短干扰核酸杂交体及其制备方法

专利名称：短干扰核酸杂交体及其制备方法
短干扰核酸杂交体及其制备方法根据美国能源部与加利福尼亚大学之间关于美国劳伦斯利弗莫尔国家实验室运 作的协议No. W-7405-ENG-48,美国政府对该发明享有权利。相关申请交叉参考本申请要求享有于2002年9月9日提交、题目为"使用DNA:RNA杂交的短干 扰分子的基因沉默"的美国临时申请No. 60/409,680的优先权，其通过引用并入本文。发明背景近年来，人们已经接受RNA干扰是由表现出序列特异性基因沉默效应的短干扰 RNA分子("siRNA")介导的。虽然siRNA基因沉默的具体机制还不完全清楚，但 可以通过引入与靶基因同源的siRNA分子从而降解细胞mRNA，来使基因沉默或丧 失功能。之前涉及使用反义分子的实验性工作说明了作为优异的抗病毒载体的反义治 疗，但事实上由于反义分子的半衰期非常短，从而限制了其应用。另外，反义治疗是 一种被动的方法，因为其只是简单地阻断病毒mRNA的翻译，而RNAi实际上降解 mRNA。涉及将产生siRNA的质粒转染入细胞的类似工作适合于突变研究，但是诸 如此类的积极方法对于遗传病程如微生物感染的长期保护来说并非这么有用。下列参考文献涉及基因沉默技术，其整体内容通过引用并入本文。参考文献-1. R e, A" Xu， S" Mcmtgomery， MX, Kostas, S.A" Driver, S.E"旭d Mello, C.C. (1998) Potent aiKi specific gei tic intoference by double stranded RNA in CacmoduAditis ^gans. 408,325-330.2. KKuiMdeU， J.R.， and Cartfaew, R,W. (l卿)U站of dsRNA-迈ediated辟加tic int faa^ to tea咖trste that^zzfed and</>tee2Al 2 act in the wingless pathway. CeU. 95， 1017-1026.83. 鳩squitt^ L,旭d Patersoa, B .M. 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(1982) Mutagen treatoient of single Chinese Hamster Ovary ceils produce colcmies mosaic for Glucose-6-]Ao^)hatedriiydro,ase activity. Somaric CtfU Genera. 8,643~651.发明内容本发明涉及一种新型组合物和使用该组合物在体内和体外抑制任意真核和原核 生物有机体或细胞中基因功能的方法。本发明的短干扰核酸或核酸类似物杂交体可以用于靶向并抑制任意基因的功能，使该基因的特异序列可以得以鉴定，不管基因的功 能或来源如何。在特定的实施方案中，本发明提供了一种组合物，其中核酸或核酸类似物单链 的杂交互补部分与其他不同类型核酸或核酸类似物单链杂交形成具有杂交部分和至 少一个3'突出端的siHybrid。 siHybrid的杂交部分的长度可以是10-100个碱基对，取 决于基因和其要应用的生物有机体或细胞。本发明还提供了一种组合物，其中核酸或核酸类似物单链的杂交互补部分与其 他不同类型核酸或核酸类似物单链杂交形成siHybrid,所述的siHybrid具有长度为 19-21个碱基对的杂交部分和长度为2-3个碱基的两个3'突出端。另外，本发明还提供了一种组合物，其中核酸或核酸类似物单链的杂交互补部 分与其他不同类型核酸或核酸类似物单链杂交形成siHybrid,所述的siHybrid具有长 度为21个碱基对的杂交部分和长度为2个碱基的两个3'突出端。本发明还提供了一种制备siHybrid组合物的方法，包括提供与其他不同类型核酸或核酸类似物的单链杂交形成siHybrid的核酸或核酸类似物单链，所述的siHybrid 具有杂交部分和至少一个3'突出端。本发明还提供了一种制备siHybrid组合物的方法，包括提供与其他不同类型核 酸或核酸类似物单链杂交形成siHybrid的核酸或核酸类似物单链，所述的siHybrid 具有长度为19-21个碱基对的杂交部分和长度为2-3个碱基的两个3'突出端。此外，本发明还提供了一种制备siHybrid组合物的方法，包括提供与其他不同 类型核酸或核酸类似物单链杂交形成siHybrid的核酸或核酸类似物单链，所述的 siHybrid具有长度为21个碱基对的杂交部分和长度为2个碱基的两个3'突出端。本发明还提供了一种制备多个siHybrid组合物的方法，包括提供与其他多个不 同类型核酸或核酸类似物单链杂交形成多个siHybrid的一组核酸或核酸类似物单链， 所述的siHybrid具有长度为19-21个碱基对的杂交部分和长度为2-3个碱基的两个3' 突出端。本发明还提供了一种制备多个siHybrid组合物的方法，包括提供与其他多个不 同类型核酸或核酸类似物单链杂交形成多个siHybrid的一组核酸或核酸类似物单链， 所述的siHybrid具有长度为21个碱基对的杂交部分和长度为2个碱基的两个3'突出 端。本发明的另一个实施方案是将所述的siHybrid直接应用到基质上，或使用一种 转染试剂应用于基质上，以沉默一个基因或多个基因，所述的基质是细胞或生物有机 体，即病毒、原核生物、细菌、真核生物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、 人类、人类细胞、植物、昆虫或真菌。


图1说明siHybrid分子。图2说明通过在哺乳动物细胞中非辅助性递送siRNA和siHybrid分子实现的 G6PD的基因沉默。图3是说明短干扰分子的核酸构象改变哺乳动物细胞中siRNA介导的基因沉默 效应的程度和持久性的图。图4是说明两种类型的哺乳动物细胞中对基因沉默效应的程度和时间长度应答的图。图5说明细菌细胞的CFU形成使抗生素抗性基因沉默。 图6说明细菌细胞的CFU形成使/o/A基因沉默。
具体实施方式
siRNA的三个最大的弱点是其短期效应、对细菌无效和需要辅助递送至细胞。 转染是将基因或其他核酸递送到真核细胞的策略。有三类转染技术生化方法、物理 方法和病毒介导的方法。所采用的转染技术取决于转染对细胞的胁迫和方法的效率。 生化方法包括磷酸钙介导的转染法、DEAE-葡聚糖介导的转染法和脂质体转染法。物 理方法包括电穿孔法和基因枪法(biolisics)。在细菌中核酸的吸收称作转化。必须处 理细菌膜，以使细胞处于"感受态"，从而吸收异源核酸。两种转化技术是热激和电 穿孔。siRNA短的持久性是防碍其任何有意义临床用途的特征。包括癌症治疗、抗病 毒药物和特定遗传病治疗的潜在应用都需要长期作用过程，以促进递送和效率。例如， 由于siRNA对细菌无效，排除了作为抗细菌药进行较短期治疗的用途。本文所公开 的siHybrid构建体解决了这两个问题。本文公开了siHybrid分子，其具有与siRNA类似的功能，但是在基因沉默方面 更有效。siHybrid分子包括一个核酸链如RNA与核酸类型不同于第一链的第二核酸 链如DNA杂交，而非双链RNA。两种不同类型核酸的杂交产生的siHybrid具有杂交 互补部分和至少一个3'突出端。核酸类似物可以代替核酸使用。术语"核酸类似物" 指修饰的或非天然存在的核苷酸或骨架结构，如肽核酸(PNA)。siHybrid的独特功能与分子的稳定性相关。双链的RNA分子天生是不稳定的； 其在哺乳动物细胞中快速降解，在细菌中几乎立即降解。相比之下，DNA:RNA杂交 体可能是天然材料中最稳定的一类核酸分子，该构建体在细胞、细菌或哺乳动物中不 降解。实验结果表明DNA:RNA杂交体是比siRNA更强的基因沉默试剂。逻辑上说， 分子越稳定,分子越可以是更强的基因沉默试剂。因此，包含至少一个PNA的siHybrid 或由新的合成核酸类似物构成的分子可以和DNA:RNA杂交体同样有效或比 DNA:RNA杂交体更强，如果合成siHybrid比DNA:RNA杂交体更稳定的话。12参照图l，最有效的DNA:RNA杂交体具有长度为19-21个碱基对的杂交互补部 分(2)和长度为至少2个碱基的至少一个突出3'端(4)。分子的杂交互补部分可以 由最多为100个碱基对组成。通常，长度越短，其特异性越低。如果siHybrid包含少 于10个碱基对，其将丧失沉默基因的特异性。另一方面，长的分子难以进入细胞， 从而不能够使基因沉默。因此，含有超过100个碱基对的siHybrid将难以进入细胞。可以使用具有多个基因共有序列的siHybrid来同时沉默多个基因。另外，还可 以使用多个siHybrid来沉默多个基因。多个基因沉默尤其可用于抗生素目的，因为通 过同时沉默多个基因可以比只沉默一个基因更具选择性、更有效地杀死细菌。多基因 沉默还可以用于人类治疗目的。例如，通过抑制负责肿瘤生长的多个基因，可以实现 抑制一个基因所不能达到的对肿瘤生长的有效抑制。siHybrid分子具有近乎万能的潜力。它们可用于沉默任意生物有机体内细胞中 的基因。它们可用于治疗或研究目的。它们可用作抗生素、抗病毒药物和癌症治疗药 物，还可用于治疗由基因的非必要超表达所致的各种遗传病。另外，它们还可用在植 物中以治疗植物疾病，改善植物品质，如产量、颜色、环境耐受性或质量。通过选择 性地沉默基因，siHybrid可以用作除草剂、杀虫剂、农药和杀真菌剂。siHybrid可以用于预防细胞的病毒感染。通过寻找对病毒感染独特且必要的基 因，如蛋白酶基因或逆转录酶基因，构建相应的siHybrid,并将这些siHybrid应用于 细胞，可以通过使基因沉默来杀死病毒，并治愈病毒感染。并且，通过使细菌菌株的 必要基因途径沉默可以将siHybrid用作抗生素。沉默这种途径提供了一种杀死细菌细 胞的方法。另外，siHybrid可以用于治疗由基因的超表达或致病基因所致的人类或动物疾 病。这类疾病可以包括但不局限于自身免疫性疾病、肿瘤、炎症和高血压。siHybrid 还可用来抑制正常表达的基因，以用作治疗目的。例如，为了能够成功进行器官移植， 可以抑制与排斥反应免疫应答相关的基因。 配方和施用途径siHybrid可以配制成药学上可接受的任意剂型。例如，可以是一种适合人体静 脉用药的剂型。所述剂型可以包括本领域已知的、药学上可接受的赋形剂、载体、缓 冲液、渗透剂等。所述配方可以包括用于联合治疗的其他药用活性成分。所述配方还可以针对特定用途设计成粉末、固体、液体或气体形式。siHybrid可以口服、皮下、 静脉内、大脑内、肌肉内、髓内、肠道外、经皮、经鼻或经直肠施用。使用的siHybrid 形式至少部分取决于它们的施用途径。 实验如下文所述对哺乳动物细胞和细菌细胞进行实验。用在哺乳动物细胞实验中的 siHybrid浓度以终浓度计为10吗/1"06细胞—25吗/1><106细胞。用在细菌细胞实验 中的siHybrid浓度以终浓度计为0.25 pg/ml—4 pg/ml。虽然这些实验说明了在沉默基 因方面有效的范围，但实际的最低有效浓度可以远低于10 ^/1"06细胞或0.25 fag/ml。哺乳动物细胞概述建立了用于验证siHybrid对各种癌基因和肿瘤抑制因子基因的效应的方法。目 的是建立长期关闭特定基因的一种途径，并观察效果。使用siHybrid来沉默人体或仓 鼠来源的正常或癌变细胞中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因。结果表明和siRNA 相比，siHybrid在抑制G6PD基因表达的量和持久性上都较强。结果还表明siHybrid 的效力不依赖于DNA:RNA的取向。在siRNA和siHybrid基因沉默实验中，只使用 了脂质体转染法。脂质体转染涉及将待递送入细胞的核酸用结合核酸分子的阳离子脂 质包覆。人造膜和同样由脂质组成但带负电荷的细胞膜融合。对于非辅助性的递送实 验来说，构建体直接加到培养基中。不需要使用转染培养基或试剂；只需要将siHybrid 加入到培养基中即可。图2说明了通过siRNA和siHybrid分子的非辅助性递送使 G6PD的基因沉默。在不同的实验中，siHybrid加入到分裂细胞中，然后生长至少8天。在8天中 的各间隔，诱导G6PD基因，观察到了少于40%的基因表达。对照细胞表现出正常的 G6PD活性，加入传统siRNA分子的细胞表现出正常的G6PD活性，两天内返回到 100%的基因表达。这些观察结果说明siHybrid可以用于沉默哺乳动物细胞中的几乎 所有基因。该功能可以用于抑制任意致病基因超表达，从而提供对疾病的有效治疗。 细菌细胞概述在哺乳动物细胞上使用siHybrid的显著基因沉默效果暗示了其在细菌细胞上的 用途，其逻辑前提是其在哺乳动物中的显著持久性能够使它在细菌中发挥类似功能。第一个靶点是简单的位于转化到细菌中的质粒上的抗生素抗性基因。当在含抗生素 的培养基中生长时，只有这些质粒上所含基因的活性使细胞存活。使用大肠杆菌 (E.coU)进行所有的细菌试验，因为它们易于得到，并可安全使用。由于细菌降解 siRNA的机制在所有细菌中都是相同的，因此认为这种试验是合理的。在一系列实验中，对两种常用抗生素氨苄青霉素和氯霉素提供抗性的基因得到了沉默。在所有情况下，当对抗抗生素抗性基因的siHybrid加入到培养基中时，易于在含抗生素培养基中 生长的细菌死亡。不需要转化步骤，也不需要转染培养基或试剂。只需要将siHybrid 简单加入到培养基中即可。另外，当将不靶向表达基因的siHybrid加入到培养基中时， 没有这种效应；细菌就象没有加入任何东西一样生长。这说明所观察到的是一种直接 效应，而不是大规模的、非特异性的杀伤细胞。为了证明细菌中的基因沉默效应，对在细菌中产生DHFR并提供嘌呤合成的 /0/A基因进行靶向。在供有嘌呤的"富集"培养基中，基因产物是非必需的。当将沉 默DHFR的siHybrid加入到在富集培养基中生长的细菌时，没有所述效应。但是， 在不提供有嘌呤或嘧啶的基本培养基中，DHFR蛋白是细胞存活所必需的。它使得细 胞从其他分子合成嘌呤，如胸苷或腺嘌呤。在基本培养基中，如果/o/A基因没有功 能，则细胞不能进行DNA合成，从而会变得静息，不能生长。当向培养基中加入嘌 呤或嘧啶(核苷)如腺嘌呤或胸苷时，细胞将再次生长，因为DHFR蛋白质不再为 嘌呤合成所必需。对于该实验，我们向培养基中加入了siHybrid/o/A拮抗剂，然后加 入氨苄青霉素。获得siHybrid的所有细胞都停止分裂；而未获得siHybrid的细胞都被 只杀死分裂细胞的氨苄青霉素杀死。将细胞旋转出含氨苄青霉素的培养基，重悬于不 含siHybrid、氨苄青霉素和核苷的基本培养基。在将嘌呤加入到培养基中时，细胞就 开始以正常速率生长。再次加入不靶向非必需或不表达基因的siHybrid则没有效应。 加入与siHybrid具有相同序列的siRNA分子也没有效应。这些实验说明基因沉默是 特异而非致死的，用传统的siRNA治疗是不可能的。该实验中描述的结果表明对 于特定的细菌来说，通过选择独特的、细菌存活所必需的基因，siHybrid可以通过使 基因沉默来充当那些特定细菌的抗生素。由于细菌具有细胞壁和细胞膜，该实验的结果说明siHybrid可以直接应用于哺 乳动物细胞以产生基因沉默效应，而不需使用转染手段，因为哺乳动物细胞仅具有细胞膜，易于siHybrid透过，且siHybrid比siRNA更为稳定。因此，除了通过转染手 段如脂质体、蛋白质和核酸序列将siHybrid递送到细胞中，还可以不使用转染试剂， 直接使用siHybrid进行疾病治疗。 舰糊纖为了研究由siRNA介导的RNAi能力，设计实验来转录后沉默培养的哺乳动物 细胞的可诱导性内源基因，并测定这种效应的持久性。使用siRNA来沉默CHOAA8 细胞系中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因，其是哺乳动物细胞中可诱导的内源 性基因。G6PD在动物组织内的戊糖磷酸途径中起到重要的作用，以产生还原形式的 尼古酰胺二核苷三磷酸、NADPH和用于形成核苷酸的核糖-5-磷酸(参见Carson，P.E. and Frischer, H. (1966) Glucose-6隱Phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of the pentose phosphate pathway. 4 n JMed 41, 744-764.)。葡萄糖-6-磷酸进 入该途径，为G6PD所氧化，产生NAPDH和6-磷酸-glucno-S-内酯(参见Carson, P.E. and Frischer, H. (1966) Glucose-6-Phosphate dehydrogenase deficiency and related disorders of the pentose phosphate pathway.爿w /A/ed 41， 744-764.)。该反应的氧化还原 性质可以和细胞暴露于葡萄糖-6-磷酸时使用的四唑基组织化学染料联用，作为比色 分析以定量由细胞中的G6PD酶活性所表示的G6PD基因沉默程度。改变短干扰分子的核酸组成，进行siRNA介导的基因沉默分析来测试其对这种 基因沉默模式所改变的参数的影响。这些因素包括基因沉默效应的程度和持久性，以 及恢复的基因表达的量。使用哺乳动物G6PD基因，这些参数的改变取决于细胞所暴 露的短干扰分子的核酸组成。为了说明哺乳动物细胞间这些观察结果的普遍性，进行 了人类细胞与仓鼠细胞之间的比较分析。 材料与方法短干扰分子制备.从G6PD基因序列中随机选择21 bp的序列。使用与仓鼠和人 G6PD基因中共有序列同源的第二区域进行仓鼠-人类比较研究。在John Hopkins大学 的DNA合成核心机构(DNA Synthesis Core Facility)构建反义和正义链，其具有2 个核苷酸3'尿苷突出端。siDNA序列含有2个核苷酸3'胸苷突出端。siRNA序列是 非纯化的，siDNA序列为RP cartridge纯化。在10 mM Tris-HCl (pH 8.0)的存在下， 以等摩尔量于94'C变性5分钟、53'C重新退火3 h并缓慢冷却至室温，使正义和反义链退火在一起。细胞培养和转染.中国仓鼠卵巢(CHO) AA8细胞在添加有10%胎牛血清 (FBS)、 1% L-谷氨酰胺和1°/。抗生素-抗真菌剂的F-12 Nutrient Mixture Ham (Life Technologies, New York)中于37。C增殖。人HCF-7细胞在添加有10% FBS、 1%L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素、1%MEM非必需氨基酸溶液、P/。丙酮酸钠和2。/。BME 氨基酸溶液的DMEM/F-12 (Life Technologies)中增殖。FBS于56'C加热30分钟灭 活以去除核酸酶活性。细胞每周传代3次，以维持指数生长。转染前24小时，将细 胞用lxPBS洗3次，胰酶处理，以"106/板铺在35 mm组织培养皿中不含有抗生素 的2ml生长培养基中，于37。C孵育。使用10叫核酸、使用Lipofectamine试剂(Life Technologies, New York)并根据生产商对贴壁细胞的操作方案进行短干扰分子的转 染。细胞与转染复合物一起孵育5 h。为了防止细胞毒性，吸出复合物，用完全的生 长培养基将细胞洗两次，并在含抗生素的生长培养基中于37'C孵育，直至准备进行 G6PD酶活性分析。G6PD比色分析和酶活性的定量.如Stamato(参见Stamato， T.D.， Mackenzie, L.， Pagani， J.M.， and Weinstein, R. 1982, Mutagen treatment of single Chinese Hamster Ovary cells produce colonies mosaic for Glucose-6-phosphate dehydrogenase activity. S固Wc Ce// Ge"幼'c;y. 8， 643-651 )所述监测G6PD酶活性。简而言之，将单层细胞用2 ml 0.14M NaCl/0.012% Triton-X 100溶液处理，并在2 ml含2.5 mg/ml葡萄糖-6-磷酸二钠盐， pH 6.5、 0.17 mg/ml吩嗪硫酸甲酯、0.33 mg/ml硝基四氮唑兰、0.14 MNaCl、0.17 mg/ml NADP和0.012% Triton-X 100的溶液中孵育1 h。将细胞用2 ml 10%醋酸缓冲的福尔 马林固定15min，洗涤并氮气干燥。为了定量酶活性，获得细胞的平均像素强度，以 表示与G6PD活性水平相关的细胞颜色深浅。在Zeiss Axiophot上使用亮视野光以20x 观察细胞。在存在有单层细胞的区域中获取板的图象。获得单个细胞和显示背景的不 含细胞区域的平均像素强度差。使用Smart Capture VP软件进行图象分析。点杂交.转染有短干扰分子的CHOAA8细胞在转染后0、 6、 12、 18和24小时 的时间点上用lxPBS洗涤3次而取出(lifted),并和胰酶一起孵育5分钟。将细胞用 1xPBS洗涤，并重悬于lxPBS中。将细胞悬液(约105细胞)于95t:煮IO分钟以获 得细胞裂解物。如Gibco的Blugene非放射性核酸检测系统(Gibco，s BlugeneNonradioactive Nucleic Acid Detection System)中所述进行杂交过程，以检测裂解物中 短干扰分子的存在。所用的探针是生物素化的反义G6PDDNA序列。统计.CHO AA8 siRNA和siDNA时间实验中的值是5个重复实验的平均值，杂 交实验为3个重复实验的平均值。仓鼠-人类比较时间实验中的值为两个重复实验的 平均值。通过将阳性对照条件的平均值表示为100%、将实验条件下的平均值除以平 均阳性对照值而获得相对值。误差条线表示标准偏差。 实验铕果使用阳离子脂质体进行的短干扰分子的转染不一致地导致细胞毒性，导致低转 染效率。CHOAA8和人MCF-7细胞用阳离子脂质体来转染短干扰分子。不论用何种 转染试剂，活细胞计数(vital count)表明暴露于转染复合物的细胞有50%死亡。测 试了 5种不同的阳离子脂质体转染试剂，以使细胞的毒性和死亡最小，其中 Lipofectamine (Life Technologies)产生最低水平的细胞死亡。只对转染后看起来健康 的细胞进行G6PD活性分析。在分析G6PD酶活性时，根据细胞颜色，在35mm板中转染的细胞大约有40-50n/。 转染了短干扰分子。如细胞颜色指示，单层培养物中转染和未转染细胞倾向于发生在 离散的批次间。只有转染区的细胞用于分析基因沉默。在G6PD活性未受到抑制的对 照板中，不存在细胞颜色深浅不同的区域，说明G6PD分析不产生这种效应。比色分析提供了检测单个细胞中G6PD基因沉默存在的有效方法.G6PD基因是 研究siRNA介导的基因沉默的首选。为了将转染效率和siRNA研究分割开，重要的 是能够分析单个细胞，而非获得群体平均值。为此，使用Stamato等(22)建立的比 色分析法分析G6PD蛋白的酶活性。之前Elbashir等(20)使用siRNA来沉默培养的 哺乳动物细胞的工作也使用荧光染色和荧光酶活性的比色技术对结果进行分析。在转 染之后，细胞和含有葡萄糖-6-磷酸(G6P)和尼古酰胺二核苷三磷酸(NAPD)的四 唑基组织化学染料一起孵育。向细胞中加入G6P激活G6PD基因转录和蛋白质合成。 G6PD的酶活性将G6P的氧化和NADP到NADPH的还原相偶联，以产生从白到紫 的细胞颜色变化。如果与G6PD基因序列具有序列同源性的siRNA的加入诱导CHO AA8细胞中的转录后基因沉默，则合成不足量的G6PD蛋白，导致G6PD酶活性缺 乏和抑制颜色变化反应。暴露于siRNA分子的中国仓鼠卵巢细胞中存在的诱导性G6PD酶活性下降.通过将细胞的颜色强度和同样与组织化学染料孵育的未转染细胞的颜色强度相比较，测 定siRNA转染细胞中G6PD活性的相对变化。为了保证转录后基因沉默是siRNA的 特异效应，还测定了转染有非同源核苷酸序列、T7引物的CHO AA8细胞以及暴露于 不含载体的阳离子脂质体的细胞中的酶活性。不存在G6P的条件下和组织化学染料 一起孵育的CHOAA8细胞用作分析的阴性对照。孵育后获得细胞的图象，测定基于 单个细胞颜色的像素强度，以测定G6PD活性的相对变化。通过将G6PD所致的葡萄糖-6-磷酸的氧化与NAPD的还原和四唑基组织化学染 料相偶联，可以检测哺乳动物细胞中的G6PD活性。s汲NA诱导G6PD基因沉默的动力学.为了确定siRNA对G6PD转录后基因沉 默的动力学，在5小时的转染之后跨越长达96小时的特定时间点上进行比色分析， 以测定G6PD酶活性的存在。siRNA介导的基因沉默在转染后的前24小时提供G6PD 活性的约为60%的下降。在48小时，细胞开始重新表达G6PD基因，在转染后96 小时表现出完全的表达。参照屈3， (A)转染siRNA分子的CHOAA8细胞；(B)暴露于siDNA分子的 细胞；(C)导入短干扰杂交分子DNAs:RNAa和(D) RNAs:DNAa。对照反应转染 具有T7噬菌体启动子引物序列(T)的si分子(RNA:RNA、RNA:DNA或DNA:DNA)， 或暴露于不含载体(B)的阳离子脂质体复合物。暴露于对照试验的所有细胞都表现 出100%的基因表达和酶活性。转染siDNA分子的细胞表现出最低程度的基因沉默效 应，而siRNA分子提供了对基因表达的较大抑制作用。对于转染siRNA或siDNA分 子的细胞来说，沉默时间长约24小时。DNAs:RNAa和RNAs:DNAa构象的短干扰杂 交分子表现出对内源基因表达的最大程度和持久的抑制作用。该效应一直持续96小 时。图A和B是从5个重复实验获得的数据，图C和D的数据为从3个重复实验获 得的数据。当*鼷于不同核酸组成的短干扰分子时细胞表现出在G6PD基因沉默方面的差 异性应答.由于siRNA介导的RNAi的机制不清楚，不清楚转录后基因沉默是否是由 RNA组成的短干扰序列的特异效应，核酸组成不同的siRNA分子是否能提供基因沉 默效应。为了验证这一点，序列同所用siRNA载体相同的siDNA序列和由RNA与DNA组成的短干扰杂交分子转染到CHO AA8细胞中，再次在转染后跨越长为96小 时的设定时间点分析G6PD酶活性。构建了两种不同的杂交分子，其中组成正义链和 反义链的核酸不同。对细胞的分析表明在所用的不同短干扰分子间存在不同的G6PD 沉默应答。转染siDNA分子的细胞表现出最低程度的基因沉默，直到转染后12小时 都未见对表达的最大抑制。转染siRNA分子的对照细胞早在转染后0小时就表现出 表达下降，与siDNA分子相比，具有较大程度的沉默。siDNA和siRNA分子的效应 都持续约24小时，在96小时达到正常表达水平。转染DNAs:RNAa和RNAs:DNAa短干扰杂交分子的CHO AA8细胞都表现出 G6PD酶活性的最大下降，持久性最长。转染DNAs:RNAa的细胞早在转染后O小时 就表现出G6PD下降，相对活性百分比约为20%。这些效应在整个实验时程中持续， 剰余活性量约为20%或更低。转染RNAs:DNAa分子的细胞也观察到了类似的效应。 参照图3，在整个实验中剩余的酶活性百分比约为20%或约20%以下。进行点杂交以 检测短干扰杂交分子的存在。但未检测到，说明分子的细胞内浓度太低以致检测不到。在转染后120-192小时之间，每24小时分析暴露于杂交分子的细胞中G6PD的 存在，以确定杂交构建体的效应能持续多长时间。在120小时，存在的G6PD活性增 加至约40%，但是直到192小时都保持在该水平。进行点杂交以检测短干扰杂交分子 的存在。但未检测到，说明分子的细胞内浓度太低以致检测不到。不同核酸组成的siRNA介导的基因沉默的差异性应答可能存在于所有的哺乳动 物细胞中。为了说明差异性应答不是仓鼠细胞的特异效应，在人细胞和仓鼠细胞中进 行了核酸组成各异的短干扰分子的比较时程研究。本实验还说明了改变短干扰分子与 之同源的基因序列的效应。所述分子与仓鼠和人G6PD编码区中的序列相同。图4 显示差异性应答也存在与人MCF-7细胞中，说明该应用对所有培养的哺乳动物细胞 的可能通用性。转染siDNA分子的细胞表现出最低程度的基因沉默，而siRNA分子 提供对基因表达的较大程度的抑制作用。在转染后约24小时siRNA和siDNA的沉默 效应都表现出丧失，在96小时重新获得完全的表达。在人类细胞和仓鼠细胞中杂交 分子都提供了基因沉默方面的最大下降，和对内源基因表达的长期抑制。只使用了由 RNA正义链和DNA反义链组成的杂交分子，因为在此之前仅涉及仓鼠细胞的实验中 两种杂交分子获得了类似的结果。图示为转染(A) siRNA分子；(B) siDNA分子和(C) RNAs:DNAa组成的短 干扰杂交分子的CHO AA8和人MCF-7细胞。由于此处所用的序列与CHOAA8细胞 中的第一系列实验中所用序列不同，这些结果说明不同的应答不是细胞特异的效应， 也不是序列特异的效应。导入siDNA分子导致对基因表达的最低抑制，而siRNA分 子提供较大程度的基因沉默。两种细胞系中的两种效应都在转染后持续约24小时。 短干扰杂交分子表现出对G6PD基因表达的最大程度和持久性，持续整个实验时程。 所有3个图中的数据是从两个重复实验获得的数据。除了说明该应用在哺乳动物细胞中的潜在用途，这些实验还表明存在的差异性 应答和短干扰分子与之同源的编码区序列无关。在仓鼠细胞中验证核酸组合物效应的 初步实验使用了与人类-仓鼠比较实验所不同的短干扰序列，两种序列都与编码链的 非区分区同源。但二者都导致基因沉默，具有杂交分子提供的差异性应答和长期抑制。 细菌细胞只采用了 siHybrid的非辅助性递送。非辅助性递送涉及将siHybrid直接加到细 菌培养物的培养基中。1.有效剂量的cW siHybrid:UltraMAX DH5a-FT感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen, Carlsbad, California)通过热激转化编码氯霉素乙酰转移酶抗性蛋白(c加基因)的 pBC SK+质粒(Promega， Madison， WI)。转化子在c加siHybrid构建体存在下在含 25吗/ml氯霉素抗生素(Sigma, St. Louis， MO)的2 ml Luria-Bertani (LB)培养基 中培养。为了确定c加siHybrid的有效剂量，细胞在0.125、 0.25、 0.50、 1.0、 2.0、 4.0 和8.0吗/ml构建体的存在下生长。siHybrid长度为21个碱基对，与pBC SK+质粒中 W基因编妈区的特异序列同源。根据Tuschl等的指导设计构建体(参见"ThesiRNA user guide",网址为mpibpc.gwdg.de/abteilungen/100/105/sirna.html)。正义链由序列为 5， CGGUGGUAUAUCCAGUGAUUUUU 3'(Dharmacon， Lafayette, CO)的RNA组成。 反义链由序列为5' AAATCACTGGATATACCACCGTT 3' (Sigma Genosys, The Woodlands, TX)的DNA组成。对照条件包括阳性对照，其含有在LB-氯霉素培养基 中生长的细胞，在序列与siHybrid相同的4吗/ml siRNA存在下的LB-氯霉素培养 基中生长的培养物。为了说明siHybrid的作用是序列特异性的，还使用了与大肠杆 菌基因组中任意区域都不同源的siHybrid构建体(NH)。正义链由序列为5，CUGGCCAGCCACAUAGGAGUUUU 3， (Dharmacon)的RNA组成。反义链由序列 为5'AACTCCTATGTGGCTGGCCAGTT3， (SigmaGenosys)的DNA组成。培养物 在摇床(shaker)上于37°C以250rpm孵育过夜。孵育后，将培养物以1:1000稀释至 LB培养基中，将10 pi稀释物铺到添加有25 pg/ml氯霉素抗生素的LB/琼脂板上。为 了在板上获得均匀的菌落，将直径为5 nun的钠钙玻璃(soda lime glass)珠(VWR， Westchester, PA)涂到板上，用手摇晃。将板面朝上于37'C孵育过夜。为了对siHybrid 所致基因沉默活性的基因沉默发生进行定量，利用下列公式计算菌落形成单位 (CFU):[(菌落数/铺板10ml) x (稀释系数)x (2000 pi)]。参照图5,测定caf siHybrid活性，并表示为107菌落形成单位。对照、非同源 siHybrid和siRNA条在36.0-43.0xl07 CFU的面积中都表现出类似的生长。该结果表 明菌落生长与cW siHybrid浓度成反比。2.0吗/ml、4.0吗/ml和8.0 pg/ml的siHybrid 浓度在菌落形成方面与对照相比都表现出72.2%的下降。每增加一个剂量的orf siHybrid,菌落生长平均下降23.6%。对于这里的所有实验技术，误差百分比都计算 为约5%。2.使用siHybrid沉默/o/A基因.MG1655大肠杆菌细胞培养物在与/o/A基因 编码区序列同源的4 pg/ml siHybrid存在下于2 ml M9基本培养基中开始培养，所述 /o/A基因的蛋白产物是二氢叶酸还原酶。正义链由序列为5' UCUCGCCUGGUUUAAACGCAAUU 3， (Johns Hopkins Synthesis Facility, Baltimore, Maryland)的RNA组成。反义链由序列为5， TTGCGTTTAAACCAGGCGAGATT 3' (Johns Hopkins Synthesis Facility)的DNA组成。/o/A基因的沉默阻碍大肠杆菌细 胞在基本培养基中的生长，因为它们不能合成嘌呤和嘧啶。有六种实验条件，包括含 有基本培养基中细胞的阳性对照，4 pg/ml /o/A siHybrid构建体存在下基本培养基中 的细胞、具有4 jLig/ml/o/A siRNA (序列与siHybrid相同)构建体的基本培养基中的 细胞、具有4 pg/ml非同源siHybrid构建体的基本培养基中的细胞，和具有4 pg/ml/o/A siHybrid并添加有20 mM胸苷、胞苷、腺苷和鸟苷(Sigma)的基本培养基中生长的 细胞。细胞生长在添加有50ng/ml三甲氧苄二氨嘧啶(Sigma)的基本培养基中，三 甲氧苄二氨嘧啶是一种特异性抑制二氢还原酶作用的抗生素，充当药理对照。培养物 于37'C生长过夜，并以250rpm摇培。次日，将培养物稀释至1:1000和1:100,000，并铺板。对菌落进行计数，计算每个实验条件下的CFU。参照图6，将从阳性对照(只在基本培养基中生长的细胞)获得的CFU值设定 为100%,所有其他条件都相对于该值表示。对于/o/AsiHybrid存在下生长的培养物 来说CFU形成方面有超过80%的显著下降。在阳性对照、/o/A siRNA存在下生长的 培养物和非同源/o/AsiHybrid存在下生长的培养物中形成CFU的量之间差异不显著。 /o/AsiHybrid以及嘌呤与嘧啶(siHybrid/营救)存在下生长的培养物表现出超过100% 的CFU形成。己经通过实验确定(数据未示出)这是由于营救培养物的生长速率显 著快于阳性对照的生长速率所致。人们假设生长速率较快是由于营救培养物中的细胞 不需要合成它们自己的嘌呤和嘧啶，因此能够以较快的速率发生分裂。上面说明书中提到的所有出版物和专利都通过引用并入本文。在不背离本发明的 范围和实质的条件下，对本发明的所述方法和系统进行各种修改和变动对于本领域的 技术人员来说将是显而易见的。虽然联系特定的实施方案描述了本发明，应该理解， 所要求保护的发明不应局限于这些特定的实施方案。事实上，对实施本发明的所述方 式所作的、对于分子生物学领域或相关领域的技术人员显而易见的各种修改也属于附 加的权利要求的范围。
权利要求
1.一种组合物，包括一种siHybrid，其包括(1)杂交互补部分和(2)至少一个突出的3’端部分，所述的siHybrid具有相杂交的第一单链核酸或核酸类似物序列和第二单链核酸或核酸类似物序列，其中所述的第二单链序列的核酸或核酸类似物类型与第一单链序列不同。
2. 权利要求1的组合物，其中所述的第一单链序列和第二单链序列选自DNA、 RNA 和PNA。
3. 权利要求l的组合物，其中所述组合物的杂交互补部分长度为10-100个碱基对。
4. 权利要求l的组合物，其中所述的突出3'端长度为2-3个碱基。
5. 权利要求1的组合物，其中所述组合物的杂交互补部分长度为19-21个碱基对。
6. 权利要求l的组合物，其中所述的siHybrid具有两个突出的3'端。
7. 权利要求6的组合物，其中所述的两个突出3'端的每一个长度为2个碱基，组合 物的杂交部分长度为21个碱基对。
8. —种组合物，包括一种siHybrid，其包括(1)长度为19-21个碱基对的杂交互补部分和(2)每个 长度为2-3个碱基的两个突出的3'端，所述的siHybrid具有相杂交的第一单链核酸或 核酸类似物序列和第二单链核酸或核酸类似物序列，其中所述第二单链序列的核酸或 核酸类似物类型与第一单链序列不同。
9. 权利要求8的组合物，其中所述的第一单链序列和第二单链序列选自DNA、 RNA 和PNA。
10. —种组合物，包括一种siHybrid，包括(1)长度为21个碱基对的杂交互补部分和(2)每个长度 为2个碱基的两个突出的3'端，所述的siHybrid具有相杂交的第一单链核酸或核酸类 似物序列与第二单链核酸或核酸类似物序列，其中所述第二单链序列的核酸或核酸类 似物类型与第一单链序列不同。
11. 权利要求10的组合物，其中所述的第一单链序列和第二单链序列选自DNA、RNA 和PNA。
12. —种方法，包括 提供第一单链核酸或核酸类似物序列；提供第二单链核酸或核酸类似物序列，其核酸或核酸类似物类型与所述的第一单 链序列不同；和使所述的第一单链序列和所述的第二单链序列杂交，以制备siHybrid，其包括(l) 杂交互补部分和(2)至少一个3'突出端。
13. 权利要求12的方法，其中所述的第一单链序列和第二单链序列选自DNA、 RNA 和PNA。
14. 权利要求12的方法，其中所述siHybrid的杂交部分长度为10-100个碱基对。
15. 权利要求12的方法，其中所述的突出3'端长度为2-3个碱基。
16. 权利要求12的方法，其中siHybrid的杂交互补部分长度为19-21个碱基对。
17. 权利要求12的方法，其中所述siHybrid的两个突出3'端的每一个长度为2个碱 基，siHybrid的所述杂交部分长度为21个碱基对。
18. 权利要求12的方法，其还包括使所述的siHybrid直接与基质接触，或者使用转染试剂使所述的siHybrid与基质 接触，以沉默至少一个基因。
19. 权利要求18的方法，其中所述siHybrid的杂交部分长度为10-100个碱基对。
20. 权利要求18的方法，其中所述的突出3'端长度为2-3个碱基。
21. 权利要求18的方法，其中所述siHybrid的杂交互补部分长度为19-21个碱基对。
22. 权利要求18的方法，其中所述siHybrid的两个突出3'端的每一个长度为2个碱 基，siHybrid的所述杂交部分长度为21个碱基对。
23. 权利要求18的方法，其中所述的基质是生物有机体或细胞。
24. 权利要求23的方法，其中所述的生物有机体是病毒、原核生物、细菌、真核生 物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、人类、人类细胞、植物、昆虫或真菌。
25. —种方法，包括提供一种siHybrid，其具有相杂交的第一单链核酸或核酸类似物序列和第二单链 核酸或核酸类似物序列，所述的第二单链序列的核酸或核酸类似物类型与第一单链序 列不同，其中所述的siHybrid具有(l)杂交互补部分和(2)至少一个突出的3'端；和使所述的siHybrid直接与基质接触，或者使用转染试剂使所述的siHybrid与基质 接触，以沉默至少一个基因。
26. 权利要求25的方法，其中所述的第一单链序列和第二单链序列选自DNA、 RNA 和PNA。
27. 权利要求25的方法，其中所述siHybrid的杂交部分长度为10-100个碱基对。
28. 权利要求25的方法，其中所述的突出3'端长度为2-3个碱基。
29. 权利要求25的方法，其中所述siHybrid的杂交互补部分长度为19-21个碱基对。
30. 权利要求25的方法，其中所述siHybrid的两个突出3'端的每一个长度为2个碱 基，siHybrid的所述杂交部分长度为21个碱基对。
31. 权利要求25的方法，其中所述的基质是生物有机体或细胞。
32. 权利要求31的方法，其中所述的生物有机体是病毒、原核生物、细菌、真核生 物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、人类、人类细胞、植物、昆虫或真菌。
33. —种方法，包括 提供第一单链核酸或核酸类似物序列，所述的序列是多个基因所共有的； 提供第二单链核酸或核酸类似物序列，其核酸或核酸类似物类型与所述的第一单链序列不同；和使所述的第一单链序列和所述的第二单链序列杂交，以制备siHybrid，其具有(l) 杂交互补部分和(2)至少一个3'突出端。
34. 权利要求33的方法，其中所述的第一单链序列和第二单链序列选自DNA、 RNA 和PNA。
35. 权利要求33的方法，其还包括使所述的siHybrid直接与基质接触，或者使用转染试剂使所述的siHybrid与基质 接触，以沉默所述的多个基因。
36. 权利要求33的方法，其中所述siHybrid的杂交互补部分长度为10-100个碱基对。
37. 权利要求33的方法，其中所述的3'突出端长度为2-3个碱基，所述的杂交互补部分长度为19-21个碱基对。
38. 权利要求33的方法，其中所述siHybrid的两个突出3'端的每一个长度为2个碱 基，siHybrid的所述杂交部分长度为21个碱基对。
39. 权利要求35的方法，其中所述的基质是生物有机体或细胞。
40. 权利要求39的方法，其中所述的生物有机体是病毒、原核生物、细菌、真核生 物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、人类、人类细胞、植物、昆虫或真菌。
41. 一种方法，包括提供每个具有不同序列的一组siHybrid，所述siHybrid的每一个包含相杂交的第 一单链核酸或核酸类似物序列和第二单链核酸或核酸类似物序列，所述的第二单链序 列的核酸或核酸类似物类型与第一单链序列不同，其中每个siHybrid具有(l)杂交互 补部分和(2)至少一个3'突出端；和使所述的一组siHybrid直接与基质接触，或者使用转染试剂使所述的一组 siHybrid与基质接触，以沉默至少一个基因。
42. 权利要求41的方法，其中所述的第一单链序列和第二单链序列选自DNA、 RNA 禾B PNA。
43. 权利要求41的方法，其中所述siHybrid的杂交部分长度为10-100个碱基对。
44. 权利要求41的方法，其中所述的突出3'端长度为2-3个碱基。
45. 权利要求41的方法，其中所述siHybrid的杂交互补部分长度为19-21个碱基对。
46. 权利要求41的方法，其中所述siHybrid的两个突出3'端的每一个长度为2个碱 基，siHybrid的所述杂交部分长度为21个碱基对。
47. 权利要求41的方法，其中所述的基质是生物有机体或细胞。
48. 权利要求47的方法，其中所述的生物有机体是病毒、原核生物、细菌、真核生 物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、人类、人类细胞、植物、昆虫或真菌。
49. 一种方法，包括 提供第一组单链核酸或核酸类似物序列，其中每个具有不同的序列； 提供第二组单链核酸或核酸类似物序列，其中所述第二组单链的核酸或核酸类似物类型和所述第一组单链不同；和使所述的第一组单链和所述的第二组单链杂交，以制备一组siHybrid，其中每个siHybrid具有(l)杂交互补部分和(2)至少一个3'突出端部分。
50. 权利要求49的方法，其还包括使所述的一组siHybrid直接与基质接触，或者使用转染试剂使所述的一组 siHybrid与基质接触，以沉默至少一个基因。
51. 权利要求49的方法，其中所述siHybrid的杂交互补部分长度为10-100个碱基对。
52. 权利要求49的方法，其中所述的3'突出端长度为2-3个碱基。
53. 权利要求49的方法，其中所述的杂交互补部分长度为19-21个碱基对。
54. 权利要求49的方法，其中每个siHybrid的两个突出3'端的每一个长度为2个碱 基，所述一组siHybrid的杂交部分长度为21个碱基对。
55. 权利要求50的方法，其中所述的基质是生物有机体或细胞。
56. 权利要求55的方法，其中所述的生物有机体是病毒、原核生物、细菌、真核生 物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、人类、人类细胞、植物、昆虫或真菌。
57. —种方法，包括提供单链DNA，其具有23个碱基，5'端的前21个碱基序列与耙基因互补； 提供单链RNA，其具有23个碱基，5'端的前21个碱基序列与所述单链DNA5'端的所述前21个碱基序列互补；将所述的单链DNA与所述的单链RNA杂交，以形成siHybrid，其具有(1)21个碱基对的杂交部分和(2)位于每个3'端的两碱基突出部分。
58. 权利要求57的方法，其还包括使所述的siHybrid与细胞或生物有机体接触，所述的生物有机体选自病毒、原核 生物、细菌、真核生物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、人类、人类细胞、 植物、昆虫或真菌。
59. —种方法，包括提供单链DNA与单链RNA，杂交以形成siHybrid，其中所述的单链DNA具有 23个碱基，5'端的前21个碱基序列与靶基因互补，所述的单链RNA具有23个碱基， 5'端的前21个碱基序列与所述单链DNA 5'端的所述前21个碱基序列互补，所述的 siHybrid具有(1) 21个碱基对的杂交部分和(2)位于每个3'端的两碱基突出部分; 禾口使所述的siHybrid与基质相接触。
60. 权利要求59的方法，其中所述的基质是细胞或生物有机体，所述的生物有机体 选自病毒、原核生物、细菌、真核生物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、 人类、人类细胞、植物、昆虫或真菌。
61.提供单链RNA，其具有23个碱基，5'端的前21个碱基序列与靶基因互补； 提供单链DNA，其具有23个碱基，5'端的前21个碱基序列与所述单链RNA5'端的所述前21个碱基序列互补；将所述的单链RNA与所述的单链DNA杂交，以形成siHybrid，其具有(1) 21个碱基对的杂交部分和(2)位于每个3'端的两碱基突出部分。
62. 权利要求61的方法，其还包括使所述的siHybrid与细胞或生物有机体接触，所述的生物有机体选自病毒、原核 生物、细菌、真核生物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、人类、人类细胞、 植物、昆虫或真菌。
63. —种方法，包括提供单链RNA与单链DNA，杂交以形成siHybrid，其中所述的单链RNA具有 23个碱基，5'端的前21个碱基序列与靶基因互补，所述的单链DNA具有23个碱基， 5'端的前21个碱基序列与所述单链RNA 5'端的所述前21个碱基序列互补，所述的 siHybrid具有(1) 21个碱基对的杂交部分和(2)位于每个3'端的两碱基突出部分； 和使所述的siHybrid与基质相接触。
64. 权利要求63的方法，其中所述的基质是细胞或生物有机体，所述的生物有机体 选自病毒、原核生物、细菌、真核生物、真核细胞、脊椎动物、哺乳动物、灵长类、 人类、人类细胞、植物、昆虫或真菌。
全文摘要
本文公开了用于基因沉默的siHybrid。siHybrid是一种短的双链分子，包括退火在一起的一个DNA链和一个RNA链，在其每个3’端具有2-碱基突出端。除了DNA和RNA，其还可包含PNA或其他核酸类似物。和siRNA相比，siHybrid可以更大量且更持久地使基因沉默，它们还可以沉默细菌基因，而siRNA不能。siHybrid是用于治疗由过表达基因或癌基因所致疾病的药物和治疗剂的理想候选物。当靶向关键而独特的细菌基因时，它们还可以用作抗生素。siHybrid可以用作抗病毒药物、杀真菌剂、除草剂或杀虫剂。可以设计适当的siHybrid以沉默任意生物有机体内任意细胞中的任意基因。
文档编号C12N15/11GK101405390SQ03821315
公开日2009年4月8日 申请日期2003年9月5日 优先权日2002年9月9日
发明者艾伦·T·克里斯蒂, 贾内尔·S·兰伯顿 申请人:加利福尼亚大学董事会