专利名称：转基因农产品外源基因的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种新型分子生物学方法，是用于转基因农产品外源基因35S、Nos及Npt II的单管同步二重及三重PCR(Polymerase Chain Reaction，即多聚酶链反应)检测的方法。
背景技术：
随着基因工程技术的迅速发展与在生物改良及遗传育种的大规模运用，转基因生物体(Genetically Modified Organism)种类越来越多，含有的外源基因类型也越来越多，转基因生物的研究与开发正从单价向多价发展，必然导致将来转基因食品的外源基因成分越来越复杂。今后我国将对进口的转基因农产品实施强制性的标识制度，因此转基因生物及其产品的检测任务越来越重，工作难度越来越大，检测成本也越来越高。因此，研究开发快速、准确、简便、经济的转基因检测方法，是摆在质检系统转基因产品检测科技工作者面前的重要而紧迫的任务。目前，单一PCR技术已广泛地应用于多种领域，多重PCR技术主要应用于动物病毒性传染病检测中，而已有的用于检测转基因农产品外源基因或外源基因产物即外源蛋白的方法有定性的PCR法和试纸条法，但它们存在的缺陷是一次只能测一个基因或基因产物，工作效率低、成本高，而且容易出现假阳性，影响检测的准确性，因而越来越不适应当今社会的发展了。
发明内容
本发明的目的就是提供一种可用于转基因农产品外源基因35S、Nos及Npt II的单管同步二重及三重PCR检测方法。
本发明以二重及三重PCR方法在反应体系中加入一对到三对引物同时检测转基因农产品中的一个到三个外源基因，包括花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(NOS)、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶II(Npt II)编码基因。
根据一般性原则，在PCR反应中不同的寡核苷酸组合需要选定不同的反应条件才能使多重PCR反应最佳，在同一反应中，所加寡核苷酸对越多，适合的反应条件的可能性越小。因此，本发明的二重及三重PCR反应寡核苷酸的设计和PCR扩增条件选择是影响PCR反应成功的关键。在设计三对PCR寡核苷酸时，除应遵循一般PCR寡核苷酸设计原则外，首先应采用适当调整三对PCR扩增寡核苷酸长度的方法，使三对PCR寡核苷酸的解链温度(Tm)尽可能一致，或者选用所要求的温度条件差异小的引物对，以保证同一反应条件下的良好扩增结果；其次应使三对寡核苷酸PCR扩增产物片段大小有相当的差异，以保证在普通琼脂糖凝胶电泳中有良好的分辩率；最后，由于多个聚合酶链反应同时进行，存在竞争，可有效排除假阳性现象。在本发明中，除了使用PCR反应体系的一般成分及步骤外，其特征在于以下三点1、所使用的PCR引物为下述三对寡核苷酸中的任意两对或三对①NOS-A5’-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3’NOS-B5’-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3’(165bp)②35S-15’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’35S-25’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’(195bp)③Npt II-15’-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3’Npt II-25’-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3’(600bp)2、PCR反应体系各种引物成分的比例和最终浓度为NOS∶35S∶Npt II＝1(0.4μM)∶1(0.4μM)∶3-4(1.2-1.6μM)。比例不恰当将导致某种基因不能扩出或扩出不明显，从而影响结果的可靠性。
3、PCR循环参数及循环程序为94℃，5分钟，54℃，55秒钟，72℃，1分钟；94℃，30秒钟，52℃，50秒钟，72℃，30秒钟，40个循环；72℃，8分钟，结束反应。
本发明的优点在于可同时在一个PCR反应管里检测转基因农产品的2-3个外源基因，成本低，操作简便，效率高，无假阳性现象。
具体实施例方式本发明的实施例如下1、转基因农产品样品的DNA提取取0.5g转基因农产品样品，用Takara试剂盒(DNA Extraction Kit for GMO Detection Ver.2)提取，方法按照Takara宝生物工程有限公司提供的说明书进行。并取5μL DNA在1.0％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上以98V电泳40分钟，进行DNA检测。
2、多重PCR扩增在PCR仪上进行。PCR采用25μl反应体系，10×PCR缓冲液2.5μl，Mg2+贮存液2.0μl，dNTP(四种单核苷酸浓度各10mM)0.5μl。引物选用下述三对寡核苷酸中的任意两对或三对①NOS-A5’-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3’NOS-B5’-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3’(165bp)；②35S-15’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’35S-25’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’(195bp)；③Npt II-15’-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3’Npt II-25’-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3’(600bp)。
所用引物成分的比例和最终浓度为NOS∶35S∶Npt II＝1(0.4μM)∶1(0.4μM)∶3-4(1.2-1.6μM)。模板DNA为1μl(约10-20ng)，Taq酶1U，加ddH2O将体积调整为25μl。采用的PCR循环参数及循环程序为94℃，5分钟，54℃，55秒钟，72℃，1分钟；94℃，30秒钟，52℃，50秒钟，72℃，30秒钟，40个循环；72℃，8分钟，结束反应。最后置4℃环境备用。
3、PCR产物检测与鉴定取PCR产物10μL在1.5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上以98V电泳40分钟，用凝胶成像仪观察。如果观察到在165bp、195bp或600bp的位置出现图谱，则说明所检测的样品为转基因产品。
本发明可同时在一个PCR反应管里检测转基因农产品的2-3个外源基因，技术可靠，成本低，操作简便，效率高，准确性好。本发明的技术可以组装成对转基因农产品外源基因35S、Nos及Npt II的单管同步二重及三重PCR的检测试剂盒，提供给质检系统转基因产品检测部门和科研单位使用，其推广应用前景十分广阔。
权利要求
1.一种转基因农产品外源基因的检测方法，其特征在于为用于转基因农产品外源基因35S、Nos及Npt II的单管同步二重及三重PCR检测方法，其所使用的PCR引物为下述三对寡核苷酸中的任意两对或三对①NOS-A5’-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3’NOS-B5’-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3’(165bp)②35S-15’-GCTCCTACAAATGCCATCA-3’35S-25’-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’(195bp)③Npt II-15’-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3’Npt II-25’-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3’(600bp)
2.根据权利要求1所述的转基因农产品外源基因的检测方法，其特征在于PCR反应体系各种引物成分的比例和最终浓度为NOS∶35S∶Npt II＝1(0.4μM)∶1(0.4μM)∶3-4(1.2-1.6μM)。
3.根据权利要求1或2所述的转基因农产品外源基因的检测方法，其特征在于PCR循环参数及循环程序为94℃，5分钟，54℃，55秒钟，72℃，1分钟；94℃，30秒钟，52℃，50秒钟，72℃，30秒钟，40个循环；72℃，8分钟，结束反应。
全文摘要
本发明涉及一种新型分子生物学方法，是用于转基因农产品外源基因35S、Nos及Npt II的单管同步二重及三重PCR检测的方法。本发明可同时在一个PCR反应管里检测转基因农产品的2－3个外源基因，技术可靠，成本低，操作简便，效率高，准确性好，其推广应用前景十分广阔。
文档编号C12Q1/68GK1524966SQ0311872
公开日2004年9月1日 申请日期2003年2月26日 优先权日2003年2月26日
发明者陈文炳, 邵碧英, 李寿崧, 朱晓南 申请人:福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中