专利名称：冯希普尔－林道肿瘤抑制蛋白对低氧诱导因子－1的条件调节机制的制作方法
背景技术：
冯希普尔-林道(von Hippel-Lindau，VHL)病是由于VHL易感性基因的胚系突变而导致的一类疾病。这些突变引起各种各样肿瘤的发生，包括明细胞肾癌、嗜铬细胞瘤以及中枢神经系统和视网膜的血管瘤等(Maher，E.R.et al.，Medicine，76381-391，1997；Kaelin，W.G.et al.，Trends Genet.，14423-426，1998)。两种VHL等位基因的功能性灭活作用已在许多散发性明细胞肾癌中得以证实(Gnarra，J.R.et al.，Nat.Genet.，785-90，1994)。并且，在裸鼠的异种移植实验中，将野生型而非突变型的VHL cDNA重新导入VHL(-/-)肾癌细胞中，会抑制它们形成肿瘤的能力(Iliopoulos，O.etal.，Nat.Med.，1822-826，1995；Gnarra，J.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，9310589-10594，1996)。VHL相关性肿瘤的典型表现为血管过多和血管原性因子如血管内皮生长因子(VEGF)生成过多(Takahashi，A.et al.，Cancer Res.，544233-4237，1994；Wizigmann-Voos，S.and Plate，K.H.，Histol.Histopathol.，111049-1061，1996)，而且还表现为在VHL缺失细胞的正常氧条件下，低氧诱导mRNA(包括VEGF mRNA)可以基本得以表达(Gnarra，J.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，9310589-10594，1996；Iliopoulos，O.et al.，Nat.Med.，1822-826，1995；Siemeister，G.et al.，Cancer Res.，562299-2301，1996)。将VHL重新导入VHL(-/-)肾癌细胞中，显示它可以通过后转录机制(post-transcriptional mechanism)(Gnarra，J.R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，9310589-10594，1996；Iliopoulos，O.etal.，Nat.Med.，1822-826，1995；Siemeister，G.et al.，CancerRes.，562299-2301，1996)和/或转录机制(Mukhopadhyay，D.etal.，Mol.Cell.Biol.，175629-5639，1997)充当VEGF mRNA的负调节因子(negative regulator)。
VHL蛋白由三个外显子所编码，并且包含213个氨基酸(SEQ IDNO2)(Latif，F.et al.，Science，601317-1320，1993)。编码VHL蛋白的核苷酸如SEQ ID NO1所提供。VHL分子包括一个α域(155到192残基)和一个β域，β域由一个七链β“三明治”(63到154残基)和一个α螺旋(193-204残基)构成。序列相似性的缺乏致使无法获得关于VHL功能的线索。
生物化学研究表明，VHL联合许多细胞蛋白包括延长因子(elongin)B和C(Duan，D.R.et al.，Science，2691402-1406，1995；Kibel，A.et al.，Science，2691444-1446，1995；Takagi，Y.etal.，J.Biol.Chem.，27227444-27449，1997)以及cullin-2(Cul-2)(Pause，A.et al.，Proc.Natl.Acaad.Sci.，942156-2161，1997；Longergan，K.M.et al.，Mol.Cell.Biol.，18732-741，1998)，形成VHL-BC-Cul-2复合体。VHL-BC三元复合体的晶体结构有两个界面一个是在VHL和延长因子C之间，另一个在延长因子B和C之间(Stebbins，C.E.et al.，Science.284455-461，1999)。α域主要与延长因子C相接触。延长因子C与VHL的结合域是肿瘤中的一个突变热点(Gnarra，J.R.et al.，Biochim.Biophys.Acta.，1242201-210，1996)，这表明对于肿瘤抑制因子的功能作用来说VHL-BC-复合体是很关键的。此外，在一分离域——VHL的β域中，也存在一个突变热点(Gnarra，J.R.et al.，Biochim.Biophys.Acta.，1242201210，1996)，此突变热点与假想的高分子结合位相重叠，而这个高分子结合位在VHL的晶体结构中可以鉴别(Stebbins，C.E.et al.，Science，284455-461，1999)。VHL的结合伴侣(延长因子B和C以及Cul-2)跟SCF(Skpl-Cul-1-F-框蛋白(box protein))多蛋白复合体组分相似，这个多蛋白复合体激活细胞循环调节蛋白，并由此引发泛蛋白(ubiquitin)介导的蛋白水解作用(Ciechanover，A.EMBO J.，177151-7160，1998)。更重要的是，VHL-BC复合体的结构将这种相似性扩展到SCF复合体结构(Stebbins，C.E.et al.，Science，284455-461，1999)，这表明VHL-BC-Cul-2和SCF复合体具有相似的功能。与这一模型具有极其一致的是，最近发现在哺乳动物细胞提取物中，VHL与一种E3泛蛋白连接酶的活性相关(Lisztwan，J.et al.，Genes&Dev.，1318221833，1999；Iwai，K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.9612436-12441，1999)。
通过泛蛋白系统的蛋白降解过程包括两个严格的步骤一步是多个泛蛋白分子共价结合到靶蛋白，另一步是泛蛋白标记的底物被26S蛋白酶体所降解(Ciechanover，A.EMBO J.，1771517160，1998)。酶途径的级联作用可以调节泛蛋白连接到它的底物上，尽管这已得以很好的表征(Ciechanover，A.EMBO J.，177151-7160，1998；Hershko，A.Ciechanover，A，Annu.Rev.Biochem.，67425-479，1998)，然而还存在一个核心问题，就是蛋白怎样被选择出来进行降解(Laney，J.D.Hochstrasser，M.，Cell，97427-430，1999)。很明显，这个过程一定具有极高的针对性，因为在细胞中，寿命较短的蛋白需要被鉴别以及从更稳定的蛋白中区别出来。
如上所述，在VHL缺失细胞中，低氧诱导mRNA，包括血管内皮生长因子(VEGF)mRNA，在正常氧的条件下可以进行组成性表达。已知转录因子低氧诱导因子-1(HIF-1)可以调节低氧应答基因，包括编码VEGF、促红细胞生成素、酪氨酸羟化酶、诱导氧化氮合成酶以及糖酵解酶(Semenza，G.L.，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.，15551-578，1999)。因此，HIF-1参与了涉及血管生成、细胞生成、能量新陈代谢、铁新陈代谢、血管舒缩控制、炎症、组织基质新陈代谢以及细胞存活决定因子等基因调节(Semenza，G.L.，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.，15551-578，1999)。HIF-1是一个异源二聚复合体，该复合体含有碱性螺旋-环-螺旋PAS(Per/Arnt/Sim)蛋白、HIF-1α和一种跟芳烃核易位体(translocator)(ARNT)相同的蛋白(Wang，G.L.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，925510-5514，1995)。
HIF-1复合体中的HIF-1α蛋白属于目前已知的、最短寿命的蛋白之一。将细胞置于低氧状态下随后恢复正常氧条件，则HIF-1α的半衰期为数分钟(Wang，et al.，1995)，与其他的受到抑制激活的转录因子如c-Jun(半衰期≈90分钟；(Musti，A.M.et al.，Science，275400-402，1997))或p53(半衰期≈7-8小时(Kubbutat，M.H.et al.，Nature，387229-303，1997；以及其参考文献))相比，显著缩短。在努力表征HIF-1α的功能激活机制的过程中，研究者观察到低氧状态下HIF-1α蛋白水平大幅度上调(Kallio，P.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，9456675672，1997；Huang，L.E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，957987-7992，1998)，这表明，在从正常氧细胞中提取后，HIF-1α是多泛蛋白化的(Huang，L.E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，957987-7992，1998；Kallio，P.J.et al.，J Biol.Chem.，2746519-6525，1999)。然而，HIF-1αmRNA在许多哺乳动物细胞中得以组成性表达，而不受低氧影响(Kallio，P.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，945667-5672，1997)。
HIF-1α包含826个氨基酸残基(SEQ ID NO4)，并且被SEQ IDNO3的核苷酸序列所编码。HIF-1α在其N端包含一个碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)域，随后是两个PAS(Per/Arnt/Sim)域。两个转活化域已经得以鉴别，一个在C端(C-TAD)，而另一个在多肽的中间(N-TAD)(Jiang，B.H.et al.，J.Biol.Chem.，27219253-19260，1997；Pugh，C.W.et al.，J.Biol.Chem.，272，1120511214，1997)。尽管以前报导C-TAD可被转录共活化因子CBP/p300调节而专一性地激活(Arany，Z.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，9312969-12973，1996)，但是最近观察到细胞在处于低氧状态下N-TAD和C-TAD都受CBP/p300所调控(Ema，M.et al.，EMBO J.，181905-1914，1999；Carrero P.et al.，Mol.Cell.Biol.，20402-415，2000)。
较早前的实验研究表明，受蛋白酶途径调节的HIF-1α蛋白水平可被一种具有跨PEST序列模体结构的HIF-1α所调节(Huang，L.E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，957987-7992，1998；Kallio，P.J.et al.，J.Biol.Chem.，2746519-6525，1999)。这种结构被定义为氧依赖性降解(ODD)域(Huang，L.E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，957987-7992，1998)，并且，严格来说，这个区域含有HIF-1α的转活化域——N-TAD(Jiang，B.H.et al.，J.Biol.Chem.，27219253-19260，1997；Pugh，C.W.et al.，J.Biol.Chem.，272，11205-11214，1997)。以上资料说明HIF-1α的C端具有非常复杂的功能构造。在氧依赖性降解域和N-TAD的附近，存在一个低氧诱导核定位信号，这个信号可以协调低氧细胞中HIF-1α的细胞核输入(Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，1765736586，1998)。
HIF-1α的稳定化可以引发多步途径的HIF-1α活化，该途径包括HIF-1α的低氧依赖性核易位、与Arnt发生二聚、与靶促进子的同源低氧响应因子相互作用、随后被转录辅激活蛋白(coactivator)补充(Wenger，R.H.and Gassmann，M.，Biol.Chem.，378609-616，1997；Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998；Ema，M.et al.，EMBOJ.，181905-1914，1999)。最近，两个研究发现在调控HIF-1功能的过程中VHL起到截然相反的作用一方面，在VHL缺失细胞中，HIF-1α反义转录的诱导导致HIF-1α功能的负调节(Thrash-Bingham，C.A.and Tartof，K.D.，J.Natl.Cancer Inst.，91143-151，1999)；另一方面，据最近报道，VHL可以同HIF-1发生物理相互作用(Cockman，M.E.et al.，J Biol Chem，May 22，2000)。现已发现，通过充当泛蛋白连接酶复合体的鉴别组分，pVHL可以调节HIF-1α的蛋白酶解(Cockman，M.E.et al.，J Biol Chem，May 22，2000)。VHL的β域可以形成一个界面，该界面可以直接或间接地同HIF-1α发生相互作用，并且HIF-1α的549-572残基对这个相互作用是必需的(Cockman，M.E.et al.，J BiolChem，May 22，2000)。
发明内容
本发明提供了一种分离的多肽，该多肽包含一个SEQ ID NO4的氨基酸序列及其片段，其中含有可影响多肽稳定性的、改变了的残基。
第一方面，在本发明中，基本纯化的、分离的多肽含有SEQ IDNO4(HIF-1α)氨基酸序列及其片段，其中在564-566残基上含有改变了的PYI模体。
第二方面，在本发明中，基本纯化的、分离的多肽含有SEQ IDNO4(HIF-1α)氨基酸序列，该氨基酸序列具有改变了的P564残基。
第三方面，在本发明中，基本纯化的、分离的多肽含有SEQ IDNO4(HIF-1α)氨基酸序列，该氨基酸序列具有改变了的YI565-566残基。
第四方面，在本发明中，基本纯化的、分离的多肽含有SEQ IDNO.4(HIF-1α)氨基酸序列，该氨基酸序列具有改变了的Y565残基。
第五方面，在本发明中，基本纯化的、分离的多肽含有SEQ IDNO4(HIF-1α)氨基酸序列，该氨基酸序列具有改变了的DDD569-571残基。
第六方面，在本发明中，基本纯化的、分离的多肽含有SEQ IDNO4(HIF-1α)氨基酸序列，该氨基酸序列具有改变了的I566残基。
第七方面，在本发明中，基本纯化的、分离的多肽含有SEQ IDNO4(HIF-1α)氨基酸序列，该氨基酸序列具有改变了的FQL572-574残基。
第八方面，在本发明中，基本纯化的、分离的多肽含有SEQ IDNO4(HIF-1α)氨基酸序列，该氨基酸序列具有改变了的DDD569-571残基。
第九方面，在本发明中，基本纯化的、分离的多肽含有SEQ IDNO4(HIF-1α)氨基酸序列，该氨基酸序列具有改变了的K547残基。
以上九个方面的HIF-1α多肽及其片段较野生型更加稳定，并且以上九个方面的HIF-1α多肽在正常氧条件下，通过VHL调节的降解作用不能使其发生降解。
以上九个方面的多肽及其片段的专一性氨基酸残基的改变，可以通过如定位诱变(site directed mutagenesis)而产生。生成的突变分子可以在正常氧条件下以及存在VHL时，检测其稳定性。
第十方面，如前文所述，本发明提供了一种经过纯化和分离的、核酸编码的多肽或多肽片段。所说的核酸可以是DNA、基因组DNA、cDNA或RNA，并且可以是单链或者双链结构。此核酸可以从细胞或者组织中提取，也可以通过重组或者人工合成获得。由于遗传密码的退化，所以本领域人员对存在如此多的编码序列感到高兴，其中每一个序列可以编码SEQ ID NO4所示的、具有以上所述被专一改变的氨基酸序列及其片段。
第十一方面，本发明提供了数种载体，这些载体包含本发明中的cDNA或核酸分子，以及被本发明中的核酸分子或载体转化或转染的宿主细胞。这些细胞最初可以是真核或者原核细胞；这些细胞尤其适合本发明中多肽的表达，而且这些细胞包括昆虫细胞，如从美国模式培养物保藏所(ATCC SRL-171)获得的Sf9细胞，并被杆状病毒载体转化；还包括人胚胎肾细胞系293-EBNA，并被适当表达的质粒转染。本发明中优选的载体是表达载体，在该载体中本发明的核酸有效地连接到一种或多种合适的启动子和/或其他的控制序列上，使得被载体转化或转染的、合适的宿主细胞能够表达本发明的多肽。其他优选的载体是那些适合哺乳动物细胞转染或者适于基因治疗的载体，例如腺病毒、牛痘或逆转录病毒载体或者脂质体。许多这样的载体是本领域中已知的。
本发明还提供了一种制备载体的方法，该载体可以表达由本发明核酸所编码的多肽。所述的方法包含如上所述的、将核酸有效地连接到一种或多种合适的启动子和/或其他的控制序列上的步骤。
本发明进一步提供了一种制备本发明多肽的方法，该方法包含在宿主细胞中表达本发明核酸或载体、并从宿主细胞或宿主细胞的生长介质中分离出多肽的步骤。
本发明提供了一种筛选系统，该系统可以鉴定影响HIF-1α降解/转活化的药剂(agent)。这个筛选系统包括准备和混合一种充分纯化的多肽制剂，该多肽至少含有一个SEQ ID NO5(最小N-TAD)氨基酸或其更小的片段(SEQ ID NO6(547-575残基；图28))，或者用试验药剂所得的突变体；还包括通过任何可行的方法监测HIF-1α转活化的抑制，藉此HIF-1α转活化的抑制可以鉴别HIF-1α拮抗剂。该筛选系统也可以用来鉴别激活HIF-1α转活化的药剂。
根据在哺乳动物细胞中多肽和VHL蛋白(SEQ ID NO2)的过度表达，在正常氧条件下，该筛选系统能够检测在某些药剂的作用下，SEQ ID NO5或6中结构域转活化势能的变化，或其蛋白稳定性(降解)的变化，所述多肽含有至少一个SEQ ID NO5(最小N-TAD)氨基酸或其更小的片段(SEQ ID NO6(547-575残基；图28))或其所述的突变体。
利用此筛选系统可以提供一种能确定那些可能改变HIF-1α转活化/降解的药剂/化合物的方法。考虑到可以对潜在的治疗药剂进行有效的、大量的筛选，此筛选方法可以适用于大规模的自动化生产过程，例如PANDEX(Baxter-Dade诊断学)系统。
对于此种筛选系统，最小N-TAD序列或547-575残基片段可以如上所描述进行制备，优选使用DNA重组技术。可以将试验药剂，譬如一种化合物或者蛋白，导入到反应管中，此反应管包含最小N-TAD或547-575残基序列。可以通过任何可行的方法来确定试验药剂是否结合到最小蛋白片段上，这些方法包括但并不局限于报道基因系统(reporter gene system)。这种报道基因系统的实例包括荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶(CAT)报道基因，但并不局限于此。
本发明中的多肽可以用于筛选能够影响或调节其活性或功能的分子，这样的分子也许能用于治疗(可能也包括预防)过程。
众所周知，在发现主要成分之前甚至之后，鉴别新药物的药物学研究包括对大量候选物质进行筛选。这是导致药物学研究费用高昂及花费时间较长的因素之一。采用本筛选方法则具有可观的商业价值及效用性。根据本发明中的多肽，我们找到了一种筛选物质的方法，该物质在治疗或抑制癌症方面有潜在的效用。作为多肽的调节子的这些物质代表了当前抗癌研究的进展，因为其为体内应用的治疗方法提供了设计和研究的基础。
筛选可以调节多肽活性的物质的方法包括将一种或多种试验物质与合适反应介质中的多肽接触，测试已处理过的多肽的活性，将该活性与在类似试验介质中但未用试验物质处理过的多肽的活性进行比较。处理过与未处理过的多肽活性的差异表现了相关试验物质的调节效能。
结合文库中的技术，从而可以提供了一种有效的方法，来测试那些具有调节多肽活性能力的潜在的、大量的不同物质；这些文库及其应用是本领域已知的，优选使用肽链文库。
待检物质与多肽相互作用的能力可以在检测调节活性能力之前或同其一并检测出来，例如，酵母双杂交系统(这需要多肽和待测物质的编码核苷酸链都能在酵母中表达)。这可以用来在试验一种物质对多肽的调节活性的实际功效之前进行粗略筛选。或者，可以用来筛选跟PYI模体或P564跨多肽(如547-575残基)及其片段结合的物质，或者用来找到PYI模体或P564跨多肽(如547-575残基)及其片段的类似物，例如进行治疗性实验。
由于能够鉴别可以模仿PYI模体或P564跨多肽(如547-575残基)或其片段的生物活性(例如，与VHL结合)的物质，使得我们能对这些物质进行更深入的研究。另外，它可以用于诸如药剂、药物学成分或药物的制备。这些可以用于个体治疗。
作为多肽功能调节子的物质可以是肽类或非肽类物质。在体内药物应用中，经常优选许多非肽类的“小分子”。因此，可以设计一些模仿的物质(尤其如果是肽类)作为药物应用。
对已知药物活性成分进行仿造设计，是药物开发中众所周知的方法，这种方法以其主要成分为基础。在下列情况时，该方法的选用较为理想当某种活性成分较难获得或成本较高时，或者这种成分不适合某种特定的给药方法时，如肽类的一些活性成分不适合口服，因为其在消化道中很快被蛋白水解酶所降解。通常利用仿造设计、合成和检测，可以避免而获得目标性质而对大量的分子进行随机筛选。
在仿造设计具有给定目标性质的成分时，一般包括几个步骤。首先是要鉴别那些决定目标性质的必需的和/或重要的特定组分。对于肽类物质，可以通过系统地改变肽的氨基酸残基而做到，譬如依次替代每一个残基。在提纯这些肽类模体中广泛采用肽的丙氨酸扫描。构成活性区域的这些部位或残基称为“药效团”(pharmacophore)。
一旦药效团被发现，它的结构就可以被模仿，这主要是根据其物理特性，如立体化学、键接、大小和/或电荷，这些特性源于如下方法，如光谱技术、X线衍射和NMR。在模仿过程中可以利用计算分析、相似性图谱(模仿药效团的电荷和/或体积，而不是原子间的键)以及其他技术。
在该方法的一个改进方案中，建立配体和其结合者的三维结构模型。这一方法在配体跟结合子(binding partner)的结合构型的改变中非常有用，模型的建立可以使得在设计模仿体的时候将这一因素考虑进来。在这种情况下，配体可以是PYI模体或P564跨多肽(如547-575残基)或功能性片段。结合子可以是VHL或其功能性片段，如HIF-1α相互关联域。
然后可以选定一个模板分子，在其上面可以接枝模仿药效团的化学基团。这个模板分子和接枝上的化学基团可以被方便地选定，所以此模仿品可以较为容易地合成，在药理学上被接受的可能性较大，并且在体内不会降解而一直保持其主要成分的生物活性。或者，以肽链为基础的模仿物可以通过环化肽链提高其刚性，来增加其稳定度。通过此方法得到的模仿品可以加以筛选，确定它们是否具有目标特性，或者具有目标特性的程度为多少。然后就可以在体内或临床试验中实行进一步地进行优化或改进，以得到一个或多个最终的模仿品。
因此，在本发明的第九方面提供了一种筛选物质的方法，这些物质模仿PYI模体或P564跨多肽(例如547-575残基)或其片段的活性。该方法包括将试验物质与HIF-1α特定结合子(如VHL或其片段)相接触、然后确定是否试验物质结合到特定结合子上的步骤。
本发明中的多肽在用于治疗时，给药剂量或给药途径要依靠病人的特性和状态，并且要完全听从主治医师的指导。合适的给药途径包括口服、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射或者静脉注射、胃肠外、局部应用、植入等。
本发明中的多肽可以与合适的药物载体联合使用，所得的组合物包括本发明中的多肽或非毒性药用性盐类，以及药用性固态或液态载体或者佐剂。这些载体或佐剂包括盐水、缓冲盐水、林格液(Ringer’ssolution)、矿物油、滑石、玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高龄土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠、褐藻酸、葡萄糖、水、甘油、乙醇、增稠剂、稳定剂、悬浮剂及其混合物，但是并不局限于以上物质。上述组合物可以制成以下形式溶液、悬浮液、片剂、胶囊、乳油、软膏、药酒剂(elixir)、糖浆、膜片(wafer)、油膏或者其他传统形式。至于它们具体以何种形式存在，应以给药方式而定。包含本发明多肽的组合物中含有的活性成分以重量百分比计应介于0.1％到90％之间，而大多数情况下大约为10％到30％。
另一方面，本发明提供了一个调节HIF-1α信号途径的方法，该方法为向细胞、或细胞团块或有机体给予某种物质，例如PYI模体、PYI模体的功能性片段、PYI模体的类似体、P564跨蛋白(spanningprotein)或者P564跨蛋白的类似体。
再一方面，本发明提供了一种治疗疾病的方法，该方法包括向一个细胞、或细胞团块或有机体给予在PYI模体带有突变的全长HIF-1α或其片段、或者PYI模体的类似体或者PYI模体的拮抗剂。
又一方面，本发明通过添加一种物质到体外培养系统中，而对其显示出促进性或稳定性，所述物质选自于组成性激活(constitutivelyactive)的HIF-1α突变体、组成性激活的HIF-1α突变体的功能性片段、PYI模体的激活剂以及P564跨蛋白的激活剂。
又一方面，本发明显示了在细胞、细胞团块或者有机体中的分子调节机制，所述分子如HIF-1α、EPAS或HIF-3α，这种调节机制包括给予细胞、细胞团块或者有机体某种物质，如PYI模体、PYI模体的功能性片段、PYI模体的类似体、P564跨蛋白、P564跨蛋白的功能性片段或者P564跨蛋白的类似体。
又一方面，本发明显示了在细胞、细胞团块或者有机体中的分子调节机制，所述分子如HIF-1α、EPAS或HIF-3α，这种调节机制包括给予细胞、细胞团块或者有机体PYI模体的拮抗剂或者P564跨蛋白的拮抗剂。
又一方面，本发明公开了一种在细胞、细胞团块或者有机体中影响分子降解的方法，所述分子如HIF-1α、EPAS或HIF-3α，这种方法包括给予细胞、细胞团块或者有机体某种物质，如PYI模体、PYI模体的功能性片段、PYI模体的类似体、P564跨蛋白、P564跨蛋白的功能性片段或者P564跨蛋白的类似体。
又一方面，本发明提供了一种促进或调节血管生成、红细胞生成的方法，该方法将HIF-1α突变体给予到细胞、细胞团块或者有机体中，所述突变体具有至少一个选自于K547、P564、Y565、I566、D569、D570以及D571中的残基的改变。
图1正常氧(21％O2)及低氧(1.0％O2)状态下HIF-1α蛋白的增长量的免疫印迹结果。
图2在VHL肿瘤抑制蛋白存在的情况下HIF-1α蛋白的免疫印迹结果。
图3在VHL肿瘤抑制蛋白和蛋白酶体抑制剂MG-132存在的情况下HIF-1α蛋白的免疫印迹结果。
图4在VHL蛋白存在的情况下二噁英受体的免疫印迹结果。
图5GAL4融合野生型和缺失突变或单一氨基酸点突变VHL的图示表达。
图6在野生型VHL或VHL缺失突变的条件下，GAL4抗体(面板上部)或HIF-1α的预免疫血清对照(面板下部)的联合免疫沉淀印迹结果。
图7在野生型VHL或VHL单一氨基酸点突变的条件下，GAL4抗体(面板上部)或HIF-1α的预免疫血清对照(面板下部)的联合免疫沉淀印迹结果。
图8置于野生型或突变形式的VHL中HIF-1α蛋白水平的免疫印迹分析结果。
图9A-B一系列FLAG标记的HIF-1α缺失突变的图示表达。
图10在野生型HIF-1α或HIF-1α缺失突变的条件下，GAL4抗体(面板上部)或HIF-1α的预免疫血清对照(面板下部)的联合免疫沉淀印迹结果。
图11小鼠(m)和人(h)的EPAS-1以及HIF-1α的N-TAD序列的反义中心模体的排列。
图12在野生型(wt)或突变(mt)N-TAD的条件下，VHL的FLAG抗体的联合免疫沉淀印迹结果。
图13置于VHL中野生型(wt)或突变(mt)形式的N-TAD蛋白水平的免疫印迹分析结果。
图14在VHL存在的条件下，泛蛋白化的野生型(wt)或突变(mt)形式的N-TAD蛋白免疫印迹分析结果。
图15在VHL存在的条件下，泛蛋白化的野生型(wt)或单一赖氨酸突变的N-TAD蛋白的免疫印迹分析结果。
图16在正常氧和低氧条件下，VHL的亚细胞定位。
图17正常氧和低氧条件下，GFP-HIF-1α嵌合蛋白的亚细胞定位。
图18正常氧和低氧条件下、有或无VHL的情况下，野生型HIF-1α、HIF-1αK719T、或HIF-1αΔ178-390突变体的免疫印迹分析结果。
图19在正常氧和低氧条件下，野生型HIF-1α免疫印迹沉淀后VHL的免疫印迹分析结果。
图20在存在或无VHL的情况下，正常氧和低氧状态下野生型HIF-1α免疫印迹沉淀后Arnt的免疫印迹分析结果。
图21在正常氧和低氧条件下，野生型(wt)和PYI突变型(mt)N-TAD的免疫印迹分析结果。
图22在正常氧和低氧条件下，野生型(wt)和PYI突变型(mt)N-TAD的转录活性结果。
图23在存在或无VHL的情况下，正常氧和低氧状态下野生型(wt)和PYI突变型(mt)N-TAD的免疫印迹分析结果。
图24野生型(wt)和PYI突变型(mt)N-TAD的转录活性结果。
图25在正常氧和低氧条件下，HIF-1α功能的条件调节的示意图模型。
图26HIF-1家族中的五个成员所共有的保守性氨基酸序列及在NTAD中诱导的点突变。
图2735S-蛋氨酸标记的VHL和FLAG-GAL4-NTAD突变体的免疫印迹沉淀。
图28在正常氧和低氧条件下，293细胞中GAL4-NTAD突变体的荧光素酶活性。
图29野生型(wt)和P564(P-A)突变体的NTAD序列。
图30在正常氧和低氧条件下最小野生型GAL4-NTAD功能的荧光素酶相对活性。
图31P564(P-A)突变体的蛋白片段与野生型(wt)细胞抗降解的低氧依赖性保护作用的比较。
具体实施例方式
实施例1VHL肿瘤抑制蛋白对HIF-1α蛋白稳定性的调节。
在正常氧条件下，HIF-1α蛋白具有明显的不稳定性，故通常此条件下不能通过细胞提取物的免疫印迹分析检测到HIF-1α。因此目前不能就VHL的表达对内源性HIF-1α蛋白水平的作用进行研究。
A.为了建立实验条件从而能够在正常氧情况下检测VHL对HIF-1α蛋白稳定性的影响，在直径6cm的塑料平皿中瞬时转染0.2、0.5或1.0μg FLAG抗原决定簇标记的HIF-1α表达质粒。pFLAG-CMV2/HIF-1α(1-826)表达质粒的构建按照Kallio，P.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，945667-5672，1997文章中所描述的方法。COS7(从ATCC获得)常规保持在含10％胎牛血清及青霉素(50IU/ml)和链霉素(50ug/ml)的Dulbecco’s必需培养基中。这种质粒与两倍体积的FuGene6(Boehringer Mannhein)相混合，并且加入培养基。孵育12小时后，细胞在正常氧(21％O2)或低氧(1.0％O2)状态下处理12小时。为了检测HIF-1α融合蛋白的表达，整个细胞提取物必须按照Kallio，P.J.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，945667-5672，1997.文章中的方法进行准备。
简要的来说，细胞首先在TEN缓冲液(40mM Tris-HCl pH 7.9，10mM EDTA，150mM NaCl)中收集，再用20微升来苏尔缓冲液(150mM NaCl，1％NP40，0.5％deoxycholate，0.1％SDS，0.05M Tris-HCl pH8.0)将细胞团重悬，随后以14,000rpm离心30分钟。提取物的蛋白密度用Bio-Rad蛋白检测试剂来计量。经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及在含5％无脂奶粉的Tris缓冲盐(TBS)溶液中阻断，过夜，然后，将50微克细胞蛋白移到硝化纤维过滤膜上。作为一抗的抗FLAGM2(Kadak)抗体在含0.1％Tween-20(TBS-T)和1％无脂奶粉的TBS中以1∶500稀释，并且与样品共同孵育1小时。经过几次洗涤后，作为二抗的抗小鼠Ig-辣根过氧化物酶结合物(Amersham LifeScience)在含1％无脂奶粉的TBS-T缓冲液中以1∶1000稀释，并且在室温下与样品共同孵育1小时。用TBS-T缓冲液仔细洗涤后，按照生产商的说明书在增强的化学荧光(Amersham Pharmacia Biotech)下就可以见到免疫复合物。
图1为利用在正常氧(21％O2，条带1，3，5)或低氧(1.0％O2，条带2，4，6)状态下HIF-1α蛋白(0.2μg(条带1，2)，0.5μg(条带3，4)，1.0μg(条带5，6))的增长量表示的结果。分子量标记物的迁移率表示在印迹的右边。
在表达载体最低浓度时，正常氧时检测不到HIF-1α，但在低氧条件下却可以检测到(图1，条带1，2)。而在表达载体较高浓度时，正常氧时也可以检测到HIF-1α蛋白的表达(图1，条带3)。在表达载体最高浓度时，不管是在正常氧或者低氧条件下均可以检测到显著的HIF-1α表达水平(图1，条带5，6)。因此这些实验表明在上述条件下正常氧时HIF-1α的降解作用已达到饱和，并且其中的一个或几个成分的降解机制具有限制性。
B.为了确认在VHL肿瘤抑制蛋白存在时HIF-1α蛋白降解作用的效力，将1.0μg pFLAG-CMV2/HIF-1α同2.0μg空载体或野生型VHL表达载体(pCMX/VHL)共转染入COS7细胞。pCMX/VHL质粒通过将一个pCI/VHL野生型(由Dr.Joan W.Conaway，Howa rdHughes Medical Institute，美国提供)的NHeI-EcoRI(这两个位点已被Klenow聚合酶钝化)片段插入到EcoRV-digested pCMX载体中而得以构建。在一个直径6cm的平皿中将质粒混合物同2倍体积的FuGene6(Boehringer Mannhein)相混合，同时加入培养基。孵育12小时后，将细胞在低氧(1％O2)或正常氧(21％O2)条件下处理12小时。整个细胞提取物按以上方法进行准备，并且按以上方法用抗FLAG M2(Kodak)或抗VHL(Pharmingen)抗体为一抗(primaryantibody)进行免疫印迹分析。
如图2所示，将带有FLAG/HIF-1α的细胞同VHL表达质粒共转染致使正常氧条件下HIF-1α蛋白信号显著减少(面板上部，比较条带1和3)，这表明在HIF-1α单独过表达时VHL具有限制性。令人感兴趣的是，在低氧条件下瞬时表达VHL不能诱导HIF-1α蛋白水平降低(比较条带2和4)。在实验对照组，从正常氧细胞或低氧细胞得到的提取物检测到类似的VHL表达水平(面板下部，比较条带3和4)。分子量标记物的迁移率表示在印迹的右边。
C.为了确认VHL是否调节HIF-1的蛋白酶体的降解，除了在共转染细胞收集前，将其在不含或存在5μM蛋白酶体抑制因子MG-132的条件下孵育6小时，以上实验过程进行重复操作。细胞提取物的准备和分析方法如实施例1B。
如图3所示，在正常氧条件下HIF-1α蛋白水平的VHL诱导性减少被经过蛋白酶体抑制因子MG-132处理过的细胞所抑制(比较条带1-3)。经过以上实验，这些结果表明VHL能够调节HIF-1α蛋白酶体的降解。
D.为了确定VHL是否对HIF-1α是特异的，从而设计了一个实验观察VHL的过表达是否影响二噁英受体(DR)蛋白水平。二噁英受体是一个碱性螺旋-环-螺旋/PAS(Per/Arnt/Sim)蛋白，属于转录调节子如HIF的同一家族。1μg FLAG标记的二噁英受体表达载体(pCMV/DR/FLAG)同2.0μg空载体或野生型VHL表达载体(pCMX/VHL)共转染入COS7细胞中。FLAG标记的二噁英受体表达质粒，pCMV/DR/FLAG，由Dr.J.McGuire(Karolinska Institutet，Sweden)提供。共转染，孵育以及分析方法按实施例1B。
如图4所示，瞬时表达的VHL并不能影响FLAG标记的二噁英受体蛋白水平。这表明VHL的作用对HIF-1α是专一性的。
实施例2VHL的两个域在诱导HIF-1蛋白降解中是必需的。
为了确定VHL是否与HIF-1α有物理性的相互作用，将35S标记的，在体外翻译的HIF-1α与野生型或突变型GAL4-VHL融合蛋白，或者免疫沉淀印迹测定前单独的最小GAL4 DNA结合域(DBD)共同孵育。图5提供了GAL4融合野生型(1-213)和有缺失突变或单氨基酸点突变(pmt)形式的VHL的示意图。野生型或突变型VHL和GAL4 DBD融合VHLs组装在一起，这是通过将pCI/VHL野生型或突变型/FLAG(一般由Dr.Joan W.Conaway，Howard HughesMedical Institute，美国提供)的一个NheI-EcoRI(这两个位点已被Klenow聚合酶钝化)片段插入到一个EcoRV消化的pCMX-GAL4中而实现的。
在体外免疫沉淀印迹测定中，包含全长HIF-1的GAL4融合蛋白在兔网织红细胞裂解物(Promega)中的[35S]蛋氨酸存在的情况下被翻译。[35S]蛋氨酸标记的翻译产物通过SDS-PAGE分离，并在[35S]蛋氨酸协助的基础上利用磷光影像扫描分析仪(Fuji)分析计算蛋白浓度。免疫沉淀印迹实验按照Gradin，K.et al.，Mol.Cell.Biol.，165221-5231，1996文章中所描述的方法进行。简要的来说，就是将放射性标记的HIF-1α与等浓度的无标记的GAL4-VHL或VHL突变体在室温下共同孵育1小时。随后细胞经5μM MG-132处理6小时，再在TEN缓冲液中收集。提取物的蛋白浓度利用Bio-Rad蛋白测定试剂进行计量。5微升抗GAL4(Upstate Biotech)或预免疫兔血清加入到蛋白混合物中在室温下再孵育1小时。30微升50％的蛋白G琼脂糖TEG混悬液(20mM TrisHCl(pH7.4)，1mM EDTA，10％glycerol，1mM DTT)，加入到反应混合物中在4℃，旋转状态下孵育12小时。此混悬液包含150mM NaCl和0.1％Triton X-100。快速离心后，得到的琼脂糖沉淀用补充的TEG缓冲液洗涤3次，并且通过SDS-PAGE和随后的放射自显影技术对联合免疫沉淀蛋白进行分析。体外翻译的、35S标记的全长HIF-1α和体外翻译的野生型GAL4/VHL(图6，条带6)或VHL缺失突变体(图6，条带3-5)或GAL4/DBD跨GAL4DNA连接结合域片段等浓度孵育。加入10％35S标记的HIF-1α作负荷对照。图6中抗GAL4抗体的联合免疫沉淀印迹结果显示在面板上部，而对照组预免疫血清的结果显示在下部。
如图6所示，在GAL4/VHL存在的条件下利用GAL4专一性抗体进行35S标记的HIF-1α的共免疫沉淀，在HIF-1α和最小GAL4DNA结合域之间却没有观察到相互作用(面板上部，比较条带2和6)。非专一性预免疫兔血清在VHL或GAL4单独存在的条件下，不能使HIF-1α蛋白沉淀(图6，面板下部)，这表明野生型VHL与HIF-1α在体外专一性的相互作用。
至于缺失突变体，VHLΔ114-154缺失突变体可以与HIF-1α相互作用，而VHL 114-154片段却不能(图6，比较条带3和4)。然而VHL 91-154缺失突变体能够与HIF-1α相互作用(图6，比较条带4和5)。因此，定位于VHL 91到113残基的结构对于VHL与HIF-1α的相互作用看来是至关重要。VHL的这个区域不仅是在VHL-BC复合体的晶体结构中观察到的理论大分子结合域(Stebbins，C.E.etal.，Science，284455-461，1999)，而且还是肿瘤中的一个突变热点(Gnarra，J.R.et al.，Biochim.Biophys.Acta.，1242201-210，1996)。
为了证明VHL突变导致的肿瘤是否能够影响其同HIF-1α相互作用的能力，和/或诱导HIF-1α降解，利用包含Y98N(大部分肿瘤突变发生在此区域)或C162F单氨基酸突变(见图5VHL单氨基酸点突变(pmt)形式的示意图)的GAL4-VHL融合蛋白进行实验。已经证明C162F突变致使VHL不能结合到延长因子B-C复合物(Lonergan，K.M.et al.，Mol.Cell.Biol.，18732-741，1998；Lisztwan，J.et al.，Genes&Dev.，131822-1833，1999)，并且抑制体外泛蛋白连接酶活性(Lisztwan，J.et al.，Genes&Dev.，131822-1833，1999)。在这些联合免疫沉淀印迹实验中，体外翻译的、35S标记的全长HIF-1α和体外翻译的野生型GAL4/VHL(图7，条带3)或VHL Y98N(图7，条带4)、C162F突变体(图7，条带5)或GAL4-DBD(图7，条带2.)等浓度孵育。联合免疫沉淀印迹结果显示在图7面板上部，而对照组预免疫血清的结果显示在下部。这些联合免疫沉淀印迹实验如图6所示进行和分析。
如图7面板上部所示，VHL Y98N不能与HIF-1相互作用，而VHL C162F同野生型的VHL一样能和HIF-1α相互作用(比较条带3-5)。这些结果表明β域点突变来源的肿瘤削弱了HIF-1α同VHL的相互作用。
接下来进行的是细胞降解的测定。如图8所示，在野生型或突变型VHL和GAL4融合蛋白存在或无的条件下，pFLAG CMV2/HIF-1α在COS7细胞中瞬时共表达。这些细胞在正常氧条件下孵育24小时。准备好的细胞提取物用免疫印迹法进行分析。进行免疫印迹实验使用抗FLAG(面板上部)或抗VHL(面板下部)抗体。
如图8所示，免疫印迹分析证明，与野生型VHL相反的是，VHLY98N和VHL C162F突变体均不能在正常氧条件下诱导HIF-1α降解(图8，比较条带2-4)。因此，这些结果证明HIF-1α相互作用区和VHL的延长因子C结合域在调节HIF-1降解中均是必需的，并且HIF-1α的调节也许与VHL的肿瘤抑制功能有关。
实施例3VHL作用于HIF-1α氧依赖性降解域发挥调节作用。
VHL作用于HIF-1α区域从而在正常氧条件下调节蛋白酶体的降解，为了鉴别这一区域，在有或无VHL及正常氧条件下，在COS7细胞中瞬时表达野生型FLAG/HIF-1α或一系列FLAG标记的HIF-1α缺失突变体。图9A提供了此系列FLAG标记的HIF-1α缺失突变体的示意图。在图9A中，bHLH是碱性螺旋-环-螺旋域的首字母缩写词，PAS是Per/Arnt/Sim域的首字母缩写词，ODD是氧依赖性降解域的首字母缩写词，N-TAD是N端转活化域的首字母缩写词，C-TAD是C端转活化域的首字母缩写词。N端转活化域位于531-575氨基酸之间(Jiang，B.H.et al.，J.Biol.Chem.，27219253-19260，1997)，或549-582氨基酸之间(Pugh，C.W.et al.，J.Biol.Chem.，27211205-11214，1997)。
FLAG抗原表位标记的缺失突变体HIF-1α(1-652)通过将pGFP/HIF-1(1-652)的BamHI-SpeI片段(SpeI位点填入Klenow聚合酶)插入到BamHI-SmaI-digested pFLAG-CMV2(Kodak)中而形成。pFLAG-CMV2/HIF-1(1-330)通过插入一个pFLAG-CMV2/HIF-1(1-826)的EcoRI片段到EcoRI消化的pFLAG-CMV2中而构建。pFLAG-CMV2/HIF-1(526-826)通过插入一个pCMX-GAL4/HIF-1(526-826)的SalI-Hind III(Hind III位点填入Klenow聚合酶)片段到SalI-BamH I(BamH I位点填入Klenow聚合酶)中而构成。如实施例1B所描述，整个细胞提取物被准备和应用于免疫印迹分析。
如图9B所示，在正常氧细胞中GAL4/HIF-1α1-625和HIF-1α526-826片段被VHL降解。然而，在正常氧条件下，COS7细胞中VHL的过度表达不能使缺失突变体HIF-1α1-330降解。
为了确定同VHL相互作用所必需的HIF-1α区域，全长HIF-1α或融合到GAL4DNA结合域的HIF-1α缺失突变体被表达，并且在与35S标记的VHL共同孵育后进行联合免疫沉淀印迹试验。在兔网织红细胞裂解物(Promega)中35S-蛋氨酸存在的条件下35S标记的VHL被翻译。35S标记的翻译产物通过SDS-PAGE分离，并在35S-蛋氨酸协助的基础上利用磷光影像扫描分析仪(Fuji)分析计算蛋白浓度。体外翻译的、35S标记的全长HIF-1α和体外翻译的GAL4融合蛋白跨HIF-1α缺失突变体(图10，条带2-7)或GAL-DBD(图10，条带8)等浓度孵育。加入10％35S标记的HIF-1α作负荷对照。沉淀物质通过SDS-PAGE和放射自显影技术进行分析。图10中抗GAL4抗体的联合免疫沉淀印迹结果显示在面板上部，而对照组非专一性兔抗血清的结果显示在下部。
如图10所示，GAL4/HIF-1α1-330在体外不能与35S标记的VHL发生物理性相互作用(面板上部，条带2)。而且，GAL4/HIF-1α778-826跨越HIF-1αC端转活化域并不与VHL发生任何相互作用(面板上部，条带7)。与之相反，GAL4/HIF-1α1-652，GAL4/HIF-1α331-641，GAL4/HIF-1α526-641以及GAL4/HIF-1α526-826片段与VHL发生明显的相互作用(面板上部，条带3-6)。实际上，与全长HIF-1α相比较，所有这些HIF-1α后部的片段以相似的效力与VHL相互作用。在对照组沉淀反应中，在GAL4/HIF-1α片段或GAL4单独存在的条件下非专一性预免疫兔抗血清不能使VHL蛋白沉淀(面板下部)。
综合这些结果说明HIF-1α跨526-641残基的区域对与VHL的物理性相互作用是必需的。令人感兴趣的是，这个区域包含HIF-1α的氧/氧化还原作用依赖性降解域，这个降解域先前已经证明可以在正常氧细胞中调节HIF-1α蛋白酶体降解，并且广泛定义为被定位于hHIF-1α401到603氨基酸残基之间(Huang，L.E.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，957987-7992，1998；Kallio，P.J.et al.，J.Biol.Chem.，2746519-6525，1999)。
实施例4HIF-1α的最小N端转活化域是泛蛋白化作用和VHL介导的蛋白降解作用的作用位点。
VHL相互作用片段GAL4/HIF-1α526-641不仅包含HIF-1α氧依赖性降解域的核心结构，并且包含N端反义激活域N-TAD(见图9A)。在HIF-1α的N-TAD中，一个大约含有19个氨基酸残基的序列模体(此模体位于人类HIF-1α556-574氨基酸之间)具有最强烈的物种间保守性，同时，在相关的低氧诱导因子EPAS-1/HLF中也非常保守。这个相关的低氧诱导因子EPAS-1/HLF具有组织专一性表达(Ema，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，944273-4278，1997；Tian，H.etal.，Genes&Dev.，1172-82，1997)。这部分模体的序列在果蝇样低氧反应蛋白中高度保守(Taylor，B.L.et al.，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，63479-506，1999)。近期报道，根据在这个区域中被丙氨酸替代后会破坏低氧依赖性蛋白的稳定性和使之在正常氧环境中稳定，这部分模体序列对于HIF-1α的低氧依赖性降解域有重要的功能(Srinivas，V.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，260557-561，1999)。图11是该模体在人N-TAD和小鼠HIF-1α、EPAS-1的保守性比对图。
为了证明VHL是否可以与HIF-1α的N-TAD的核心保守模体直接相互作用，该法利用了体外转移35S-标记的VHL蛋白和FLAG-标记的野生型或突变型N-TAD片断的技术。
pFLAG/HIF-1/N-TAD(HIF-1α的532-585氨基酸)由将PCR产生的EcoRI-BamHI片断插入EcoRI-BamHI消化的pFLAG-CMV2组成。另外，突变的N-TAD是含有N-TAD的PYI三合体被三个天冬氨酸代替造成的。PFLAG/HIF-1/N-TAD的氨基酸替换使用了QuickChang的定位诱变试剂盒(Stratagene)，氨基酸替换位置见图11。35S-标记的VHL蛋白与等浓度的FLAG-标记的野生型(图12，条带3)或突变型(图12，条带4)N-TAD片断或FLAG抗原决定簇(图12，条带2)一起孵育。联合免疫沉淀法利用抗-FLAG抗体作用，产生的沉淀利用SDS-PAGE或放射自显影技术分析。加入10％的35S-标记的VHL以作负荷对照(图12，条带1)。
正如图12所示，在有最小FLAG抗原决定簇标记的HIF-1α野生型N-TAD存在的条件下，FLAG抗体可以使35S-标记的VHL产生沉淀(条带3)。这证明了HIF-1α的这个区域是与VHL充分介导作用的区域。而PYI三合体被天冬氨酸替代就破坏了VHL和N-TAD的相互作用(比较条带3和4)。这个实验证明了N-TAD的高度保守的核心模体是和VHL严格作用的。
由于这部分序列非常重要，所以564-566位的氨基酸的任何改变都会使之不能与N-TAD蛋白作用。并由此产生耐N-TAD介导的降解作用和随之而来的低氧依赖性蛋白的转活化功能。
关于PYI三合体及其邻近的残基的更仔细的突变分析证明，YI564-565变为GG，或DDD569-571变为AAA，可以使VHL和N-TAD的相互作用完全丧失，RM567-568突变可使VHL和N-TAD的相互作用部分丧失(图27)。
Y565的替代可阻断与VHL的作用。Y565被G的替代可产生耐N-TAD介导的降解作用，而要是被F代替就不会产生这种效应。F565不会改变降解盒的特性，反而它维持了与VHL的相互作用，介导在正常氧环境下的降解作用和低氧依赖性转活化作用。因此，Y565的改变会改变突变残基的亲水性，而亲水性或者核心氨基酸的改变会破坏与VHL的结合，而Y565的亲水性不发生改变，这种效应就不会发生。
在I566的氨基酸的替代也会阻断与VHL的结合。例如，I566被G替代会使蛋白在VHL介导的降解作用中维持稳定。YI565-566也会发生氨基酸的替代。例如，YI565-566被GG替代，从而阻断与VHL的作用，使蛋白质在VHL介导的降解作用中维持稳定，失去低氧依赖性转活化作用。与Y565的氨基酸替代一样，YI565-566的氨基酸也会产生这种效应。
DDD569-571的氨基酸的替代也会阻断与VHL的作用。估计DDD569-571的所有氨基酸的替代都会产生这种效应。FQL572-574被AQA替代也会阻断与VHL的作用，这种替代会使蛋白在VHL介导的降解作用中维持稳定，使蛋白组分有转活化功能，或者不再有低氧依赖性。FQL572-574的其他替代也会有这种效应。
另外，免疫印迹法可以用于证明在没有VHL或者增加VHL浓度的条件下，对N-TAD发生的影响。在分别没有VHL(-)和有VHL(+，1.0μg；++2.0μg、6-cm平皿)介导的条件下，每6-cm平皿1μg FLAG(图13，条带1)或者FLAG标记的野生型(图13，条带2-4)或突变型N-TAD(图13，条带5-7)在COS7细胞中瞬时共表达。细胞在正常氧环境下孵育24小时。整个细胞提取物准备按实施例1，用免疫印迹法进行分析。印迹通过抗-VHL(图13，面板下部)或抗-FLAG抗体(图13，面板上部)显色。
如图13所示，野生型N-TAD的降解呈VHL剂量依赖性(比较条带2-4)，而突变型的N-TAD的稳定性却没有这种特性(比较条带5-7)。
利用FLAG标记的野生型或突变型N-TAD的体内实验可以用来探明HIF-1α的VHL介导降解作用的机理。在分别没有VHL(图14，条带2，4，6)和有VHL(图14，条带1，3，5)介导的条件下，在正常氧环境中，并有蛋白酶小体抑制剂MG132存在的前提下孵育6小时，FLAG抗原决定簇(图14，条带1)和FLAG标记的野生型(图14，条带2-3)或突变型(图14，条带4-5)N-TAD一起，加上HA标记的泛蛋白可以在COS7细胞中瞬时共表达。在对全细胞提取物进行免疫沉淀后，抗HA免疫印迹法可以检测到泛蛋白化TAD的存在。
如图14所示，在VHL共表达的前提下，野生型N-TAD的泛蛋白化能大大的加强(面板上部，比较条带2和3)。而即使有VHL存在，突变型N-TAD的泛蛋白化却不明显(面板上部，条带5-7)。10％的细胞提取物显示在面板下方。这些结果充分证明，VHL介导的HIF-1α泛蛋白化过程是与最小的N-TAD模体的作用相关的。
从最小的N-TAD模体泛蛋白化可以证明，三赖氨酸的N-TAD是VHL调控的目标区域。FLAG标记的野生型或单赖氨酸突变型(K532R，K538R，K547R)N-TAD分别在293细胞中瞬时表达。细胞在正常氧或者低氧的环境中孵育12小时，全细胞提取物准备成1A的样品并利用免疫印迹法分析。与全长HIF-1α相似，最小的野生型GAL4/N-TAD融合蛋白在正常氧环境中呈明显的降解效应，在低氧环境中却很稳定。很奇怪，K547的突变能使之在正常氧环境中稳定，而其他两个赖氨酸的突变蛋白却很难在正常氧环境中发现(图15)。结果表明，K547在HIF-1α的降解中十分重要。
实施例5在正常氧和低氧环境中的VHL的亚细胞定位先前已有人证明低氧导致HIF-1α的核转位(Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998)。对于VHL，核-胞质的交通是VHL的功能所需要的(Lee，et al.，1999)。VHL在COS7细胞的表达可用来研究在正常氧和低氧条件下，VHL的与功能相关的细胞内定位。注入FLAG-VHL表达质粒(FLAG/VHL)的COS7细胞在盖玻片上生长并孵育24小时。然后在正常氧(21％O2)或低氧(1％O2)环境下孵育6小时，再在室温下4％(w/v)多聚甲醛中固定30分钟，接着在4℃条件下，在0.1％Triton X-100和PBS溶液中，与抗VAL单克隆抗体共孵育9小时。在0.1％Triton X-100和PBS溶液中，生物素标记的抗小鼠IgG抗体与FITC标记的链亲合素(Amersham)可产生间接荧光。根据数量，150-200个荧光细胞用于进行组分分析并被分为四类。这种方法参照Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998文章中所述。
如图16所示，在正常氧环境中，由于胞质的成分，抗VHL的免疫荧光在整个细胞都可见。在低氧的环境中也是如此。在正常氧环境中的VHL的免疫荧光的亚细胞定位半定量分析(此方法是根据Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998文章所述)，47％细胞的胞质和胞核荧光分布量相等(N＝C)，45％细胞的胞质荧光分布量大于胞核(N＜C)，只有3％细胞的胞核荧光量大于胞质(N＞C)，没有细胞呈只有胞核荧光分布样(N)。在低氧环境中，细胞N＝C、N＜C、N＞C的比例分别为47％、51％、6％，VHL的细胞内分布并没太大改变。与正常氧环境一样，低氧环境中也不见VHL限核分布的细胞存在。因此，与核HIF-1α的低氧介导核输出活性相反(Kallio，P.J.et al.，EMBOJ.，176573-6586，1998)，低氧并不改变VHL的亚细胞定位。
实施例6保护HIF-1α不受VHL依赖性蛋白酶小体降解是一个多步骤的过程，包括了HIF-1α的低氧介导性转位和低氧介导性活化信号接着，野生型的HIF-1α的亚细胞定位与突变型的HIF-1α，包括HIF-1αK719T和HIF-1αΔ178-390突变的亚细胞定位比较。HIF-1αK719T突变在低氧环境不能进入胞核，只能存在于胞质(Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998)。HIF-1αΔ178-390突变缺少PAS功能域，只能存在域胞核中(Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998)。
由绿色荧光蛋白与野生型全长HIF-1α融合的表达质粒，是由从pGEX-4T3-HIF1α剪切的HIF-1α编码区作为BamHI-NotI片断(NotI位点填入Klenow聚合酶)，插入BamHI-NheI消化的pCMX-SAH-Y145F中而构成(Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998)。pCMX-SAH-Y145F表达载体在CMV介导的早期促进子的控制下，表达一种被修饰的、由高度发色基团的GFP，和Y145F突变会增加GFP在胞内的稳定性一样，S45A突变会导致发光波形的改变和蛋白质的温度抵抗效应。GFP-HIF1(K719T)是通过重叠PCR介导的定位突变技术构建而成的，这个C端核定位信号定位诱变产物如Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in Molecular.Biology，J.Wiley and Sons，NY，1994文章所述。PCR产物含有设计突变(密码子719AAG变为ACA)，并作为EcoRI-PstI亚片断，插入pGFP-HIF1α(526-586)中。一个融合了含有K179T突变的全长HIF-1α的GFP，是通过将HIF-1α的BamHI-SpeI的N-端片断插入pGFP-HIF1α(526-586，K719T)(Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998)而成的。质粒在COS7细胞中瞬时表达。分别注入GFP-融合表达质粒的COS7细胞在盖玻片上孵育24小时。之后，细胞在正常氧(21％O2)或低氧(1％O2)环境下孵育6小时，再观察。检测荧光活性的亚细胞分布，并用由FITC过滤装置的Zeiss Axiovert135进行拍照，和用产生外荧光的Gixenon燃烧器(Carl Zeiss JenaGmbH，Jena，Germany)照射。
正如预期的一样，HIF-1αΔ178-390突变在正常氧和低氧环境都表现为限核存在；而HIF-1αK719T在低氧环境中不能进入胞核，只存在于胞质中(图17)。
在图18中，将VHL稳定野生型HIF-1α全长蛋白和HIF-1αK719T突变型的作用相比较。将pGFP/HIF1αK719T的BamHI-NehI片断(NehI位点填入Klenow聚合酶)插入BamHI-NheI消化的pFLAG-CMV2构成pFLAG-CMV2/HIF-1αK719T。经过24小时的表达之后，细胞在正常氧(21％O2，图18，条带1-2)或低氧(1％O2，图18，条带3-4)环境下孵育12小时，再观察。全细胞提取物准备按实施例1A和按实施例1B进行免疫印迹分析。
在正常氧的环境中，过量表达的VHL能使野生型HIF-1α和HIF-1αK719T突变型发生降解(图18，条带2)。野生型HIF-1α在低氧环境中有明显的(虽然不是完全的)抗VHL的效应(图2；图18，条带4)，而HIF-1αK719T突变型在低氧环境中仍会被VHL有效降解(图18，条带4)。这三个结果表明，低氧介导的HIF-1α核转位有效保护HIF-1α不被VHL介导的蛋白酶小体降解。
我们检查VHL在影响HIF-1αΔ178-390突变型稳定性方面的效应，以证明核转位是否有效保护HIF-1α不被VHL介导的蛋白酶小体降解。pFLAG-CMV2/HIF-1α(Δ178-390)是由pCMX-GAL4//HIF-1α(Δ178-390)的SalI片断插入SalI消化的pFLAG-CMV2中构成的。经过24小时的表达之后，细胞在正常氧(21％O2，图18，条带1-2)或低氧(1％O2，图18，条带3-4)环境下孵育12小时，再观察。全细胞提取物准备按实施例1A和按实施例1B进行免疫印迹分析。
如图18所示，在正常氧环境中，HIF-1αΔ178-390突变型在VHL中能被降解(比较带1和2)。所以核转位假说并不能解释HIF-1α的抗VHL降解机制。然而，这种突变型在低氧细胞中有明显的抗VHL降解效应(比较条带2和4)。这些结果表明，除了核转位外，HIF-1α的抗VHL降解机制还需要其他特异的核内的因素或信号来完成。根据HIF-1α的N-TAD内的某些结构惊人的重叠，我们假设核内的稳定信号与蛋白质的转活化功能相关，这些结构与介导氧依赖性降解、同VHL物理性相互作用和低氧诱导的转活化效应相关。
实施例7在低氧细胞中，HIF-1α并不释放VHL既然HIF-1α核转移和低氧介导的活性信号都是HIF-1α的抗VHL降解机制所必需的，我们必须证明在低氧环境中，VHL是否从HIF-1α中释放。为此，我们让含有GAL4DBD(4μg)(图19，条带1)或GAL4/HIF-1α(4μg)(图19，条带2-6)的COS7细胞，在没有VHL存在(图19，条带2)和VHL存在(图19，条带1，3-6)的条件下，在直径10cm的塑料平皿中孵育。经过12小时的孵育后，细胞分别在正常氧(图19，条带1-3)或低氧(图19，条带4-6)环境中孵育1、3或6个小时。在把细胞放入TEN缓冲液之前，细胞要在5μM的MG-132蛋白酶抑制剂(Cabiochem)中孵育6小时。细胞团再悬浮在200升的全细胞提取缓冲液中(25mM Hepes，100mMNaCl，5mM EDTA，20mMβ-甘油磷酸盐，20mM聚硝基苯磷酸盐，0.5％Triton X-100，100M正钒酸钠)，并加入20μM N-乙基顺丁烯二酰亚胺，然后以14000rpm的速度离心30分钟。提取物的蛋白质浓度利用Bio-Rad蛋白分析法试剂检测。联合免疫沉淀的蛋白质在免疫印迹后，用SDS-PAGE法进行分析。再利用抗GAL抗体(图19，面板上部)或对照的抗血清抗体(图19，面板中部)对全细胞提取液进行联合免疫沉淀后，用VHL抗体的免疫印迹法检测VHL。加入10％的全细胞提取液以作对照(图19，面板下部)。
正如所预期的，VHL在正常氧条件下，与GAL4/HIF-1α联合免疫沉淀(图19，条带1-3)。然而，VHL在低氧条件下也有联合免疫沉淀，沉淀水平与正常氧环境的相当(图19，条带4-6)。这些结果表明，HIF-1α-VHL复合体的解离在HIF-1α的抗VHL降解机制中并不是必需的，而是存在一种机制，在VHL和HIF-1α相连时能够在低氧环境中灭活VHL的功能。
接着，我们需要证明Arnt是否与-VHL复合体相关联。在低氧或正常氧环境中，无论VHL和/或Arnt存在与否，GAL4/HIF-1α或最小的GAL4 DNA结合域均可在COS7细胞中表达。正如所预期的，在低氧条件下，在没有VHL存在的条件下，Arnt和GAL4/HIF-1α联合免疫沉淀(图20)。另外，在有VHL存在的条件下，在低氧环境中，Arnt和GAL4/HIF-1α也会联合免疫沉淀(图20)，由此证明这些蛋白质可以在低氧细胞中形成三联体。
实施例8蛋白质的稳定在HIF-1αN-TAD功能区的低氧依赖性转活化功能的调节中的作用在低氧细胞中由HIF-1α控制的活性是由N-TAD和C-TAD两个专一性转活化功能区介导的(Arany，Z.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，9312969-12973，1996；Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998；Ema，M.et al.，EMBO J.，181905-1914，1999；Carrero，P.et al.，Mol.Cell.Biol.，20402-415，2000)。根据VHL与最小的N-TAD结构相互作用，在正常氧和低氧环境中，我们将含有野生型或PYI突变N-TAD模体的GAL4融合蛋白(图11)的稳定性和转活化功能进行比较。
在正常氧(图21，条带1，3)或低氧(图21，条带2，4)的环境中，含有4微克FLAG标记的野生或PYI突变型N-TAD的COS7细胞在直径10cm的塑料平皿中孵育12小时。全细胞提取物准备按实施例1A和按实施例1B进行免疫印迹分析。
与全长的HIF-1α相似，最小的野生型GAL4/N-TAD融合蛋白在正常氧环境明显降解，在低氧环境却很稳定(图21，条带1-2)。用免疫印迹法可以检测从正常氧细胞提取的GAL4/N-TAD蛋白，在低氧细胞检测到的蛋白水平并没有明显增加(图21，条带3-4)。
最小的N-TAD片断组成的残基547-575功能与N-TAD结构域相似它在正常氧环境中会降解而在低氧环境中稳定(图30)。相反，P564的点突变会抑制抗正常氧依赖性降解机制，并使细胞在低氧环境中也不再稳定(图31)。因此，这些突变型蛋白与VHL错误作用，通过联合免疫沉淀法评估(图12；图27)，相关组分蛋白的表达量与野生型GAL4/N-TAD在低氧环境中的表达量相仿。
野生或PYI突变型GAL4/N-TAD的转录活性可以用共转染法在COS7细胞中分析，该法需要在胸腺嘧啶激酶控制下的荧光素报道基因，最小的启动子和五排GAL4反应元件拷贝(GAL4-luc)(0.5μg/30-mm平皿)和β-半乳糖苷酶表达质粒(0.05μg/30-mm平皿)作为对照。经过6小时转染后，细胞在正常氧(21％O2)或低氧(1％O2)环境下孵育36小时，然后进行报道基因的活性分析。报道基因活性表达与正常氧环境中GAL4-DNA连接结构域的活性相关。数值来源于三个独立实验的均值±SD。正如图22和图30所示，利用GAL4驱动的荧光素报道基因的报道基因转活化，比低氧环境下野生型GAL4/N-TAD的要强(约3倍)。这些结果正如Carrero，P.et al.，Mol.Cell.Biol.，20402-415，2000的发现所预期的。
在全长HIF-1α存在的前提下，突变的PYI模体能使蛋白质在正常氧环境中稳定，不被VHL依赖性降解(图23)。这证明这个模体决定了HIF-1α的VHL依赖性降解。虽然与野生型的HIF-1α相比，突变蛋白表现出较强的组分转录活性，但它依然是低氧依赖性的(图24)。在N-TAD结构域中，无论是低氧或者正常氧环境，突变的PYI模体均使蛋白转活化功能下降(图22)。这些结果表明，突变可能改变对转活化功能十分重要的结构，可能损伤了与全活性反应相关的蛋白质联系。因此，这些突变结构在低氧条件下，转活化功能大概增强两倍(图22)。这些数据表明，能抗VHL介导的降解作用的稳定蛋白依然有能力介导低氧依赖性的活性反应。这些蛋白质本身很稳定，并不是低氧引起的转活化旁路所必需的。
和上面描述的广泛的PYI-AAA突变型蛋白不同，含有P564A点突变的GAL4-N-TAD融合蛋白转活化功能明显加强。实际上，它是和野生型结构中最大的低氧介导的功能相比较的(图30)。P564A突变结构在低氧处理后，功能并没增强，这证明正是这个点突变使组分活性增强(图30)。与YI565-566突变相似，DDD-AAA不仅阻断了与VHL的相互作用(图27)，而且产生有活性的GAL4-N-TAD融合蛋白突变体结构，这在报道基因法评估中，在293细胞有上述表现(图28)。
除了P564A突变体的活性外，在P564位上的任何氨基酸的替代都会产生相同的效应。例如，P564H也会阻断与VHL的作用，使蛋白在VHL介导的降解作用中保持稳定，并使蛋白组分产生转活化功能，也就是说，蛋白质不再低氧依赖性了。
特异的突变破坏了降解盒的功能，这对现在的发明有很大帮助。另外，从正常降解盒的融合体到HIF-1α以外其他蛋白的的直接蛋白质的降解，可以推而广之到全细胞的蛋白质。
实施例9在正常氧或者低氧环境中，HIF-1α功能的条件调节模型这里的数据表明，在正常氧条件下，VHL可以引发泛蛋白-蛋白酶小体降解HIF-1α，使之生成VHL-BC-Cul-2复合体。这两种蛋白的作用是由VHL和HIF-1α的最小N-TAD介导的。低氧条件下，通过核转位，HIF-1α的降解受到抑制，还会产生与生成伴侣DNA连接因子、Arnt、转录共活性子和/或氧化还原调节子相关的调节信号。
图25的VHL的阴影区域显示，VHL在肿瘤中的突变热点分别与VHL的β结构域和延长因子C结合域(CBD)相对应。这两个区域的突变使HIF-1α稳定性加强。
点突变实验证明，HIF-1α的N-TAD的核心PYI模体高度保守，特别是P564和Y565，在与VHL的相互作用和VHL降解的蛋白小体降解作用中尤为重要。实际上它证明了HIF-1α的N-TAD结构的泛蛋白化是由VHL介导的，这过程需要保守的核心PYI模体参与。根据在HIF-1α和相关的组织专一性低氧介导因子EPAS-1/HLF中这个核心模体的保守性(Ema，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，944273-4278，1997；Tian，H.et al.，Genes&Dev.，1172-82，1997)，我们可以推测这两个因子都受VHL介导的泛蛋白化所调节。EPAS-1/HLF最近发现也含有与N-TAD相似的氧依赖性降解域(Ema，M.et al.，EMBOJ.，181905-1914，1999)并能在体外和VHL反应(Maxwell，P.H.et al.，Nature，399271-275，1999)正支持了我们的推测。
另外，赖氨酸残基K547点突变也证明是很重要的。这个赖氨酸残基域与维持HIF-1α蛋白的稳定性相关。
如图25所图示，低氧介导的抗VAL调节的保护机制包括两个特异的相连续的步骤HIF-1α的核转位和保护HIF-1α抗VHL介导的蛋白降解的核内因素与信号。这个模型的根据是我们发现即使在低氧细胞中，在VHL介导的降解过程中，突变的HIF-1α不能进入核内。另外，在正常氧细胞中的降解过程中，有一种核内定位的HIF-1α，但在VHL存在下，它表现为低氧介导的稳定性。这些数据表明，除了HIF-1α需要低氧信号来抗降解外，胞核的间隔化并不能充分的保护HIF-1α不受VHL的作用。根据介导与VHL物理性相互作用，产生氧依赖性降解的结构和低氧介导的转活化结构高度重叠，我们假设核内稳定信号可能与蛋白质的转活化功能相关。
有实验证明，N-TAD和C-TAD的低氧介导功能都必须依赖于转录共活性因子CBP/p300和SRC-1/p160的生成(Arany，Z.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，931296912973，1996；Kallio，P.J.et al.，EMBO J.，176573-6586，1998；Ema，M.et al.，EMBO J.，181905-1914，1999；Carrero，P.et al.，Mol.Cell.Biol.，20402-415，2000)。氧化还原调节子Ref-1又能促进这个过程的进行(Ema，M.et al.，EMBO J.，181905-1914，1999；Carrero，P.et al.，Mol.Cell.Biol.，20402-415，2000)。因此，N-TAD的包绕重叠结构，也就是N-TAD的功能性结构域应该具有两种不同的功能。实际上，这些功能是相互拮抗的，例如蛋白的降解和基因转录的激活。这就使在HIF-1α的功能调节上产生了一个重要的“开关”。就如图25列出的模型，低氧依赖性核内保护机制可能会包括Arnt的二聚化，共活性因子的激活和/或Ref-1的激活这几部分。现在的数据明确指出，蛋白质稳定性的本质并不是为HIF-1α的转录活性提供单独的基础。即使点突变的N-TAD能抵抗VAL，十分稳定，它依然需要低氧来介导转活化功能。HIF-1α的C端的共价修饰可能在这个调节效应中起重要作用。与类固醇受体系统(Xu，L.et al.，Curr.Opin.Genet.Dev.，9140-147，1999)相似，低氧信号也可以使HIF-1α的结构发生改变，由此激活共活性因子和灭活VHL的功能，这点很能引起人们的兴趣。
前面的描述和实施例只是用来阐述本发明，而不是对本发明的限制。对于本领域的熟练人员而言，完全可以在本发明的精髓和本质的基础上对所公开的具体实施方式
进行改进，所以，本发明应被广义地定义为其包括权利要求及其等同物范围内的所有改进。
序列表序列表<110>罗伦斯·波林格特雷莎·彼雷拉乔治·洛斯<120>冯希普尔-林道肿瘤抑制蛋白对低氧诱导因子-1的条件调节机制<130>3743/49008PC<150>US 60/223,480<151>2000-08-07<160>7<170>PatentIn 3.0版<210>1<211>642<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(639)<400>1atg ccc cgg agg gcg gag aac tgg gac gag gcc gag gta ggc gcg gag48Met Pro Arg Arg Ala Glu Asn Trp Asp Glu Ala Glu Val Gly Ala Glu1 5 10 15gag gca ggc gtc gaa gag tac ggc cct gaa gaa gac ggc ggg gag gag96Glu Ala Gly Val Glu Glu Tyr Gly Pro Glu Glu Asp Gly Gly Glu Glu20 25 30tcg ggc gcc gag gag tcc ggc ccg gaa gag tcc ggc ccg gag gaa ctg 144Ser Gly Ala Glu Glu Ser Gly Pro Glu Glu Ser Gly Pro Glu Glu Leu35 40 45ggc gcc gag gag gag atg gag gcc ggg cgg ccg cgg ccc gtg ctg cgc 192Gly Ala Glu Glu Glu Met Glu Ala Gly Arg Pro Arg Pro Val Leu Arg50 55 60
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Gly Ala Glu Glu Glu Met Glu Ala Gly Arg Pro Arg Pro Val Leu Arg50 55 60Ser Val Asn Ser Arg Glu Pro Ser Gln Val Ile Phe Cys Asn Arg Ser65 70 75 80Pro Arg Val Val Leu Pro Val Trp Leu Asn Phe Asp Gly Glu Pro Gln85 90 95Pro Tyr Pro Thr Leu Pro Pro Gly Thr Gly Arg Arg Ile His Ser Tyr100 105 110Arg Gly His Leu Trp Leu Phe Arg Asp Ala Gly Thr His Asp Gly Leu115 120 125Leu Val Asn Gln Thr Glu Leu Phe Val Pro Ser Leu Asn Val Asp Gly130 135 140Gln Pro Ile Phe Ala Asn IIe Thr Leu Pro Val Tyr Thr Leu Lys Glu145 150 155 160Arg Cys Leu Gln Val Val Arg Ser Leu Val Lys Pro Glu Asn Tyr Arg165 170 175Arg Leu Asp Ile Val Arg Ser Leu Tyr Glu Asp Leu Glu Asp His Pro180 185 190Asn Val Gln Lys Asp Leu Glu Arg Leu Thr Gln Glu Arg Ile Ala His195 200 205Gln Arg Met Gly Asp210<210>3<211>2481<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)..(2478)
<400>3atg gag ggc gcc ggc ggc gcg aac gac aag aaa aag ata agt tct gaa48Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys Lys Ile Ser Ser Glu1 5 10 15cgt cga aaa gaa aag tct cga gat gca gcc aga tct cgg cga agt aaa96Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys20 25 30gaa tct gaa gtt ttt tat gag ctt gct cat cag ttg cca ctt cca cat 144Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His35 40 45aat gtg agt tcg cat ctt gat aag gcc tct gtg atg agg ctt acc atc 192Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile50 55 60agc tat ttg cgt gtg agg aaa ctt ctg gat gct ggt gat ttg gat att 240Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile65 70 75 80gaa gat gac atg aaa gca cag atg aat tgc ttt tat ttg aaa gcc ttg 288Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu85 90 95gat ggt ttt gtt atg gtt ctc aca gat gat ggt gac atg att tac att 336Asp Gly Phe Val Met Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile100 105 110tct gat aat gtg aac aaa tac atg gga tta act cag ttt gaa cta act 384Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr115 120 125gga cac agt gtg ttt gat ttt act cat cca tgt gac cat gag gaa atg 432Gly His Ser Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met130 135 140aga gaa atg ctt aca cac aga aat ggc ctt gtg aaa aag ggt aaa gaa 480Arg Glu Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu145 150 155 160caa aac aca cag cga agc ttt ttt ctc aga atg aag tgt acc cta act 528Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr165 170 175agc cga gga aga act atg aac ata aag tct gca aca tgg aag gta ttg 576Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu180 185 190cac tgc aca ggc cac att cac gta tat gat acc aac agt aac caa cct 624His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn Gln Pro195 200 205cag tgt ggg tat aag aaa cca cct atg acc tgc ttg gtg ctg att tgt 672Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys210 215 220gaa ccc att oct cac cca tca aat att gaa att cct tta gat agc aag 720Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys225 230 235 240act ttc ctc agt cga cac agc ctg gat atg aaa ttt tct tat tgt gat 768Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp
245 250 255gaa aga att acc gaa ttg atg gga tat gag cca gaa gaa ctt tta ggc 816Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Leu Gly260 265 270cgc tca att tat gaa tat tat cat gct ttg gac tct gat cat ctg acc 864Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr275 280 285aaa act cat cat gat atg ttt act aaa gga caa gtc acc aca gga cag 912Lys Thr His His Asp Met Phe Thr Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln290 295 300tac agg atg ctt gcc aaa aga ggt gga tat gtc tgg gtt gaa act caa 960Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln305 310 315 320gca act gtc ata tat aac acc aag aat tct caa cca cag tgc att gta 1008Ala Thr Val Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val325 330 335tgt gtg aat tac gtt gtg agt ggt att att cag cac gac ttg att ttc 1056Cys Val Asn Tyr Val Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe340 345 350tcc ctt caa caa aca gaa tgt gtc ctt aaa ccg gtt gaa tct tca gat 1104Ser Leu Gln Gln Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp355 360 365atg aaa atg act cag cta ttc acc aaa gtt gaa tca gaa gat aca agt 1152Met Lys Met Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser370 375 380agc ctc ttt gac aaa ctt aag aag gaa cct gat gct tta act ttg ctg 1200Ser Leu Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu385 390 395 400gcc cca gcc gct gga gac aca atc ata tct tta gat ttt ggc agc aac 1248Ala Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn405 410 415gac aca gaa act gat gac cag caa ctt gag gaa gta cca tta tat aat 1296Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr Asn420 425 430gat gta atg ctc ccc tca ccc aac gaa aaa tta cag aat ata aat ttg 1344Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile Asn Leu435 440 445gca atg tct cca tta ccc acc gct gaa acg cca aag cca ctt cga agt 1392Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Ser450 455 460agt gct gac cct gca ctc aat caa gaa gtt gca tta aaa tta gaa cca 1440Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu Lys Leu Glu Pro465 470 475 480aat cca gag tca ctg gaa ctt tct ttt acc atg ccc cag att cag gat 1488Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met Pro Gln Ile Gln Asp485 490 495cag aca cct agt cct tcc gat gga agc act aga caa agt tca cct gag 1536
Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr Arg Gln Ser Ser Pro Glu500 505 510cct aat agt ccc agt gaa tat tgt ttt tat gtg gat agt gat atg gtc1584Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr Val Asp Ser Asp Met Val515 520 525aat gaa ttc aag ttg gaa ttg gta gaa aaa ctt ttt gct gaa gac aca1632Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr530 535 540gaa gca aag aac cca ttt tct act cag gac aca gat tta gac ttg gag1680Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu545 550 555 560atg tta gct ccc tat atc cca atg gat gat gac ttc cag tta cgt tcc1728Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser565 570 575ttc gat cag ttg tca cca tta gaa agc agt tcc gca agc cct gaa agc1776Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser580 585 590gca agt cct caa agc aca gtt aca gta ttc cag cag act caa ata caa1824Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln595 600 605gaa cct act gct aat gcc acc act acc act gcc acc act gat gaa tta1872Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu610 615 620aaa aca gtg aca aaa gac cgt atg gaa gac att aaa ata ttg att gca1920Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala625 630 635 640tct cca tct cct acc cac ata cat aaa gaa act act agt gcc aca tca1968Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser645 650 655tca cca tat aga gat act caa agt cgg aca gcc tca cca aac aga gca2016Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala660 665 670gga aaa gga gtc ata gaa cag aca gaa aaa tct cat cca aga agc cct2064Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro675 680 685aac gtg tta tct gtc gct ttg agt caa aga act aca gtt cct gag gaa2112Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu690 695 700gaa cta aat cca aag ata cta gct ttg cag aat gct cag aga aag cga2160Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg705 710 715 720aaa atg gaa cat gat ggt tca ctt ttt caa gca gta gga att gga aca2208Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr725 730 735tta tta cag cag cca gac gat cat gca gct act aca tca ctt tct tgg2256Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp740 745 750
aaa cgt gta aaa gga tgc aaa tct agt gaa cag aat gga atg gag caa2304Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln755 760 765aag aca att att tta ata ccc tct gat tta gca tgt aga ctg ctg ggg2352Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly770 775 780caa tca atg gat gaa agt gga tta cca cag ctg acc agt tat gat tgt2400Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys785 790 795 800gaa gtt aat gct cct ata caa ggc agc aga aac cta ctg cag ggt gaa2448Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu805 810 815gaa tta ctc aga gct ttg gat caa gtt aac tga2481Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn820 825<210>4<211>826<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>4Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys Lys Ile Ser Ser Glu1 5 10 15Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys20 25 30Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His35 40 45Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile50 55 60Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile65 70 75 80Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu85 90 95Asp Gly Phe Val Met Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile100 105 110Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr115 120 125
Gly His Ser Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met130 135 140Arg Glu Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu145 150 155 160Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr165 170 175Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu180 185 190His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn Gln Pro195 200 205Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys210 215 220Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys225 230 235 240Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp245 250 255Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Leu Gly260 265 270Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr275 280 285Lys Thr His His Asp Met Phe Thr Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln290 295 300Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln305 310 315 320Ala Thr Val Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val325 330 335Cys Val Asn Tyr Val Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe340 345 350Ser Leu Gln Gln Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp355 360 365Met Lys Met Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser370 375 380
Ser Leu Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu385 390 395 400Ala Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn405 410 415Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr Asn420 425 430Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile Asn Leu435 440 445Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Ser450 455 460Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu Lys Leu Glu Pro465 470 475 480Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met Pro Gln Ile Gln Asp485 490 495Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr Arg Gln Ser Ser Pro Glu500 505 510Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr Val Asp Ser Asp Met Val515 520 525Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr530 535 540Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu545 550 555 560Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser565 570 575Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser580 585 590Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln595 600 605Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu610 615 620Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala625 630 635 640
Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser645 650 655Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala660 665 670Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro675 680 685Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu690 695 700Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg705 710 715 720Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr725 730 735Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp740 745 750Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln755 760 765Lys Thr Ile Ile Lau Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly770 775 780Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys785 790 795 800Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu805 810 815Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn820 825<210>5<211>54<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>5Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys1 5 10 15
Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala20 25 30Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln35 40 45Leu Ser Pro Leu Glu Ser50<210>6<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述含HindIII和Bst98I限制部位的寡核苷酸<400>6agcttttttc tcagaatgaa gtgtacccta actagcatat ggactagtc 49<210>7<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述含HindIII和Bst98I限制部位的寡核苷酸<400>7ttaagactag tccatatgct agttagggta cacttcattc tgagaaaaa 49
权利要求
1.一种分离的多肽，其包含在564-566残基上PYI模体发生改变的、SEQ ID NO4所示氨基酸及其片段。
2.如权利要求1中所述的分离的多肽，其中，564-566残基被DDD所替代。
3.如权利要求1中所述的分离的多肽，其中，564-566残基被AAA所替代。
4.一种分离的多肽，其包含P564残基发生改变的、SEQ ID NO4所示氨基酸及其片段。
5.如权利要求4中所述的分离的多肽，其中，564残基被A所替代。
6.如权利要求4中所述的分离的多肽，其中，564残基被H所替代。
7.一种分离的多肽，其包含YI656-566残基发生改变的、SEQ IDNO4所示氨基酸及其片段。
8.一种分离的多肽，其包含PM567-568残基发生改变的、SEQID NO4所示氨基酸及其片段。
9.一种分离的多肽，其包含DDD569-571残基发生改变的、SEQID NO4所示氨基酸及其片段。
10.一种分离的多肽，其包含K547残基发生改变的、SEQ ID NO4所示氨基酸及其片段。
11.如权利要求10中所述的分离的多肽，其中，547位置的氨基酸被R所替代。
12.一种分离的多肽，其包含Y565残基发生改变的、SEQ ID NO4所示氨基酸及其片段。
13.如权利要求12中所述的分离的多肽，其中，565位置的氨基酸被G所替代。
14.一种分离的多肽，其包含I566残基发生改变的、SEQ ID NO4所示氨基酸及其片段。
15.如权利要求14中所述的分离的多肽，其中，566位置的氨基酸被G所替代。
16.一种分离的多肽，其包含FQL572-574残基发生改变的、SEQID NO4所示氨基酸及其片段。
17.如权利要求16中所述的分离的多肽，其中，572-574位置的氨基酸被AQA所替代。
18.一种分离的核酸分子，其包含能对权利要求1-17中任一所述的多肽进行编码的多核苷酸序列。
19.一种载体，其包含权利要求18中所述的核酸分子，该核酸分子与至少一个启动子结合。
20.一种被权利要求19中所述的载体转化或转染的宿主细胞。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1-17中任一所述的分离的多肽和至少一种药物载体或佐剂。
22.如权利要求19中所述的载体，其中，所述的载体是质粒。
23.如权利要求19中所述的载体，其中，所述的载体是病毒载体。
24.如权利要求19中所述的载体，其中，所述的载体是逆转录病毒载体。
25.如权利要求25中所述的宿主细胞，其中，所述的宿主细胞是原核细胞。
26.如权利要求25中所述的宿主细胞，其中，所述的宿主细胞细菌细胞。
27.如权利要求25中所述的宿主细胞，其中，所述的宿主细胞真核细胞。
28.如权利要求25中所述的宿主细胞，其中，所述的宿主细胞哺乳动物细胞。
29.一种制备蛋白质或其功能性片段的方法，包括将权利要求18中所述的核酸导入宿主细胞或细胞提取物中；将上述宿主细胞或细胞提取物在能使上述核酸进行转录的条件下孵育，所述转录能够表达为含有上述蛋白的翻译产物；分离上述翻译产物。
30.如权利要求29中所述的方法生产的分离的蛋白或其功能性片段。
31.一种制备分离的降解框蛋白的方法，包括用一种包含SEQ ID NO2所示核酸的表达载体感染、转化或转导宿主细胞；培养上述所说的宿主细胞；从所述的宿主细胞中移除上述分离的蛋白。
32.一种由权利要求31中所述方法制备的分离的蛋白或其功能性片段。
33.一种筛选调节N-TAD功能的药剂的方法，包括将含有下列物质的混合物进行孵育如权利要求29中所述的分离的蛋白；靶蛋白；以及候选药剂；在上述药剂存在的条件下，上述蛋白专一性地转活化报道基因，或介导VHL依赖性降解，或者以参考亲和力与VHL发生物理相互作用；检测上述分离的蛋白与上述靶蛋白的结合亲和力，以确定药剂的偏性亲和力；上述参考亲和力和药剂偏性亲和力之间的差别，用于表征上述药剂调节上述分离蛋白对上述靶蛋白的功能激活作用。
34.如权利要求33中所述的方法，其中，所述的靶蛋白为VHL或其功能性片段。
35.如权利要求33中所述的方法，其中，所述的孵育是在正常氧条件下进行的。
36.如权利要求33中所述的方法，其中，所述的孵育是在低氧条件下进行的。
37.一种评价潜在的PYI模体或P564跨蛋白或其功能片段的类似体与VHL-HIF-1α相互作用的调节效力的方法，该方法包括确定在细胞、细胞团块或有机体中天然VHL-HIF-1α的相互作用；将上述潜在的类似体加入到等同的试验细胞、细胞团块或有机体中；检测上述试验细胞、细胞团块或有机体中VHL-HIFα相互作用的水平；当检测的VHL-HIFα相互作用的试验水平等同于或高于VHL-HIFα相互作用的天然水平时，确定上述潜在的类似体是有效的。
38.如权利要求37中所述的方法，其中所述的试验细胞、细胞团块或有机体是在正常氧条件下。
39.如权利要求37中所述的方法，其中，所述的试验细胞、细胞团块或有机体是在低氧条件下。
40.一种评价PYI模体或P564跨蛋白或其功能性片段的拮抗剂对VHL-HIFα相互作用的抑制效力的方法，包括确定在细胞、细胞团块或有机体中VHL-HIF-1α的相互作用的正常水平；将上述拮抗剂加入到等同的试验细胞、细胞团块或有机体中；检测上述试验细胞、细胞团块或有机体中VHL-HIF-1α相互作用的水平；当检测的VHL-HIF-1α相互作用的试验水平低于VHL-HIF-1α相互作用的正常水平时，确定上述拮抗剂是有效的。
41.如权利要求40中所述的方法，其中，所述的试验细胞、细胞团块或有机体是在正常氧条件下。
42.如权利要求40中所述的方法，其中，所述的试验细胞、细胞团块或有机体是在低氧条件下。
43.一种调节生物体的HIF-1α信号路径的方法，所述生物体选自细胞、细胞团块和有生命力的有机体，所述方法包括在上述细胞、细胞团块或有生命力的有机体中，给予一种选自于PYI模体、PYI模体的功能性片段、PYI模体的类似体、P564跨蛋白、P564跨蛋白的功能性片段以及P564跨蛋白的类似体的物质。
44.一种调节生物体的HIF-1α信号路径的方法，所述生物体选自细胞、细胞团块和有生命力的有机体，所述方法包括在上述细胞、细胞团块或有生命力的有机体中，给予PYI模体的拮抗剂或P564跨蛋白拮抗剂。
45.一种治疗疾病的方法，包括给予细胞、细胞团块或有机体以全长HIF-1α或其类似体，所述全长HIF-1α或其类似体含有至少一个突变的或修饰的PYI模体。
46.如权利要求45中所述的方法，其中，所述的疾病为局部缺血性疾病。
47.如权利要求46中所述的方法，其中，所述的缺血性疾病是脑梗塞、心肌梗塞和循环障碍。
48.一种疾病治疗的方法，所述疾病包括癌症、高血压、脱髓鞘疾病、弥漫增生性肾小球肾炎、弓形体性视网膜脉络膜炎、HIV引起的Tat血管生成、HIV引起的Kaposi’s肉瘤、肝炎引起的炎症、肝炎引起的血管生成、慢性溃疡、增生性视网膜病、视网膜血管母细胞瘤、肿瘤血管生成、动脉血管过多、肉状瘤病、大疱性皮肤病、伴有血管生成的脉管炎、伴有血管生成的皮肌炎、伴有血管生成的多肌炎、类风湿性关节炎、幼年型骨软骨病、多关节炎、颈内动脉-后交通动脉动脉瘤和动脉粥样硬化；该方法包括给予PYI模体或P564跨蛋白或其功能性片段的拮抗剂到细胞、细胞团块或有机体中。
49.一种疾病治疗的方法，该方法包括给予PYI模体或P564跨蛋白或其功能性片段的激活剂到细胞、细胞团块或有机体中。
50.如权利要求49中所述的方法，其中，所述的疾病包括局部缺血、脑梗塞、心肌梗塞和循环障碍。
51.一种促进体外培养条件的方法，该方法包括在培养基中添加选自于如下的物质组成性激活的HIF-1α突变体、组成性激活的HIF-1α突变体的功能性片段、PYI模体的激活剂、P564跨蛋白的激活剂。
52.如权利要求51中所述的方法，其中，所述的培养基是用于维持和生长神经干细胞。
53.一种药物组合物，该组合物包含选自于PYI模体、PYI模体的功能性片段、PYI模体的类似体、P564跨蛋白和P564跨蛋白的功能性片段以及P564跨蛋白的类似体，并包含至少一种药物载体或佐剂。
54.一种药物组合物，该组合物包含PYI模体的拮抗剂或P564跨蛋白的拮抗剂，并且包含至少有一种药物载体或佐剂。
55.一种调节细胞、细胞团块或有机体中分子功能的方法，所述分子包括HIF-1α、EPAS和HIF-3α，该方法包括给予上述细胞、细胞团块或有机体选自如下的物质PYI模体、PYI模体的功能性片段、PYI模体的类似体、P564跨蛋白、P564跨蛋白的功能性片段和P564跨蛋白的类似体。
56.一种调节细胞、细胞团块或有机体中分子功能的方法，所述分子包括HIF-1α、EPAS和HIF-3α，该方法包括将PYI模体的拮抗剂或P564跨蛋白的拮抗剂加入到上述细胞、细胞团块或有机体中。
57.一种影响细胞、细胞团块或有机体中分子降解的方法，这些分子包括HIF-1α、EPAS和HIF-3α，该方法包括给予上述细胞、细胞团块或有机体选自于如下的物质PYI模体、PYI模体的功能性片段、PYI模体的类似体、P564跨蛋白、P564跨蛋白的功能性片段和P564跨蛋白的类似体。
58.一种提高血管生成的方法，该方法包括将具有至少一个改变残基的HIF-1α突变体加入到细胞、细胞团块或有机体中，所述残基包括K547、P564、Y565、I566、D569、D570和D571。
59.一种调节血管生成的方法，该方法包括将具有至少一个改变残基的HIF-1α突变体加入到细胞、细胞团块或有机体中，所述残基包括K547、P564、Y565、I566、D569、D570和D571。
60.一种提高红细胞生成的方法，该方法包括将具有至少一个改变残基的HIF-1α突变体加入到细胞、细胞团块或有机体中，所述残基包括K547、P564、Y565、I566、D569、D570和D571。
61.一种调节红细胞生成的方法，该方法包括将具有至少一个改变残基的HIF-1α突变体加入到细胞、细胞团块或有机体中，所述残基包括K547、P564、Y565、I566、D569、D570和D571。
62.一种控制蛋白的氧依赖性降解的方法，该方法包括在细胞蛋白中并入SEQ ID NO5序列。
63.如权利要求62中所述的方法，其中，所述的蛋白质为GAL-4。
64.一种用于检测编码氧独立性降解的HIF-1α突变体的HIF-1α序列的方法，该方法包括对532-585残基中任何一个发生改变的样本序列进行评估。
65.如权利要求64中所述的方法，其中，所述的改变发生在如下残基上K547、P564、Y565、I566、P567、M568、D569、D570、D571、F572、Q573和L574。
66.如权利要求64中所述的方法，其中，所述的评估受寡核苷酸探针、PCR诊断和抗体的影响。
全文摘要
HIF－1α的转活化域(N－TAD)的改变表明该结构域含有一个重要结构，此结构对低氧诱导转活化、氧依赖性降解和VHL－HIF－1α相互作用是必需的。含有N－TAD域改变的HIF－1α序列、其片段及其类似体在修饰或调节生物体活性中十分有用。HIF－1α的N－TAD域的激活剂和拮抗剂在修饰或调节生物体活性中也非常有用。
文档编号C12N5/06GK1835969SQ01817003
公开日2006年9月20日 申请日期2001年8月7日 优先权日2000年8月7日
发明者罗伦斯·波林格, 特雷莎·彼雷拉, 乔治·洛斯 申请人:血管基因瑞典有限公司