一种肿瘤抑制蛋白变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种肿瘤抑制蛋白的变体。该蛋白变体相对于野生型具有更强的抑制肿瘤细胞生长的效果。这些变体蛋白质和它们的衍生物可以用于多种肿瘤的治疗。
【专利说明】一种肿瘤抑制蛋白变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地说，本发明涉及肿瘤抑制蛋白变体。
【背景技术】
[0002]肿瘤相关蛋白DENND2D-V2，由468个氨基酸残基组成，自序列4的氨基末端第47至145位氨基酸残基为uDENN结构域，自序列4的氨基末端第146至330位氨基酸残基为DENN结构域，自序列4的氨基末端第368至435位氨基酸残基为dDENN结构域。该肿瘤相关蛋白在小鼠成纤维细胞内稳定高表达可以明显抑制该细胞的恶性转化；在mRNA水平检测其在细胞系中的表达结果表明，肺癌细胞系中的表达水平显著低于原代培养的正常支气管上皮细胞；在肺癌临床组织标本中检测其表达水平结果表明，肺癌组织的表达水平明显低于其周边的正常组织。该肿瘤相关蛋白可用于肿瘤的体外诊断、预后。含有上述肿瘤相关蛋白编码基因的重组真核表达载体在导入肺癌细胞系中后，能单独引起肺癌细胞系的生长变缓及致瘤性减弱。因此，该蛋白具有较好的肿瘤药物应用前景。
[0003]在现有技术中，为了提高蛋白的活性，针对蛋白的活性位点进行特异性的突变和取代，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性， 申请人:通过大量的实验，针对DENND2D-V2氨基酸序列中特定的位点进行了点突变，从而获得了比DENND2D-V2蛋白本身具有更高抑制活性的变体。 [0004]发明详述
[0005]本发明涉及亲本蛋白的分离的变体，其在至少一个对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置 53Y、60K、70P、79R、92R、971、109A、131K、141A、204S、225E、232L、253K、270A、271A、297C、305G、322V、347L、379F、398Q、433Q或45IL的位置包含修饰。具体而言，本发明的变体具有改善的抑制活性。
[0006]优选地，应用于本发明的方法、呈现改善的抑制活性的蛋白变体包含至少I种任一下述修饰:53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、433Q/S、451L/V。
[0007]本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法，包括(a)培养宿主细胞；和(b)回收所述蛋白变体。
[0008]在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。[0009]所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
[0010]本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification, J.-C.Janson 和 Lars Ryden 编，VCH Publishers, New York,1989)。
[0011]本发明的多肽用于制备相应的药物，去用于治疗癌症。
【具体实施方式】
[0012]实施例1:DENND2D_v2基因的获得
[0013]DENND2D-V2:
[0014]上游引物5 ’ CACTCCAGGGGCCATGGATG3 ’
[0015]下游引物5，GTCATTCTTATTCACCACAGCTC3，
[0016]用上述引物，以人正常肺组织cDNA文库(Clontech:K1420_1)为模板进行PCR扩增反应，反应条件如下:
[0017]反应体积50 μ 1，其中含有:
[0018]
人正常肺组织cDNA模板5 μ l(5ng)
引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μΜ
dNTP终浓度各200 μ M
Taq DNA 聚合酶2.5U
10XTaq DNA聚合酶缓冲液 5μ1
[0019]
[0020]用双蒸水补足至50 μ I体积。
[0021]反应温度、时间:94°C，变性5分钟；然后94°C变性30秒，57 °C退火30秒，72°C延伸I分钟，扩增30个循环；最后在72°C下延伸10分钟。
[0022]扩增产物为3’带有碱基A的3’突出粘端片段，用QIAquick胶回收试剂盒(Qiagen, 28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pGEM_TEASY载体(Promega7Al360)在16°C下连接8小时，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5 α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序,获得 DENND2D_v2 基因的全长 cDNA,长度为1905bp，其编码序列是自序列的5'端第57至1463位脱氧核糖核苷酸，编码468个氨基酸。
[0023]实施例2:相应突变后的DENND2D-V2基因的获得方法
[0024]1.突变点的引入
[0025](I)根据相应的突变位点设计相应的诱变引物，采用PCR定点突变法在DENND2D-V2基因上把野生型对应的氨基酸位点进行突变；
[0026](2)上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶进行酶切，与经过相同酶切的质粒pPIC9k片段连接后，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞；
[0027]2.鉴定重组质粒:用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到突变后的核苷酸序列。
[0028]实施例3、DENND2D-V2变体对肺癌细胞系Η1299生长抑制作用
[0029]将实施例2获得的突变后的核苷酸序列回收后直接正向连入pcDNA3.l/V5_HisTOPO TA(Invitrogen, K4800)真核表达载体，经双向测序和酶切鉴定无误，得到正向插入突变后的核苷酸序列的cDNA基因质粒，命名为pcDNA3.l/V5_His TOPO TA_DENND2D_v2，简称pcDB3.l-DENND2D-v2。
[0030]1、细胞凋亡的观察与检测:
[0031](I)阳性对照质粒pcDB3.1-BAX质粒的构建
[0032]pcDB3.1-BAX为凋亡实验的阳性对照，按照下述方法构建:以人正常肺组织cDNA文库(Clontech:K1420-1)为模板，利用Taq酶进行PCR反应扩增BAX的全长cDNA基因(Genbank N0.NM_138761)。琼脂糖电泳回收PCR产物，连接到pGEM-T_easy载体中进行测序，将测序正确的片段用限制性内切酶EcoRI (Promega)从pGEM-T_Bax载体上切下，同时用EcoRI 酶切真核表达载体 pcDNA3.1/mycHis (-) B (Invitrogen, V85520),将酶切后的 Bax 的cDNA基因片段与载体在16°C下连接8小时，转化大肠杆菌DH5a，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选生长的菌落，提取质粒，用EcoRI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，挑选有插入片段的阳性克隆，通过测序(使用ABI PRISM3700DNA分析仪)，选出正确的正向插入Bax 的cDNA基因质粒，命名为pcDB3.1-BAX0 pcDB3.1-BAX不带有c_myc和his标签。
[0033](2)瞬时转染H1299细胞:将H1299细胞以I X 105传入六孔板中，24小时待细胞贴壁生长后，按照Lipofectamine2000说明书提供的操作方法,将pcDNA3.1/mycHis (-)B,pcDB3.1-DENND2D-V2变体，pcDB3.1-BAX质粒分别转染入各孔细胞，所用质粒DNA及转染试剂的量为推荐量的1/2以降低细胞毒性。转染后4小时更换培养基，待转染后36小时收取细胞。按照 Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit (CALBIOCHEM, PF032)说明进行Annexin V FITC和PI双染，流式细胞仪检测。结果如下表所示。
[0034]2、细胞周期的观察与检测:
[0035]PI流式细胞法进行细胞周期检测:将空载体H1299-VeCtor细胞，稳定高表达DENND2D-V2变体的H1299_DENND2D_v2变体单克隆细胞以2 X 105个传入60mm细胞培养皿中，37°C 5 % C02培养至融合率达到80 %左右。消化收取细胞，80 %乙醇(用PBS配制)-20°C固定过夜(大于8小时)。经PI染色后，上机检测。如下表所示，DENND2D-V2变体的外源性高表达能将H1299显著阻滞在G1/S期。
[0036]3、软琼脂集落形成实验:采用空载体H1299-vector细胞，H1299-DENND2D-V2野生型细胞，筛选得到的稳定表达DENND2D-V2变体的H1299-DENND2D_v2变体单克隆细胞株进行实验。实验用六孔板进行，每孔先加入1.5毫升含10%胎牛血清、0.5%琼脂的DMEM培养基，室温冷却后，将建成的稳定转染细胞系，各5000个细胞加到含10%胎牛血清、0.35%琼脂糖的DMEM培养基中，混合后加到上述底层培养基上，培养2-3周，每皿加入0.5ml0.2%P-1odonitrontetraziIium chiloride染色I小时以上；镜下观察照相，计数大于200微米的克隆。每组重复三个孔。裸眼及光镜下观察，三组平行实验集落形成结果数目比较如下表所示。
【权利要求】
1.一种肿瘤抑制蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.一种肿瘤抑制蛋白变体，其特征在于:与SEQ ID NO:1所述的的氨基酸序列相比至少75%同一性，并且与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比在选自下述的至少I个或2个位置包含修饰:53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、433Q/S 或 451L/V。
3.一种人肿瘤抑制蛋白变体，其特征在于，在SEQ ID NO:1所示的氨基酸的基础上，分另Ij 在 53Y/F、60K/C、70P/V、79R/K、92R/K、97I/F、109A/S、131K/R、141A/P、204S/T、225E/A、232L/S、253K/V、270A/R、271A/S、297C/R、305G/S、322V/L、347L/R、379F/S、398Q/R、433Q/S或451L/V进行相应的取代。
4.如权利要求3所述的蛋白变体在制备抑制肿瘤药物中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于:肿瘤为肝癌。
6.一种抗肿瘤 药物制剂，它含有权利要求3所述的蛋白质以及药学上合适的载体。
【文档编号】A61K38/17GK103992399SQ201410214506
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】马恒标 申请人:马恒标