是离子质量，并且δ m是质谱中的两个峰之间的质量差异。例如，具有分辨率1000的质谱仪可以分辨具有m/z 100.0的离子与具有m/z 100.1的离子。
[0063]几类质谱仪是可获得的，并且可以产生具有各种构型。一般而言，质谱仪具有下述主要部件:样品入口、离子源、质量分析仪、检测器、真空系统和器械控制系统以及数据系统。样品入口、离子源和质量分析仪中的差异一般限定器械类型及其能力。例如，入口可以是毛细管柱液相层析源，或可以是例如质量辅助激光解吸中使用的直接探针或台(stage)。常见离子源是例如电喷射，包括纳米喷雾和微喷雾或基质辅助激光解吸。示例性质量分析仪包括四极滤质器、离子阱质量分析仪和飞行时间质量分析仪。
[0064]离子形成过程是用于质谱分析的起点。几种电离法是可获得的，并且电离法的选择取决于待分析的样品。例如，对于多肽分析，相对温和的电离操作例如电喷射电离(ESI)可以是希望的。对于ESI，使含有样品的溶液以高电位经过细针，高电位产生强电场，导致导向质谱仪的高度荷电的小滴的细微喷雾。其他电离操作包括例如快原子轰击(FAB)，其使用中性原子的高能束来打击固相样品，促使解吸和电离。基质辅助激光解吸电离(MALDI)是其中激光脉冲用于打击样品的方法，所述样品已在UV吸收化合物基质中结晶化。本领域已知的其他电离操作包括例如等离子体辉光放电、等离子体解吸电离、共振电离、和次级电离。MDF可以在从加上标签的探针中切割之前、期间或之后变得电离。
[0065]电喷射电离(ESI)具有用于本文描述的本发明的几种特性。例如，ESI可以用于难以电离或蒸发的生物分子，例如多肽。另外，ESI的效率可以是极高的，其提供了用于高灵敏度测量的基础。此外，ESI产生来自溶液的荷电分子，其对于分析溶液中的MDF是方便的。相比之下，电离操作例如MALDI要求在电离前的样品结晶。
[0066]因为ESI可以直接由溶液产生荷电分子，所以它与来自液相层析系统的样品相容。例如，质谱仪可以具有关于液相层析系统例如HPLC的入口，使得级分从层析柱流动到质谱仪内。液相层析系统和质谱仪的这种在线排列有时被称为LC-MS。在质谱法分析前，LC-MS系统可以用于例如使未切割或部分切割的MDF与切割的MDF分离。另外，在质谱法分析前，层析可以用于去除来自MDF样品的盐或其他缓冲液组分。例如，使用在线或离线反相HPLC柱使样品脱盐可以用于增加电离过程效率，且因此改善通过质谱法的检测灵敏度。
[0067]各种质量分析仪是可获得的，其可以与不同离子源配对。不同的质量分析仪具有不同的优点，如本领域技术人员已知的和如本文描述的。选择用于检测的质谱仪和方法取决于特定测定，例如当生成少量离子用于检测时，可以使用更灵敏的质量分析仪。几类质量分析仪和质谱法在下文描述。
[0068]离子迀移率(頂)质谱法是气相分离方法，其对质谱法(MS)添加新量纲。IM基于其碰撞截面分离气相离子，并且可以与飞行时间(TOF)质谱法偶联，以获得用于鉴定且表征蛋白质和肽的有力工具。因此，当MDF是蛋白质或肽时，IM-MS具有用于本发明的特定效用。IM-MS 通过 Verbeck 等人在 Journal of B1molecular Techniques (第 13 卷，Issue2，56-61)中更详细地讨论。
[0069]四极质谱法利用四极滤质器或分析仪。这类质量分析仪包含排列为两套两个电连接杆的四个杆。当离子从滤质器开始移动到末端时，将rf和dc电压的组合施加于每对杆，其产生促使离子的振荡运动的场。这些场的结果是在一对杆中产生高通滤质器，并且在另一对杆中产生低通滤器。高通和低通滤器之间的重叠留下限定m/z，其可以经过两个滤器且穿越四极的长度。该m/z被选择且在四极滤质器中保持稳定，而其他m/z具有不稳定轨迹并且不保留在滤质器中。质谱通过慢加速外加场而产生，使得选择渐增的m/z经过滤质器且到达检测器。另外，通过仅施加rf场，四极还可以设置为含有且传递所有m/z的离子。这允许四极充当质谱仪区域中的透镜或聚焦系统，在所述区域中需要离子传递而无需质量过滤。这可用于串联质谱法中，如下文进一步描述的。
[0070]四极质量分析仪，以及本文描述的其他质量分析仪，可以按程序工作，以分析限定的m/z或质量范围。质谱仪的这种特性可用于本文描述的本发明。因为切割的MDF的质量范围在测定前将是已知的，所以质谱仪可以按程序工作，以传递投射的正确质量范围的离子，同时排除更高或更低质量范围的离子。选择质量范围的能力可以减少测定中的本底噪声，并且因此增加信噪比。另外，限定的质量范围可以用于排除任何未切割的寡核苷酸探针的分析，其具有比MDF的质量更高的质量。因此，质谱仪可以完成固有的分离步骤以及MDF的检测和鉴定。
[0071]量子阱质谱法利用量子阱质量分析仪。在这些质量分析仪中，这样施加场，使得所有m/z的离子最初均在质量分析仪中被诱陷且振荡。离子从离子源通过聚焦装置例如八极透镜系统进入离子阱。在激发和通过电极射出到检测器前，离子诱陷在诱陷区中发生。质量分析通过序贯施加电压来完成，所述电压增加振荡幅度，其方式将m/z渐增的离子射出陷阱且进入检测器内。与四极质谱仪形成对比，所有离子均保留在质量分析仪的场内，除了所选m/z的那些之外。离子阱的一个优点是它们具有极高灵敏度，只要仔细限制一次诱陷的离子数目。离子数目的控制可以通过改变离子经过其注射到陷阱内的时间来完成。离子阱的质量分辨率类似于四极滤质器的那种，尽管离子阱的确具有低m/z局限性。
[0072]飞行时间质谱法利用飞行时间质量分析仪。对于这种m/z分析方法，离子首先通过在电场(通过高压生成)中加速给予固定量的动能。在加速后，离子进入无场或“漂移”区，在其中它以与其m/z成反比的速度行进。因此，具有低m/z的离子比具有高m/z的离子更快速行进。测量离子经过无场区域长度所需的时间且用于计算离子的m/z。
[0073]这类质量分析中的一个考虑是将待研究的离子集合同时引入分析仪内。例如，这类质量分析非常适合于电离技术如MALDI，其以短的充分确定的脉冲产生离子。另一个考虑是控制通过在其动能量中具有变动的离子产生的速度分布。使用更长的飞行管、离子反射器或更高的加速电压可以帮助使速度分布的效应降到最低。飞行时间质量分析仪具有高水平的灵敏度和比四极或离子阱质量分析仪更宽的m/z范围。另外，使用这类质量分析仪可以快速获得数据，因为不需要质量分析仪的扫描。
[0074]气相层析质谱法提供用于实时检测靶的良好解决方案。系统的气相层析(GC)部分将化学混合物分离成分析物(例如MDF)的脉冲，并且质谱仪(MS)鉴定且定量分析物。
[0075]串联质谱法可以利用上文描述的质量分析仪的组合。串联质谱仪可以使用根据其m/z分离离子的第一质量分析仪，以便分离目的离子用于进一步分析。经分离的目的离子随后破碎成碎片离子(称为碰撞活化解离或碰撞诱导解离)，并且碎片离子通过第二质量分析仪进行分析。这些类型的串联质谱仪系统称为空间串联系统，因为两个质量分析仪通常通过碰撞室在空间中分离。串联质谱仪系统还包括其中使用一种质量分析仪的时间串联系统，然而，质量分析仪序贯使用以分离离子，诱导破碎且随后执行质量分析。
[0076]空间串联类别中的质谱仪具有超过一个质量分析仪。例如，串联四极质谱仪系统可以具有第一四极滤质器，随后为碰撞室，随后为第二四极滤质器且随后为检测器。另一种排列是使用四极滤质器用于第一质量分析仪，以及飞行时间质量分析仪用于第二质量分析仪，其中碰撞室使两个质量分析仪分离。其他串联系统是本领域已知的，包括反射式飞行时间、串联扇形和扇形-四极质谱法。
[0077]时间串联类别中的质谱仪具有在不同时间执行不同功能的一个质量分析仪。例如，离子阱质谱仪可以用于诱陷所有m/z的离子。应用一系列rf扫描功能，其射出来自陷阱的所有m/z，除了目的离子的m/z之外。在目的m/z已被分离后，施加rf脉冲以对陷阱中的气体分子产生碰撞，以诱导离子的破碎。随后通过质量分析仪测量碎片离子的m/z值。离子回旋加速器共振器械，也称为傅立叶变换质谱仪，是时间串联系统的例子。
[0078]几类串联质谱法实验可以通过控制在实验的每个阶段中选择的离子来执行。不同类型的实验利用质量分析仪的不同操作模式，有时称为“扫描”。在称为质谱扫描的第一个例子中，第一质量分析仪和碰撞室将用于质量分析的所有离子传递到第二质量分析仪内。在称为产物离子扫描的第二个例子中，目的离子在第一质量分析仪中进行质量选择，并且随后在碰撞室内破碎。所形成的离子随后通过扫描第二质量分析仪进行质量分析。在称为前体离子扫描的第三个例子中，扫描第一质量分析仪，以将质量分析的离子序贯传递到碰撞室内用于破碎。第二质量分析仪质量选择目的产物离子用于传递给检测器。因此，检测器信号是所有前体离子的结果，其可以破碎成共同的产物离子。其他实验形式包括中性丢失扫描，其中在质量扫描中指出恒定质量差异。与多路实验一样，当报道标签的大集合在单次实验中进行测量时，这些不同的串联质谱法扫描操作的使用可以是有利的。
[0079]在典型应用中，通过反应期间生成的MDF量基于循环阈(Ct)值进行测定，所述Ct值代表生成可检测量的核酸所需的循环数目。Ct值的测定是本领域众所周知的。简言之，在PCR期间，随着形成的扩增子的量增加，信号强度增加至可测量水平，并且在反应进入非对数期时的以后循环中到达平台。通过针对反应对数期过程中的循环数目标绘信号强度，可以推断在其下获得可测量信号的特异性循环，且用于计算在PCR起始前的靶数量。测定Ct的示例性方法在例如Heid等人Genome Methods 6:986-94，1996中描述，参考探针水解。
实施例
[0080]笔施例I
核酸外切酶抗性修饰的评估
为了评估可以用于实践本发明的方法的不同核酸外切酶抗性修饰，合成下述寡核苷酸=T9JTTTGC (SEQ ID NO: 1)，其中T9代表5’翼部分，并且J代表修饰。在一个特定实验中使用的修饰包括硫代磷酸酯、2’ -氨基-尿苷、2’ -氟尿苷、2’ -O-甲基尿苷、丙烷二醇间隔物和HEG (全名)间隔物。将I μΜ每种寡核苷酸悬浮于I X核酸外切酶I缓冲液(NewEngland B1labs)和2单位的核酸外切酶I (New England B1labs)中，并且在37°C下温