用lna修饰寡核苷酸改进的靶向核苷酸交换方法

专利名称：：用lna修饰寡核苷酸改进的靶向核苷酸交换方法
技术领域：
：本发明涉及一种通过向靶细胞导入寡核苷酸引起在靶细胞内DNA特异位点的核苷酸序列的特异性和选择性改变的方法。结果是一个或多个核苷酸的靶向交换导致了靶DNA的序列中与上述寡核苷酸的序列不同的地方变成与该寡核苷酸相同的序列。具体地说，本发明涉及使用了修饰寡核苷酸的靶向核苷酸交换。本发明进一步涉及寡核苷酸和试剂盒。本发明也涉及所述方法的应用。
背景技术：
：遗传修饰是为了达到修改活细胞的，或者由该细胞作为组成部分的生物体的或者该细胞再生的产生的生物体的一个或者多个基因编码的生物学性质的目的，在活细胞的遗传物质中有意产生变化的过程。这些变化可以是下述形式，删除部分遗传物质、加入外源性遗传物质或者改变遗传物质中现有的核苷酸序列。20多年来，真核生物遗传修饰的方法已为人们所熟知，并且在植物、人类和动物细胞以及微生物中广泛应用以达到农业领域、人类健康、食品质量和环境保护的改善。遗传修饰的一般方法包括将外源DNA片段加入到细胞的基因组，这将给予该细胞或其生物体超过现有基因编码性质的新性质(包括现有基因的表达将因此被抑制的应用)。虽然许多这样的例子在获得所需性质上是有效的，然而这些方法并不是十分精确的，因为在外源DNA插入的基因组位置是没有控制的(因而对最终表达水平也没有控制)，同时因为所需效应必须要在原来良好平衡的基因组编码的天然性质的基础上显示。相反的，导致在预先确定的基因组位点的核苷酸的添加、删除或者转换的基因修饰的方法将会提供对现有基因的精确修饰。寡核苷酸指导的靶向核苷酸交换(Oligonucleotide-directedTargetedNucleotideExchange,TNE，有时称ODTNE)是一种基于将合成寡核苷酸传入真核生物细胞核的方法(含有核苷酸类似部分的短范围的分子，这与DNA在它们的Watson-Crick碱基配对性质方面相似，但是与DNA在化学性质上是不同的)(Alexeev和Yoon，NatureBiotechnol.1343，1998;Rice，NatureBiotechnol.12:321，2001;Kmiec，J.Clin.Invest.112:632，2003)。通过有意地在寡核苷酸同源性序列中的设计错配核苷酸，该错配核苷酸可以被包含到基因组DNA序列中。这种方法提供了在现有基因座中单个或者至多一些核苷酸的转换，但是可以用来在现有基因中产生终止密码子，这导致它们功能的破坏，或者用来产生密码子变化，产生编码氨基酸组成发生改变的蛋白质的基因(蛋白质工程)。靶向核苷酸交换(TNE)已经在植物、动物和酵母细胞中描述。最先的TNE报道利用了由设计的嵌入到染色体耙位的自我互补的寡核苷酸组成的所谓嵌合体。该嵌合体含有错配核苷酸形成在耙染色体引入突变的模板。为了对TNE事件进行选择，大多数研究试图在导致除草剂抗性的内源性基因中引入一个单个核苷酸变化。最初使用嵌合体的例子来自人类细胞(参见综述Rice等，Nat.Biotech.J^:321-326)。嵌合体的使用同样在植物种烟草、稻米、和玉米中已经是成功的。(Beetham等，1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA巡8774-8778;Kochevenko等，2003PlantPhys.巡174-184;Okuzaki等，2004PlantCellRep.509-512)。然而，嵌合体的活性被发现是很难复制的，因此单链(ss)寡核苷酸的TNE活性已经被测定。已发现在小麦、酵母以及人类细胞中结果更具有可重复性(Liu等，2002Nuc.AcidsRes.1^:2742-2750;综述，Parekh-Olmedo等，2005GeneTherapy12:639-646;Dong等.2006PlantCellRep.21:457-65)。一些研究组已经证明TNE也可以通过使用总细胞蛋白提取物检领U。该TNE活性分析被称为无细胞分析(Cole-Strauss等，1999NucleicAcidsRes.27:1323-1330;Gamper等，2000NucleicAcidsRes.28，4332-4339;Kmiec等，2001PlantJ.;22:267-274;Rice等，2001处857-868)。该分析组织如下。使含有两个细菌抗菌素抗性基因(卡那霉素和羧苄青霉素)的质粒突变，以便由于单个核苷酸的变化(例如，从TAT到TAG)使其中一个抗菌素抗性基因(例如卡那霉素)含有一个框架内终止密码子。这个突变的质粒然后与总细胞蛋白以及设计用来校正抗生素抗性基因中的终止密码子的单链寡核苷酸进行培养。TNE必需的蛋白质存在于细胞提取物中，并且使用上述寡核苷酸来改变抗菌素抗性基因中的终止密码子，恢复了抗性表型。质粒DNA然后从反应混合物中提取同时转入大肠杆菌。该细菌随后在含有卡那霉素的培养基上进行培养，同时细菌菌落的数量代表TNE修复事件的数量。电穿孔效率通过生长在含有羧苄青霉素的培养基上的菌落数的计数来计算。TNE效率可以通过计算修复质粒相对转入质粒的总数的比例来定量。在所述的实验中，该寡核苷酸产生置换，将TAG改变为TAC。此外，无细胞系统也可以用来研究使用寡核苷酸产生单核苷酸插入的可能性。可以制备含有从抗生素基因删除单核苷酸、产生移码突变的质粒。在无细胞分析中，删除部分通过由该寡核苷酸介导的单核苷酸的添加而被修复。TNE在如植物这样高等生物的细胞中的的应用所面临的最大问题，到目前为止已有报道的是其效率低的问题。在玉米中，Zhu等(2000NatureBiotech.il:555-558)报道的转换率为1x10—4。后来在烟草(Kochevenko等2003PlantPhys.174-184)和稻米(Okuzaki等2004PlantCellRep.^2:509-512)上的研究分别报道了1><10-6和lxl(^的转换率。这些转换率对于TNE的实际应用仍然是太低的。可靠的DNA复制是传递基因组组稳定性维持以及保证DNA含有的遗传信息免于突变从一代传到下一代的关键标准之一。许多错误起于亲代DNA链中的损害或由与DNA碱基起反应的试剂引发(UV光，环境毒素)。每个生物体必须含有一个防御机制以防止或者校正这些突变。错配修复系统(MMR)被认为是在DNA损害监视和防止非全同序列之间的重组中识别以及校正错配或在DNA复制中引起的不配对碱基(Fedier和Fink，2004Int.JOncol.2004;24(4):1039-47)，并且促成活细胞中DNA复制的精确度。TNE已经在许多Kmiec专利申请中有描述，其中如WO0173002、WO03/027265、WOO1/87914、WO99/58702、W097/48714、WO02A0364。在WO01A73002中注意到使用未修饰DNA寡核苷酸得到的基因变化的低效率被认为主要是由于反应混合物或者靶细胞中的核酸酶引起的供体寡核苷酸降解的结果。为了补救这个问题，提出结合修饰核苷酸以使得所得寡核苷酸对核酸酶有抗性。典型的例子包括带有磷硫酰键、2'-氧-甲基-类似物或者锁核酸(LNA)的核苷酸。这些修饰优选地位于寡核苷酸的末端，留下环绕靶碱基的中心DNA区域。此外，该出版物规定在转化寡核苷酸和参与转化过程的蛋白质之间有特异的化学相互作用。因为参与改变过程的蛋白质及其与寡核苷酸取代基的化学相互作用是未知的，通过在寡核苷酸内使用除LNA、磷硫酰连接或者2'-氧-甲基类似物以外的修饰以产生抗核酸酶末端的上述化学相互作用的作用是不可预测的，并且根据WO0173002,发明者认为是不能预测的。因为ODTNE现有方法的效率是相对低的(如前所述，在10—6和10—4之间，尽管报道有90%的寡核苷酸传递率)，在本领域中需要更有效率的TNE方法。相应地，本发明者已经开始改进现有TNE技术。
发明内容本发明者现在己经发现通过将与象A、C、T或G未修饰核苷酸相比与受体DNA结合能力更强的相应核苷酸结合到TNE供体寡核苷酸中，TNE比率可以显著提高。抛开理论的束缚，本发明者相信通过将修饰核苷酸结合到供体寡核苷酸，该供体寡核苷酸更强的结合到受体DNA，因此提高了TNE比率。本发明者已经发现在接近但是不(直接)毗邻错配的位置，即和错配位至少有一个核苷酸的距离，含有一个或者更多LNA的寡核苷酸可以显著提高TNE的效率。为此，在无细胞系统中按TNE转换率使用在寡核苷酸内不同位置结合了一个或更多LNA的寡核苷酸的效果已经被研究。该寡核苷酸的TNE活性与由普通DNA构成的寡核苷酸的TNE活性进行比较。我们发现在错配位移除至少一个核苷酸的位置上含有一个或者多个LNA的寡核苷酸可以使无细胞分析中的置换和插入TNE效率都提高到迄今未观察到的水平。含有LNA的寡核苷酸与由普通DNA构成的寡核苷酸相比在无细胞分析中达到多IO倍的效率。我们发现TNE效率可以在寡核苷酸中LNA数量的增加时而改善，多个LNA被分别安置在至少相隔2个核苷酸，优选至少3个，更优选至少4个的位置。此外，我们发现所观察到的改善不依赖于基因座，这表明与错配相比带有特定位置LNA的本发明的寡核苷酸能够以不依赖于物种的方式提供提高的TNE转换率，例如在植物和动物细胞中。因此，本发明是基于合乎需要的耙向核苷酸交换可以通过使用部分(即至多为75%，优选至多为50%)LNA修饰的核苷酸而完成的创造性设想。寡核苷酸修饰的位置、类型和数量可以在如下公开的限定内不同。因此，本发明的一个方面提供了LNA修饰寡核苷酸。LNA修饰的，ss-寡核苷酸可以用来在植物和动物或者人类细胞引入特定的基因变化。本发明适用于生物医学研究、农业领域，并且适用于构建特定的突变植物和动物，包括人类。本发明也适用于药物和基因治疗领域。本发明的寡核苷酸序列除了含有错配碱基的部分以外与靶链是一致的，其中的错配碱基在靶链中引入了碱基变化。错配碱基被引入到靶序列中。通过处理核苷酸的修饰(与常规的A、C、T或G相比)，更特别地，通过处理引入错配的寡核苷酸的LNA修饰的位置和数量，效率(或者在DNA双链中的所需位置上引入所需核苷酸的成功程度)可以得到改善。本发明的另一个方面是一种通过使亲本DNA双链接触含有至少一个与亲本链相比错配的核苷酸的寡核苷酸以实现亲本DNA链(第一条链，第二条链)靶向改变的方法，其中供体寡核苷酸包含在能够实现靶向核苷酸交换的蛋白质存在时，在特定位置用LNA修饰以获得比亲本(受体)链具有更高结合力的区段。因此，本发明的要点在于相对于未修饰的插入寡核苷酸，带有LNA核苷酸的插入寡核苷酸(有时称为供体)的结合力的改善，LNA修饰位于不毗邻所述错配的一个或者多个位置。具体实施例方式本发明的一个方面涉及用于双链DNA序列靶向改变的寡核苷酸，该双链DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，该寡核苷酸包含能够杂交到第一DNA序列的结构域，该结构域包含至少一个与第一DNA序列有关的错配，其中该寡核苷酸包含至少一个区段，所述的区段含有至少一个与天然存在的A、C、T或G相比具有更高的结合亲和力的修饰核苷酸，其中，优选地，所述的至少一个修饰核苷酸与天然存在的第一DNA序列中相对位置上的核苷酸的互补核苷酸相比，对第一DNA序列中相对位置上的该核苷酸的结合更强，其中所述的至少一个修饰核苷酸是一个置于距离所述的至少一个错配至少一个核苷酸的LNA，并且优选的，其中该寡核苷酸含有至多约75%的修饰核苷酸。在一个方面，本发明涉及用于双链DNA序列耙向改变的LNA修饰寡核苷酸。该双链DNA序列包含第一DNA序列和第二DNA序列。该第二DNA序列与第一DNA序列互补，并且与第一DNA序列配对形成双链。该寡核苷酸包含含有至少一个与将被改变的双链DNA序列有关的错配的结构域。优选地，该结构域是与第一链的互补的，包括至少一个错配的寡核苷酸的一部分。优选地，该结构域内的错配与第一DNA序列有关。该寡核苷酸包含由至少一个LNA修饰的区段以具有比第二DNA序列(的相应部分)更高的结合亲合力。优选地，所述的至少一个修饰核苷酸是一个置于距离所述的至少一个错配至少一个核苷酸的LNA，更优选的，该寡核苷酸含有至多约75%的LNA修饰核苷酸。含有错配的结构域和含有修饰核苷酸的区段可以是重叠的。因此，在某些实施方案中，含有错配的结构域在寡核苷酸上位于与修饰区段不同的位置。在某些实施方案中，该结构域包括所述的区段。在某些实施方案中，该区段包括所述的结构域。在某些实施方案中，该结构域和该区段位于寡核苷酸上相同位置并且具有相同的长度，即它们的长度和位置重叠。在某些实施方案中，在该结构域中可以有多于一个的所述的区段。对于本发明，这意味着含有结合到DNA双链中的错配的寡核苷酸的部分可以位于与寡核苷酸被修饰部分不同或者移位的位置。特别地，在某些实施方案中，其中细胞修复系统(或者至少是与该系统有关的蛋白质，或者至少是涉及TNE的蛋白质)决定了哪条链含有所述的错配以及哪条链用作错配校正的模板。在某些实施方案中，寡核苷酸包含含有至少一个，优选为至少2个，更优选为至少3个LNA修饰核苷酸的区段。在某些实施方案中，在寡核苷酸上的所述的区段可以包含多于4、5、6、7、8、9或者10个LNA修饰核苷酸。在某些实施方案中，所述的至少一个LNA被置于距错配至多10个核苷酸，优选为至多8个核苷酸，更优选为至多6个核苷酸，甚至更优选为至多4、3或者2个核苷酸的距离。在一个更优选的实施方案中，所述的至少一个LNA被置于距错配1个核苷酸的距离，即一个核苷酸被置于错配和LNA之间。在某些涉及含有多于一个LNA寡核苷酸的实施方案中，每个LNA位于距错配至少一个核苷酸的距离。在一个优选的实施方案中，LNA不是彼此毗邻的而是至少由一个核苷酸分开，优选地两个或者三个核苷酸。在某些实施方案中，在有两个或者更多(偶数)个寡核苷酸的LNA修饰时，修饰从错配以(大约)相等的距离被间隔。换句话说，优选地，LNA修饰被对称地置于错配的周围。例如，在一个优选的实施方案中，两个LNA以距错配1个核苷酸的距离对称地置于错配的周围(同时彼此之间是3个核苷酸)。在某些实施方案中，至多50%的寡核苷酸的修饰核苷酸是LNA衍生物，例如，常规的A、C或G被它的LNA相应物代替，优选为至多40%,更优选为至多30%，甚至更优选为至多20%，最优选为至多10%。在某些实施方案中，多于一个的错配可以同时或者接连被引入。寡核苷酸可以接纳多于一个的寡核苷酸上毗邻或者间隔位置上的错配。为此，寡核苷酸可以适合接纳一个第二套遵守这里描述的原则的LNA，只要它们不会由于在寡核苷酸中LNA的特殊构象而干扰彼此的改善的结合能力，即优选地距错配1个核苷酸的距离相互间隔地围绕在错配周围。在某些实施方案中，寡核苷酸可以包含2、3、4或者更多个错配核苷酸，它们可以是毗邻的或者远离的(即非毗邻的)。寡核苷酸含可以包含结构域和区段以接纳上述内容，特别地可以包含若干区段。在某些实施方案中，该寡核苷酸可以包括一个潜在的插入，该插入将被插入到受体链中。所述的插入在长度上可以是不同的，从多于5个核苷酸直至达到100个核苷酸。同理，在某些实施方案中，类似的不同长度的核苷酸片段可以被删除(1-100个核苷酸)。本发明的还有一个方面，寡核苷酸的设计可以通过以下步骤完成——确定所要交换的受体链序列，或至少是围绕将要发生交换的核苷酸的序列区段。典型地，这可以是至少10个，优选为15、20、25或30个核苷酸毗邻错配，优选在错配的两侧(例如GGGGGGXGGGGGG，其中X是错配)；——设计一个供体寡核苷酸，该寡核苷酸与毗邻错配的一个或者两个区段互补，并且包含所需的将被交换的核苷酸(例如CCCCCCYCCCCCC);——提供(例如，通过合成)在所需的位置带有LNA修饰得供体寡核苷酸。修饰可以是很大程度上不同的，这依赖于环境。例如，CCCmCCmCYCCmCCCmC、CCCmCCCYCCCmCCC、CCCCCCYCCCmCmCmCm、CmCmCmCmCmCYCCCCCC、CCCCCmCYCCCmCCCCC等等，其中C"M戈表一个LNA修饰核苷酸残基。对于不同的受体序列，例如ATGCGTACXGTCCATGAT,可以设计相应的供体寡核苷酸，例如，TACGCALGYCLGGTACTA(L=LNA)，其修饰可以进行如前所述的变化。——在能够靶向核苷酸交换的蛋白质存在时，用供体寡核苷酸对DNA进行修饰，例如，特别地，所述蛋白质在细胞错配修复机制中发挥功能的蛋白质。抛开理论的束缚，改善的结合亲合力被认为是提高寡核苷酸的发现并且保持结合到它的靶标的可能性，从而改善TNE效率。许多不同的糖主链或者碱基的化学修饰提供了改善的结合亲合力。然而，本发明人致力于研究LNA修饰寡核苷酸，发现它们在TNE中的活性取决于在寡核苷酸中的位置。封闭核苷酸(LNA)是一种具有非常有趣性质的用于反义基因疗法的DNA类似物。LNA是二环核苷酸和三环核苷酸和核苷酸类似物和含有这样核苷酸类似物的寡核苷酸。LNA和相关类似物的碱基结构和功能特性在许多公开物和专利中公开了，包括WO99/14226、WO00/56748、WO00/66604、WO98/39352，美国专利No.6,043,060，以及美国专利No.6,268,490，所有的这些通过引用完整的合并于此。特别地，它结合了辨别正确和不正确的靶标(高专一性)，非常高的生物稳定性(低周转，lowturnover)和空前的亲和力(对耙非常高的结合力)的多种能力。事实上，LNA带来的亲和力的增加使得先前报道的类似物的亲和力处于低到中度的范围。LNA是一种RNA类似物，其中的核酸糖在结构上受到2，-氧原子和4，-碳原子之间的亚甲基桥的抑制。该桥接限制了呋喃核糖的适应性并且将结构封闭到刚性二环结构中。这样所谓的N型(或3，-内)构象导致含有双链LNA的Tm的增加，以及因此获得的更高的结合亲合力和更高的特异性。NMR光谱研究现在已经实际上证实了LNA糖封闭的N型构象，但是也显示LNA单体可以扭曲它们的未修饰的相邻核苷酸成为一个N型构象。重要地，所述的LNA的有利特性并不像其它核苷酸类似物经常观察到的那样以牺牲其他重要性质为代价。LNA可以与所有其它构成DNA类似物集合的化学化学物自由混合。LNA碱基可以作为短全LNA序列或作为较长的LNA/DNA嵌合体结合到寡核苷酸中。LNA可以被置于内部，3'或5'-位置。然而，由于它们的刚性二环构象，LNA残基有时会扰乱核苷酸链的螺旋状扭曲。因此通常很少设计带有两个或者更多毗邻LNA残基的寡核苷酸。优选地，LNA残基被至少一个不干扰螺旋状扭曲的(修饰)核苷酸如常规的核苷酸(A、C、T或G)分开。最初发展的以及优选的LNA单体(β-D-氧-LNA单体)已经被修饰成新的LNA单体。新的a-L-氧-LNA显示出对于3'核酸外切酶活性的高稳定性，并且比3-D-氧-LNA在设计有效反义寡核苷酸方面更有效率且具有更多用途。同时，可以使用xylo-LNA和L-riboLNA，如W09914226、WO00/56748、WO00/66604所公开的。在本发明中，任何上述类型的LNA在达到本发明的目的(即改善TNE效率)上都是有效的，优选为3-D-LNA类似物。在TNE领域，LNA修饰已经被列举在用于作为TNE的嵌合分子的可选择的可能寡核苷酸的列表中。然而，该领域迄今没有给出LNA修饰单链DNA寡核苷酸将TNE效率显著提高到现在已经发现的当LNA置于距错配至少一个核苷酸和/或寡核苷酸不含有超过约75%(大概是核苷酸的最接近整数)LNA时的水平。寡核苷酸的递送可以经电穿孔法或者其它能够递送到细胞核或者细胞质的常规技术来完成。在活体外，本发明的方法的试验可以通过使用例如WO01/87914、WO03/027265、WO99/58702、WO01/92512中所述的无细胞系统来完成。如这里所用的，供体寡核苷酸影响TNE的能力依赖于合并到供体核苷酸中的修饰核苷酸的类型、位置和数量或相对量。这种能力可以通过例如将常规核苷酸之间的结合亲合力(或结合能(吉布斯自由能))以1为标准进行标准化的方法定量，即对于AT和GC的结合，该亲合力被标准化为l。对于本发明的寡核苷酸，各修饰核苷酸的相对结合亲和力(RelativeBindingAffnity，RBA)是大于1。这体现在下面的公式中<formula>seeoriginaldocumentpage15</formula>其中，RBA是总相对结合亲和力，RBA(修饰的)是具有n个核苷酸长度的修饰寡核苷酸的相对结合亲和力的和，RBA(非修饰的)是具有m个核苷酸长度的修饰寡核苷酸的相对结合亲和力的和。例如，一个100bp的寡核苷酸含有10个修饰，每个修饰具有1.1的相对结合亲和力。那么总RBA等于RBA=[(10*1.1)+(90*1.0)]-(100*1.0)=1。要注意的是，RBA的定义原则上不依赖于与之相比的核苷酸链的长度。然而，当不同链的RBA相比较时，优选地是链具有大约相同的长度或者长度相当的区段被采用。要注意的是，RBA在修饰可被集合在一条链上未予考虑。因此，相比链B，某链A更高的修饰度表示RBA(A)>RBA(B)。对于上游和下游区段，相应的(局部的)RBA值是可以被确定和使用的。为了调节修饰核苷酸的位置的作用，加权因子被引入RBA值。例如，在毗邻错配的供体核苷酸上的修饰核苷酸的作用可以比位于错配5个核苷酸距离的修饰核苷酸的作用更大。在本发明的上下文中，RBA(供体)>RBA(受体)。在某些实施方案中，供体的RBA值至少比受体的RBA值大0.1。在某些实施方案中，供体的RBA值至少比受体的RBA值大0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5。RBA值可以通过核苷酸修饰结合亲合力的常规分析获得，例如通过分子模型、热力学测量等等。可选择地，它们可以通过修饰和未修饰链之间的Tm差值的测定来决定。可选择地，RBA可以表达为未修饰和修饰链之间在Tm的差值，该差值或者通过测量或者通过用于计算一套核苷酸的Tm的常规公式计算，或者结合计算和测量来获得。根据本发明的供体寡核苷酸可以包含进一步的修饰以改善杂交性质，使得供体显示出对靶DNA链提高的亲和力，以便供体的插入更容易。供体寡核苷酸可以进一步被修饰以对核酸酶更具抗性、以稳定三倍体或四倍结构。本发明的LNA修饰供体寡核苷酸的修饰可以包含磷硫酰修饰、2-OMe置换、在寡核苷酸的3'和/或5'末端的进一步使用LNA、PNA(肽核苷酸)、核糖核苷酸和其他修饰，优选增强寡核苷酸和受体链之间的杂交稳定性的碱基。这些修饰中特别有用的是PNA，它们是寡核苷酸类似物，其中的脱氧核糖主链被肽主链替代。一种所述的肽主链由酰胺键连接的N-(2-氨乙基)(N-(2-aminoethy1))甘氨酸的重复单位构成。每个肽主链的亚单位附加到一个核碱基(nucleobase，也命名为"碱基")，该核碱基可以是天然存在的、非天然存在的或修饰的碱基。PNA寡聚物特异性结合到比DNA或RNA具有更高亲和力的互补DNA或RNA序列。相应地，所得的PNA/DNA或PNA/RNA双链具有更高的解链温度(Tm)。另外，PNA/DNA或PNA/RNA双链的Tm比DNA/DNA或DNA/RNA双链对于盐浓度较不敏感。PNA的聚酰胺主链也对酶解作用更具抵抗力。PNA的合成在例如WO92/20702和WO92/20703中有描述，它们的内容通过引用完整的合并于此。其它的PNA在例如W093/12129和1996年7月23日颁发的美国专利No.5,539,082中有说明，它们的内容全部引入以作为参考。另外，许多科学出版物叙述了PNA的合成以及它们的性质和用途。参见，例如Patel，Nature,1993，365，490;Nielsen等，Science,1991，254，1497;Egholm，J.Am.Chem.Soc，1992，114，1895;Knudson等，NucleicAcidsResearch,1996，24，494;Nielsen等，J.Am.Chem.Soc，1996，118，2287;Egholm等，Science,1991，254，1497;Egholm等，J.Am.Chem.Soc.，1992，114，1895;以及Egholm等，JAm.Chem.Soc.，1992，114，9677。更多有用的本发明的LNA寡核苷酸以SuperA和SuperT被熟知，这从EpochBiosciencesGermany可获得。这些修饰核苷酸含有插入到DNA大沟中的附加取代基，被认为可以改善DNA双链中碱基堆积。在进一步的实施方案中，有利结果可以在根据本发明的LNA修饰寡核苷酸之外，进一步修饰引入到寡核苷酸提高受体链寡核苷酸的亲和力时获得。因此，我们已经发现根据本发明的LNA修饰寡核苷酸进一步含有C5-丙炔修饰嘧啶和/或C7丙炔基修饰嘌呤显著改善了TNE的效率。本发明的供体寡核苷酸也可以用来制备嵌合体，即含有DNA、RNA、LNA、PNA或其结合的区段。因此，在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸还包含其它可选的非甲基化的修饰核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸对核酸酶是抗性的。这有利于防止寡核苷酸被核酸酶降解以及增加供体找到它的耙标(受体分子)的可能性。在某些实施方案中，位于错配位置上的寡核苷酸中的核苷酸是可以被修饰的。错配是否可以修饰很大程度上依赖于使用供体和受体链之间亲和力上的差异的靶向核苷酸交换的精确机制或者细胞DNA修复机制。对于错配的临近或者接近位置上的其它修饰的位置的精确定位来讲也是一样的。然而，基于此处的公开，所述的寡核苷酸是容易设计和试验的，参考本说明书中其它地方所描述的对合适的寡核苷酸的试验操作。在某些实施方案中，在错配位上的核苷酸是不被修饰的。在某些实施方案中，修饰位于距错配l个核苷酸距离的位置，优选为距错配2、3、4、5、6或7个核苷酸的位置。在某些实施方案中，修饰位于距错配下游区的位置。在某些实施方案中，修饰位于距错配上游区的位置。在某些实施方案中，修饰位于距错配10bp到10kB的位置，优选为距错配50到5000bp，更优选为距错配100-500。用作供体的寡核苷酸在长度上可以是不同的，但一般的长度上的变化在10到500个核苷酸之间，优选为11到100个核苷酸，优选为15到90个核苷酸，更优选为20到70个核苷酸，最优选为30到60个核苷酸。在一个方面，本发明涉及双链受体DNA序列靶向改变的方法，包括使该双链受体DNA序列结合一条供体寡核苷酸，其中该双链受体DNA序列含有一条第一DNA序列和一条与第一DNA序列互补的第二DNA序列，以及其中该供体寡核苷酸含有包含至少一个与将被改变的双链受体DNA序列有关的错配的结构域，优选地与第一DNA序列有关，以及在有靶向核苷酸交换能力的蛋白质存在时，其中供体寡核苷酸的区段被LNA修饰以表现出与寡核苷酸中位于该位置上的未修饰核苷酸相比，对于第一DNA序列更高的亲和力，其中LNA位于距离至少相对该错配一个核苷酸的位置。广义地来讲，本发明一般适用于所有种类的生物体，例如人类、动物、植物、鱼类、爬行类动物、昆虫、真菌、细菌等等。本发明适用于任何类型DNA的修饰，例如得自基因组DNA、线性DNA、人工染色体、核染色体DNA、细胞器染色体DNA、BAC、YAC的DNA。本发明可以在活体内(invivo)以及取自体内在活体外(exvivo)完成。广义地来讲，本发明适用于改变细胞、通过回复校正突变到野生型、诱导突变、通过破坏编码区的灭活酶、通过改变编码区对酶的生物活性进行修饰、通过破坏编码区对蛋白质进行修饰。本发明实质上也涉及如上所述寡核苷酸的用途，用于改变细胞、通过回复校正突变到野生型、诱导突变、通过破坏编码区的灭活酶、通过改变编码区对酶的生物活性进行修饰、通过破坏编码区对蛋白质进行修饰、错配修复、靶向改变(植物)遗传物质，包括基因突变、靶向基因修复和基因敲除。本发明进一步涉及试剂盒，其包含一个或者更多如本说明书在别处所定义的寡核苷酸，可选的联合能诱导MRM、特别是有TNE能力的蛋白质。本发进一步涉及通过本发明的方法得到的修饰遗传物质、涉及含有该修饰遗传物质的细胞和生物体，以及涉及如此得到的植物或植物部分。本发明特别涉及使用本发明的LNA修饰寡核苷酸以提供植物中的抗除草剂的TNE方法的用途。特别地，本发明涉及被提供了抗除草剂的植物，尤其是草甘磷和/或磺酰脲类除草剂，例如氯磺隆。附图1:靶向核苷酸交换图示。含有将被交换核苷酸(X)的受体双链DNA链被带入与含有将被插入的核苷酸(Y)的LNA修饰供体寡核苷酸(以NWTNNNmYNNmNNm的图式给出)接触。三环构造受到或被带入接触有TNE能力的环境或者与有执行TNE能力的蛋白质接触，例如所知的无细胞的酶混合物或者无细胞提取物(参见i.a.WO99/58702、WO01/73002)。附图2:不同LNA的化学结构。附图3:使用无细胞分析测量的含有LNA修饰核苷酸的寡核苷酸的TNE修复效率。每个使用普通DNA寡核苷酸的实验的修复效率被确定，并且被定义为1的值。成倍的增加表明通过使用含有3-D-LNA的寡核苷酸与使用普通DNA寡核苷酸相比得到的修复效率的观察到的修复的增加。实施例材料和方法含有LNA核苷酸的寡核苷酸从Eurogentec购买。所用的寡核苷酸的序列如下所示。实验中所用的质粒是含有能给予卡那霉素和羧苄青霉素抗性的基因的pCR2.1(Invitrogen)的衍生物。在结构中，终止密码子和缺失基因组被引入卡那霉素ORF和羧苄青霉素，如前人所述(Sawano等，2000NucleicAcidsRes.e78)。质粒KmY22stop在卡那霉素ORF中密码子Y22处具有TAT到TAG的突变。在质粒KmY22中，Y22密码子(TA工)的第三核苷酸被删除给出一个移码。有缺陷的卡那霉素基因和用在无细胞系统中的寡核苷酸<formula>seeoriginaldocumentpage20</formula><table><row><column>寡核苷酸</column><column>序列</column><column>LNA/DNA</column><column>SEQID</column></row><row><column>L1</column><column>tgtgcccagtCgTagccgaatagc</column><column>2/24(8-3%)</column><column>1</column></row><table><table><row><column>L2</column></row><row><column>tgtgcccagTcgtAgccgaatagc</column></row><row><column>2/24(8-3%)</column></row><row><column>2</column></row><row><column>13V</column></row><row><column>TgTgCcCaGtCg;TaGcCgAaTaGc</column></row><row><column>12/24(50%)</column></row><row><column>3</column></row><row><column>L4</column></row><row><column>GtGcCcAgTcGtAgCcGaAtAgC</column></row><row><column>12/24(50%)</column></row><row><column>4</column></row><row><column>L5</column></row><row><column>GtgcCcagTcgtAgccGeta/tAgc</column></row><row><column>6/24(25%)</column></row><row><column>5</column></row><row><column>L6</column></row><row><column>tgtgCccagTcgtaGccgaAtagc</column></row><row><column>4/24(16-6%)</column></row><row><column></column></row><table>相关的卡那霉素开放读码框和编码的氨基酸的序列被展示。产生终止密码子(TAG，勺的单个核苷酸突变如前所述被引入(Sawano等，2000NucleicAcidsRes.2§:e78)。实验中使用的LNA寡核苷酸的序列以大写字母显示。寡核苷酸Ll-L6被用来使KmY22stop和KmY22A突变转化为交变的酪氨酸编码密码子(TAC)。在每个寡核苷酸中的错配核苷酸是用下划线强调的。在卡那霉素ORF上的寡核苷酸结合区域是用下划线强调的。寡核苷酸Ll-L6是卡那霉素编码序列的互补。无细胞分析按照如下完成拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Col-0生态型)的花芽被收集并且在氮下粉碎。200^tl蛋白质分离缓冲液(20mMHEPESpH7.5、5mMKC1、1.5mMMgCl2、10mMDTT、10%(v/v)甘油、1%(w/v)PVP)被加入。植物碎屑通过离心分离在14kRPM下30分出沉淀，并且上清液在-80。C储藏。蛋白质浓縮物通过使用NanoOrange试剂盒(MolecularProbes,Inc)被测量。一种典型的分离物导致约3-4pg4il的蛋白质浓度。无细胞反应包括以下组分，lpg质粒DNA(KmY22stop或KmY22△)，100ng寡核苷酸，30ng总植物蛋白，4^1切断的鲑精DNAG(ig/W)，2^蛋白酶抑制剂混合物(50x浓度完全无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂，RocheDiagnostics),50(xl2x无细胞反应缓冲液(400mMTrispH7.5、200mMMgC12、2mMDTT、0.4mM精脒、50mMATP、2mM每种CTP、GTP、UTP，O.lmM每种dNTP和10mMNAD)，加水至总体积lOO(il。混合物在37°C下培养1小时。然后质粒DNA按以下方法分离。100U1H2021加入到每个反应中以增加体积随后加入20(V1的碱性缓冲苯酚(pH8-10)。简要地旋转然后在13krpm下离心3分钟。上层的水相被转到一个新的试管中同时然后加入200pl氯仿，简要地旋转，然后在13krpm旋转3分钟，上层水相转移到一个新的试管中。DNA通过加入0.7体积的2-丙醇沉淀出来，同时片状沉淀物在TE中再悬浮。为了清除任何共纯化寡核苷酸，DNA通过QiagenPCR纯化柱，同时质粒DNA在30pl的终体积中洗脱。2jil的质粒DNA电穿孔到18(ilDH10B(Invitrogen)电穿孔感受态细胞。在电穿孔后，细胞在37°C下在SOC培养基中恢复1小时。这段时间以后，卡那霉素加入到100昭/ml的浓縮物中，同时细胞进一步培养3小时。固体培养基含有100i!g/ml卡那霉素或者羧节青霉素。对于KmY22stop禾nKmY22实验，TNE事件的数量在卡那霉素培养基上被检测，同时电穿孔术的效率通过计数得自羧苄青霉素培养基析出的电穿孔的10—4和10—5稀释的菌落的数量而计算。TNE效率通过按转化细胞的总数除以TNE事件的数量而计算。结果寡核苷酸被设计在引入到卡那霉素ORF中的终止密码子(TAG)产生单个核苷酸置换(KmY22stop)或插入(KmY22A)，因此密码子再次编码正确的氨基酸。在每个实验中，未修饰DNA寡核苷酸和LNA修饰寡核苷酸是平行进行的。在每个实验中，使用普通DNA寡核苷酸得到的TNE效率被设定为1，同时LNA寡核苷酸的TNE效率随后以与普通DNA寡核苷酸相比成倍增长的形式表达。我们发现修复效率的增加依赖于LNA在寡核苷酸中的位置。寡核苷酸Ll含有在错配核苷酸两侧的LNA核苷酸，同时这表明与DNA寡核苷酸相比没有改善。然而，带有与错配间隔一个核苷酸的LNA核苷酸的寡核苷酸L2表现出5倍的平均增加。额外的LNA核苷酸(L3&L4)的加入减少修复效率低于普通DNA寡核苷酸的修复效率到背景水平，这些寡核苷酸是无生物学活性的。这被使用L5和L6的数据所证实。在L5中，除了如L2中的LNA侧邻错配核苷酸，它还包含附加的LNA核苷酸。在这个例子中，使用L2得到的在修复中的增加是观察不到的，推测这可能是附加LNA核苷酸的抑制作用。L6也表明当使用KmY22stop时修复中的改善。同样的趋势当实验使用KmY22A完成时也被观察到。已知经由单个核苷酸插入的修复比经由置换的修复的效率低，这与此处观察到的相同。L2表明在修复率的增加，这表明围绕错配的LNA核苷酸位置的插入是增加修复率的一个重要特征。在本发明中，实验表明使用无细胞系统活体外TNE分析，含有LNA核苷酸的寡核苷酸表现出相比使用普通DNA寡核苷酸得到的TNE效率更高水平的TNE。所述的增加可以是高达5倍。该作用很大程度上依赖于相对错配核苷酸LNA核苷酸的位置。此外，修复过程对寡核苷酸上LNA核苷酸的数量非常敏感，当该数量达到50%时，寡核苷酸表现出在分析中减少的生物学活性。LNA核苷酸的另一种形式，2'-氨基-LNA类似物(Rosenbohm等，(2003)OrgBiomolChem.丄，655-663)可以通过在核苷酸中附加其他化学基团而进一步功能化。除增加的结合亲合力以外，所述的具有附加化学基团的LNA核苷酸可以在许多方面与DNA相互作用，进一歩增强结合亲合力(Sorensen等，(2003)ChemCommun(Camb)i2，2130-2131)。该2'-氨基隱LNA可超过已显示的5倍增加而进一步增加修复。权利要求1、一种用于双链DNA序列靶向改变的寡核苷酸，该双链DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，该寡核苷酸包含能够杂交到第一DNA序列的结构域，该结构域包含至少一个与第一DNA序列有关的错配，其中该寡核苷酸包含至少一个区段，所述的区段含有至少一个与天然存在的A、C、T或G相比具有更高的结合亲和力的修饰核苷酸，其中所述的至少一个修饰核苷酸是一个置于距离所述的至少一个错配至少一个核苷酸的LNA，其中，可选的是，该寡核苷酸含有至多约75％的LNA修饰核苷酸。2、根据权利要求1的寡核苷酸，其中至少2个，优选为至少3个，更优选为至少4个，甚至更优选为至少5个以及最优选至少6个核苷酸是LNA。3、根据权利要求1或2的寡核苷酸，其中所述的LNA不受限制地分布在距离所述的错配两侧至多10个核苷酸上，优选为至多8个核苷酸，更优选为至多6个核苷酸，甚至更优选为至多4、3或2个核苷酸的。4、根据权利要求1-3的寡核苷酸，其中2个，优选为3个，更优选为4个，甚至更优选为5个以及最优选为6个核苷酸是LNA。5、根据前述任一权利要求的寡核苷酸，其中至多50%的该寡核苷酸的所述的修饰核苷酸是LNA衍生物，优选为至多40%，更优选为至多30%，甚至更优选为至多20%，以及最优选为至多10%。6、根据前述任一权利要求的寡核苷酸，其中所述的至少一个修饰核苷酸不受限制地置于该错配的5'侧和/或3'侧。7、根据前述任一权利要求的寡核苷酸，其中位于所述的错配的5'侧或3'侧同一侧的两个LNA修饰核苷酸彼此间隔至少一个，优选为两个碱基对。8、根据前述任一权利要求的寡核苷酸，其中在该错配位置的核苷酸是未修饰的。9、根据前述任一权利要求的寡核苷酸，其中所述的至少一个修饰核苷酸不位于该错配毗邻的位置，同时优选地位于该错配2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸以内。10、根据前述任一权利要求的寡核苷酸，其具有10至500个核苷酸的长度。11、根据前述任一权利要求的寡核苷酸，其中所述的(修饰)区段即是所述的结构域。12、双链受体DNA序列耙向改变的方法，包括使该双链受体DNA序列结合一条供体寡核苷酸，其中该双链受体DNA序列含有一条第一DNA序列和一条与第一DNA序列互补的第二DNA序列，以及其中该供体寡核苷酸含有包含至少一个与将被改变的双链受体DNA序列有关的错配的结构域，优选地与第一DNA序列有关，以及其中该寡核苷酸含有包含至少一个与天然存在的A、C、T或G相比具有更高亲合力的修饰核苷酸的区段，以及在存在能够耙向核苷酸交换的蛋白质时，该修饰核苷酸与天然存在的第一DNA序列中相对位置上的核苷酸的互补核苷酸相比，对第一DNA序列中相对位置上的该核苷酸的结合更强，以及其中该修饰寡核苷酸是如权利要求1-11所述的寡核苷酸。13、根据权利要求12的方法，其中所述的改变是在细胞中的，该细胞优选自由植物细胞、真菌细胞、啮齿动物细胞、灵长类动物细胞、人类细胞或酵母细胞组成的群组。14、根据权利要求12的方法，其中该蛋白质得自细胞提取物。15、根据权利要求14的方法，其中该细胞提取物选自由植物细胞提取物、真菌细胞提取物、啮齿动物细胞提取物、灵长类动物细胞提取物、人类细胞提取物或酵母细胞提取物的组成的群组。16、根据权利要求12的方法，其中该改变是至少一个核苷酸的删除、置换或插入。17、根据前述任一权利要求的方法，其中该细胞是真核细胞、植物细胞、非人类哺乳动物细胞或人类细胞。18、根据前述任一权利要求的方法，其中靶标DNA来自于真菌、细菌、植物、哺乳动物或人类。19、根据前述任一权利要求的方法，其中双链DNA来自于基因组DNA、线性DNA、哺乳动物人工基因组、细菌人工基因组、酵母人工基因组、植物人工基因组、核基因组DNA、细胞器基因组DNA、附加体DNA。20、根据前述任一权利要求的方法，用于改变细胞、通过回复校正突变到野生型、诱导突变、通过破坏编码区的灭活酶、通过改变编码区对酶的生物活性进行修饰、通过破坏编码区对蛋白质进行修饰。21、如权利要求1-12所述的寡核苷酸的用途，用于改变细胞、通过回复校正突变到野生型、诱导突变、通过破坏编码区的灭活酶、通过改变编码区对酶的生物活性进行修饰、通过破坏编码区对蛋白质进行修饰、错配修复、靶向改变(植物)遗传物质，包括基因突变、靶向基因修复和基因敲除。22、如权利要求1-12所述的寡核苷酸的用途，用于增强的双链DNA序列的耙向改变，该双链DNA序列含有一条第一DNA序列和一条与第一DNA序列互补的第二DNA序列，该寡核苷酸包含能够杂交到第一DNA序列的结构域，该结构域包含至少一个与第一DNA序列有关的错配，同时其中该寡核苷酸包含一个含有修饰核苷酸的区段，其中所述的修饰核苷酸与天然存在的A、C、T或G相比具有更高的结合亲和力，以及其中所述的修饰核苷酸与天然存在的第一DNA序列中相对位置上的核苷酸的互补核苷酸相比，对第一DNA序列中相对位置上的该核苷酸的结合更强，其中所述的修饰核苷酸是LNA。23、如权利要求1-11所述的寡核苷酸在提供植物抗除草剂的方法中的用途。24、含有如权利要求1-11所述寡核苷酸的试剂盒。25、通过如权利要求12-20所述的方法产生的修饰遗传物质。26、包含如权利要求25所述的修饰遗传物质的细胞。27、如权利要求11-20的所述的方法制备的或者包含如权利要求25所述的修饰遗传物质的植物或植物部分。全文摘要本发明涉及一种用于双链DNA序列的靶向核苷酸交换的方法和寡核苷酸，其中供体寡核苷酸含有至少一个修饰核苷酸，该修饰核苷酸是与天然存在的A、C、T或G相比具有更高结合亲合力的LNA，和/或是与天然存在的第一DNA序列中相对位置上的核苷酸的互补核苷酸相比，对第一DNA序列中相对位置上的该核苷酸的结合更强的修饰核苷酸。文档编号C12N15/10GK101346466SQ200680048992公开日2009年1月14日申请日期2006年12月21日优先权日2005年12月22日发明者L·K·瓦霍夫斯基,M·T·J·德博特,P·本多克,R·C·J·霍格斯申请人:凯津公司