且更优选血浆。如本文使用的，术语“血液”涵盖全血或任何血液级分，例如如常规定义的血清和血浆。血液血浆指起因于用抗凝剂处理的血液离心的全血级分。血液血清指血样已凝固后剩下的流体的水样部分。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、水和工业样品，以及得自食物和乳制品加工器械、仪器、设备、器皿、一次性使用和非一次性使用项目的样品。这些例子不应解释为限制可应用于本发明的样品类型。
[0016]如本文使用的，术语“靶”或“靶核酸”意指待检测或测量其存在，或者待研究其功能、相互作用或特性的任何分子。因此，靶包括对于其存在可检测探针(例如寡核苷酸探针)或测定，或可以通过本领域技术人员产生的基本上任何分子。例如，靶可以是生物分子，例如核酸分子、多肽、脂质或碳水化合物，其能够与可检测探针(例如抗体)结合或以其他方式接触，其中可检测探针还包含能够通过本发明的方法检测的核酸。如本文使用的，“可检测探针”指能够与目的靶生物分子杂交或对目的靶生物分子退火，且允许如本文描述的特异性检测靶生物分子的任何分子或试剂。在本发明的一个方面，靶是核酸，并且可检测探针是寡核苷酸。术语“核酸”和“核酸分子”在公开内容自始至终可以互换使用。该术语指寡核苷酸、寡核苷酸(ο I i go )、多核苷酸、脱氧核糖核苷酸(DNA )、基因组DNA、线粒体DNA (mtDNA )、互补 DNA (cDNA)、细菌 DNA、病毒 DNA、病毒 RNA、RNA、信使 RNA (mRNA)、转移 RNA (tRNA)、核糖体RNA (rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、扩增核酸、扩增子、PCR产物及其他类型的扩增核酸、RNA / DNA杂交体和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些均可为单链或双链形式，并且除非另有限制，否则将包含天然核苷酸的已知类似物，其可以以与天然存在的核苷酸相似的方式起作用，及其组合和/或混合物。因此，术语“核苷酸”指天然存在和经修饰的/非天然存在的核苷酸两者，包括核苷三、二和单磷酸，以及在聚核酸或寡核苷酸内存在的单磷酸单体。核苷酸还可以是核糖；2’_脱氧；2’，3’_脱氧以及广泛多样的其他核苷酸模拟物，其是本领域众所周知的。模拟物包括链终止核苷酸，例如3’ -O-甲基、卤代碱基或糖取代；可替代糖结构包括非糖，烷基环结构；可替代的碱基包括肌苷；脱氮修饰的；接头修饰的X和Φ ;质量标记修饰的；磷酸二酯修饰或替换，包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、酰胺、酯、醚；和碱基或完全核苷酸间替换，包括可切割连接例如光可切割的硝基苯基部分。
[0017]靶的存在或不存在可以进行定量或定性测量。靶可以以各种不同形式出现，包括例如简单或复杂混合物，或基本上纯化的形式。例如，靶可以是含有其他组分的样品的部分，或可以是样品的唯一或主要组分。因此，靶可以是全细胞或组织、细胞或组织提取物、其分级的裂解产物或基本上纯化的分子的组分。另外，靶可以具有已知或未知的序列或结构。
[0018]术语“扩增反应”指用于扩大核酸靶序列的拷贝的任何体外手段。
[0019]“扩增”指将溶液提交给足以允许扩增的条件的步骤。扩增反应的组分可以包括但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语“扩增”通常指靶核酸中的“指数”增加。然而，如本文使用的，“扩增”还可以指核酸的选择靶序列数目中的线性增加，但不同于一次性单个引物延伸步骤。
[0020]“聚合酶链反应”或“PCR”指由此以几何级数扩增靶双链DNA的特异性区段或子序列的方法。PCR是本领域技术人员众所周知的；参见例如美国专利号4，683，195和4，683，202 ;和 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applicat1ns, Innis 等人，编辑，1990ο
[0021]如本文使用的，“寡核苷酸”指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或经修饰的核苷单体的线性聚合物。寡核苷酸包括能够与靶核酸特异性结合的脱氧核糖核苷、核糖核苷、其异头物形式、肽核酸(PNA)等。通常，单体通过磷酸二酯键或其类似物连接，以形成大小范围从几个单体单位例如3-4个到几十个单体单位例如40-60个的寡核苷酸。每当寡核苷酸通过字母序列，例如“ATGCCTG”表示时，应当理解核苷酸处于从左到右的5’ -3’次序，并且除非另有说明，否则“Α”指示脱氧腺苷，“C”指示脱氧胞苷，“G”指示脱氧鸟苷，“Τ”指示脱氧腺苷，并且“U”指示核糖核苷尿苷。通常，寡核苷酸包含四种天然脱氧核苷酸；然而，它们还可以包含核糖核苷酸或非天然核苷酸类似物。当酶具有关于活性的特异性寡核苷酸或多核苷酸底物需求时，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，则关于寡核苷酸或多核苷酸底物的适当组成的选择完全在普通技术人员的知识内。
[0022]如本文使用的，“寡核苷酸引物”或简单的“引物”指多核苷酸序列，其与靶核酸模板上的序列杂交，并且促进寡核苷酸探针的检测。在本发明的扩增实施方案中，寡核苷酸引物充当核酸合成的起始点。在非扩增实施方案中，寡核苷酸引物可以用于制备能够被切割试剂切割的结构。引物可以具有各种长度，并且通常长度小于50个核苷酸，例如长度12-25个核苷酸。用于PCR中的引物长度和序列可以基于本领域技术人员已知的原则进行设计。
[0023]如本文使用的，术语“寡核苷酸探针”指这样的多核苷酸序列，其能够与目的靶核酸杂交或对目的靶核酸退火，并且允许靶核酸的特异性检测。
[0024]“错配核苷酸”或“错配”指在所述一个或多个位置处与靶序列不互补的核苷酸。寡核苷酸探针可以具有至少一个错配，但还可以具有2、3、4、5、6或7个或更多个错配核苷酸。
[0025]如本文使用的，术语“多态性”指等位基因变体。多态性可以包括单核苷酸多态性(SNP)以及单序列长度多态性。多态性可以是由于与另一个等位基因相比较，在一个等位基因处的一个或多个核苷酸置换，或可以是由于本领域已知的插入或缺失、复制、倒转及其他改变。
[0026]如本文使用的，术语“质量可区别大小”可以与“可切割产物大小”、“降解产物大小”或“探针片段大小”互换使用，并且指起因于寡核苷酸探针切割和释放的一种或多种降解产物，如通过本文方法描述的。具有质量可区别大小(MDF)的片段可以包括但不限于寡核苷酸探针片段、核苷酸寡核苷酸探针片段、非核苷酸寡核苷酸探针片段、含有修饰标签以促进分离(如疏水和亲和部分)的寡核苷酸探针片段。产生具有独特的质量可区别大小的片段导致显著改善的灵敏度，且允许执行多路化反应的能力增强。
[0027]如本文使用的，术语“修饰”指在分子水平上(例如碱基部分、糖部分或磷酸盐主链)的寡核苷酸探针改变。核苷修饰包括但不限于引入切割阻断剂或裂解诱导物，引入小沟结合剂，同位素富集，同位素耗尽，引入氘和卤素修饰。核苷修饰还可以包括增加杂交严格性或增加寡核苷酸探针的解链温度的部分。例如，核苷酸分子可以用连接2’和4’碳的额外桥进行修饰，导致对通过核酸酶的切割抗性的锁核酸(LNA)核苷酸。
[0028]提及一种分子与另一种分子的结合中的术语“特异性的”或“特异性”，例如探针对于靶多核苷酸的特异性，指两种分子之间的识别、接触和稳定复合物形成，连同基本上更少的该分子与其他分子的识别、接触或复合物形成。如本文使用的，术语“退火”指两种分子之间的稳定复合物形成。
[0029]如果探针的至少一个区域与核酸序列的互补体的至少一个区域共享基本序列同一性，则探针“能够对核酸序列退火”。“基本序列同一性”是至少约80%，优选至少约85%，更优选优选至少约90%、95%或99%，且最优选100%的序列同一性。为了测定DNA序列和RNA序列的序列同一性的目的，U和T通常视为相同核苷酸。例如，包含序列ATCAGC的探针能够与包含序列GCUGAU的靶RNA序列杂交。
[0030]如本文使用的，术语“切割试剂”指能够切割寡核苷酸探针以获得质量可区别大小的片段的任何手段，包括但不限于酶。对于其中不发生扩增的方法，切割试剂可以仅用于切害J、降解或以其他方式释放寡核苷酸探针的第二部分或其片段。切割试剂可以是酶。切割试剂可以是天然的、合成的、未经修饰的或经修饰的。
[0031]对于其中扩增发生的方法，切割试剂优选为具有合成(或聚合)活性和核苷酸活性的酶。此类酶通常为核酸扩增酶。核酸扩增酶的例子是核酸聚合酶，例如栖热水生菌(Thermus aquaticus) (Taq)DNA 聚合酶(TaqMAN.RTM.)或大肠杆菌(Ε.coli)DNA 聚合酶I。酶可以是天然存在的、未经修饰的或经修饰的。
[0032]术语“切割所述片段直至核酸外切酶抗性修饰”意指切割片段直至到达核酸外切酶抗性修饰自身或在定位接近于核酸外切酶抗性修饰的限定核苷酸处的切割活性。对于3’至5’核酸外切酶活性，接近于修饰的限定核苷酸可以定位于距离修饰紧3’的第一个位置处。备选地，限定核苷酸可以定位于距离修饰3’两个或三个或甚至更多个位置，只要通过3’至5’核酸外切酶的切割一致地在限定核苷酸的位置处终止。
[0033]术语“丙二醇”或“丙二醇间隔物”指1，3-丙二醇，并且与丙烷-1，3-二醇、1，3-二羟基丙烷和亚丙基二醇同义。术语“HEG”或“HEG间隔物”指六乙二醇，并且与3，6，9，12，15-五氧杂十七烷-1，17- 二醇同义。术语倒转核苷酸指其中糖部分经由3’至3’磷酸二酯键而连接至邻近核苷酸的糖部分的核苷酸。
[0034]术语“质谱法的污染物”指能够干扰通过质谱仪检测具有质量可区别大小(MDF)的片段的任何物质。质谱法的一些污染物的例子公开于Keller等人，Analytica ChimicaActa (2008) 627:71-81 中。
[0035]“核酸聚合酶”指催化核苷酸掺入核酸内的酶。示例性核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶等。
[0036]“热稳定的DNA聚合酶”指当遭受高温所选时间段时，其为稳定的(即抵抗分解或变性)且保持足够的催化活性的DNA聚合酶。例如，当遭受高温使双链核酸变性所需的时间时，热稳定的DNA聚合酶保留实现后续引物延伸反应的足够活性。核酸变性所需的加热条件是本领域众所周知的，并且在美国专利号4，683，202和4，683，195