一种产生ho-1/app/psen1三转基因阿尔茨海默病小鼠模型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种生物技术，具体设及建立一种生物模型的方法，也是建立一种疾 病的生物模型的方法。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病(AD)模型是研究AD发病机制、治疗策略必不可少的工具，目前建立 AD模型的最佳方法是转基因技术。
[0003] 现有阿尔茨海默病转基因模型主要转入的是家族性AD(FAD)中的突变基因，最常 用的是:e-淀粉样前体蛋白（APP)和早老素(PSEN)的突变基因。
[0004] 由于鼠类AP多肤即使是在过表达的状态下也很难在体内高水平聚集形成明显的 斑块（Jankowsky,J丄.，Younkin,L.H. ,Gonzales,V. ,Fadale,D.J. ,Slunt,H.H. ,Lester, H.A.,Younkin,S.G.,and Borchelt,D.R.(2007)Rodent Ab modulates the solubility and distribution of amyloid deposits in transgenic mice .J. Biol.Chem.282, 22707-22720.)，因此为了在小鼠转基因模型中获得老年斑(senile plaque,SP)病理，通常 会将人源APP的突变基因转入小鼠体内。常用的APP突变型有：瑞典双突变型化670NW及 M671L)，伦敦突变型(V717I)，印第安纳突变型(V717F)，荷兰突变型化69%)等，运些位点突 变使APP易于被分泌酶切割生成A0。
[0005] 早老素(PSEN1/2)参与构成丫-分泌酶复合体，其基因突变出现在FAD中，可促进 丫-分泌酶裂解 APP 生成 A0(Newman,M. ,Musgrave,I.F. ,and Lardelli,M. (2007)Alzheimer disease:amyloidogenesis,the presenilins and animal models. Biochim. Bio地ys. Acta 1772,285-297.)。阿尔茨海默病转基因模型中常联合应用 PSEN和APP，W增强和提前A朗君块的形成。
[0006] 尽管APP/PSEN转基因鼠具备了一些重要的AD表现型，但是却缺少神经纤维缠结 (neurof ibri 1 Ia巧化ngles ,NFPs)运个重要的病理标志。因此为了获得神经纤维缠结人们 又向模型中转入了 tau蛋白突变基因，从而使APP/PSEN/TAUS转基因小鼠获得了AD所有主 要的表现型:包括老年斑;神经纤维缠结;神经元丢失;认知功能障碍。
[0007] 但是事实上阿尔茨海默病与tau基因突变并无联系，FAD中也并不存在tau基因突 变（Ballatore'C.,Lee,V.M.,and Trojanowski,J.Q.(2007)Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders.Nat.Rev.Neurosci.8,663-672.Giannakopoulos,P.,Gold,G.,Kovari,E.,von Gunten,A.,Imhof,A.,Bouras,C.,and Hof,P.R.(2007)Assessing the cognitive impact of Alzheimer disease pathology and vascular burden in the aging brain: The Geneva e 邱 erience .Acta Neuropathol. 113,1-12.)。目前AD 转基因模型中广泛应用的 tauP301L突变型来源于前颠顧痴呆帕金森症（frontal temporal dementia with 化丘1^邮〇1113111^10口-17)，该突变导致化11蛋白结合微管的性能降低，促使。10口-17脑中形成 明显的神经纤维缠结化ee,V.M. ,Goede;rt,M. ,and Trojanowski ,J.Q. (2001) Neurodegenerative tauopathies.Annu.Rev.Neurosci.24,1121-1159.Roberson,E.D. (2006)Frontotemporal dementia.Curr.Neurol.Neurosci.Rep.6,481-489.)。
[0008] 也就是说，AD中的神经纤维缠结并不是由tau基因突变引起的，而是存在其他的诱 导因素。虽然APP/PSEN/TAIE转基因动物是目前最佳的AD模型，具有很多应用价值，但是它 并不符合AD真实的病理发生机制。如果用运样的模型研究AD发病机制可能会得出与实际不 符的结论，用其开发治疗祀点或作临床前药效评价，可能收不到预期的疗效。
[0009] 因此，开发既能够涵盖AD表现型，又能够真实模拟阿尔茨海默病的模型，对于阿尔 茨海默病的研究十分必要。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于通过转基因技术建立册-I/APP/PSENIS转基因 AD小鼠模型，W 获得一种可稳定遗传、既能涵盖阿尔茨海默病表型，又符合阿尔茨海默病真实病理状态的 动物模型。该模型将可用于基因在体功能分析、疾病发病机制探讨、药物新祀点发现及临床 前药效评价等研究，具有十分重要的科学意义和临床价值。
[0011] 本发明的目的是通过W下技术手段实现的：
[0012] -种产生H0-1/APP/PSEN1S转基因阿尔茨海默病小鼠模型的方法，其是将mHO-1 转基因小鼠与APP/PSEN1双转基因小鼠杂交，对获得的子代小鼠进行鉴定，获得阳性HO-1 / APP/PSEN1S转基因阿尔茨海默病小鼠模型。
[0013] 在本发明中，所述的对获得的子代小鼠进行鉴定，优选包括按照阿尔茨海默病的 分子、病理、行为学特征对册-1/APP/PSEN1转基因小鼠进行鉴定。
[0014] 在本发明中，APP/PSEN1双转基因小鼠可购买自美国国立化Ckson动物中屯、（Bar 化rbor，ME，USA)。
[0015] 在本发明中，优选的，所述的mHO-1转基因小鼠的受精卵通过W下方法制备得到：
[0016] (1)将小鼠血红素加氧酶Uheme O巧genase 1)编码基因血0x1的cDNA插入pCAG载 体EcoRI酶切位点，获得的含有血0x1的CDNA的pCAG重组载体，命名为pCAG-m册-1;
[0017] (2)将包括CMV增强子，chickenP-actin启动子，mHO-lcDNA编码序列，终止信号 rabbi巧-globin poly(A)在内的一段序列从载体pCAG-mHO-1中切下，纯化线性DNA片段；
[0018] (3)制备显微注射用的DNA溶液；
[0019] (4)应用显微注射的方法将构建的基因序列注入到小鼠的成活的受精卵中，即得。
[0020] 在本发明中，优选的，步骤（2)是通过Sail W及DraI酶切将包括CMV增强子， chicke址-actin启动子，m册-lcDNA编码序列，终止信号rat)bit0-globinpoly(A)在内的一 段序列从载体pCAG-mHO-1中切下，纯化线性DNA片段。
[0021] 目前APP/PSEN/TAUS转基因模型是能够复制出所有阿尔茨海默病病理特征的最 佳模型，它虽然通过引入突变的化U基因获得了神经纤维缠结(NFTs)病理，但事实上阿尔茨 海默病中的NFTs并不是由tau基因突变引起的，而是存在其他诱导因素。本发明利用转基因 技术用HO-I基因代替APP/PSEN/TAUS转基因模型中的tauP301L突变基因，建立了 HO-I/ APP/PSEN1S转基因 AD小鼠模型，该转基因小鼠是符合阿尔茨海默病的病理状态的。经行为 学、形态学、分子生物学检测，H0-1/APP/PSEN1转基因小鼠在认知功能、脑组织病理及分子 标志方面均符合阿尔茨海默病特征性表型，可作为阿尔茨海默病动物模型。并且，HO-I/ APP/PSENS转基因小鼠是一种既能涵盖阿尔茨海默病表型又符合阿尔茨海默病病理发生 机制的动物模型。该模型可用于基因在体功能分析、疾病发病机制探讨、药物新祀点发现及 临床前药效评价等研究。
【附图说明】
[0022] 图1为构建Tg(mHO-l)小鼠转基因片段结构示意图；
[0023] 图2为外源mHO-1转基因片段的mRNA表达水平；
[0024] 其中，U低表达系;Hl:高表达系1;肥:高表达系2;
[0025] 图3为Tg(m册-1)小鼠总册-1的mRNA表达水平；