评估乳癌风险的方法

专利名称：：评估乳癌风险的方法评估乳癌风险的方法交叉参考本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2005年11月16日提交的美国临时申请No.60/737,281和2006年9月22日提交的美国临时申请No.60/846，456的权益。政府支持本发明部分地得到国立卫生研究院(NIH)资助No.P01CA45548的支持。美国政府具有本发明的某些权利。
背景技术：
：乳癌是女性中最常见的癌症并且在当今女性癌症死亡原因中占第二位。女性一生中发生浸润性乳癌的机率约为七分之一(13.4%)。乳癌是世界范围内最常诊断出的癌症之一，并且是世界上最流行的癌症、美国癌症协会估计在2005年有约211,240名美国女性将被诊断患有浸润性乳癌并且将有40,410名女性死于该疾病2。仅仅浸润性乳癌就构成女性中32%的所有新发癌症病例的形成原因2。另外58，490名女性将被诊断患有原位乳癌，这是乳癌的非常早期形式2。征服乳癌的关键被认为是早期检测并治疗。但是乳癌被称为"不可预测的疾病"，因为在乳房X射线摄影或触诊检测限度下甚至非常小的损伤可能已经发展成转移性疾病3。乳房X射线摄影(mammography)是目前筛查女性乳癌最灵敏、广泛应用的方法。目前，尽管乳房X射线摄影是我们检测乳癌的"金标准"，但是其不是完全可靠的39。当然，最近的进展比如数字乳房X射线摄影已经提高了诊断准确度并且在降低乳癌死亡率中具有显著差异40，41。然而，就总体诊断准确性而言，乳房X射线摄影有10至30%的假阴性率并且其灵敏度和准确性在乳房密度高的女性中有所消弱42，43。假阳性也是一个实际问题。应当注意的是，在最近研究中，美国乳房X射线摄影人员将所有筛查中的10%判断为异常-并且几乎所有这些都是假阳性44，45。此外，尽管大多数女性有机会使用这些工具，但是在许多真正需要它们的人(包括老年人和经济困难的女性)中并没有得到充分利用46，47。最近研究显示，在检测浸润性乳癌中，乳房MRI优于乳房X射线摄影，其灵敏度是乳房X射线摄影和超声的两倍48。然而，MRI昂贵，健康保险公司不总能支付其费用，并且对于所用技术以及结果解释在各机构之间有相当大的差异。有机会使用乳房X射线摄影对于少数民族女性、低收入女性和老年女性来说是一个严肃的问题46，47，49。费用、害怕疼痛以及缺少对推荐筛查指导的教育也是限制乳房X射线摄影广泛应用的因素5()，51。乳房X射线摄影检查需要高技术的专业人员以及购买并放置大且昂贵的设备、以及维护工作和质量保证成本。所有这些因素限制都可限制其可用性，尤其是对于处于不利地位的女性。由于早期检测的局限性，鉴定女性处于所述疾病风险中以及提供降低风险策略的目标是特别受欢迎的。乳癌风险评估正在成为对女性提供其健康咨询中越来越重要的部分，尤其是成功技术正发展成为预测哪些女性具有发生乳癌之高风险以及预防癌症损伤发生。生物标志物的鉴定尤其与改进乳癌的检测、预后和治疗相关。因此，本领域中需要可被快速、容易并安全地检测的用于乳癌风险评估的替代生物标志物。利用这样的生物标志物可得到具有高依从率的筛选方法以及鉴定更多需要随后监测的对象。
发明内容我们显示处于发生乳癌高风险的女性中尿液金属蛋白酶(MMP)(例如MMP9)以及解联蛋白金属蛋白酶12(adisintegrinandmetalloprotease12，ADAM12)显著升高，并且监测是否存在MMP9和ADAM12二者代表一种新的乳癌风险评估方法。此外，我们指出MMP9和ADAM12水平可作为乳癌风险的独立预测因子。而且，我们已经确定，在根据Gai15年风险模型被预测不处于乳癌风险的对象中，尿液ADAM12水平升高预示着乳癌风险增加66，67。因此，本文提供了评估乳癌风险的方法以及指导医疗保健的方法。一方面，提供了通过检测对象生物样品中是否存在ADAM12以及是否存在MMP9来评估对象中乳癌风险的方法。ADAM12和MMP9同时存在表示乳癌风险增加。该方法还可包括评估对象历史的一个或多个方面，比如年龄、种族特性、生育史、月经史、口服避孕药的使用、体重指数、饮酒史、吸烟史、运动史、饮食、乳癌或其它癌症家族史(包括其亲属癌症诊断时的年龄)、个人的乳癌经历、乳腺活组织检查或DCIS、LCIS或非典型增生。在一个实施方案中，评估对象年龄。另一方面，提供了在根据Gail5年风险模型被认为处于乳癌低风险的对象中评估乳癌风险的方法。在一个实施方案中，所述方法包括检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险的对象之生物样品中ADAM12水平，并将该水平与ADAM12标准水平进行比较，其中与标准水平相比较，ADAM12水平升高表示乳癌风险增加。在一个实施方案中，祁4tGail5年风险模型处于乳癌低风险的对象的分数小于1.67%。在另一个实施方案中，在根据Gail5年风险模型被认为处于乳癌低风险的对象中评估乳癌风险的方法包括检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险的对象之生物样品中的MMP9水平，并将该水平与MMP9标准水平进行比较，其中与标准水平相比较，升高的MMP9水平表示乳癌风险增加。在一个实施方案中，根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险的对象的分数小于1.67%。在一个实施方案中，在根据Gail5年风险模型被i人为处于乳癌低风险的对象中评估乳癌风险的方法包括检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险的对象之生物样品中MMP9水平和ADAM12水平，并将该水平与标准的MMP9水平和ADAM12水平进行比较，其中与标准水平相比较，升高的MMP9水平和ADAM12水平表示乳癌风险增加。在一个实施方案中，根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险的对象的分数小于1.67%。另一方面，提供了评估患者乳癌风险的方法，所述方法包括检测在一定时期内定期从对象中得到的多个生物样品中的ADAM12水平和MMP9水平。然后测量生物样品中所测ADAM12水平和所测MMP9水平的变化。所测ADAM12水平和所测MMP9水平随时间的升高表示乳癌风险增加。所述方法还可包括评估对象历史的一个或多个方面，比如年龄、种族特性、生育史、月经史、口月git孕药的使用、体重指数、饮酒史、吸烟史、运动史、饮食、乳癌或其它癌症家族史(包括其亲属癌症诊断时的年龄)、个人的乳癌经历、乳腺活组织检查或DCIS、LCIS或非典型增生。在一个实施方案中，评估了对象年龄。在另一个实施方案中，提供了评估患者乳癌风险的方法，所述方法包括检测在一定时期内定期从对象中得到的多个生物样品中的ADAM12水平，然后测量生物样品中所测ADAM12水平的变化。所测ADAM12水平随时间的升高表示乳癌风险增加。所述方法还可包拾泮估对象历史的一个或多个方面，比如年龄、种族特性、生育史、月经史、口服避孕药的使用、体重指数、饮酒史、吸烟史、运动史、饮食、乳癌或其它癌症家族史(包括其亲属癌症诊断时的年龄)、个人的乳癌经历、乳腺活组织检查或DCIS、LCIS或非典型增生。在一个实施方案中，评估了对象年龄。在又一个实施方案中，提供了评估患者乳癌风险的方法，所述方法包括检测在一定时期内定期从对象中得到的多个生物样品中的MMP9水平，然后测量生物样品中所测MMP9水平的变化。所测MMP9水平随时间的升高表示乳癌风险增加。所述方法还可包括评估对象历史的一个或多个方面，比如年龄、种族特性、生育史、月经史、口服避孕药的使用、体重指数、饮酒史、吸烟史、运动史、饮食、乳癌或其它癌症家族史(包括其亲属癌症诊断时的年龄)、个人的乳癌经历、乳腺活组织检查或DCIS、LCIS或非典型增生。在一个实施方案中，评估了对象年龄.在一个实施方案中，所述生物样品是血液、组织、血清、尿液、大便、唾液、血浆、脑脊液、乳头吸出物、或细胞裂解物上清。在一个实施方案中，所述生物样品是尿液。在另一些实施方案中，评估乳癌风险的方法还可包括决定对象癌症诊断检测的时间安排和/或频率，或决定对象预防性癌症治疗的时间安排和/或频率。还提供了指导对象医疗保健的方法。在一个实施方案中，所述指导医疗保健的方法包括利用来自对象的生物样品中ADAM12存在状况和MMP9存在状况来评估对象中乳癌风险，其中ADAM12和MMP9同时存在表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估指导医疗保健(包括第二次检测方法)。在一个实施方案中，分别通过检测MMP9水平变化和ADAM12水平变^ttl来测量MMP9存在状况和ADAM12存在状况。在一个实施方案中，所述指导医疗保健的方法包括通过检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中ADAM12水平评估对象中乳癌风险，并将该水平与ADAM12标准水平进行比较，其中与标准水平相比较，ADAM12水平升高表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估指导包含第二次检测方法的医疗保健。在一个实施方案中，所述指导医疗保健的方法包括通过检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中MMP9水平来评估对象中乳癌风险，并将该水平与标准的MMP9水平相比较，其中与标准水平相比较，升高的MMP9水平表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估用于指导包括第二次检测方法的医疗保健。在一个实施方案中，所述指导医疗保健的方法包括通过检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中MMP9水平和ADAM12水平来评估对象中乳癌风险，并将该水平与标准的MMP9水平和ADAM12水平相比较，其中与标准水平相比较，升高的MMP9水平和ADAM12水平表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估用于指导包括第二次检测方法的医疗保健。所述第二次检测方法包括例如乳房X射线摄影、早期乳房X射线摄影程序、定期乳房X射线摄影程序、活组织检查程序、超声、磁共振成像、电阻抗(T-扫描)分析、导管灌洗、ductagram、核医学分析、热成像、或前述方法的任意组合。在一个实施方案中，所述指导对象医疗保健的方法包括利用对象生物样品中ADAM12存在状况和MMP9存在状况来评估对象中乳癌风险，其中ADAM12和MMP9同时存在表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估指导包括降低乳癌风险的医疗保健。在一个实施方案中，分别通过检测MMP9水平变4t和ADAM12水平变4t来测量MMP9存在状况和ADAM12存在状况。在一个实施方案中，所述指导医疗保健的方法包括通过检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中ADAM12水平来评估对象中乳癌风险，并将该水平与标准的ADAM12水平进行比较，其中与标准水平相比较，升高的ADAM12水平表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估指导医疗保健(包括降低乳癌风险)。在一个实施方案中，所述指导医疗保健的方法包括通过检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中MMP9水平和ADAM12水平来评估对象中乳癌风险，并将该水平与标准的MMP9水平和ADAM12水平进行比较，其中与标准水平相比较，升高的MMP9水平和ADAM12水平表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估指导医疗保健包括降低乳癌风险。在一个实施方案中，所述指导医疗保健的方法包括通过检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中ADAM12水平和MMP9水平来评估对象中乳癌风险，并将该水平与标准的ADAM12水平和MMP9水平相比较，其中与标准水平相比较，升高的ADAM12水平和MMP9水平表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估指导医疗保健包括降低乳癌风险。降低乳癌风险可以例如施用选择性激素受体调节剂，例如施用他莫昔芬或雷洛昔芬，或抗血管生成治疗。在一个实施方案中，至少每季度、至少每两月、至少每两周、至少每周、至少每三天、或至少每天连续监测ADAM12存在状况和MMP9存在状况。在一个实施方案中，至少每季度、至少每两月、至少每两周、至少每周、至少每三天、或至少每天连续监测ADAM12水平。还提供了用于监测乳癌风险降低策略的治疗效果的方法。在一个实施方案中，应用对象生物样品中ADAM12存在状况和MMP9存在状况来评估对象中乳癌风险，其中ADAM12水平降低和/或MMP9水平降^J^示乳癌风险降低策略是有效的。可通过检测生物样品中ADAM12水平变化或MMP9水平变化来测量生物样品中ADAM12存在状况和MMP9存在状况。在另一个实施方案中，监测乳癌风险降低策略的治疗效果的方法包括以下步骤a)检测在一定时期内定期从对象中得到的多个生物样品中的ADAM12水平和MMP9水平；和b)测量所测ADAM12水平变化和所测MMP9水平变化。所测ADAM12水平和/或所测MMP9水平随时间的降低表示乳癌风险降低策略是有效的。在一个实施方案中，应用根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中ADAM12水平来评估对象中乳癌风险，其中ADAM12水平降低表示乳癌风险降低策略是有效的。在另一个实施方案中，应用根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中MMP9水平来评估对象中乳癌风险，其中MMP9水平降低表示乳癌风险降低策略是有效的。在又一个实施方案中，应用根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中MMP9水平和ADAM12水平来评估对象中乳癌风险，其中MMP9水平降低和ADAM12水平降低表示乳癌风险降低策略是有效的。本发明的另一些方面包括指导对象治疗的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在来自对象的生物样品中检测对象ADAM12的存在和MMP9的存在，其中临床医生评价结果，并且如果生物样品中ADAM12和MMP9的存在呈阳性，临床医生指导对象进行适当的医学治疗。在一个实施方案中，检测在一定时期内定期从对象中得到的多个生物样品并测量生物样品中所测ADAM12水平和所测MMP9水平的变化。如果检测到MMP9水平和/或ADAM12水平升高，则临床医生指导对象进行适当的医学治疗。在一个实施方案中，所述指导对象治疗的方法包括在来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中检测对象ADAM12水平，其中临床医生将其与标准的ADAM12水平进行比较并评价结果，并且如果与标准水平相比较，生物样品的ADAM12水平升高，则临床医生指导对象进行适当的医学治疗。适当的医学治疗可以是例如包括第二次检测方法或乳癌降低治疗的医疗保健。在一个实施方案中，所述指导对象治疗的方法包括在来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中检测对象MMP9水平，其中临床医生将其与标准的MMP9水平进行比较并评估结果，并且如果与标准水平相比较，生物样品的MMP9水平升高，则临床医生指导对象进行适当的医学治疗。适当的医学治疗可以是例如包括第二次检测方法或乳癌降低治疗的医疗保健。在一个实施方案中，所述指导对象治疗的方法包括在来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中检测对象ADAM12水平和MMP9水平，其中临床医生将其与标准的ADAM12水平和MMP9水平进行比较并评估结果，并且如果与标准水平相比较，生物样品的ADAM12水平和MMP9水平升高，则临床医生指导对象进行适当的医学治疗。适当的医学治疗可以是例如包括第二次检测方法或乳癌降低治疗的医疗保健。可以在对象居住的相同国家或另一个国家进行检测，并且结果是可以得到的，例如通过网络，或者传送给临床医生。在一个实施方案中，所述第二次检测方法包括例如乳房X射线摄影、早期乳房X射线摄影程序、定期乳房X射线摄影程序、活组织检查程序、超声、磁共振成像、电阻抗(T-扫描)分析、导管灌洗、ductagram、核医学分析、热成像、或前述方法的任意组合。在一个实施方案中，乳癌风险降低治疗是利用激素受体调节剂治疗或抗血管生成治疗。图1A至1B分别显示酶镨和Western印迹。图1A，尿液MMP存在于处于发生乳癌风险的女性尿液中，MMP-2(明胶酶A)、MMP-9(明胶酶B)、MMP-9/NGAL复合物以及高分子量MMP类4_人尿液中可通过明胶酶镨检测的主要MMP类型。图IB,ADAM12以显著高于正常对照的水平存在于被诊断患有AH或LCIS以及处于发生乳癌风险增加的女性尿液中。ADAM12的68kDa活性形式是利用ADAM12特异性抗体通过免疫印迹分析在人尿液中检测的主要类型。分析条带强度并利用UN誦SCAN-ITtm(SilkScientific,Orem,UT)软件数字转换技术转化成DU73。图2A至2B显示，与正常对照相比较，举例说明针对ADAM12水平的AH(图2A)和LCIS(图2B)概率的理论曲线。经验数据显示为柱状图，其代表每组中ADAM12水平位于X-轴上每个区间内的女性百分率。Logistic回归分析表明ADAM12水平增加与AH(1自由度上LRT=58.4，PO.0001)和LCIS(1自由度上LRT=53.3，P〈0.0001)概率增加之间非常显著的非线性相关。约60%对照的ADAM12水平为0，而75%被一诊断患有AH的女性和80%被诊断患有LCIS的女性中ADAM12水平大于10个密度计量单位。图3显示利用ADAM12水平和Gail分数的组合预测AH可能性的概率曲线。通过多元Logistic回归产生Gail风险亚组的曲线，这种回归分析证实了ADAM12水平和Gail分数可以各自独立地预示AH的异常诊断。对于低风险Gail5年分数<1.67%的女性，如果其ADAM12水平还<12个密度计量单位，她的AH预测概率则较低。发明详述本发明是基于这种发现，即女性尿液中同时存在ADAM12和MMP9与非常高的乳房病变发病率有关，它们本身则表示发生浸润性乳癌的风险增加。在对151名女性的研究中，尽管ADAM12和MMP9存在单独地分别表示50至67%和25至40%的与发生乳癌风险增加相关的病变概率，而两者同时存在则表示100%的概率。还已经确定，在根据Gail5年风险模型显示乳癌风险较低的对象中，ADAM12水平升高表示乳癌风险增加。因此，本发明的实施方案提供了通过检测来自对象的生物样品中是否存在ADAM12以及是否存在MMP9来评估乳癌风险的方法。同时存在ADAM12和MMP9表示乳癌风险增加。在一个实施方案中，分别通过检测MMP9水平变化与ADAM12水平变化来测量MMP9的存在状态与ADAM12的存在状态。因为ADAM12水平和MMP9水平也可用作乳癌风险的独立预测因子,本发明的实施方案进一步提供通过测量对象的生物样品中MMP9水平或ADAM12水平来评估对象中乳癌风险的方法，其中MMP9水平升高或ADAM12水平升高表示乳癌风险增加。可在一定时期内定期从对象中得到的多个生物样品中检测ADAM12水平和MMP9水平。本发明还提供在根据Gail5年风险模型被认为处于乳癌低风险的对象中评估乳癌风险的方法。所述方法包括检测来自才艮据Gail5年风险模型处于乳癌低风险的对象之生物样品中的ADAM12水平，并将该水平与标准的ADAM12水平进行比较，其中与标准水平相比较，升高的ADAM12水平表示乳癌风险增加。在一个实施方案中，所述方法包括检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险的对象之生物样品中MMP9水平，并将该水平与标准的MMP9水平进行比较，其中与标准水平相比较，升高的MMP9水平表示乳癌风险增加。在一个实施方案中，所述方法包括检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险的对象之生物样品中MMP97JC平和ADAM12水平，并将该水平与标准的MMP9水平和ADAM12水平相比较，其中与标准水平相比较，升高的MMP9水平和ADAM12水平表示乳癌风险增加。乳癌风险的评估提供了鉴定需要第二次检测方法之对象的方法，所述第二次检测方法例如能够检测任何异常病变的位置或检测乳房中癌变的存在。本文所用的"ADAM12"或"解联蛋白金属蛋白酶结构域12"或"ADAM金属蛋白酶结构域12"指Genbank登记号NM_003474、NM—021641、NP_003465、NP—067673(人)的ADAM12蛋白质(SEQIDNO:l)。该术语还包括其变4、同源物、等位基因形式、突变形式、以及等价物。已知ADAM12通过syndecan介导细胞粘附和扩展并且最近已经提出整合素相互作用可作为肝癌中肿瘤4曼袭和近艮的标志物(Pabicetal.Hepatology.2003;37(5):1056-1066)。ADAM12与乳癌相关是已知的(Kveiborgetal.CancerRes.2005;65:4754画61.;Thodetietal.FEBSLett.2005;579:5589-95.;Royetal.JBiolChem.2004;279:51323-30;WO05/071387)因为其存在于具j非癌病变的对象的尿液中(Royetal.JBiolChem.2004;279:51323-30)。然而，单独使用ADAM12作为生物标志物仅^t恶性乳癌得到证明。本文所用的"MMP9"或"基质金属蛋白酶9"指GenBank登记号NM_004994、NP_004985的92kDa明胶酶(EC3.4.24.35)。MMP9是分泌蛋白，由Wilhelm等(1989)首次纯化然后克隆并确定其序列。Vu&Werb(1998)的MMP9评论提供了有关该蛋白酶的详细信息和极好的参考资源。与其它分泌型MMP—起，MMP9^L释放为无活性的前酶或包含前肽结构域的前体。随后前酶被切割形成活性酶。本文所用的术语"目标蛋白质"或单独或一起指ADAM12和MMP9。本文所用的"非典型增生"(Atypia,AtypicalHyperplasia)或"AH"或"非典型小叶增生"或"ALH"或"非典型导管增生"或"ADH"可互换使用。非典型增生已被证实是将来发生乳癌的主要风险因子，使得女性的相对风险增加为普通人群的5.3倍。如果对象的一级亲属中有人患有乳癌，该风险进一步增加(10倍风险)2"8。无论如何命名，小叶原位癌(LobularCarcinomaInSitu，LCIS)还被认为AX险增加的标志物而不是前期病变(precursorlesion)29，3°。然而，现在渐渐认识到LCIS可包括一系列病症，这些病症的小亚类比如多形性变体实际上可代表前期病变31，32。根据参与监测、流行病学和最终结果(SEER)项目的9个基于幹沐的癌症登记，从1978年至1998年绝经后女性中LCIS诊断率增加4倍29。似乎非典型增生(AH)的诊断还可能正在增加。非典型增生的比率难于追踪，因为该诊断的报告不是肿瘤登记中所必需的，并且该诊断在SEER数据中没有记录。在20世纪80年代和90年代，几个大型研究证明AH构成所有良性乳腺活组织检查的少于5%33，34。在近来的大型病史事件中，非典型增生代表所有良性乳腺活组织检查的4%35。更近来的非典型增生比率报告达到所有良性乳腺活组织检查的7%36。在奥博恩山医院跟踪活组织检查结果显示从1997年至2004年ADH加倍并且LCIS增加3倍(表A)。这最可能至少部分地是由于乳房X射线摄影筛查增加，因为ADH最经常随着异常乳房X射线摄影而被鉴定37。应当注意的是，在经历预防性乳房切除术、处于极高的乳癌遗传风险的女性乳房样本的最近前瞻性研究中，57%的所述女性中发现这些高风险病变38。在这些当中，37%是非典型小叶增生(ALH),39%是非典型导管增生(ADH)、以及25%是LCIS38。非典型增生最经常是在为异常乳房X射线摄影或物理发现所做的乳腺活组织检查中被诊断，而且还可以被乳头吸取、随机乳晕旁细针抽取和导管灌洗所证实8。表A.活组织检查结果的变化趋势ADH/ALHLCISDCIS浸润性总活组织检查1997l月至6月7(3.3%)2(0.9%)16(7.6%)40(18.90/o)2112004l月至6月20(5,7%)12(3.4%)20(5.7%)55(1.5.60/o)352本文所用的"生物样品"指从对象(优选人类对象)中得到的生物材料样品，包括组织、组织样品、细胞样品，例如组织活组织检查比如抽吸活组织检查、刷拭活组织检查、表面活组织检查、针吸活组织检查、钻取活组织检查、切除活组织检查、开放性活组织检查、切口活组织检查或内窺镜活组织检查，以及肿瘤样品。生物样品还可以是生物流体样品。在一个实施方案中，所述生物样品是尿液。然而，还可以使用血液、血清、血浆、唾液、脑脊液、乳头吸出物、以及细胞裂解物上清。本发明的实施方案还包括在本发明的方法中使用生物样品的分离物。本文所用的生物样品的"分离物"(例如组织活肺瘤样品的分离物)指从样品中隔离、衍生、提取、纯化或分离出来的材料或组分(例如生物材料或组分)，并且优选地基本不含有不期望的组分和/或与生物样品相关的杂质或污染物。本文所用的"组织样品"指从对象(例如人类对象)的完整组织中得到或取出的组织部分(portion)、片(piece)、局部(part)、片段(segment)或块(fraction),在一个实施方案中，所述组织样品是乳房组织。本文所用的"对象"或"患者"通常指哺乳动物。在一个实施方案中，处理生物样品从而阻止蛋白质或mRNA的降解，例如ADAM12蛋白、ADAM12mRNA、MMP9蛋白、MMP9mRNA。抑制或阻止降解的方法包括但不限于利用蛋白酶或RNA酶抑制剂处理生物样品，冷冻生物样品，或将生物样品放置在冰上。优选地，在分析之前，一直将生物样品或分离物放置在防止蛋白质或RNA(例如ADAM12蛋白、ADAM12mRNA、MMP9蛋白质、MMP9mRNA)降解的条件下。本文所用的术语"乳癌风险增加"用于指不同于一般人群的乳癌风险增加。乳癌风险增加的人需要监测乳癌的发生。乳癌风险增加的人需要监测乳癌风险标志物的连续存在、新的乳癌风险标志物的产生或发现存在乳癌风险标志物。乳癌风险标志物包括本发明的蛋白质、风险的遗传标志物(包括但不限于BRCA1和BRCA2)、乳癌家族史、吸烟习惯或既往吸烟习惯、饮酒和技术人员已知的其它乳癌风险标志物。本文所用的"连续监测"是否存在MMP9或ADAM12、或"连续监测"ADAM12水平是指不止一次地例如每季度、每两月、每月、每两周、每周、每三天或每天检测样品中是否存在MMP9或ADAM12,或测量样品中ADAM12水平。连续监测包括在技术人员认为必要的规律性间隔内定期测量。本文所用的术语"标准水平"指从被认为未患癌症的"正常"或"健康"对象中得到的一个或多个生物样品中测定的ADAM12或MMP9的基线量。一旦为标准群体很好地建立了水平，来自试验生物样品中的结果可直接与已知的标准水平进行比较。例如，可至少从一个对象中得到基线并且优选地从对象的平均数(例如n=2至100或更多)得到基线，其中所述对象没有既往癌症史。本文所用的术语"标准水平"还旨在包括根据进行乳癌风险监测的对象测定的ADAM12或MMP9的基线量。例如，不必直接将对象样品中ADAM12或MMP9的量与从正常对象中得到的标准水平进行比较，而是可以测量从对象中得到的多个生物样品中存在的ADAM12或MMP9水平在一定时期内的变化，例如用于比较的标准水平是从对象得到的第一个生物样品中所测的ADAM12或MMP9。在一定时期内所测ADAM12或MMP9水平升高表示乳癌风险增加。作为替代，当测试乳癌风险降低策略的治疗效果时，所测ADAM12水平和/或所测MMP9水平随时间的降低表示乳癌风险降低策略是有效的。本文所用的"一定时期"旨在包括几天、几周、几月或甚至几年的时期。一定时期内从对象中得到的多个生物样品，即在不同时间间隔内定期从对象得到生物样品，可以任何间隔从对象得到生物样品。例如，可数周、数月或数年地每天得到生物样品。作为替代，可每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、或每周六次在数周、数月或数年的时期内得到生物样品。在一个实施方案中，在3个月的时期内每周一次得到生物样品。在一个实施方案中，在数月或数年的时期内每月一次得到生物样品。为了进行比较，待测生物样品中ADAM12或MMP9水平与用于基线标准水平测定的类型相同(从相同生物源中得到)。例如，在本发明的一个实施方案中，通过测量尿液中ADAM12蛋白水平来测量ADAM12水平。因此，通过测量正常、健康对象尿液中ADAM12蛋白水平来测量基线标准水平。在另一个实施方案中，通过测量组织样品中ADAM12mRNA转录物的量来测量ADAM12水平，并因此通过测量正常、健^象尿液中ADAM12mRNA转录物的量来测量基线标准水平。本文所用的相对于标准水平所测ADAM12或MMP9水平的"升高"意指，相对于标准ADAM12或MMP9水平，对象生物样品中ADAM12或MMP9的量或浓度更大。例如，相对于标准水平所测水平的升高可以是任何可检测的统计学显著的升高。这样的升高可包括但不限于相对于标准约1%、约10%、约20%、约40%、约80%、约2倍、约4倍、约8倍、约20倍、或约100倍升高，或更多。本文所用的术语"约"指lt值加或减所述数值的10%。ADAM12和MMP9的检测ADAM12和MMP9的检测(包括测量如本文所述的表达水平)可利用本领域技术人员公知的任何方法完成，包括但不限于亂欧电泳、色镨技术、免疫印迹分析、免疫组织化学、基于酶的免疫分析、质镨、高效液相色镨、表面等离子体共振、光学生物传感器、和/或抗体和蛋白质阵列(Ausubel,F.A.etal"eds"1990,CurrentProtocolsinMolecularBiology-GreenePublishingandWiley隱Interscience,NewYork,USA,Chapter10;MyszkaandRich2000，Pharm.Sci.Technol.Today3:310-317)。在一个实施方案中，应用抗体或抗体等价物来检测生物样品中的ADAM12和MMP9蛋白。在另一些实施方案中，使用其它的方法检测ADAM12和MMP9表达，比如通过分析mRNA转录物来测量表达。可以优选测量mRNA，例如当生物样品是肿瘤或组织样品时。在一个实施方案中，检测ADAM12的方法不同于检测MMP9的方法。例如，MMP9可通过酶镨法检测，而ADAM12可通过Western印迹检测。在一个实施方案中，本发明的方法可以与检测对象生物样品中其它分析物的方法同时进行，例如其它mRNA或蛋白质或小分子，例如其它的与癌症风险相关的标志物，例如与乳癌风险增加相关的标志物，例如与癌症相关的标志物。检测mRNA水平的方法是本领域技术人员熟知的。例如，通过Northern印迹可实现RNA转录物的检测，其中将RNA制备物进行变性琼脂糖凝胶电泳，并且转移到适当的支持物上，比如活化纤维素、硝化纤维素或玻璃膜或尼龙膜。然后将标记(例如放射性标记)cDNA或RNA与所述制备物杂交、冲洗并利用比如放射自显影进行分析。基于目标mRNA的已知序列(例如ADAM12，例如MMP9)产生杂交探针的方法是技术人员公知的。利用已知扩增方法可进一步实现RNA转录物的检测。例如，在本发明的范围内将mRNA反转录成cDNA之后进行聚合酶链式反应(RT-PCR);或如美国专利No.5,322,770所述在两个步骤中利用单一酶，或将mRNA反转录成cDNA之后进行R.L.Marshall等人(PCRMethodsandApplications4:80-84(1994))所述的对称缺口脂肪酶链式反应(RT-AGLCR)。一种检测ADAM12mRNA转录物的适当方法描述于参考文献Pabic等人Hepatology,37(5):1056-1066,2003中，在此以其整体通过参考并入本文。基于已知的目标基因之核,列产生扩增引物的方法是技术人员熟知的。在此可使用的其它已知的扩增方法包括但不限于描述于PNASUSA87:1874-1878(1990)中以及描述于Nature350(No.6313):91-92(1991)中的所谓"NASBA"或"3SR"技术、描述于公开的欧洲专利申请(EPA)No.4544610中的Q-P扩增、描述于GT.Walker等人Clin.Chem.42:9-13(1996)和欧洲专利申请No.684315中的链置换扩增法、以及PCT公开WO9322461中所述的乾介导的扩增。还可使用原位杂交显示，其中放射性标记的反义RNA探针与活组织检查样品的薄切片杂交、清洗、用RNA酶切割并暴露于感光乳剂中用于放射自显影。可用苏木素对样品进行染色以确定样品的组织学组成，并利用适当的滤光器进行暗场成像显示已显影的乳剂。还可使用非放射性标记比如洋地黄毒普。作为替代，可在DNA阵列、芯片或微阵列上检测mRNA表达。与目标基因(例如ADAM12或MMP9)对应的寡核苷酸被固定在芯片上，然后所述芯片与从对象所得试验样品的标记核酸进行杂交。利用含有目标基因(例如ADAM12或MMP9)之转录物的样品得到阳性杂交信号。制备DNA阵列的方法及其应用是本领域熟知的(见例如美国专利Nos:6，618，6796、6，379，897、6,664,377、6,451,536、548,257;U.S.20030157485和Schenaetal.1995Science20:467-470;Gerholdetal.1999TrendsinBiochem.Sci.24,168-173;和Lennonetal.2000DrugdiscoveryToday5:59-65,在此以其整体通过参考并入本文)。还可进行基因表达系列分析(SAGE)(见例如美国专利申请20030215858)。为了监测mRNA水平，例如，从待检测生物样品中提取mRNA并进行反转录，产生荧光标记的cDNA探针。然后用标记cDNA探针探测能与目标cDNA(例如ADAM12或MMP9)杂交的微阵列，扫描微阵列并测量荧光强度。该强度与杂交强度和表达水平相关。当生物样品是流体样品比如血液或尿液时，还可检测蛋白质(例如ADAM12或MMP9)，包括测量蛋白质水平，包括测量蛋白质活性。在一个实施方案中，通过将生物样品与基于抗体的结合结构相接触来检测蛋白质例如ADAM12或MMP9，所逸基于抗体的结合结构与该蛋白质或该蛋白质的片段特异性结合。然后检测抗体-蛋白质复合物的形成，并可以测量这种形成以指示蛋白质水平。术语"基于抗体的结合结构"或"抗体"包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性决定簇，例如含有与目标蛋白质(例如ADAM12，例如MMP9)特异性结合的抗原结合位点的分子。术语"基于抗体的结合结构"意指包括例如任何亚型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的所有抗体并包括还与目标蛋白质(例如ADAM12，例如MMP9)特异性反应的其片段。可利用常规技术切割抗体片段。因此，该术语包括抗体分子的能与某蛋白质选择性反应的蛋白水解切割或重组制备部分的片段。这种蛋白水解和/或重组片段的非限定性实例包括Fab、F(ab，)2、Fab，、Fv、dAb以及含有通过连接肽连接的VL以及VH域的单链抗体(scFv)。所述scFv可以共价键或非共价键相连接形成具有两个或多个结合位点的抗体。因此，"基于抗体的结合结构"包括多克隆、单克隆、或其它纯化的抗体制备物以及重组抗体。术语"基于抗体的结合结构"还包括人源化抗体、双特异性抗体、以及具有至少一个来源于抗体分子的抗原结合决定簇的嵌合分子。在一个优选实施方案中，所述基于抗体的结合结构被可检测地标记。本文所用的"标记抗体"包括通过可检测的方法进行标记的抗体并且包括但不限于被用酶、放射性、荧光、以及化学发光标记的抗体。还可利用可检测标签标记，比如c-Myc、HA、VSV-G、HSV、FLAG、V5或HIS。在利用基于抗体的结合结构检测目标蛋白质(例如ADAM12,例如MMP9)的本发明方法中，生物样品中存在的目标蛋白质水平与可检测标记之抗体发出的信号强度相关。在一个实施方案中，通过将抗体与酶相连接对基于抗体的结合结构进行可检测标记。当暴露于其底物时，所述酶将依次与底物反应，以产生可被例如分光光度、荧光或可视方法检测的化学结构。可用于可检测标记本发明抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-v-类固醇异构酶、酵母醇脱氲酶、a-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、门冬跣胺酶、葡萄糖氧化酶、P-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶以及乙酰胆喊酯酶。化学发光是可用于检测基于抗体的结合结构的另一种方法。还可利用多种其他免疫分析中的任一种进行检测。例如，通it^:射性标记抗体，可通过利用放射性免疫分析来险测抗体。可通过利用诸如y-计数器或闪烁计数器或放射自显影等方法ilb险测放射性同位素。对于本发明目的特别有用的同位素是311、mI、35S、"C，并且优选1251。还可以利用荧光化合物来标记抗体。当荧光标记的抗体^L^露于适当波长的光时，可利用荧光检测其存在。其中最常用的荧光标记化合物是CYE染料、异硫氰酸荧光素、罗丹明、phycoerytherin、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻&甲醛以及荧光胺。还可利用荧光发射金属比如152Eu或其它镧系金属可检测地标记抗体。这些金属可利用比如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属螯合基团与抗体结合。还可通过将抗体与化学发光化合物偶联可检测标记抗体。然后在化学反应期间通过检测是否存在发光的来测定化学发光-抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、劳光素、异鲁米诺、theromatic吖咬絲酯、咪唑、吖咬鎗盐以及草酸酯。如上所述，可通过免疫分析比如酶^JL疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫放射分析(IRMA)、Western印迹、或免疫组化来检测本发明的蛋白质(例如ADAM12,例如MMP9)，下面更详细地描述各种免疫分析法。通常更优选可非常快速地进行检测的免疫分析比如ELISA或RIA。还可使用抗体阵列或蛋白质芯片，见例如美国专利申请No:20030013208A1、20020155493Al、20030017515以及美国专利No:6,329,209、6,365,418，，在此以其整体作为参考并入本文。免疫分析"放射免疫分析"是利用标记(例如放射性标记)形式的抗原检测或测量抗原浓度的技术。抗原的放射性标记的实例包括311、"C、和1251。通过将生物样品中抗原与标记(例如it射性标记)抗原竟争性地与抗原之抗体相结合来测量生物样品中抗原(例如ADAM12，例如MMP9)的浓度。为了保证标记抗原与未标记抗原之间竟争性结合，标记抗原以足够饱和抗体结合位点的浓度存在。样品中抗原浓度越高，结合抗体的标记抗原的浓狄低。在放射免疫分析中，为了测定与抗体结合的标记抗原的浓度，必须将抗原-抗体复合物与游离抗原分开。将抗原-抗体复合物与游离抗原分开的一种方法是将抗原-抗体复合物与抗亚型抗血清沉淀。将抗原-抗体复合物与游离抗原分开的另一种方法是将抗原-抗体复合物与福尔马林杀死的金黄色葡萄球菌(S.aureus)进行沉淀。将抗原-抗体复合物与游离抗原分开的又一种方法是当抗体与琼脂糖微珠、聚苯乙烯孔、聚氯乙烯孔、或微量滴定孔(例如共价键)结合时，进行"固相放射性免疫标记"。将与抗体结合的标记抗原浓度与基于样品中已知浓度的抗原标准曲线相比较，可测定生物样品中抗原的浓度。"免疫放射分析"(IRMA)是抗体试剂被放射性标记的免疫分析。IRMA需要产生多价抗原缀合物，这可以通过比如与例如兔血清白蛋白(RSA)等蛋白质相缀合的技术。多价抗原缀合物必须每分子中具有至少两个抗原残基并且所述抗原残基必须分开有足够的距离以允许至少两个抗体与抗原结合。例如，在IRMA中，多价抗原缀合物可附着到固体表面比如塑料球上。未标记的"样品"抗原与放射性标记的抗原之抗体添加到含有多价抗原缀合物包被球的试管中。样品中的抗原与多价抗原缀合物竟争抗原抗体结合位点。孵育适当的时间后，通过清洗除去未结合的反应物并测定固相中放射活性的量。结合的放射活性抗体的量与样品中抗原浓度呈反比。最常用的酶免疫分析是"酶联免疫吸附测定(ELISA)"。ELISA是利用标记(例如酶联接的)形式的抗体险测和测量抗原浓度的技术。具有不同形式的ELISA,这是本领域技术人员熟知的。本领域中公知的ELISA标准技术描述于"MethodsinImmunodiagnosis"第二版，RoseandBigazzi,eds.JohnWiley&Sons,1980、Campbelletal""MethodsandImmunology",W.A.Benjamin,Inc.,1964、以及Oellerich,M.1984，J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,22:895-904中。在"三明治ELISA"中，抗体(例如抗ADAM12，例如抗MMP9)与固相(即微滴定板)连接，并暴露于含有抗原(例如ADAM12，例如MMP9)的生物样品中。然后清洗固相除去未结合的抗原。然后，如果存在的话，(例如酶连接的)标记抗体与结合抗原相结合，从而形成抗体-抗原-抗体三明治夹心。可与抗体连接的酶的实例是碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶、脲酶以及β-半乳糖苷酶。酶联抗体与底物反应产生可被测量的有色反应产物。在"竟争性ELISA，，中，用含有抗原(例如ADAM12，例如MMP9)的样品孵育抗体。然后将抗原-抗体混合物与包被有抗原(例如ADAM12,例如MMP9)的固相例如微滴定;M目接触。样品中存在的抗原越多，可与固相结合的游离抗体将越少。然后将标记的(例如酶联的)笫二抗体添加到固相中，以测定与固相结合的第一抗体的量。在"免疫组化分析"中，将组织暴露于特异性针对待分析蛋白质的抗体，以检测组织切片的特异性蛋白质。然后利用M多种方法观察抗体测定所存在的蛋白质及其量。用于观察抗体的方法实例是例如通过酶联的抗体，例如荧光素酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、或P-半乳糖苷酶或化学法例如DAB/底物显色。基于目前的公开内容，根据操作者的爱好，可使用其它技术检测本发明的蛋白质(例如ADAM12，例如MMP9)。一种这样的技术是Western印迹(Towbinetat.，Proc.Nat.Acad.Sci.76:4350(1979))，其中在转移到固体支持物比如硝化纤维素滤膜上之前经SDS-PAGE凝胶电泳适当处理的样品。然后，当存在与蛋白质(例如ADAM12，例如MMP9)之量相对应的可检测标记的信号强度时，可检测标记的抗体(例如抗ADAM12，例如MMP9)的水平。水平可被定量:例如通过密度计量学质镨此外，可利用质镨比如MALDI/TOF(飞行时间)、SELDI/TOF、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色镨-质谱(GC-MS)、高效液相色镨-质谱(HPLC-MS)、毛细管电泳-质镨、核磁共振质镨、或串联质镨(例如MS/MS、MS/MS/MS、ESI-MS/MS等)来检测蛋白质(例如ADAM12，例如MMP9)。见例如美国专利申请Nos:2003019卯01、20030134304、20030077616，其通过引用并入本文。质谱法是本领域熟知的并且已经用于定量和/或鉴定生物分子比如蛋白质(见例如Lietal.(2000)Tibtech18:151-160、Rowleyetal.(2000)Methods20:383-397、以及KusterandMann(1998)Curr.Opin.StructuralBiol.8:393-400)。而且，质镨技术已经发展为允许至少部分对分离蛋白质进行从头测序。Chaitetal.，Science262:89-92(1993);Keoughetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96:7131-6(1999);reviewedinBergman,EXS88:133-44(2000)。在某些实施方案中，使用气相离子分光光度计。在另一些实施方案中，使用激光解pA/电离质镨分析样品。现代的激光解pA/电离质谱("LDI-MS)可以两种主要变化形式进行基质辅助激光解吸l/电离("MALDI")质镨和表面增强激光解吸/电离("SELDI")。在MALDI中，分析物与含有基质的溶液混合，并将一滴液体放置于衬底的表面上。然后将基质溶液与生物分子共结晶。将所述衬底插入到质谱仪中。激光能量直接传到底物表面，并在那里吸收和电离生物分子而不使生物分子显著地片段化。然而，作为分析工具，MALDI具有局限性。它不能提供分级分离样品的手段，并且基质物质可干扰检测，尤其是低分子量分析物的检测。见例如美国专利No.5，118，937(Hillenkampetal.)和美国专利No.5,045,694(Beavis&Chait)。在SELDI中，底物表面被修饰使得其在解吸附过程中是主动参与者。在一个变化方案中，表面被吸附剂和/或与目标蛋白质选择性结合的捕获试剂衍生化。在另一个变化方案中，利用当被激光冲击时不解吸的能量吸收分子将表面衍生化。在另一个变化方案中，利用与目标蛋白质结合并含有施用激光时断裂的光解键的分子将表面衍生化。在每个这样的方法中，衍生化剂通常位于施加样品的衬底表面的特殊位置上。见例如美国专利No.5,719,060和WO98/59361。例如可利用SELDI亲和表面捕获分析物以及将含有基质的液体添加到被捕获分析物中以提供能量吸收物质而将这两种方法相组合。对于有关质镨的更多信息,见例如PrinciplesofInstrumentalAnalysis,3rdedition.,Skoog,SaundersCollegePublishing,Philadelphia,1985和Kirk-OthmerEncyclopediaofChemicalTechnology,4.sup.thed.Vol.15(JohnWiley&Sons,NewYork1995)，pp.1071-1094。检测标志物或其它物质的存在一般包括检测信号强度。这依进而反映与底物结合的多肽的量和性质。例如，在某些实施方案中，可比较第一样品和第二样品的镨中的峰值信号强度(例如通过观察、计算机分析等)以测定特定生物分子的相对量。软件程序比如BiomarkerWizard程序(CiphergenBiosystems，Inc.,Fremont,Calif.)可用于帮助分析质镨。所质谱仪及其技术是本领域技术人员熟知的。本领域任何技术人员了解质普仪的任何组件例如解吸附源、质量分析器、检测等，并且不同的样品制备物可与在此所述的或本领域公知的其它适当组件或制备物相组合。例如，在一些实施方案中，对照样品可含有重原子例如13C,从而允许试验样品与已知的对照样品在同一个质镨操作中相混合。在一个实施方案中，使用激光解吸飞行时间(TOF)质镨仪。在激光解吸镨仪中，带有结合标志物的底物被引入进口系统中。所述标志物被解吸附并被电离源的激光电离为气相。利用离子光学系统收集产生的离子，然后在飞行时间质量分析器中，离子被短时间高电压场加速并漂移到高真空室中。在所述高真空室的远端，被加速的离子在不同时间撞击敏感探测器表面。因为飞行时间是离子质量的函数，所以可应用离子形成和离子检测器轰击之间的流逝时间来确定是否存在特定质荷比的分子。在一些实施方案中，利用可编程数字计算机执行数学算法来部分地测定第一或第二样品中存在的一种或多种生物分子的相对量。所述算法鉴定第一个质镨和第二个质镨中的至少一个峰值。然后该算法比M谱中第一个质谱的峰值信号强度与第二个质谱的峰值信号强度。相对信号强度指示第一个样品和第二个样品中存在的生物分子的量。含有已知量生物分子的标准可作为第二个样品进行分析以提供更好地定量第一个样品中存在的生物分子的量。在某些实施方案中，还可测定第一个样品和第二个样品中生物分子的身份。在一个实施方案中，通过MALDI-TOF质谱检测本发明的蛋白质例如ADAM12，、如MMP9。其它测定还可利用其它生物学测定例如测量活性来测量蛋白质(例如ADAM12,例如MMP9)的水平，这包括但不限于酶镨法。酶镨法是本领域技术人员熟知的并被描述于Heusenetal.，Anal.Biochem.，(1980)102:196-202、Wilsonetal.,JournalofUrology,(1993)149:653-658、Hernonetal"J.Biol.Chem.(1986)261:2814-2828，Braunhutetal"J.Biol.Chem.(1994)269:13472-13479、Mosesetal.,CancerResearch58，1395-1399，April1，1998;U.S.Pat.Appl.SerialNo.08/639,373以及美国专利No.6，037，138and6,811,995中，;此以其整体通过引用并入本文。检测生物样品中ADAM12和MMP9的方法还包括使用表面等离子体共振(SPR)。在该分析中，结合ADAM12或MMP9的抗体不必被可检测地标记并且可不需要结合特定多肽的第二抗体而进行使用。例如，ADAM12或MMP9的特异抗体可与适当的固体衬底结合然后暴露于样品。可利用表面等离子体共振现f^r测ADAM12或MMP9与抗体在固体衬底上的结合,这可在通itil:当仪器例如Biacorei殳备(BiacoreInternationalAB,Rapsgatan，瑞典)定性或定量地检测结合时导致表面等离子体共振强度的变化。还可设想将光学生物传感器用于本发明的实施方案中.所述SPR生物传感技术已经与MALDI-TOF质镨相组合用于生物分子的解吸附和鉴定。在基于芯片的BIA-MS方法中，配体(例如ADAM12或MMP9抗体)被共价固定在芯片的表面上。样品中的蛋白质通过芯片，并且相关物质被配体结合。清洗步骤之后，通过MALDI-TOF质镨分析被洗脱的蛋白质。所述系统可以是全自动的过程并且适用于检测和表征复杂的生物流体中存在的蛋白质以及低至亚飞摩尔水平的细胞提取物。抗体本发明中所用的抗体可从商业来源得到。抗-MMP抗体可从OncogeneSciences,Cambridge,Mass购得。或者，可制备抗全长多狀或抗部分多肽(例如ADAM12，例如MMP9)的抗体。制备ADAM12抗体的方法公开于PCT申请WO97/40072或美国专利申请No.2002/0182702中，其通过引用并入本文。可利用制备抗体的标准方法制备本发明中所用的抗体，例如通过单克隆抗体制备技术(Campbell,A.M.,MonoclonalAntibodiesTechnology:LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,theNetherlands(1984)、St.Grothetal"J.Immunology,(19卯)35:1-21以及Kozboretal"ImmunologyToday(1983)4:72)。还可通过本领域中熟知的方法利用蛋白质的抗原部分筛选抗体库比如噬菌体展示库而容易地得到抗体。例如，美国专利5,702,892(U.S.A.Health&HumanServices)和WO01/18058(NovopharmBiotechInc.)公开了噬菌体展示库以及制备抗体结合结构域片段的选择方法。个人历史参数可使用测量对象发生乳癌风险的另外因素。具体而言，可检查多种因素包括年龄、种族特性、生育史、月经史、口月腿孕药的使用、体重指数、饮酒史、吸烟史、运动史、饮食以提高本方法的预测准确度。亲属癌症史以及所述亲属被诊断患有癌症的年龄也是重要的个人历史M。分析中纳入个人历史^lt以及是否存在MMP9和ADAM12的标志物数据预测乳癌是以下述理解作为基础几乎所有癌症来自于个体基因与基因作用环境之间的动态相互作用。在一个实施方案中，对象的年龄包括在乳癌风险的评估中。监测乳癌风险的方法
技术领域：
：本发明的实施方案还提供了指导对象医疗保健的方法。在一个实施方案中，所述方法包括从对象得到生物样品并检测生物样品中是否存在ADAM12以及是否存在MMP9，生物样品中同时存在ADAM12和MMP9的检测用于指导包括第二次检测方法的医疗保健。在一个实施方案中，分别通过检测MMP9水平变化与ADAM12水平变化来测量MMP9的存在状态与ADAM12的存在状态。在一个实施方案中，来自对象的生物样品中ADAM12的存在状态与MMP9的存在状态各自独立地用于评估对象中乳癌风险。在另一个实施方案中，所述指导医疗保健的方法包括通过检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中ADAM12水平来评估对象的乳癌风险，并将该水平与标准的ADAM12水平进行比较，其中与标准水平相比较，升高的ADAM12水平表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估用于指导包括第二次检测方法的医疗保健。作为替代，当升高的水平表明乳癌风险增加时，可测量MMP9水平或同时测量MMP9和ADAM12。在一个实施方案中，在乳癌风险的评估之上进行第二次检测步骤。第二次检测步骤包括但不限于检测或诊断乳癌的方法以及检测对象中病变例如非典型增生例如LCIS的方法。可使用任何多种其它检测或诊断步骤，比如乳房X射线摄影、超声、MRI、乳房电阻抗(T-扫描)分析、热成像或任何其它成像技术、活组织检查、临泉险查、ductogram、导管灌洗、核医学分析比如乳房闪烁扫描、乳房热成l象或其它方法。在一个实施方案中，使用国际申请WO05/071387"Methodsfordiagnosisandprognosisofcancersofepithelialorigin"中的方法。在一个实施方案中，在评估乳癌风险增加时将检测方案用于指导对象，例如常规的乳房X射线摄影方案，例如每年一次，或每六个月、四个月、三个月或两个月一次；早期乳房X射线摄影方案，例如在25、30、35岁开始进行的乳房X射线摄影测试；一次或多次活组织检查程序，例如在40岁开始的常规活组织检查方案。许多遗传标志物与乳癌相关。这些标志物的实例包括癌胚抗原(CEA)(Mughaletal"249JAMA1881(1983))、MUC-1(Frische和Liu，22J.Clin.Ligand320(2000))、HER國2/neu(Harisetal"15ProcAmSocClinOncology-.A96(1996))、uPA、PAI國1、LPA、LPC、RAK以及BRCA(EstevaandFritsche,SerumandTissueMarkersforBreastCancer,inBREASTCANCER,286-308(2001))。在一个实施方案中，BRCA1、BRCA2或其它乳癌遗传标志物或乳癌标志物的任何组合的基因型分析可用于进一步监测对象中乳癌风险。此外，可4艮据个体对象中ADAM12和MMP9状态来监测乳癌风险。例如，对于ADAM12状态是阴性而MMP9状态是阳性的对象，可监测对象ADAM12状态和MMP9状态随时间的变化。预防乳癌的方法
技术领域：
：本发明的实施方案还提供了指导对象医疗保健的方法，其中指导所述对象进行医疗保健以降低乳癌风险。例如，检测来自对象的生物样品中同时存在ADAM12和MMP9来指导医疗保健以降低乳癌风险。在一个实施方案中，来自对象的生物样品中ADAM12的存在状态与MMP9的存在状态各自独立地用于评估对象中乳癌风险。在一个实施方案中，使用来自对象的生物样品中ADAM12的存在状态与MMP9的存在状态来评估对象中乳癌风险，其中当评估对象的乳癌风险增加时，指导用于降低乳癌风险的医疗保健。在一个实施方案中，通过检测MMP9水平变4匕与ADAM127JC平变化来测量MMP9的存在状态与ADAM12的存在状态。在一个实施方案中，检测来自根据Gail5年风险模型处于乳癌低风险之对象的生物样品中ADAM12水平并将该水平与标准的ADAM12水平进行比较，其中与标准水平相比较，升高的ADAM12水平表示乳癌风险增加，并且其中风险增加的评估用于指导包括降低乳癌风险的医疗保健。作为替代，当升高的水平表明乳癌风险增加时，可测量MMP9水平或同时测量MMP9和ADAM12。乳癌风险降低包括防止性的预防性治疗。例如，指示或施用防止性的预防性治疗以降低乳癌相关病症发生或逸艮的概率。这些治疗有时是治疗性的，有时则延迟、减轻或停止乳癌的逸艮。任何已知的用于减轻或预防乳癌发生的防止性或治疗性处理均可被执行和/或施用，其包括选择性激素受体调节剂，例如选择性雌激素受体调节剂(SERM)比如他莫昔芬、雷洛昔芬和托瑞米芬；预防激素产生的组合物，例如预防肾上腺中产生雌激素的aramotase抑制剂，比如依西美坦、来曲唑、阿那曲哇、戈舍瑞林、以及曱地孕酮；其它的激素治疗例如醋酸戈舍瑞林和氟维司群(fulvestrant);生物反应修饰物比如抗体例如曲妥珠单抗(herceptin/HER2);手术例如乳房肿瘤切除术和乳房切除术；延迟或停止转移的药物，例如帕米膦酸钠；以及替^R/补充医学例如针术、针压法、灸术、气功、灵气、印度药草学、维生素、矿物质、以及草药例如黄芪根、牛蒡根、大蒜、绿茶、以及甘草根。A.他莫西芬他莫西芬(NOLVADEX)是非甾体类抗雌激素，以杼檬酸他莫西芬提供。可购得10mg或20mg片剂的杵檬酸他莫西芬片。每片10mg的片剂含有15.2mg柠檬酸他莫西芬，相当于10mg他莫西芬。无活性的成分包括羧甲基纤维素钙、硬脂酸镁、甘露醇和淀粉。柠檬酸他莫西芬是三苯乙烯衍生物的反式异构体。化学名是(Z)2-[4-(l，2-联苯基-l-丁烯基)苯緣-N，N-二甲基乙胺2-羟基-l，2,3丙三羧酸盐(l:l)。柠檬酸他莫西芬的分子量是563.62，pKa，是8.85，37℃时在水中的平衡溶解度0.5mg/mL，37℃时在0.02NHC1中的平衡溶解度0.2mg/mL。在动物试验系统中，柠檬酸他莫西芬具有强效的抗雌激素性质。虽然确切的作用机制未知，抗雌激素作用可能与其能在靶组织比如乳房中与雌激素竟争结合位点有关。他莫西芬抑制由二甲基苯并蒽(DMBA)诱导的大鼠乳房癌并在大鼠中引起DMBA诱导的肿瘤原位衰退。在该模型中，他莫西芬似乎通过结合雌激素受体发挥其抗肿瘤作用。口服后，他莫西芬被广泛地代谢。接受20mg放射性标记(TIC)他莫西芬的女性研究中已经显示约65。/。的施用剂量在2周内从身体排泄掉(主要通过粪便途径)。N-去曱基他莫西芬是在患者血浆中发现的主要代谢物。N-去甲基他莫西芬的生物活性似乎与他莫西芬相似。4-羟基他莫西芬以及他莫西芬的侧链伯醇衍生物已被确认为血浆中的次要代谢物。单次口服20mg剂量il后，月艮用后大约5小时出现40ng/mL(范围35至45ng/mL)的平均峰值血浆浓度。他莫西芬的血浆浓度的下降是双相的，终末消除半衰期是约5至7天。N-去曱基他莫西芬的平均峰值血浆浓度15ng/mL(范围10至20ng/mL)。患者每日两次长期施用10mg他莫西芬3个月导致他莫西芬的平均稳态血浆浓度为120ng/mL(范围67至183ng/mL)以及N-去甲基他莫西芬的平均稳态血浆浓度为336ng/mL(范围148至654ng/mL)。每日一次施用20mg他莫西芬3个月，他莫西芬和N-去甲基他莫西芬的平均稳态血浆浓度分别为122ng/mL(范围71至183ng/mL)和353ng/mL(范围152至706ng/mL)。开始治疗后，他莫西芬在约4周内达到稳态浓度并且N-去甲基他莫西芬在约8周内达到稳态浓度，提示该代谢物的半衰期约14天。对于乳癌患者，推荐的日剂量为20至40ma。大于20mg/日的剂量应当以分开的剂量服用(早晨和晚上)。然而，预防性的剂量可以更低。B.雷洛昔芬盐酸雷洛昔芬(EVISTAtm)是属于苯并瘗吩类化合物的选择性雌激素受体调节剂(SERM)。其化学名称是甲酮，[6-羟基-2-(4-羟苯基)苯并[b噻吩-3-基-[4-[2-(l-哌啶基)乙氧基苯基-盐酸盐。盐酸雷洛昔芬的经验式是C28H27N04S.HCl，对应分子量510.05。盐酸雷洛昔芬是在水中极微溶的近白色至浅黄色固体。盐酸雷洛昔芬被提供为用于口服施用的片剂剂型。每片含有60mg盐酸雷洛昔芬，其摩尔当量是55.71mg游离碱。无活性成分包括无水乳糖、棕榈蜡、交联聚维酮、ED&CBlueNo.2铝色淀、羟丙基甲基纤维素、乳糖一水合物、硬脂酸镁、I改性药用釉、聚乙二醇、吐温80、聚维酮、丙二醇以及二氧化钛。雷洛昔芬的生物学作用与雌激素相似，是通过与雌激素受体结合进行调节的。临床前数据证明雷洛昔芬在尿液和乳房组织中是雌激素拮抗剂。初步临床数据(历经30个月)提示EVISTA对子宫和乳房组织缺少雌激素##用。口服后雷洛昔芬迅速被吸收。约60%的口服剂量被吸收，但是全身分布前的葡糖苷酸缀合是广泛的。雷洛昔芬的绝对生物利用Jbl:2.0%。达到平均最大血浆浓度和生物利用度的时间是全身相互转化和进入肝循环雷洛昔芬及其葡糖苷酸代谢物的函数。口服施用单次剂量30至150mg盐酸雷洛昔芬后，表现体积分布是2.348L/kg并且不是剂量依赖性的。口服施用14C标记的雷洛昔芬后，测定了其在人中的生物转化和分布。雷洛昔芬经历广泛的首过代谢变成葡糖苷酸缀合物雷洛昔芬-4，-葡糖苷酸、雷洛昔芬-6-葡糖苷酸、以及雷洛昔芬-6，4，-二葡糖苷酸。尚未检测到其它的代谢物，这提供了强有力的I证据表明雷洛昔芬不经过细胞色素P450途径代谢。血浆中未缀合的雷洛昔芬少于总标记物质的1%。雷洛昔芬和葡糖苷酸的血浆浓度曲线的终末对数线性部分通常平行。这与雷洛昔芬和葡糖苷酸代谢物的相互转化一致。静脉内施用后，雷洛昔芬以近似肝血流的速度被清除。表观血浆清除率是44.1L/kg/小时。雷洛昔芬及其葡糖苷酸缀合物通过可逆的全身代谢进入肝循环进行相互转化，由此，口服施用后其血浆消除半衰期延长至27.7小时。单次口服剂量雷洛昔芬的结果预测多剂量药物动力学。长期施用后，清除范围是40至60L/kg/小时。增加盐酸雷洛昔芬的刑量(30至150ma)导致血浆时间浓度曲线(AUC)下面积略小于按比例增加。雷洛昔芬主要被排泄到粪便中，并且小于0.2。/。的雷洛昔芬以原形由尿液中排泄。少于6%的雷洛昔芬剂量以葡糖苷酸缀合物由尿液中消除。推荐剂量是每日一片60mg的片剂，可不考虑进食情况在每天的任何时间施用。预防性治疗还可包括施用血管生成抑制剂。血管生成抑制剂包括但不限于Aj6l管抑素(Angiostatin)、AVASTIN(bevacizumab)、美替克仑、癌抑素(Canstatin)、Combretastatin、内皮抑素、NM國3、凝血检蛋白(Thrombospondin)、肿瘤抑素(Tumstatin)、2曙甲Il^雌二醇、Vitaxin、ZD1839(Iressa)、ZD6474、OSI774(TARCEVA⑧/埃罗替尼)、CI1033、PKI1666、IMC225(ERBITUX⑧/西妥昔单抗)、PTK787、SU6668、SU11248、HERCEPTIN(曲妥珠单抗)，以及IFN-a、CELEBREX(塞来昔布)、THALOMID(沙利度胺)、罗格列酮、硼替佐米(bortezomib)(VELCADETM)、zolendronate二膦酸盐(ZOMETA)以及IFN國a。还提供了监测乳癌风险降低策ML治疗效果的方法。例如，当来自对象的生物样品中ADAM12的存在状态与MMP9的存在状态用于评估对象中乳癌风险时，ADAM12水平的降低和/或MMP9水平的降低指示乳癌风险降低策略是有效的。作为替代，根据Gail5年风险模型被认为处于乳癌低风险的对象中已升高ADAM12水平的降低指示乳癌风险降低策略是有效的。在一个实施方案中，根据Gail5年风险模型被认为处于乳癌低风险的对象中已升高MMP9水平的降低指示乳癌风险降低策略对对象是有效的。在一个实施方案中，根据Gail5年风险模型被认为处于乳癌低风险的对象中已升高ADAM12水平的降低和MMP9水平的降低指示乳癌风险降低策略对对象是有效的。检测试剂盒本发明还涉及用于检测MMP9和ADAM12的商品试剂盒。所述试剂盒可以是本领域一般技术人员熟知的任何构造，并用于进行一种或多种本文所述的检测ADAM12和MMP9的方法。所述试剂盒是方便的，因为它们提供许多(如果不是全部)的必要试剂用于实施检测生物样品中ADAM12和MMP9的测定。此外，该测定优选地与试剂盒中包含的一个标准或多个标准同时进行，比如预定量的蛋白质或核酸(例如ADAM12，例如MMP9),标准水平使得试验结果可被定量或验证。所述试剂盒包含用于检测蛋白质(例如ADAM12,例如MMP9)的装置，比如选择性结合所述蛋白质(例如ADAM12，例如MMP9)的抗体或抗体片段、或允许合成编码该蛋白质之cDNA的一组DNA寡核苷酸引物、或例如检测mRNA(例如ADAM12mRNA，例如MMP9mRNA)表达的DNA探针。所述检测试剂盒优选地配制成标准的两抗体结合形式，其中例如一种ADAM12特异性抗体捕获对象样品中的ADAM12以及另一种ADAM12特异性抗体用于检测被捕获的ADAM12。在另一个优选的试剂盒配方中，一种MMP9特异性抗体捕获对象样品中的MMP9以及另一种MMP9特异性抗体用于检测被捕获的MMP9。例如，捕获抗体被固定在固相上，例如测定板、测定孔、硝化纤维素膜、微珠、蘸棒(dipstick)、或洗脱柱的成分。第二个抗体(即检测抗体)通常用可检测标记(比如量热剂或放射性同位素)作为标签。在一个实施方案中，所述试剂盒包括检测尿样中目标蛋白质(例如ADAM12,例如MMP9)的方法。在一个具体实施方案中，所述试剂盒包含其上固定有抗体或片段(例如ADAM12，例如抗MMP9)的"蘸棒"，所述抗体或片段特异性结合目标蛋白质(例如ADAM12，例如MMP9)。然后可利用例如被量热剂或放射性同位素可检测标记的第二个抗体检测特异性结合的目标蛋白质(例如ADAM12，例如MMP9)。在另一些实施方案中，所述检测试剂盒可使用但不限于下述技术竟争性和非竟争性分析、放射免疫分析(RIA)、生物发光和化学发光分析、荧光分析、三明治分析、免疫放射分析、斑点印迹、酶联分析包括ELISA、微滴定板、表面等离子体共振、光学生物传感器、以及免疫细胞化学。对于每一种试剂盒，通过本领域技术人员熟知的方法确定分析的范围、灵敏度、精确度、可靠性、特异性和重现性。在一个实施方案中，所述检测试剂盒可包括检测其它生物标志物(例如乳癌标志物，例如乳癌风险标志物)的方法。上述检测试剂盒还提供使用说明。本文中所引用的所有参考文献以其整体通过引用并入本文。实施例1尿生物标志物提供一种新的非侵入式评估乳癌风险的方法方法研究群体邀请对象参加贝丝以色列迪克尼斯医学中心(theBethIsraelDeaconessMedicalCenter)、奥博恩山医院(theMountAuburnHospital)和达纳法布尔癌症研究所(theDanaFarberCancerInstitute)的外科临床、放射肿瘤临床和医学肿瘤临床的研究。年龄匹配的正常健康对照来自常规来BrighamandWomen'sHospital筛查乳房X射线摄影的女性，并且其被报告无慢性健康问题、无乳房疾病、具有正常的乳房X射线摄影照片并且未进行药物治疗。所有参加者在捐亂泉液时提供一伶洋细的病史表格。怀孕女性和哺乳期女性被排除在研究以外。利用改进Gail模型计算风险分数66，67尿样收集与处理如前所述收集尿液4。将样品收集在无菌容器中并立即在-201C冷冻。根据关于废弃临床材料的机构生物伦理指导原则收集尿液。分析之前，利用Multistix9尿分析试条(Bayer,Elkhart，IN)检测尿液中血液和白细胞的存在，并排除含有血液或白细胞的样品。根据厂商说明利用商品试剂盒(Sigma,St.Louis，MO)检测尿液肌酸酐浓度。利用牛血清白蛋白作为标准通过Bradford法检测尿液蛋白质浓度。从148名女性得到尿样44名AH女性患者、24名LCIS女性患者、以及80名健康对照。酶镨法利用我们实验室建立的制备方法处理尿样(美国专利序号08/639,373)并进行电泳和利用酶镨分析。根据我们先前的报道用明胶作为底物通过底物^电泳(酶镨)分析30微升的每个尿样4。利用单特异性抗体通过免疫印迹aiiMMP身份。Western印迹分析还原条件下通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质(20照)。已分离蛋白质经电泳转移到硝化纤维素膜上(Schleicher&Schuell，Keene，NH)并如前所述进行处理5。用增强化学发光显现标记蛋白质(PierceChemicalCompany,Rockford，IL)。分别以1μ/ml和2μg/ml浓度使用抗人ADAM12的多克隆抗体rbl226、S画18(sc-16526,SantaCruzBiotechnology,CA)。用增强化学发光显现标记蛋白质(PierceChemicalCompany,Rockford,IL)。利用UN-SCAN-ITTM(SilkScientific,Orem，UT)软舟数字化技术分析条带强度。利用酶镨进行MMP分析并利用单特异性抗体通过免疫印迹和随后的密度计量学测量(DU)分析ADAM12。乳房X射线摄影为了改进乳房X射线摄影结果沟通和提供结局监测以改进对象护理质量，美国放射学会(ACR)创立了乳房影像报告与数据系统(BI-RADS)7。评估分类如下。5/W"5"7表示阴性的乳房影像照片。对此没有评估。乳房对称并且无肿块，存在结构干扰或可疑钩化。5/JL42^2表示良性现象。5/i^4Z)SJ表示可能是或许良性现象并且建议短间隔期随访。该类现象应当具有非常高的良性概率(298%)。预期其不随随访间隔而变化，但是放射学者将倾向于确定其稳定性。5/iMD5W用于表示可疑的异常并应当考虑进行活组织检查。近期以来，该分类已经被重新分成a、b和c来表示可疑水平增加(轻度至中度)。5/WZW5高度提示是恶性的并且应当采^it当措施。当需要其它成像评估时使用5/i^4ZXy0。乳房密度分类如下所述1.几乎全部为脂肪的，2.离散的纤维腺体密度，3.密度不均匀，或4.极大密度。利用标准的美国放射学会(ACR)乳房影像报告与数据系统(BI-RADS)评估乳房影像学照片。统计分析利用卡方分析比较AH、LCIS和正常对照之间的尿MMP。使用方差分析(ANOVA)以及Bonferroni改进的比较用于评估3组之间ADAM12水平的差异68。利用向后选取法进行分步骤多元逻辑(logistic)回归分析来测定预测因子，通过考虑4种MMP、ADAM12作为连续变量、年龄以及用于评估统计学显著性的似然性比值^r验(LRT)中的Gail评分，所述预测因子用于区分对照与AH和LCIS69。利用作为ADAM12水平之函数估计AH概率的精确方法和概率曲线来确定比值比和95%置信区间(CI)，并且利用最终多变量模型的回归^(斜率和截距系数)推导出Gail5年风险评分7°。接受者操作特征(ROC)曲线分析用于评估ADAM12诊断的准确性、Gail分数以及区分正常和AH的组合71。利用SPSS软件包(version14.0，SPSSInc.,Chicago,IL)进行统计学分析。P<0.05的双尾值被认为是统计学显著性的。预先进行幂分析，其表示AH和LCIS各组中最小样本大小是24名对象以及80名对照将提供卯％次勒a=0.05，b=0，20)以在对象和对照之间每个MMP的阳性表达中检测20%差异，其中使用对于独立比例的二项式Z-检验72，利用ANOVA检验在各研究组之间平均ADAM12水平有30%差异(version6.0,nQueryAdvisor,StatisticalSolutions,Saugus，MA)。结果我们研究了148名女性尿液中MMP-9和ADAM12的表达44名ALH/ADH女性患者、24名LCIS女性患者与80名健康对照比较。连续检测多数研究对象尿液中的MMP-9、MMP-2、、MMP-9/NGAL复合物和ADAM12。MMP-9的4戈表性Sl镨和ADAM12的4&表性Western印示在图1中。大多数对象的年龄超过40岁并且是高加索人(表1)。组与组之间的吸烟或饮酒习惯没有显著差异(表1)。大多数研究女性从未吸过烟或已经停止吸烟。类似地，有极少数女性是酗酒者。在96%的正常对照、63%LCIS女性患者以及38%非典型增生女性患者中其乳房X射线摄影照片的BIRADS分数为1或2，被读作正常。正常对照的乳房X射线摄影照片中没有读值为BIRADS4或5的，这是怀疑恶性或高度提示恶性的分数，有52%非典型增生女性患者和37%LCIS女性患者的乳房X射线摄影照片的读值为BIRADS4或5(表1)。Gail分数计算在正常对照中与平均乳癌风险相一致，其5年风险中值是1.0;在患有非典型增生的对象中则升高，其风险中值为3.8(表l)。表l.研究组的特征<table>complextableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>我们的结果显示MMP-9和ADAM12是LCIS(均为p<0.001)和ADH/ALH(MMP-9，p=0.004;ADAM12,p<0.001)的独立预测因子。ROC曲线分析基于ADAM12的强度单位(DU)，ROC曲线下面积是0.94,示ADAM12是从正常中区分乳癌的极好标志物。利用存在/不存在数据，灵敏度是0.949(95%CI:0.827至0.994)，特异性是0.792(95%CI:0.580至0.929)。以灵敏>1/[1-特异性测定的阳性测试(LR+)的似然比是4.6，表示如果女性;j^验为阳性，她患有非典型增生或LCIS比不患这些病的可能性高4倍以上。Logistic回归进行Logistic回归测定ADAM12和MMP的组合是否提高诊断准确度并且Logistic回归显示MMP9和ADAM12是LCIS(均为p<0.001)ADH-ALH(MMP画9，p=0.004;ADAM12,p<0.001)的独立预测因子。最大似然性估计应用最大似然性估计来得出各种可能检测结果的LCIS或ADH-ALH概率尿液中MMP9和ADAM12阳性与100%LCIS概率相关，MMP9阴性和ADAM12阳性与50。/。LCIS概率相关，MMP9阳性和ADAM12阴性与40%LCIS概率相关，以及MMP9和ADAM12阴性与0%LCIS概率相关。相似地，如果女性尿液中MMP9和ADAM12都是阳性，ADH-ALH的概率是100%;MMP9阴性和ADAM12阳性，ADH-ALH的概率是67%;MMP9阳性和ADAM12阴性，ADH-ALH的概率是25%;以及MMP9和ADAM12都是阴性，ADH-ALH的估计概率是0%(表2)。表2.最大似然性估计检验结果LCIS或非典型增生的似然性+MMP-9和+ADAM12100%的LCIS或非典型增生概率-MMP-9和+ADAM12-50-67%的LCIS或非典型增生概率+MMP-9和-ADAM12-25"40%的LCIS或非典型增生概率:MMP-9和-ADAM12-0%的LCIS或非典型增生概率统计学分析对于ADAM12，单变量分析表明AH女性患者和LCIS女性患者的平均水平分别是20.7±16.8和14.7±6.9DU，通过Bonferroni调整(adjustment)以及ANOVA确定，这显著高于正常对照(2.1±2.8DU)(均为p<0.001)。正常对照的ADAM12水平中值是0。AH和LCIS组彼此之间的平均ADAM12水平或ADAM12水平中值没有显著差异(P>0.20)(表3A)。正常对照和AH女性患者或LCIS女性患者之间的MMP9阳性个体百分率之间也具有显著性差异(2自由度上的Pearson卡方=6.17，P<0.05)。多元逐步logistic回归分析显示持续的ADAM12水平(p<0.001)、MMP9阳性(P=0.02)以及年龄(P=0.04)在区分对照和诊断为AH女性患者时是独立预测的(表3B)。区分对照和AH中ADAM12的经调整的比值比是1.4，提示每10个单位的增加与增加28倍比值(1.4")相关，所述28倍比值指个体更可能患有AH而不是正常健康对照。这相当于97%的概率增加，其中概率＝比值/(l+比值)=28/29。对于二元MMP9分析，与检测为MMP-9阴性相比，阳性个体患者有AH的风险估计高5倍(比值比=5.1，95%置信区间=1.4至17.9)。裣二验的其它变量(包括MMP-2、MMP-9/NGAL，并且MMP>150kDa)不能预测AH(均为P>0.05)。表3A正常对照和对象研究组尿中ADAM12水平的单变量分析正常非典型非典型对照增生LCIS增生/LCIS(N＝80)(N＝44)(N=24)(N＝68)ADAM122.1±2.920.7士16,814.7±6.918.5士14.7(DU)0(0-3)3(9-27)15(12-18)13(11-24)中值(IQR)0-110-800-270-80全范围加-减值是平均值±SD，Dl^密度计量单位，IQR=四分间距ADAM12，解联蛋白金属蛋白Sl,LCIS=原位小叶癌利用ANOVA及针对平均值的Bonferroni校正和针对中值的Mann-Whitney.U-检验来比较ADAM12水平<formula>seeoriginaldocumentpage40</formula>与正常对照比较加-减值是平均值表3B.预测非典型增生和原位小叶癌的变量的多变量Logistic回归分4t非典型增生的预测因子ComplextableseetheoriginaldocumentpagexCI=置信区间.其它变量包括MMP-2，MMP-9/NGAL,并且MMP>150无统计学显著性(P>0.05).当评估LCIS的预测因子时，Logistic回归表明显著的多变量预测因子与针对AH的相同，包括ADAM12(p<0.0001)、MMP9(P=0.014)以及年龄(P=0.05)(表3B)。这些变量在区分LCIS女性患者和正常对照中提供独立的信息，当ADAM12的经调整的比值比是1.6时，提示每10个单位的增加与110倍比值增加(l.61G)相关，所述110倍比值指个体更可能患有LCIS而不是正常健康对照。这相当于超过99％的概率增加。与检测为MMP9阴性的个体相比，MMP9阳性的女性患有LCIS的风险高13倍(比值比=13.8，95%置信区间=1.7至110.7)。枱r验的其它变量(包括MMP-2、MMP-9/NGAL，并且MMP>150kDa)不是LCIS的显著性预测因子(全部P>0.05)。利用Logistic回归分析，推出非线性方程用于基于不同ADAM12区间来评估AH和LCIS概率，并且所述非线性方程对于AH(LRT=58.4，p<0.0001)和LCIS(LRT=53.3，p<0.0001)是高显著性的。对照和诊断患有AH(图2A)或LCIS(图2B)的对象的经验数值通过每组的柱线表示，反映每个ADAM12水平区间中的女性百分率。理论曲线举例说明与正常相比较的AH或LCIS概率，根据每图中ADAM12区间显示所述理论曲线并且所述理论曲线清楚地显示对象和对照之间的分离。如图2A所示，57%对照和仅仅7%患AH对象的ADAM12水平是0个密度计量单位，而75%的患AH对象和仅仅4％对照的水平大于10DU。ADAM12水平为0的个体的AH预测概率是7%，而ADAM12水平在5至10DU的那些个体的AH预测概率是40。/。，ADAM12水平为10至20DU的女性的AH预测概率是85%，ADAM12水平超过20DU的女性的AH预测概率是95%。相比而言，如图2B所示，57%对照和仅仅4%的LCIS对象的ADAM12水平是0，而约80%的患LCIS对象和仅仅4%对照的水平大于10DU。阳性ADAM12水平<2DU的个体的LCIS预测概率<5%，而ADAM12水平在5至10DU的那些个体的LCIS预测概率是52%,并且ADAM12水平10至20DU的女性的LCIS预测概率是85%，ADAM12水平超过20DU的女性的LCIS预测概率是97%。然后将尿液中ADAM12水平与反映临床信息的Gail5年风险分数结合67。Gail分数小于1.67。/。认为是低风险，而分数等于或大于1.67%表示发生乳癌的风险高。多元Logistic回归分析表明ADAM12水平(LRT=19.92,PO.0001)可作为区分AH和对照的显著性预测因子。该模型方法的结果可以看作分别根据Gail5年风险的高或低，随ADAM12水平增加而AH概率也增加(图3)。例如，对于Gail分fel.67。/o的女性，ADAM12水平为2DU的AH概率是90%,对于低风险Gail分数<1.67%的女性，ADAM12水平为2DU的AH概率基本上是0。/。。另一方面，低风险Gail分数<1.67%的女性的AH概率开始随中等高的ADAM12水平(例如12DU或更高水平)而增加(底部曲线)。例如，在低风险Gail5年分数女性的亚组中，ADAM12水平为14和15DU分别与50%和75%的概率相关。在Gail5年风险<1.67%和ADAM12水平为16DU或更高的个体中AH概率估计是90%或更高。相似地，单独连续ADAM12水平的ROC分析被证明可以极好地区分正常对照和AH女性患者，ROC曲线下面积是0.914。尿液中ADAM12水平还提供了出色的区分正常对照和LCIS女性患者的能力，曲线下面积(AUC)是0.950。由于对于任何检验最大AUC是1.0，这些分数证明尿液中ADAM12水平的强大预测能力。当尿液中ADAM12水平与Gail5年风险分数提供的临床信息结合时，进一步ROC分析表明最佳组合是Gail+0.15xADAM12(AUC=0.996)。因此，当ADAM12和Gail风险分数同时一起使用时得到最佳的成绩。该组合指数的最好截断值是2.8。利用2.8的截断值，该组合的灵敏度是0.976(42个AH病例之中41名被正确分类)并且特异性是0.977(44名对照中43名被正确分类)。因此，在我们的群体中使用该ADAM12水平-Gail组合指数仅仅得到1个假阳性(1名对照的组合指lbl2.95，分数大于2.8)和1个假阴性(1名AH女性患者的组合指l!bi2.3,分数低于2.8截断值)。开发替代和改进方法以确定处于高乳癌风险的女性集中了大量研究8。我们选择集中在MMP作为生物标志物，因为它们在乳癌进程的最早阶段起作用。在该研究中，我们着眼于通过活组织检查证明患有非典型增生和原位小叶癌(LCIS)的对象的尿液中MMP以及ADAM12的表达。非典型增生和原位小叶癌都被认为是风险增加的病理指标。随着对乳癌风险降低期待的增加，准确辨别发生乳癌风险增加的女性变得日益重要。我们的结果表明尿液中生物标志物ADAM12和MMP-9是AH和LCIS的高度显著的预测因子。MMP是在肺瘤生长、转移、以及重建肿瘤微环境中起重要作用的基质降解酶。免疫组化研究表明乳房肿瘤中MMP表达水平升高9-"和乳房肿瘤提取物已显示含有活性MMP4。已经报道患有乳癌的对象血浆中MMP9水平升高12。我们首次发现利用酶镨(底物皿电泳)可检测皮下^Lewis肺癌肿瘤细胞的小鼠尿液中功能性尿液MMP。酶镨利用电泳分离显示酶活性并允许单个基质降解成分显现在皿上。重要的是，这些原始数据表明不管其大小，MMP可通过荷瘤宿主中的尿液收集系统过滤并可以生物活性形式储存在膀胱中。该4^人惊讶的结果表明MMP可能存在于荷瘤个体膀胱远端部位的尿液中。与血管和淋巴系统相连通的肿瘤过量产生MMP可能导致其它体液比如血液或尿液中MMP活性水平升高。这种可能性与之前的证据相一致。所述之前的证据是已经在癌症对象体液中测量到由肿瘤过量产生的其它调节分子比如血管生成肽bFGF并已证明其是疾病状态的独立预测因子13，14。我们随后进一步在人对象中检验了该假设。我们继续报道了可在乳癌对象尿液中检测到完整MMP并且这些尿液中的MMP是疾病状态的预测因子4。自从我们的原始报道以来，现在许多其它的独立公开的研究支持我们的发现(即尿液中MMP预测肺瘤疾病状态)5，15一22。随后，我们证明了MMP是转变成血管生成表型所必需的，所述血管生成表型是癌症生长和进程中的早期和关键事件23。而且，最近我们鉴定了一种新的高分子量的尿液MMP是MMP9/NGAL(NeutrophilGelatinaseAssociatedLipocalin)的复合物5。我们已经在大量对象中研究了尿液中MMP表达并且证明随疾病进展对象尿液中MMP显著增加。我们还发现似乎主要频繁存在于乳癌对象尿液中的MMP类型是92kDa类型(MMP9)。需要注意的是，这些乳癌对象尿液中检测的MMP的特性分析显示与其中我们检测到高频率MMP2(72kDa明胶酶)的膀胱癌对象和前列腺癌对象的独立研究结果相比，乳癌对象中明显缺少MMP2。这提示可能具有基于这些对象尿液中出现不同MMP类型的特异性肿瘤"指紋"。由于这些发现以及我们对尿液中疾病标记物的兴趣，我们建立了确定癌症对象尿液中存在的蛋白质以及确定其存在是否可能与疾病状态相关的生物标志物鉴定。最近，我们分离并鉴定了乳癌对象尿液中ADAM12(解联蛋白金属蛋白酶)24。ADAM12是与MMP相关的糖蛋白家族成员。之前已经报道了乳癌、结肠癌以及肺癌组织中ADAM12的表达增加25。我们建立了ADAM12的底物特异性并显示该酶可降解明胶、IV型胶原蛋白和纤维连接蛋白而不降解I型胶原蛋白或酪蛋白，这提示该酶在ECM重建(这是肿瘤疾病的标志)中起作用。我们还证明尿液中ADAM12还随乳癌对象中疾病进程而显著增加并与疾病阶段相关。ADAM12在正常对照中是不可检测的或以非常低水平存在，而在非典型增生和LCIS以及浸润性癌症对象中增加。在转移性疾病中发现最高水平的ADAM1224。在此，我们报道了这两种有力的乳癌疾病进程的尿指示物组合MMP9和ADAM12。当尿液中MMP9和ADAM12结果相组合并且都是阳性时，观察到其与已被证明发生乳癌、非典型增生和LCIS的风险因子高显著相关。非典型增生已被证明是进一步发生乳癌的主要风险因子，其使得女性之亲属的风险是一^A群的5.3倍。如果对象的一级亲属(first-degreerelative)患有乳癌，该风险进一步增加(10倍风险)26-28。不管如何命名，LCIS也被认为AX险增加的标志物而不是前病变(precursorlesion)29,30。然而，现在认为LCIS可能包括一系列病症并且这些病症的小亚类(比如多形性变体)实际上可代表前病变31，32。9个参与监测、流行病学和最终结果(SEER)项目的基于人群的癌症登记上表明从1978年至1998年绝经后女性中LCIS诊断率增加4倍29。看来非典型增生(AH)的诊断也可能在增加。非典型增生比率难于追踪因为该诊断的报告不是肺瘤登记中所必需的，并且该诊断不被SEER数据所记录。在19世纪80年代和90年代，几个大的研究证明AH在所有良性乳腺活组织检查中比例小于5%33，34。近来大的历史事件中，非典型增生代表所有良性乳腺活组织检查中的4%35。新近的非典型增生比率报告达到所有良性乳腺活组织检查的7%36。在奥博恩山医院跟踪活组织检查结果显示从1997年至2004年ADH增加1倍并且LCIS增加3倍(表8)。这最可能至少部分地归因于乳房X射线摄影筛查增加，因为ADH最经常地被鉴定为具有异常的乳房X射线摄影37。应当注意，在经历预防性乳房切除术、处于极高乳癌遗传风险的女性乳房样本的最近前瞻性研究中，57%的所述女性中发现这些高风险的病变38。这些当中，37%是非典型小叶增生(ALH)，39%是非典型导管增生(ADH)、以及25%是LCIS38。表8.活组织检查结果的变化趋势ADH/ALHLCISDCIS浸润性总活组织检查1997l月至6月7(3.3%)2(0.9%)16(7.6%)40(18.9%)2112004l月至6月20(5.7%)12(3.4%)20(5.7%)55(15.6%)352非典型增生通常在为异常乳房x射线摄影或物理发现所做的乳腺活组织检查中被诊断出来，而且还可以被乳头吸取、随机乳晕旁细针抽取和导管灌洗记录到8。更可靠地，需要侵入更少和费用更低的方法用于评估乳癌风险。乳房x射线摄影是目前筛查女性乳癌最灵敏、广泛应用的方法。目前，尽管乳房x射线摄影是我们检测乳癌的"金标准"，但是其不是完全可靠的39。当然，最近的进展比如数字乳房x射线摄影已经提高了诊断准确度，并且在降低乳癌死亡率中具有显著差异40，41。然而，按照总体诊断准确度，乳房x射线摄影得出1o至3or。的假阴性率并且其灵敏度随乳房密度而被消弱42，"。假阳性也是一个实际问题。应当注意的是，最近研究中，美国乳房x射线摄影人员将所有筛查中的10%判断为异常-并且几乎所有这些都是假阳性44，45。此外，尽管大多数女性有机会使用这些设备，但是许多真正需要它们的人(包括老年人和经济困难的女性)未能利用这些设备46，47。最近研究显示，用于检测浸润性乳癌，乳房MRI优于乳房X射线摄影，灵敏度是乳房X射线摄影和超声的两倍48。然而，MRI较昂贵，不是总能由健康保险公司支付并且对于所用技术以及结果解释在各机构之间具有相当大的差异。有机会使用乳房X射线摄影对于少数民族女性、低收入女性和老年女性来说是一个严肃的问题46，47，49。费用、害怕疼痛以及缺少对推荐筛查指导的教育也是限制乳房x射线摄影广泛应用的因素5°，51。乳房X射线摄影检查需要高技术的专业人员并购买及放置大且昂贵的设备、以及维护工作和质量保证成本。所有这些因素都可限制其可用性，尤其是对于处于不利地位的女性。目前，他莫西芬是FDA批准的用于降低乳癌风险的唯一药剂。对于具有LCIS病史的女性，降低56%，对于具有非典型导管增生病史的女性，他莫西芬甚至更显著地降低风险-降低86%52。虽然通常可被良好地耐受，他莫西芬确实具有相关的毒性，包括子宫内膜癌、中风、肺栓塞、以及深度静脉血栓的风险增加，尤其对于50岁或更大年龄的女性52。因此，其它试验，最受关注的STAR试验(他莫西芬和雷洛昔芬研究)正在进行中以为高风险女性确定更好的医疗选择53，54。在评估降低浸润性乳癌风险的试验中，所述STAR试验(他莫西芬和雷洛昔芬研究)是直接比较两种药物55，56。雷洛昔芬是第二代选择性雌激素调节剂(SERM)并且是当前指定为预防骨质疏松症的药物，已经证明其具有抗雌激素特性，并且最小限度地刺激子宫内膜上皮细胞。该5年研究由NSABP实施，并设计成19,000名Gail相对风险至少1.67%的绝经后女性参加。该STAR试验将检测哪种治疗最显著地降低浸润性乳癌，并将为每种药物建立风险效益曲线以及终点(包括子宫内膜癌、心脏病、骨折和生活质量)。已经停止了该STAR试验的增长并且结果将在2006年可以得到。此外，现在正在评估有前景的新药剂比如雌激素合成酶抑制剂作为可能的乳癌风险降低药剂57-6°。当前，没有足够的临床标志物可用于可靠地检测是否存在原发性乳房病变(筛查)、用于监测临床进程、以及用于测定哪些亚类的对象可受益于更侵入式治疗。虽然数学模型比如Gail模型61、Claus模型62以及BRACAPRO模型63是有用的，但是可靠的生物标志物显然将是用于确定风险和追踪乳癌进程的最理想方法。最近，对MMP作为癌症诊断和监测的生物标志物的兴趣日益增加64，65。目前利用非侵入式尿液检验评估乳癌风险的方法是非常受欢迎的。评估尿液中蛋白质比乳房X射线摄影术的侵入更少、更易使用、以及更低费用，其应当是大多数女性更容易耐受的，并且其可以鼓励对筛查工作的更高依从性。这能够用于在乳房X射线摄影变化或者甚至乳房肿块出现之前开始降低风险的工作。我们的数据清楚地显示尿液中ADAM12和MMP-9是乳癌风险标志AH和LCIS的高度显著的预测因子。发现ADAM12水平能够极好地区分正常对照和AH或LCIS女性患者。当ADAM12水平与Gail风险分数相组合时，所得指数甚至更准确地区分正常对照和单独通过Gail模型被归类为低风险的AH女性(灵敏度0.976，特异性0.977)。该尿液中的生物标志物法可用于在乳房X射线摄影变化或甚至乳房肿块出现之前将受益于降低早期风险工作的对象。以下以及整个说明书所引用的参考文献以其n并入本文。参考文献1,ParkinDM，BrayF,FerlayJ，PisaniP,Globalcancerstatistics,2002.CACancerJClin2005;55:74-108,2，JeraalA，MuirayT，WardE，etal.Cancerstatistics,2005.CACancerJClin2005;55:10-30.3.StrategiesforManagingtheBreastCanowResearchProgram;AReporttotheU,S.ArmyMedicalResearchandDevelopmentCommand,:InstituteofMedicineNationalAcademyPress,1993，4，MosesMA，WiederschainD,LoughlinKR，ZurakowskiD,LambCC，FreemanMR,Increasedincidenceofmatrixmetalloproteinasesinurineofcancersubjects.CancerResl1998；58:1395-9,5.YanL，BorregaardKjeWsenL,MosesMA.Thehighmolecularweighturinarymatrixmetalloproteinase(MMP)activityisacomplexofgelatinaseB/MMP-9andneutrophilgdatinase-associatedlipocalin(NGAL).ModulationofMMP-9activitybyNGAL.JBiolChera2001;276:37258-65.i6.GilpinBJ，LoechelF，MatteiMG,EngvallE，AlbrechteenR，WewerUMAnovel,secretedformofhumanADAM12(mdtrinalpha)provokesmyogenesisinvivo.JBiolChem1998;273:157-66.7.LacquementMA，MitchellD，HollingsworthAB,PositivepredictivevalueoftheBreastImagingReportingandDataSystem,JAmCollSurg1999;189:34-40.8.HollingsworthAB，SingletarySE，MorrowM,etal.Currentcomprehensiveassessmentandmanagementofwomenatincreasedriskforbreastcancer.AmJSurg2004;187:349-62.9.PoulsomR,HanbyAM，PignatelliM，etal.ExpressionofgelatbaseAandTIMP-2mRNAsinde咖oplasticfibroblastsinbothmammarycarcinomasandbasalcellcarcinomasoftheskin,JClinPathol1993;46:429-36,10.BrownPD，BloxidgeRE，AndersonE，Hov/ellA-Expressionofactivatedgelatinaseinhumaninv貼ivebreastcarcinoma.ClinExpMetastasis1993;11:183-9.11.ZuckerS,LysikRM，DiMassimoBI，etal*PlasmaassayofgelatinaseB:tissueinhibitorofmetalloprotdnasecomplexesincancer.Cancer1995;76:700-8.12.CapperSJ，V议heijenJ,SmithL,SullyM，VisserH，HanemaaijerR,Determinationofgelatinase-A(MMP-2)activityusinganovelimmunocaptureassay,AnnNYAcadScil卿；878:487-90，13.NguyenM,WatanabeH,Buds加AE，RichieJP,FolkmanJ'Elevatedlevelsoftheangiogenicpeptidebasicfibroblastgrowthfactorinurineofbladdercancersubjects'JNatlCancerInst1993;85:241-2.14.NguyenM,WatanabeH，BudsonAE,RichieJP,HayesDF，Folfcm肌IElevatedlevelsofanangiogenicpeptide,basicfibroblastgrowthfactor,intheurineofsubjectswithawidespectrumofcancers.JNatlCancerInst1994;86:356-61.15.GerhardsS,JungK，KoenigF，etal，Excretionofmatrixmetalloproteinases2and9inurineisassociatedwithahighstageandgradeofbladdercarcinoma.Urology2001;57:675-9.16.SierCF，CasettaG,Verh^jenJH，改al-Enhancedurinarygelatinaseactivities(matrixmetalloproteinases2and9)areas幼ciatedw他early-stagebladdercarcinoma:acomparisonwithclinicallyusedtumormarkers.ClinCancerRes2000;6:233340.17.KaimyamaH，Matrixmetalloproteinasesandbladdercancer,JMedInvest2001;48:3143.18.Hanemaaij改R，SierCF，VisserH>etalMMP-9activityinurinefromsubjectswithvarioustumors,asmeasuredbyanovelMMPactivityassayusingmodifiedurokinaseasasubstrate,AnnNYAcadSci1999;878:141-9,19.MonierF,MollierS,GuilkrtM,RambeaudH，MorelF,ZaouiP,Urinaryreleaseof72and92kDagdatinases,TIMPs，N-GALandconventionalprognosticfactorsinurothelialcarcinomas,EurUrol2002;42:356-63,20，NuttJE，DurkanGC，MellonJK,LunecJ.MatrixMetalloproteinases(MMPs)inbladdercancer:theinductionofMMP9byepidermalgrowthfactoranditsdetectioninurine,BJUInt2003;91:99-104.21,SheriefMH，LowSH,MiuraM,KudoN，NovickAC,WeimbsT.Matrixmetalloproteinaseactivityinurineofsubjectswithrenalcellcarcinomaieadstodegradationofextracellularmatrixproteins:possibleuseasascreeningassay.JUro!2003;169:15304.22,DurkanGC，NuttJE，RajjayabunPH，MealDE，LunecJ,MellonJK,Prognosticsignificanceofmatrix:inetalloprotein朋e-landtissueinhibitorofmetalloprotdnase-invoidedurinesamplesfromsubjectswithtransitionalcellcarcinomaofthebladder.ClinCancerRes2001;7:3450-6.23，FangJ,SbingY,WiederschainD，etal.Matrixmetalloproteinase-2isrequiredfortheswitchtotheangiogenicphenotypeinatumormodel.ProcNattAcadSciUSA2000;97:3884-9,24,RoyR,WewerUM,ZurakowskiD，PoriesSE,MosesMA,ADAM12cleavesextracellularmatrixproteinsandcorrelateswithcancerstatusandstage.JBiolChem2004;279:51323-30.25.IbaK，AlbrechtsenGilpinBJ,LoechelF,WewerUM,Cysteine-richdomainofhumanADAM12(meltrinalpha)supportstumorcelladhesion.AmJfPatholl999；154:1489-501，26，MarshallLM,HunterDJ，ConnollyJL,etal，Riskofbreastcancerassociatedvrithatypicalhyperplasiaoflobularandductaltypes.CancerEpidemiolBiomarkersPrev1997;6:297-30〗，27，DupontWD，PageDL.Riskfactorsforbreastcancerinwomenwifeproliferativebreastdise朋e.NEnglJMed1985;312:146-51,28，DupontWD，PariFF，HartmannWH，etal，Breastcancerriskassociatedwithproliferativebreastdiseaseandatypicalhyperplasia.Cancer1993;71:1258-65.29，LiCI.Ander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