促进大鲵蜕皮的方法及提取大鲵基因组的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程术领域，尤其是一种促进大鲵蜕皮的方法及提取大鲵基因组的方法。
【背景技术】
[0002]大鲵(Andr ias dauidianus )，俗称“娃娃鱼”，也叫“大山椒鱼”，属两栖纲(Amphibia)有尾目(Caudata)隐鲍鲍科(Cryptobranchidae)大鲍属(Andrias)，是一种处于水生到陆生之间的过度物种，进化上十分原始，研究认为大鲵是与恐龙同时代的物种，为我国特有的珍稀野生动物，兼具极高的药用价值和科研价值，主要分布在长江中上游、珠江中上游及汉水上游的深山峡谷溪流中。由于大鲵对水环境的依赖程度很大，扩散能力较差，目前中国大鲵的分布范围和资源己急剧下降，栖息环境呈现出严重的片断化，再加上大鲵生存环境日益恶化，如人为捕杀、环境污染等，大鲵自然资源严重衰竭。
[0003]如何保护现存的野生种群，采取科学的繁殖配对措施以避免近交衰退和遗传多样性丢失，已成为当前中国大鲵保护和养殖中面临的关键问题。近些年来，虽然大鲵人工繁殖及规模化繁育技术取得突破性进展，种群数量也有一定的恢复，但由于对大鲵遗传背景缺乏了解，故不能从根本上解决它的濒危问题。因此，开展大鲵保护遗传学的研究，对大鲵的人工增殖和种质资源管理有重要的意义。
[0004]目前为止，国内外学者已进行了大量大鲵遗传学方面的研究。资料显示，日本大鲵分析其基因结构，采用的样本是组织样本:脚趾，尾部组织，皮肤组织和肝脏；中国大鲵线粒体基因组的提取多是通过采集大鲵的尾部肌肉、血液、肝脏或者是其受到一定刺激后分泌的粘液的方法。当前采取的这些方法或多或少会对大鲵造成一定伤害，且大鲵受惊后一段时间内会影响摄食，这是养殖户不愿看到的。而且在保护野生大鲵的角度上来说也是不可取的。蜕皮是大鲵自然生长的产物，不需要刺激或者剪切大鲵身体任何部位。但是，大鲵在自然情况下，10到15天才蜕皮一次，而且在野外或者模拟自然环境养殖的条件下，也比较难以收集。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是:提供一种促进大鲵蜕皮的方法及提取大鲵基因组的方法，它能快速、有效的获取大鲵蜕皮，以作为提取大鲵基因组的材料，避免了对大鲵造成的损伤。
[0006]本发明是这样实现的:促进大鲵蜕皮的方法，将大鲵置于离水环境下，温度为18-23°C，湿度为40-80%，时间为3-5小时;然后再将大鲵放置于水温为18-23°C的水中，1_2小时后，即可获得大鲵的新鲜蜕皮。
[0007]提取大鲵基因组的方法，收集大鲵的新鲜蜕皮作为提取大鲵基因组的材料。
[0008]由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明通过发现了一套通过环境刺激大鲵使其快速产生蜕皮的方法，利用该方法能快速、有效的收集到大鲵蜕皮，为提取大鲵基因组提供材料，增加了提取大鲵基因组以作遗传学分析的途径，并且有效的避免了损伤大鲵，达到保护大鲵的目的，也符合动物保护的思想。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。
【具体实施方式】
[0009]本发明的实施例1:促进大鲵蜕皮的方法，将大鲵置于离水环境下，温度为18-23°C，湿度为40-80%，时间为3-5;然后再将大鲵放置于水温为18-23°C的水中，1-2时间后，SP可获得大鲵的新鲜蜕皮。
[0010]本发明的实施例2:提取大鲵基因组的方法
I)将通过实施例1收集到的大鲵的新鲜蜕皮作为提取大鲵基因组的材料。采集的大鲵蜕皮无论是否新鲜，都可以提取到基因组。但是为了防止因大鲵基因组的降解影响后续实验，也为了后续实验能准确标记，最好采集大鲵身上新鲜的蜕皮。
[0011]2)提取基因组:
①取Ig左右的蜕皮，剪切成小块后放入1.5ml的离心管中，加入180μ1 Buffer GTL，将不同用品做好标记。
[0012]②加入20μ1蛋白酶K，漩涡震荡彻底混匀。56°C水浴，直至组织完全裂解，裂解过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样品分散。
[0013]③加入200μ1 Buffer GL，漩涡震荡充分混匀，70°C水浴10分钟。
[0014]④短暂离心后加入200μ1无水乙醇，漩涡震荡充分混匀。
[0015]⑤短暂离心，将④所得溶液转入收集管(Collect1nTube )的吸附柱(Sp inColumn DM)中，一次加不完可分多次加入。8000rpm离心Imin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0016]⑥向吸附柱中加入SOOyU^Buffer GWl (使用前加入无水乙醇)，8000rpm离心lmin，倒掉收吸附柱中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0017]⑦向吸附柱中加入SOOyU^Buffer GW2(使用前加入无水乙醇)，13000rpm离心lmin，倒掉收吸附柱中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0018]⑧13000rpm离心2min，倒掉收吸附柱中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干(去除残余的乙醇)。
[0019]⑨将吸附柱置于基因组收集管中，向吸附柱的中间悬空加入50—200μ1BufferGE，室温放置2—5分钟，13000rpm离心I分钟，收集DNA溶液，-20°C保存。
[0020]3)检测获得的基因组:采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，DM2000为Maker，点样量为5μ1，电泳电压110V，时间30~35min。
[0021 ] 4)PCR扩增:根据公知技术设计，筛选出的引物，PCR反应在PTC—200型PCR仪(TECHNE公司)上进行，反应体系为40μ1:上下游引物各2μ1;模板DNA 4μ1，ΜΙΧ 20μ1，加无菌去离子水至40μ1;反应程序为:95°C预变性3 min;94°C变性45 S，56°C复性45 S，72°C延伸Imin，并进行35个循环;72 °C延伸10 min。
[0022]5)检测目的片段:PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，在DYY—ΙΠ32型平板电泳槽(北京六一仪器厂)上进行。利用未加模板DNA的反应液作为空白对照，以检查是否有污染存在。点样量为5μ1，电压为100V，时间35?40 min。
【主权项】
1.一种促进大鲵蜕皮的方法，其特征在于:将大鲵置于离水环境下，温度为18-23°c，湿度为40-80%，时间为3-5小时;然后再将大鲵放置于水温为18-23°C的水中，1-2小时后，即可获得大鲵的新鲜蜕皮。2.一种基于如权利要求1所述的方法的提取大鲵基因组的方法，其特征在于:收集大鲵的新鲜蜕皮作为提取大鲵基因组的材料。
【专利摘要】本发明公开了一种促进大鲵蜕皮的方法及提取大鲵基因组的方法。本发明通过发现了一套通过环境刺激大鲵使其快速产生蜕皮的方法，利用该方法能快速、有效的收集到大鲵蜕皮，为提取大鲵基因组提供材料，增加了提取大鲵基因组以作遗传学分析的途径，并且有效的避免了损伤大鲵，达到保护大鲵的目的，也符合动物保护的思想。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。
【IPC分类】A01K67/02, C12N15/10
【公开号】CN105494257
【申请号】CN201511006587
【发明人】姚俊杰, 吴俣学, 周红霞, 熊伟, 秦国兵, 朱忠胜, 宋娇
【申请人】贵州大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月29日