使用急性期蛋白在非人类哺乳动物中控制感染的组合物和方法
【专利说明】使用急性期蛋白在非人类晡乳动物中控制感染的组合物和 方法
[0001] 本发明涉及用于在非人类哺乳动物中控制感染、尤其是乳房内感染aMIs)的组 合物和方法。本发明尤其适于通过在干燥期（dryoffperiod)改善乳腺退化而控制感染 和增强非人类哺乳动物、优选牛的健康（welfare)。本发明是基于急性期蛋白、更优选血清 淀粉样蛋白A(SAA)、甚至更优选同种型3 (SAA-3)的用途。
[0002] 引言 当非人类哺乳动物受孕达每次泌乳的时间的70%时，乳产量最大。在泌乳期之间，干乳 期（dryperiod)对于更新乳腺的衰老上皮细胞和确保下一次泌乳的最佳的乳生产是必要 的。因为在非人类哺乳动物和尤其是反刍动物例如牛中的妊娠状态所致的激素水平，乳腺 退化比在其中退化与妊娠不并存的其它物种中更缓慢。这需要60天的长的干乳期，其显著 地减少生产期的持续时间。干乳期的特征在于两个主要的细胞周转期：乳腺退化，特征在于 急性细胞凋亡，和下次泌乳前的细胞再生。在停乳后头72小时内观察到细胞凋亡的峰值， 在干乳期的剩余时间内一直持续，并伴有渐增的细胞增殖。生理学上，通过撤除对非人类哺 乳动物挤奶而产生的乳汁淤积，以及蛋白和激素因子例如催乳激素下降，诱导活性腺体退 化，并且反过来刺激实质收缩并停止泌乳。
[0003] 乳腺组织是包括上皮分泌细胞和具有不同细胞类型（例如成纤维细胞和免疫细 胞）的基质组织。这两类组织被基底膜分隔开，所述基底膜为影响乳腺的发育和生物学的 一种胞外基质（ECM)。ECM直接建立和维持乳腺分化状态和阻止细胞凋亡。基底膜的蛋白 水解破坏诱导细胞凋亡和乳腺退化。有若干蛋白酶参与胞外基质降解，但该过程中基本上 基质金属蛋白酶（MMPs)是关键酶。此外，其它功能已经归因于MMPs，所述其它功能例如生 长因子和细胞因子的释放，其反过来又调节干乳期的其它关键性方面，例如免疫系统激活 和细胞生长。
[0004] 所述非人类哺乳动物的乳腺在泌乳周期期间在感染的易感性方面经历极大变化， 如在图1中示意性地说明，和超过60%的新的乳房内感染aMIs)在干乳期早期被观察到。 的确，乳汁淤积增加了乳腺内的压力，促使乳汁渗漏和对细菌感染的易感性。而且，乳汁对 于细菌生长而言是富有营养的培养基。另外，乳产量高的动物更易患上乳房内感染，因为它 们延迟了角蛋白塞的形成并增加乳头管阻塞的时间。干乳期期间患上的IMIs与增加下次 泌乳的感染流行相已被关联起来，其导致乳产量损失并降低乳的品质。
[0005] 因此，干乳期早期提供了通过明智使用治疗而控制頂Is的理想机会。的确，为了 避免在该时期和随后的泌乳期期间的Mis的高风险，将抗生素常规地输注到乳腺中。然 而，这一实践与发展出针对在人类和动物中相同的抗微生物剂的耐药性的风险相关。在干 乳期开始时对非人类哺乳动物免疫力的刺激可以不仅与在由逃避广谱抗生素的细菌引起 的感染的情况下改善抗生素的功效有关，而且最终也能够在干乳期作为预防剂代替抗生素 的使用。
[0006] 发明概述 本发明提供用于在非人类动物中控制乳房内感染（nos)的新的组合物和方法。本 发明更尤其是基于急性期蛋白、更优选血清淀粉样蛋白A(SAA)、甚至更优选同种型3 (SAA-3)在非人类哺乳动物中控制頂I的用途。
[0007] 因此本发明的目的在于用于在非人类哺乳动物中控制IMI的急性期蛋白、优选 SAA-3蛋白，或包含急性期蛋白、优选SAA-3蛋白的组合物。本发明的进一步的目的是在非 人类哺乳动物中控制IMI的方法，包括将有效量的急性期蛋白、优选SAA-3蛋白给予所述非 人类哺乳动物。本发明的进一步的目的在于急性期蛋白在非人类哺乳动物中控制IMI的用 途。本发明的组合物、方法或用途可以单独使用（即替代现有治疗）或与现有治疗（例如， 抗生素、抗氧化剂、抗催乳激素、抗原或乳头密封剂）组合使用，以改善它们的功效。并且， 本发明可以使用一种急性期蛋白（例如SAA-3蛋白）或组合使用若干不同的急性期蛋白。
[0008] 更具体地讲，本发明提供用于通过改善常规乳房内治疗的功效在非人类哺乳动物 中控制Mis的基于急性期蛋白的组合物和方法，所述治疗优选抗生素、抗催乳激素、和/或 乳头密封剂。
[0009] 甚至更具体地讲，本发明提供用于通过替代抗生素的使用在非人类哺乳动物中控 制頂Is的基于SAA-3的组合物和方法。
[0010] 本发明尤其适合和有效用于在干乳期期间治疗非人类哺乳动物，从而在干乳期期 间和/或在随后的泌乳期中控制頂I。本发明的一个特别的目的涉及在干乳期期间和/或 在随后的泌乳期中控制Mis的新的基于急性期蛋白的组合物和方法。优选地，在干乳期期 间、更优选在干乳期开始时给予急性期蛋白组合物。
[0011] 本发明的进一步的更特别的目的涉及用于控制乳房炎的包含急性期蛋白、优选 SAA-3蛋白的新的组合物和方法。
[0012] 本发明的另一目的涉及包含急性期蛋白、更优选血清淀粉样蛋白A(SAA)、甚至更 优选同种型3 (SAA-3)的新的组合物和方法，其用于通过改善乳腺退化而增强非人类哺乳 动物的健康。
[0013] 更具体地讲，本发明提供基于急性期蛋白的组合物和方法，其用于通过改善乳腺 退化而增强乳房健康。
[0014] 甚至更具体地讲，本发明提供基于急性期蛋白的组合物和方法，其用于通过改善 乳腺退化而增强乳房炎症。
[0015] 用于本发明的急性期蛋白优选地是呈纯形式或与一种或若干制药上可接受的赋 形剂或载体联合。
[0016] 本发明的进一步的目的涉及将包含急性期蛋白的组合物单独或与以下组合给予 (一起或分开、同时或序贯）非人类哺乳动物的方法：其它急性期蛋白、抗生素、抗氧化剂、 乳头密封剂、抗原或抗催乳激素化合物、优选地多巴胺受体激动剂、更优选麦角林-衍生的 多巴胺和甚至更优选卡麦角林。本发明也涉及对于牛的组合治疗，其包含SAA-3蛋白和抗 催乳激素化合物。
[0017] 本发明可用于任何非人类哺乳动物、优选任何有蹄动物或反刍动物，例如牛、羊 (ovine)、马、绵羊或山羊。
[0018] 本发明的组合物和方法尤其可有效用于在非人类哺乳动物中控制乳房内感染 (Mis)、改善乳房健康和增强天然免疫系统。本发明尤其可有效用于抵抗或预防由金黄色 葡萄球菌以ayreM)所致的乳房内感染。本发明在干乳期期间，尤其是干乳期的早期阶段 期间更尤其有效。本发明尤其通过单独给予SAA-3或将SAA-3与常规治疗例如抗生素或乳 头密封剂组合给予可有效用于控制IMIs和/或共同感染或增强健康。
【附图说明】
[0019] 图1:泌乳周期期间的乳房内感染频率示意性说明。
[0020] 图2:干乳期早期期间的金属蛋白酶（MMP)活性。金属蛋白酶活性表示为INT*_2 土SEM的根。数据得自在干燥（dryoff)后3天期间针对MMP-9 (a)和MMP-2 (b)使用 QuantityOne软件对酶谱法凝胶的条带定量。带星号的治疗有差异（尸〈0.05)。
[0021] 图3:干乳期早期期间的体细胞计数（SCC)、脂肪和蛋白含量。SCC(a)表示为 SCC/ml土SEM(转换数据）。在干燥（dryoff)后3天期间的脂肪（b)和蛋白（c)浓度 (数据表示为％ ±SEM)。带星号的治疗有差异（尸〈0· 05)和?(尸〈0· 1)。
[0022] 图4:原代乳腺培养物。含有泛细胞角蛋白的原代乳腺培养物的免疫荧光。HeLa 细胞（a)作为阳性对照，THP-1巨噬细胞（b)作为阴性对照，以及乳腺培养物（c)。图表示 IL-8的基因表达（a)和内化的金黄色葡萄球菌的活细胞计数（b)。柱代表平均值土SEM。 带星号的柱差异显著（尸〈0.05)。
[0023] 图5:乳腺SAA3影响树突细胞中的基因表达。IL-8 (a)、INFy(b)、TNFa(c)、 CCR7 (d)、⑶80 (e)和iNOS(f)的基因表达。柱代表不同的治疗的平均值土SEM。带星 号的柱差异显著（尸〈〇· 05)和?(尸〈0· 1)。
[0024] 图6:ρΝΖ8148质粒的限制图。
[0025] 图7:在ρΝΖ8148中的saaJ基因扩增的PCR结果。
[0026] 图8.针对乳酸乳球菌（Zaciococci/6· 中产生的M-SAA3的蛋白质印迹 (A)。用QuantityOne软件（B)进行的蛋白质印迹条带的定量。
[0027] 发明详述 本发明在于急性期蛋白、更优选血清淀粉样蛋白A(SAA)、甚至更优选同种型3 (SAA-3)在非人类动物、优选牛中作为活性成分用于控制乳房内感染（IMIs)和/或用于增 强健康和/或强化或刺激天然免疫力的用途。
[0028] 本发明首次提出这类蛋白、尤其是SAA-3蛋白在非人类哺乳动物中作为免疫剂， 并活化乳腺退化的用途。
[0029] 本发明出乎意料地证明了急性期蛋白、尤其是SAA-3蛋白具有以下能力：增加免 疫细胞的募集（单核细胞分离，分化为树突细胞和白介素8表达模式），通过增强金属蛋白 酶活性而刺激乳腺退化，改变体细胞计数以及乳脂和蛋白含量，并且抑制细菌迀移例如乳 腺原代培养物中的金黄色葡萄球菌（ayrei/6·)。
[0030] 急件期蛋白 哺乳动物通过执行一系列复杂的生物反应响应组织损伤、创伤或感染，试图防止进 一步组织破坏，启动受破坏组织的修复，并且隔离和摧毁感染性生物。该过程称为炎性反 应。炎性反应的早期和中期称为急性期反应并涉及各种各样的蛋白介质，包括细胞因子、 白介素和肿瘤坏死因子，其综述参见Steel&Whitehead(ImmunologyToday15: 81-87， 1994)〇
[0031 ] 术语"急性期蛋白"在本发明的上下文中是指一组血浆蛋白，其血浆浓度在非人类 哺乳动物中的响应于组织损伤、急性感染、烧伤、或慢性炎症而增加或降低。该组包括，更具 体地讲，血清淀粉样蛋白A(SAA)蛋白、α-1酸性糖蛋白、α-1抗胰蛋白酶、触珠蛋白、纤维 蛋白原、C-反应蛋白、铁蛋白、血浆铜蓝蛋白和补体因子。用于本发明的最优选的急性期蛋 白是SAA