专利名称：奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建方法
技术领域：
本发明涉及泌乳模型的体外构建方法。
背景技术：
乳腺是乳汁合成和分泌的场所。以前在体外研究乳腺的泌乳功能与调控，多是采 用在二维平台上培养的乳腺上皮细胞作为研究载体。但研究表明，乳腺上皮细胞一但被分 离出来放到二维(平面)条件去培养，很快就会失去组织特异性功能。在乳腺上皮细胞二维 培养的时候，催乳素虽然可以激活STAT5 (信号转导和转录激活因子5)，但是这种STAT5的 激活是瞬时的，不能诱导乳蛋白基因的表达。而乳腺腺泡作为最小的泌乳功能单位则不同， 腺泡结构不但可以使催乳素受体在腺泡上皮细胞基底侧表达，而且可持续激活STAT5。这种 利用组成性激活STAT5的结构表明腺泡状结构对乳腺细胞内染色体重组和酪蛋白转录 是必需的。因此，体外培养的乳腺腺泡将逐渐取代乳腺上皮细胞，成为体外研究乳腺泌乳功 能调控的新平台。对乳腺腺泡模型的研究国际上最早是以小鼠为研究对象。1994年，Hurley等将妊 娠中期的小鼠乳腺上皮细胞在含有EHS (Engelbreth-Holm-Swarm)基质的培养基中培养， 乳腺细胞团形成带有空腔的腺泡样结构，细胞之间连接紧密。形成腺泡结构的乳腺上皮细 胞具有分泌极性，可以向腺泡腔中分泌酪蛋白和乳铁传递蛋白。1995年，Blatchford等将 35S标记的亮氨酸添加到培养基中，应用体外培养的小鼠乳腺腺泡模型研究乳蛋白的分泌方 式发现，乳腺上皮细胞存在顶浆分泌和基底侧分泌两种方式。1998年，Blatchford等又用 小鼠乳腺腺泡模型研究泌乳反馈抑制因子(feedbackinhibitoroflactation，FIL)的特性， 发现在这个模型中FIL不能抑制乳蛋白分泌，这是因为腺泡模型中紧密的胞间连接阻止了 FIL与腺泡腔侧乳腺腺泡上皮细胞表面FIL受体的相互作用。1999年，Blatchford等证实 EHS基质上乳腺腺泡模型的形成是由于位于细胞团中心的细胞选择性凋亡所致。在腺泡形 成的过程中，与乳腺细胞凋亡相关的胰岛素样生长因子结合蛋白5 (IGFBP5)表达升高。以 小鼠乳腺腺泡模型为基础，2004年，Dontu等在体外成功构建了人类乳腺腺泡模型并以此 研究Notch信号促进乳腺细胞增殖的作用。2006年，Liu等也用培养的人类乳腺腺泡模型 研究Hedgehog信号促进乳腺细胞自我更新的作用。同年Sharp等体外培养了海熊的乳腺 腺泡模型。目前，国内外均没有利用妊娠期奶牛乳腺上皮细胞构建腺泡模型的报道，而在畜 牧业生产和科学研究中，奶牛作为最主要的产奶经济动物，奶牛的产奶量和泌乳机能研究 是相当重要的研究领域，利用已知的小鼠、人等物种的乳腺腺泡来研究奶牛的泌乳功能是 不可行的；其原因是物种间的种属差异造成基因组结构、生理机能的不同；另外小鼠和人 类乳腺腺泡体外构建采用了较厚的基质成份，且所用的细胞为转染了逆转录病毒的细胞; 这种转染后的细胞改变了细胞自身的生长特性，虽然也可以在体外发育成乳腺腺泡模型结 构，但是由于构成腺泡模型的细胞自身已经不同于机体内真实的状态，因此此模型结构也 就失去了乳腺泌乳的真实性，如单纯的采用此种方法构建奶牛乳腺腺泡泌乳模型也必然存在模拟体内环境真实性降低的问题。以往在体外研究奶牛乳腺的泌乳功能时均以乳腺上皮细胞为研究载体，但是乳腺 上皮细胞一旦从乳腺组织中分离出来，进行常规的细胞培养，随着传代次数的增加，其组织 特异性功能逐渐消失，大大降低了细胞实验模拟体内环境的真实性。
发明内容
本发明目的是为了解决现有体外研究奶牛乳腺的泌乳功能时均以乳腺上皮细胞 为研究载体，存在模拟体内环境真实性低的问题，而提供奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构
建方法。奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建方法按以下步骤实现一、将基质 (Growthfactor-reducedMatrigel )在4°C条件下融解，然后铺在4°C预冷的细胞培养板 上，每孔基质厚度为0. 5mm，再置于37°C细胞培养箱中30 60min，得到基质凝胶的细胞培 养板；二、采用质量浓度为0. 25%的胰酶和质量浓度为0. 02%的EDTA消化原代培养的妊娠 4个月的奶牛乳腺上皮细胞5min，然后以1500r/min离心5min，收集细胞；三、将收集到的 细胞悬浮于4ml的分析培养基中，制得细胞悬液，然后用分析培养基将细胞悬液稀释到密 度为1 X 104 ；四、向基质凝胶的细胞培养板中加入2ml密度为1 X 104的细胞悬液，置于培养 箱中，在温度为37°C，C02的体积浓度为5%的条件下培养15日，即完成奶牛乳腺腺泡泌乳 模型的体外构建；其中步骤三中分析培养基由98ml的DMEM/F12基础培养基、2ml的胎牛血 清、lOiU浓度为50mg/ml的牛胰岛素、20 yl浓度为15. 15mg/ml的催乳素、60 yl浓度为 5mg/ml的氢化可的松和100 ill的10X双抗组成，经0. 22 y m滤膜过滤后，在4°C下储存。本发明构建的奶牛乳腺腺泡泌乳模型是最小的泌乳功能单位，其三维极性结构使 腺泡具有完整的乳汁合成和分泌能力，保证了其与体内腺泡在结构和功能上的一致性，这 种三维腺泡结构能真实地模拟体内情况，以此模型为载体开展研究，大大增加了实验结果 的直观性、准确性和科学性。本发明构建奶牛乳腺腺泡模型所需的基质厚度仅为0. 5mm，所采用的细胞为妊娠 4个月的原代培养的奶牛乳腺上皮细胞；这种原代培养的奶牛乳腺上皮细胞与奶牛乳腺组 织内细胞的生理状态一致，且具有很好的增殖特性，因此，以此细胞为基础构建出的奶牛乳 腺腺泡模型与反刍动物体内的乳腺腺泡具有一致的泌乳功能与生物学特性，模拟体内环境 的真实性高。本发明构建的奶牛乳腺腺泡泌乳模型具有许多与体内环境下腺泡相同的功能与 特性；该腺泡模型是奶牛乳腺内乳汁合成和分泌的最小结构与功能单位，其人工构建过程， 是体外模拟血乳屏障的仿真过程；本发明构建的奶牛乳腺腺泡泌乳模型，不但可以为体外 深入研究乳腺的泌乳机能提供简化并有效研究平台，深入研究乳腺中乳蛋白、乳糖及乳脂 的合成与分泌的生理生化过程，探讨多产奶和产好奶的规律和机理，而且可以为营养调控 和生物调控牛乳的乳产量和乳品质提供新的研究手段，也可以为乳腺生物反应器的研制提 供新的实验基础和新的思路。
图1为具体实施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜从中
4间至底端逐层扫描第一层的扫描图；图2为具体实施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型 的激光共聚焦显微镜从中间至底端逐层扫描图的第二层；图3为具体实施方式
一中所得奶 牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜从中间至底端逐层扫描图的第三层；图4为具体 实施方式一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜从中间至底端逐层扫描图 的第四层；图5为具体实施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜从中 间至底端逐层扫描图的第五层；图6为具体实施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激 光共聚焦显微镜从中间至底端逐层扫描图的第六层；图7为具体实施方式
一中所得奶牛乳 腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜从中间至底端逐层扫描图的第七层；图8为具体实施 方式一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜从中间至底端逐层扫描图的第 八层；图9为具体实施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜从中间至 底端逐层扫描图的第九层；图10为具体实施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光 共聚焦显微镜从中间至底端逐层扫描图的第十层；图11为具体实施方式
一中所得奶牛乳 腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜从中间至底端逐层扫描图的第十一层；图12为具体 实施方式一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜从中间至底端逐层扫描图 的第十二层；图13为具体实施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型的激光共聚焦显微镜 从中间至底端逐层扫描图的第十三层；图14为具体实施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌乳 模型中细胞核排列的激光共聚焦显微图；图15为具体实施方式
一中所得奶牛乳腺腺泡泌 乳模型中酪蛋白表达与分泌的激光共聚焦显微图。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建方法按以下步骤 实现一、将基质(Growthfactor-reducedMatrigel )在4°C条件下融解，然后铺在4°C预 冷的细胞培养板上，每孔基质厚度为0. 5mm，再置于37°C细胞培养箱中30 60min，得到基 质凝胶的细胞培养板；二、采用质量浓度为0. 25%的胰酶和质量浓度为0. 02%的EDTA消化 原代培养的妊娠4个月的奶牛乳腺上皮细胞5min，然后以1500r/min离心5min，收集细胞； 三、将收集到的细胞悬浮于4ml的分析培养基中，制得细胞悬液，然后用分析培养基将细胞 悬液稀释到密度为IX 104;四、向基质凝胶的细胞培养板中加入2ml密度为1X104的细胞 悬液，置于培养箱中，在温度为37°C，C02的体积浓度为5%的条件下培养15日，即完成奶牛 乳腺腺泡泌乳模型的体外构建；其中步骤三中分析培养基由98ml的DMEM/F12基础培养基、 2ml的胎牛血清、lOiU浓度为50mg/ml的牛胰岛素、20 yl浓度为15. 15mg/ml的催乳素、 60 u 1浓度为5mg/ml的氢化可的松和100 yl的10 X双抗组成，经0. 22 y m滤膜过滤后，在 4°C下储存。本实施方式步骤一中置于37°C细胞培养箱中30 60min，是为了使液态基质成为
基质凝胶。本实施方式步骤三将收集到的细胞悬浮于4ml的分析培养基中，采用lOOOiU的 加样枪轻轻将细胞团吹散，可使制得细胞悬液均勻。本实施方式步骤四中培养15日，每4日更换一次分析培养基。
本实施方式中所用试剂的配制
质量浓度为0. 25%的胰酶称取0. 25g胰酶，用100ml无钙镁离子的D-Hank’ s溶液溶 解，经0. 22 y m滤膜过滤后，分装1ml/管，-20°C储存；
质量浓度为0. 02%的EDTA 称取0. 02gEDTA，用100ml无钙镁离子的D-Hank，s溶液溶 解，经0. 22 y m滤膜过滤后，分装1ml/管，-20°C储存；
牛胰岛素将50mg牛胰岛素溶于1ml浓度为0. 05mol/L的HC1中，配成终浓度为50mg/ ml的储备液，经0. 22 y m滤膜过滤后，分装40 yl/管，-20°C储存；
催乳素将10mg催乳素溶于660iU浓度为0. 001mol/L的NaOH中，配成终浓度为 15. 15mg/ml的储备液，经0. 22 y m滤膜过滤后，分装40 u 1/管，-20°C储存；
氢化可的松将19mg氢化可的松溶于3. 8ml无水乙醇中，配成终浓度为5mg/ml的储备 液，经0. 22 y m滤膜过滤后，分装120 u 1/管，-20°C储存；
双抗配制10 X双抗，每100ml培养基中添加100 ill ；青霉素160万单位，链霉素100 万单位；取2支青霉素，3支链霉素，溶于30ml三蒸水中，经0. 22 y m滤膜过滤后，分装，即 为10X双抗。本实施方式中妊娠4个月的奶牛乳腺上皮细胞，在最初培养的第3 6日，增殖形 成小的细胞团；第6 10日发育成一个顶点-基底侧的极性的轴；基膜成分(胶原IV和层 粘连蛋白5)位于基底侧；位于细胞团中央的细胞经过复杂的细胞死亡过程，使得腺泡发育 成由单层乳腺上皮细胞合围而成的，具有分泌活性、通过功能性紧密连接组合而成的腔状 结构，可以向腺泡腔中分泌乳蛋白。本实施方式步骤四中培养15日，完成奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建，将所得 奶牛乳腺腺泡泌乳模型进行DAPI染色(染细胞核)，并采用激光共聚焦显微镜进行逐层扫描 并观察，结果如图1_13(奶牛乳腺腺泡泌乳模型从中间至底端逐层扫描图，上下相邻两层 之间的间距为5i!m)所示，可以看到在培养15日后，奶牛乳腺腺泡已经发育成由单层细胞 合围而成的闭合腔状结构；可见本实施方式采用原代培养的奶牛乳腺上皮细胞与奶牛乳腺 组织内细胞的生理状态一致，且具有很好的增殖特性，因此，以此细胞为基础构建出的奶牛 乳腺腺泡模型与反刍动物体内的乳腺腺泡具有一致的泌乳功能与生物学特性，模拟体内环 境的真实性高。本实施方式中所得奶牛乳腺腺泡泌乳模型，采用间接免疫荧光方法检测其乳蛋白 合成与分泌能力，结果如图14和15所示，可以看到酪蛋白的表达部位位于腺泡上皮细胞以 及腺泡腔中，表明在培养15日后，奶牛乳腺腺泡泌乳模型已经具有合成和分泌酪蛋白的能 力，可将腺泡上皮细胞中合成的酪蛋白分泌到腺泡腔中，具有与体内相同的功能与分泌极 性。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中置于37°C细 胞培养箱中40 50min，得到基质凝胶的细胞培养板。其它步骤及参数与具体实施方式
一 相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中置于37°C细 胞培养箱中45min，得到基质凝胶的细胞培养板。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
权利要求
奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建方法，其特征在于奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建方法按以下步骤实现一、将基质在4℃条件下融解，然后铺在4℃预冷的细胞培养板上，每孔基质厚度为0.5mm，再置于37℃细胞培养箱中30～60min，得到基质凝胶的细胞培养板；二、采用质量浓度为0.25%的胰酶和质量浓度为0.02%的EDTA消化原代培养的妊娠４个月的奶牛乳腺上皮细胞5min，然后以1500r/min离心5min，收集细胞；三、将收集到的细胞悬浮于4ml的分析培养基中，制得细胞悬液，然后用分析培养基将细胞悬液稀释到密度为1×104；四、向基质凝胶的细胞培养板中加入2ml密度为1×104的细胞悬液，置于培养箱中，在温度为37℃，CO2的体积浓度为5%的条件下培养15日，即完成奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建；其中步骤三中分析培养基由98ml的DMEM/F12基础培养基、2ml的胎牛血清、10μl浓度为50mg/ml的牛胰岛素、20μl浓度为15.15mg/ml的催乳素、60μl浓度为5mg/ml的氢化可的松和100μl的10×双抗组成，经0.22μm滤膜过滤后，在4℃下储存。
2.根据权利要求1所述的奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建方法，其特征在于步骤一 中置于37°C细胞培养箱中40 50min，得到基质凝胶的细胞培养板。
3.根据权利要求1所述的奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建方法，其特征在于步骤一 中置于37°C细胞培养箱中45min，得到基质凝胶的细胞培养板。
全文摘要
奶牛乳腺腺泡泌乳模型的体外构建方法，它涉及泌乳模型的体外构建方法。它解决了现有体外研究奶牛乳腺的泌乳功能时均以乳腺上皮细胞为研究载体，存在模拟体内环境真实性低的问题。方法一、制备基质凝胶的细胞培养板；二、采用胰酶和EDTA消化原代培养的妊娠４个月的奶牛乳腺上皮细胞，离心后收集细胞；三、制备细胞悬液并稀释；四、向基质凝胶的细胞培养板中加入细胞悬液，置于培养箱中培养15日，即完成构建。本发明构建的奶牛乳腺腺泡泌乳模型的人工构建过程，是体外模拟血乳屏障的仿真过程，其三维腺泡结构能真实地模拟体内情况，与反刍动物体内的乳腺腺泡具有一致的泌乳功能与生物学特性，模拟体内环境的真实性高。
文档编号C12N5/071GK101857852SQ20101018730
公开日2010年10月13日 申请日期2010年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者侯晓明, 李庆章, 林叶, 高学军 申请人:东北农业大学