评估发育异常或食道腺癌可能性的方法
【专利摘要】本发明涉及一种辅助评估受试者中存在发育异常或食道腺癌的可能性的方法，所述方法包括：(a)提供来自所述受试者的食管样品，(b)测定所述样品中(ⅰ)SLC22A18、(ⅱ)PIGR、(ⅲ)GJA12和(ⅳ)RIN2的甲基化状态，其中，如果所述基因中的2个或更多个是甲基化的，则测定存在发育异常或食道腺癌的可能性增加。本发明还涉及一种用于同样目的的装置。
【专利说明】评估发育异常或食道腺癌可能性的方法
【背景技术】
[0001] 患有巴雷特食管（Barrett'sesohphagus) (BE)的患者与普通人群相比有实质上 增加的进展至食管腺癌（EAC)的风险（RR:11. 3,95%Cl:8. 8-14. 4) 1。在过去的30年间， EAC的发病率增加了 7倍（每百万3. 6至25. 6例）2,并且由于后期表现，其预后差，具有约 11个月的生存中值3。由于当疾病局限于粘膜或子粘膜层中时已诊断患者的增加的生存 率；患有BE的患者被推荐接受内镜监测以早期检测癌症4、5。内镜检查法患者的成本效益 和风险：效益比屡次受到了质疑，这是因为年度（每年）的进展风险相对较低1、6、7 ;根据 最近的估计约〇. 3% 8。BE和EAC之间的中间发育异常阶段是进展的最可靠的标志；然而， 发育异常的病理学存在是主观的，这是由于内镜检查期间的已知的抽样偏差以及高的观察 者间和观察者内的差异性9、10。最近的两项研究强调了归类为患有低度发育异常的患者的 发展率的巨大差异。在荷兰的研究中，患有确诊的低度发育异常的个体中的高度发育异常 (HGD)或EAC的发生率为每年每患者13. 4% (95%CI3. 5-23. 2);然而在美国的研究的患 者中，此群体的进展率与非发育异常的患者相似，其是16倍的差异12。在患有高度发育异 常的患者中，随机射频消融（randomizedradiofrequencyablation) (RFA)干预试验的数 据表明非治疗组（arm)中19%的进展率13。因此，迫切需要一些生物标记，其可以准确地 检测扁平巴雷特粘膜中的常见的发育异常并预测那些最可能进展至癌症的患者。
[0002] 异常的DNA甲基化被证明是癌症的特征，并已知这些变化发生于转化的早期14。 大量研究已经证明在BE至EAC的进展中发生了DNA甲基化的变化，并且这些变化具有用 作生物标记的潜力15-20。这些研究大多采用基于其它癌症中已知的甲基化靶点的候选分 析。然而，现在可利用基于高通量阵列的平台来鉴定DNA甲基化变化，并且发明人已采用这 种方法找到了巴雷特癌变的候选生物标记。印记基因和X染色体均被DNA甲基化表观遗传 地控制21，但从未在EAC的生物标记方面进行具体的检测。
[0003]Jin等人（2009CancerResearchv. 69,4112 至 4115 页）公开了一种甲基化生物 标记的多中心、双盲的效度研究（validationstudy)，其用于巴雷特食管的发展预测。作者 研究了 8种BE发展预测甲基化生物标记。作者研究了 145例无进展者和从巴雷特食管发 展至肿瘤的50例进展者中的甲基化。这项研究是一项回顾性研究--研究采用候选基因并 由因推果地评估其甲基化状态。所评估的8种候选基因是P16、RUNX3、HPP1、NELL1、TAC1、 SST、AKAP12和⑶H13。作者认为，这8种标记组更客观且可量化，并且与临床特征如年龄的 评估相比，具有较高的预测敏感性和特异性。作者认为，他们的8种标记组以高特异性水平 准确地预测了约一半的HGD和EAC。
[0004]Kaz等人（2011Epigeneticsv. 6,1403至1412页）公开了巴雷特食管和食管腺 癌中的DNA甲基化谱揭示了独特的甲基化标签（methylationsignature)和分子亚类。作 者报道了不同的总体的甲基化标签以及特定基因的甲基化差异的发现。作者声称，它们的 标签在鳞状、BE、H⑶和EAC细胞中会有区别。作者没有公开任何生物标记。实际上，当他 们指出"将BE从BE+H⑶和EAC中区分出来的那些CpG位点的追加的验证可能导致发现在 BE和EAC的诊断和预后判断中具有潜在临床应用的有用的有用生物标记"时，作者甚至承 认了这一点。因此，此报告关注于对CpG甲基化谱的描述。特别地，研究了分散在807个基 因中的1505个CpG位点的甲基化状态。在这一文献中未提供生物标记或预后的具体教导。
[0005] 本发明的目的是克服与现有技术相关的问题。
【发明内容】
[0006] 发明人解决了巴雷特食管（BE)的内镜监测的关键问题，并且指出了DNA甲基化变 化如何可以提高在扁平的巴雷特黏膜和组织病理学中高度发育异常和早期癌症的检测。
[0007] 为此，我们进行了基于高通量阵列的甲基化扫描并利用严谨统计方法（信噪比和 双面Wilcoxon检验）在IlluminaInfinium平台上将差异化甲基化的基因进行分级。此 夕卜，我们特别地观察了印记的和X染色体的基因在癌症发展的过程中发生时甲基化中的任 何变化，这是因为这些基因可能是理想的生物标记，因为在女性中已经因印记和通过X-失 活而发生了一个等位基因拷贝的生理失活。一旦我们确定了作为生物标记的候选基因，我 们将再利用焦磷酸测序法对同一样品以及大独立组的回顾性收集样本中进行稳健的验证。 这导致鉴定了 4个基因甲基化组，其可以将非发育异常的患者与发育异常的巴雷特和早期 肿瘤的患者相区分。最后，我们进一步进行了前瞻性的多中心的研究，并证明了这个组确实 具有临床价值。因此，我们的组已完成了从发现到前瞻性评估的全部过程。
[0008] 巴雷特食管（BE)的内镜监测存在问题，这是因为发育异常和早期肿瘤常常是不 可见的且由于抽样偏差而错过。分子异常性可能比发育异常更分散。因此，目的是检测DNA 甲基化（尤其是在印记的和X-染色体的基因上）是否能够检测发育异常/早期肿瘤。
[0009] 我们描述了令人惊讶的稳健的一组甲基化标记，其与有用的临床适应症关联。本 发明的另一个关键优点是利用了场效应，借此，本发明有助于克服抽样偏差，这是因为所教 导的信息性标记发生于巴雷特病变处而不仅仅在发育异常/EAC区域（如果存在的话）。本 发明基于这些令人惊讶的发现。
[0010] 因此，在一个方面中，本发明提供了用于辅助评估受试者存在发育异常或食道腺 癌的可能性的方法，此方法包括：
[0011] (a)提供来自所述受试者的食管（esophagal)样品
[0012] (b)测定所述样品中下述的甲基化状态
[0013] (i)SLC22A18,
[0014] (ii)PIGR,
[0015] (iii)GJA12 和
[0016] (iv)RIN2
[0017] 其中，如果所述基因中的2个或更多个是甲基化的，则测定存在发育异常或食道 腺癌的增加的可能性。
[0018] 在一个实施方式中，适当地，步骤（a)包括从所述样品中提取核酸如DNA。
[0019] 在一个实施方式中，适当地，步骤（b)包括将所述样品与引物接触并测定甲基化。 可以通过例如MSP或焦磷酸测序来测定甲基化。
[0020] 适当地，方法进一步包括测定（V)TCEAL7的甲基化状态。
[0021] 适当地，如果所述受试者是男性，方法进一步包括测定（vi)RGN的甲基化状态。
[0022] 适当地，发育异常是高度发育异常（HGD)。
[0023] 在另一个方面中，本发明涉及一种评估特定受试者的风险的方法，其包括实施如 上所述的方法，其中，如果所述基因中的〇个或1个是甲基化的，则测定具有低风险，如果所 述基因中的2个是甲基化的，则测定具有中度风险，如果所述基因中的3个或更多个是甲基 化的，则测定具有商风险。
[0024] 根据本发明的方法的结果，可以对受试者进行交替治疗（alternatetreatment)。
[0025] 例如，当受试者根据本发明被鉴定为低风险时，可能规定在较长的时间间隔如3 至5年对受试者进行监测。
[0026] 当受试者根据本发明被分类为中度风险时，可能规定对受试者进行更频繁的随访 (更频繁的监测）。例如，可能规定在缩短的时间间隔如1至2年对受试者进行监测。
[0027] 当受试者根据本发明被分类为高风险时，可能规定对受试者进行干预。例如，可以 规定对受试者进行射频消融。这一过程远比食管切除更轻微且更少地侵入。因此，本发明 能够将更轻微且更少侵入的治疗分配给根据本发明的属于高风险分类的患者。
[0028] 为了进行比较，目前英国的准则是，如果患者存在3cm或更长的巴雷特食管段，规 定在约2至3年的时间间隔下对其进行监测。因此，可以理解的是，本发明通过延长低风险 患者的监测时间间隔而节省了监测成本，并且还通过允许在高风险患者的早期阶段进行干 预而改善了结果。
[0029] 适当地，甲基化状态通过焦磷酸测序来测定。
[0030] 适当地，通过使用选自补充表5中的一种或多种测序引物进行所述焦磷酸测序。
[0031] 适当地，通过测定每个所述基因的甲基化百分数并将数值与如下的甲基化取舍点 (cutoff)百分比相比较来对甲基化状态进行评分：
【权利要求】
1. 一种用于辅助评估受试者存在发育异常或食道腺癌的可能性的方法，所述方法包 括： (a) 提供来自所述受试者的食管样品 (b) 测定所述样品中下述的甲基化状态 (i)SLC22A18, (ii)PIGR, (iii)GJA12 和 (iv)RIN2 其中，如果所述基因中的2个或更多个是甲基化的，则测定存在发育异常或食道腺癌 的增加的可能性。
2. 如权利要求1所述的方法，其中方法进一步包括测定（V)TCEAL7的甲基化状态。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中如果所述受试者是男性，则方法进一步包括测定 (vi)RGN的甲基化状态。
4. 如权利要求1至3任一项所述的方法，其中发育异常是高度发育异常（HGD)。
5. -种评估特定受试者的风险的方法，其包括实施上述权利要求任一项所述的方法， 其中如果所述基因的〇个或1个是甲基化的，则测定为低风险，并且如果所述基因的2个 是甲基化的，则测定为中度风险，如果所述基因的3个或更多个是甲基化的，则测定为高风 险。
6. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中通过焦磷酸测序测定甲基化状态。
7. 如权利要求6所述的方法，其中使用选自补充表5中的一种或多种测序引物进行所 述焦磷酸测序。
8. 如前述权利要求任一项所述的方法，其中通过测定每个所述基因的甲基化百分数并 将数值与下列甲基化取舍点百分比相比较来对甲基化状态进行评分：
其中基因的数值超过所述基因的甲基化取舍点百分比则评估为"甲基化的"。
9. 一种装置或系统，其 (a) 被配置以分析来自受试者的食管样品，其中所述分析包括 (b) 测定所述样品中如下的甲基化状态 (i)SLC22A18, (ii)PIGR, (iii)GJA12 和(iv)RIN2, 所述装置或系统包括输出模块， 其中，如果所述基因中的2个或更多个是甲基化的，则测定存在发育异常或食道腺癌 的增加的可能性。
10. 如权利要求9所述的装置，其中分析进一步包括测定（V)TCEAL7的甲基化状态。
11. 如权利要求9或10所述的装置，其中如果所述受试者是男性，则分析进一步包括测 定（vi)RGN的甲基化状态。
12. 如前述权利要求任一项所述的方法、分析、装置或系统，其中所述样品包含冷冻生 检材料。
13. -种用于辅助评估受试者存在发育异常或食道腺癌的可能性的方法，方法包括 (a) 提供来自所述受试者的食管样品 (b) 测定所述样品中如下的甲基化状态 (i)SLC22A18, (ii)PIGR, (iii)GJA12 和(iv)RIN2 ； 将（b)的甲基化数值与参考标准相比较， 其中，如果所述基因中的2个或更多个的甲基化水平比参考标准更高，则测定存在发 育异常或食道腺癌的增加的可能性。
14. 如权利要求13所述的方法，其中所述参考标准来自患有巴雷特食管但没有患有发 育异常或食道腺癌的受试者。
15. 如权利要求13或14所述的方法，其中所述参考标准包含柱状上皮如巴雷特食管或 十二指肠。
16. 如权利要求13至15任一项所述的方法，其中方法进一步包括测定（V)TCEAL7的 甲基化状态。
17. 如权利要求13至16任一项所述的方法，其中如果所述受试者是男性，则方法进一 步包括测定（vi)RGN的甲基化状态。
18. -种可操作的计算机程序产品，当在计算机上执行时，其执行权利要求1至8或13 至17任一项所述的方法步骤。
19. 一种基本上如本文所述的方法、分析、装置或系统。
【文档编号】C12Q1/68GK104508147SQ201380038430
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2013年5月17日 优先权日:2012年5月18日
【发明者】丽贝卡·菲茨杰拉德, 穆罕默德·阿尔维, 新学·刘 申请人:医药研究委员会