL基因或其编码的蛋白在制备治疗癌症特别是肾癌的药物中的应用，并且涉及UNC5CL基因或其编码的蛋白在抑制肿瘤细胞的生长和/或细胞迁移中的应用，以及在抑制肿瘤细胞的成瘤性中的应用。因此，本发明为诊断和治疗肾癌提供了新途径。
文档编号G01N33/574GK102772803SQ20111012246
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者吕丹, 张君, 张毓 申请人:北京大学