用于改进的靶向核苷酸交换的可选择核苷酸的制作方法

专利名称：：用于改进的靶向核苷酸交换的可选择核苷酸的制作方法
技术领域：
：本发明涉及通过将寡核苷酸导入耙细胞中，以在该细胞的DNA的特定位置上特定地和选择性地改变核苷酸序列的方法。结果是耙向交换一个或多个核苷酸，使得靶DNA的序列转变为寡核苷酸的序列，其中靶DNA的序列与寡核苷酸的序列是不同的。更特别地，本发明涉及使用修饰寡核苷酸进行的靶向核苷酸交换。本发明进一步涉及寡核苷酸和试剂盒。本发明还涉及该方法的应用。
背景技术：
：遗传修饰是一种在活细胞的遗传物质中故意造成变化的操作，目的在于修饰该细胞或由该细胞形成其部分或该细胞能繁殖成其的生物体的一种或多种遗传编码生物学特性。这种改变的形式可以是删除遗传物质的一部分，添加外源性遗传物质，或者改变遗传物质的现有的核苷酸序列。人们知晓遗传修饰真核生物的方法己经超过20年，并且已经被广泛地应用于植物细胞、人细胞和动物细胞以及微生物中以改进农业、人类健康、食品质量和环境保护领域。普通的遗传修饰方法包括将外源性DNA片段添加到细胞的基因组中，然后该外源性DNA片段将会给细胞或其生物体带来超过和高于己存在的基因编码的特性的新特性(包括抑制现有基因的表达的应用)。尽管许多这种例子能够有效地获得期望的特性，但是这些方法仍然不是非常精确的，这是因为没有对该外源性DNA片段插入插入的基因组位置进行控制(从而未对最终表达水平进行控制)，而且原因还在于期望的效果必须证实其自身高于起始的正常基因组所编码的天然特性。相反，在预先确定的基因组基因座上产生核苷酸的添加、缺失或转变的遗传修饰方法能够精确地修饰现有基因。目前，已知两种方法能够在真核生物细胞中产生精确的靶向遗传改变通过同源重组的基因打靶以及寡核苷酸定向的靶向核苷酸交换。基于同源重组的方法利用的原理是，天然存在的或者预先诱导产生的基因组DNA中的双链断裂将会被细胞使用任何可获得模板DNA片段修复，该模板DNA片段具有一些与邻近断裂部位的侧翼区同源的核苷酸序列(Puchta，PlantMol.Biol.173，2002;J.Exp.Botany，2005，56，1)。将具有所需序列同源性的供体DNA提供给这样的细胞，在断裂部位任何一端的同源重组将会产生精确的修复，借此供体DNA的同源区间的任何人为设计的修饰将会被导入到现有的基因座中。在真核生物细胞中，插入这种精确的断裂修复发生的频率相当低，支持了更少精确度的修复机理，其中可能丢失该序列的部分，或可能引入非相关的DNA序列。寡核苷酸介导的靶向核苷酸交换(TNE，有时称作为ODTNE)是另外一种方法，该方法依据的是将合成的寡核苷酸呈递到真核生物细胞细胞核中(由短链的核苷酸样部分构成的分子，其在Watson-Crick碱基配对性质方面类似于DNA，但是在化学组成上区别于DNA)(AlexeevandYoon，NatureBiotechnol.16:1343，1998;Rice,NatureBiotechnol.i￡:321，2001;Kmiec，J.Clin.Invest.112:632，2003)。通过在寡核苷酸同源序列中故意设计一个错配的核苷酸，该错配的核苷酸将会被导入到基因组DNA序列中。这种方法只能改变现有基因座上的单个或者至多少数核苷酸，但可用于在现有基因中产生终止密码子，破坏其功能，或者产生密码子改变，使得该基因编码的蛋白质具有改变的氨基酸组成(蛋白质工程)。已经描述了在植物细胞、动物细胞和酵母细胞中进行的耙向核苷酸交换。第一个TNE报道利用所谓的嵌合体，其中寡核苷酸被合成为RNA-DNA杂交分子(Beetham"a/.，PNAS96:8774，1999;KochevenkoandWillmitzer，PlantPhysiol.132:174，2003)，以及可能是由被设计来插入到染色体目标位置的自互补寡核苷酸组成的寡核苷酸。该嵌合体含有一个错配的核苷酸，其形成一个在染色体耙点上导入突变的模板。使用嵌合体的第一个例子来自人细胞(参见综述，RiceW"/.，iVaf.伤0fec/7.，2001，J^:321-326;AlexeevWa/.，NatureBiotech,2000，18，43)。嵌合体在植物物种烟草、水稻和玉米中的应用也获得了成功(Beetham"a/.，1999，尸rac.Ato/.爿cat/.2^:8774-8778;Kochevenko&a/.，2003，尸/aw,尸/>^.132:174-184;Okuzakido/.，2004，户/朋fCe〃i印.g:509-512;Zhu"a/.，PNAS，1999，96，8768)。这些试验依赖于产生除草剂抗性的点突变的导入。研究TNE的最容易处理的系统是酿酒酵母(Rice2001，7kfo/.M;'cra^/.巡857-868)。使用酵母突变体已经鉴定了可能在TNE中起重要作用的数种基因(W""，和iL4D54)。另一种TNE方法使用单链(ss)寡核苷酸导入特异的染色体突变。迄今，仅在酵母细胞和人细胞中试验了单链寡核苷酸(LiuW2002A^cL4c/Ai^.l^:2742-2750;综述，Parekh-Olmedo"，2005，T7zera"12，639-646)。当人细胞停滞在S期时，TNE的效率会提高(Brachmane/a/.，2005，D7VJWm5"4:445-457)，这表明DNA必须具有产生有效的TNE所需的开放构象。一般认为，使用单链寡核苷酸的TNE是通过基因修复的复制模型而发生的。在这种假设中，单链寡核苷酸将在复制叉中退火，并将在后随链的Okasaki片段之间同化成子链。这会在新被复制的DNA链之一中产生错配。单链寡核苷酸中的突变将引起母链上的核苷酸发生转变，但是这种定向修复的可能性可能是低的。这是因为目前关于复制过程中的错配修复的观点促进了用母链作为模板来修复子链中的错误的主张(StojicWa/.，2004LWv47^/^>^w^」》1091-1101)。使用嵌合寡核苷酸的TNE被认为是通过该嵌合体插入到DNA双链中而发生。嵌合体RNA链结合到靶序列的一条链上。RNA/DNA结合比DNA/DNA相互作用更加稳定，有助于稳定双链体中的嵌合体。结合到其他目标链上的嵌合体的DNA链实现基因修正，在靶序列的一条链上产生碱基变化。在嵌合体发生降解或分裂后，在目标中生成的错配可能被来自错配修复路径的蛋白质解决，但这还未得到证实。在如植物等的高等生物体的细胞中应用TNE所面临的最大问题在于迄今报道的低效率。Zhu等人(2000A^/we说otec/2.i^:555-558)报道，在玉米中的转变频率为1xl(T4。在烟草(Kochevenko"a/.，2003P/aWP/7^.H2:174-184)和水稻(Okuzakia/.2004P/a"fCe〃22:509-512)中的后续研究报道的转变频率分别为1x10—6和1x10—4。对于TNE的实际应用来说，这些转变频率仍然太低。可靠的DNA复制是调节维持基因组稳定性以及确保DNA中包含的遗传信息从一代传递到下一代而不发生突变的重要标准之一。许多错误是由母DNA链受损产生或者由与DNA碱基反应的试剂(紫外线、环境毒素)引起。每种生物体都必须维持一种保障以防止或修复这些突变。据认为，错配修复系统(MMR)会识别和修正在DNA复制过程中产生的被错配的或未配对的碱基，监控DNA损坏和防止不同序列之间重组(FedierandFink,2004Int.JOncol.2004;24(4):1039-47)，对活细胞中的DNA复制保真度起作用。在复制过程中，通过切除/再合成过程，MMR识别并去除在新合成链中错误掺入的核苷酸，从而恢复模板链包含的遗传信息(Jiricny，MutatRes.，1998,409(3)，107-21;KolodnerandMarsischky，MolCell.1999，4(3)，439-444;J.Biol.Chem.1999，274(38)，26668-26682;Curr.Opin.Genet.Dev.,1999，9(1)，89-96;FedierandFink,2004IntJOncol.2004;24(4):1039-47)。这种类型的复制错误自然发生，有时并不被复制用的DNA聚合酶复合物的3'-5'核酸外切酶校正活性所检测，或者该错误是由于模板链中修饰核苷酸所引起(FedierandFink，2004IntJOncol.2004;24(4):1039-47)。己经发现人MMR蛋白中的突变会导致生成微卫星序列(FedierandFink，2004IntJOncol.2004，24(4):1039-47)。微卫星序列是1-5个碱基对串联重复的基因座，多达30个重复。这些序列引起DNA聚合酶在复制过程中发生滑移，导致在模板或新生DNA链上形成一个或多个核苷酸的小环异源双链。这些异源双链未去除会在后续的各个复制循环中产生不同大小的等位基因。已经证明这些等位基因存在于MMR蛋白有缺陷的癌症患者中(Peltomaki，JClinOncol.2003，21(6)，1174-9;FedierandFink，2004IntJOncol.2004，24(4):1039画47，JiricnyandNystrom-Lahti，CurrOpinGenetDev.2000，10(2)，157-61)。存在DNA损坏时，通过与细胞周期限制点活化和凋亡起始路径连锁，MMR还参与DNA损坏信号发送(Bellacosa，JCellPhysiol.2001，187(2)，137-44.)。MMR诱导凋亡以避免积累大量突变，并且因此，根据与抗肿瘤试剂的相互作用检査该系统的缺乏。MMR系统受损的患者对用抗肿瘤试剂处理以破坏肿瘤细胞的反应效率较低，因此，这说明了MMR系统的凋亡诱导作用在药物反应中的重要性(AquilinaandBignami，JCellPhysiol.2001May;187(2):145-54)。因此，MMR在维持基因组稳定性中具有双重作用1)识别和修正错配，以及2)发出凋亡信号，防止突变积累。细菌的MMR系统由三种主要蛋白质构成，它们被称作为MutHLS蛋白质。MutS是参与错配识别的ATP酶。在结合错配碱基对的过程中，该蛋白质结合并水解ATP(BaitingerW，JBiolChem.2003Dec5:278(49):49505-ll)。ATP促进MutS从错配上释放。MutL通过在MutS和MutH之间形成连接时起始和调整错配修复，辅助错配识别。该蛋白质的N-末端域是ATP酶域(GuameWa/.，EMBOJ.2004Oct27:23(21):4134-45)。MutL的各个域与UvrD解旋酶相互作用，刺激UvrD解旋酶活性以及其将双链DNA展开为单链形式的能力。该系统的第三种蛋白质是MutH，它在与Mbol和Sau3AI相同的识别位点上结合并切开DNA(BaitingerJBiolChem.2003Dec5;278(49):49505-11;Giron-MonzonWa/.，BiolChem.2004Nov19;279(47):49338-45;JosephWa/.，DNARepair(Amst).2004Dec2;3(12):1561-77)。MutH以协同的、金属离子(Mg2+)依赖的方式，非特异性地结合任何DNA(BaitingerJBiolChem.2003Dec5;278(49):49505-11)。MutL与ATP结合并相互作用，使得MutH更加特异性地结合完全甲基化的DNA。在Kmiec的许多专利申请中也已经描述了rAE，其中如WO0173002、WO03/027265、WO01/87914、WO99/58702、W097/48714、WO02/10364。在WO01/73002中，可以预期，使用未修饰DNA寡核苷酸获得低基因改变效率被认为主要是由于存在于反应混合物或耙细胞中的核酸酶降解供体寡核苷酸造成的。为了解决该问题，提议加入修饰核苷酸，该核苷酸将提供抗核酸酶的寡核苷酸。典型的例子包括具有硫磷酰键的核苷酸、2'-0-甲基-类似物或者锁核酸(LNA)。这些修饰优选位于寡核苷酸的末端，留下环绕耙向碱基的中心DNA域。此外，该专利文献规定，在转化寡核苷酸和参与转化的蛋白质之间存在特定的化学相互作用。由于根据WO0173002的发明人的说法，参与改变过程的蛋白质及其与寡核苷酸取代之间的化学相互作用还不知晓并且不可预知，使用导入LNA、硫磷酰键或2'-0-甲基类似物之外的修饰，这种化学相互作用在寡核苷酸中产生核酸酶抗性末端的结果是不可预期的。在哺乳动物中，DNA甲基化之间的关系并不象细菌中那样简单。DNA复制后，哺乳动物DNA在母链中具有一个暂时的、链特异性CpG半甲基化(DmmmondandBellacosa，NucleicAcidsRes.2001Jun1;29(ll):2234-43.)。然后胞嘧啶维持转甲基酶将半甲基化的CpG位点完全甲基化。还已知的是，在该系统中，其中受体DNA的两条链都被去甲基化，不存在对供体链或者携带错配受体链的偏爱。任何一个核苷酸以相同的概率被替换(参见，如AlbertsWa/.，in"MolecularBiologyoftheCell"，2ndedition,1989，Garlandpublishing,pp234ff)。由于现有ODTNE方法的效率相对低(如先前指出，在10—6到10—4之间，尽管已报道的寡核苷酸的呈递效率高达90%)，本领域需要提供更加有效的TNE方法。因此，本发明已经开始改进现有的TNE技术。
发明内容本发明人已经发现，通过将修饰核苷酸掺入到用于TNE的供体寡核苷酸，与相应的未修饰的核苷酸如A、C、T或G相比，该核苷酸能够更加牢固地结合到受体DNA上，能够显著地提高TNE的比例。不受理论的约束，本发明人认为通过将修饰核苷酸掺入到供体寡核苷酸中，供体寡核苷酸更加牢固地结合到受体DNA上并从而提高TNE的比例。本发明人现在还发现，在用于TNE的细胞中的去甲基的基因组DNA，可选择地组合使用(部分)包含具有改进的结合性能的修饰核苷酸的合成寡核苷酸为实施TNE提供了一种改进方法。可以通过在DNA复制之前化学处理生物材料或者通过使用甲基化缺陷的突变体实现基因组DNA的去甲基化。这两种方法会生成去甲基的母DNA链。单独使用去甲基的基因组DNA，或者单独使用修饰合成寡核苷酸，或者两者的组合使用，都将生成母链中的错配核苷酸被去除的双链或三链DNA结构，随后高效地将有意设计在寡核苷酸中的错配碱基稳定地掺入到基因组中。本发明还基于创造性的考虑，即通过使用(部分)修饰寡核苷酸来实现期望的靶向核苷酸交换。如下文所述，寡核苷酸进行修饰的位置、类型和数量(即状况)是可变的。因此，本发明的一个方面提供((完全)修饰)寡核苷酸。寡核苷酸可用于在植物和动物或人细胞导入特定的遗传改变。本发明可应用于生物医学研究、农业领域，和用于构建特异性突变的植物和动物，包括人。本发明还可应用于医学和基因治疗领域。除了含有将在目标链中导入碱基变化的错配碱基的部分外，本发明的寡核苷酸的序列的其他部分与目标链是同源的。错配碱基被导入到靶序列中。通过操作核苷酸的修饰(相对于常规的A、C、T或G)，更特别地，通过操作导入错配的寡核苷酸修饰的类型、位置和数量，和/或通过操作寡核苷酸所插入的DNA双链的一条或者两条链的甲基化程度，将提高效率(或者在DNA双链的期望位置上掺入期望的核苷酸的成功率)。本发明的另一个方面在于靶向改变母DNA链(第一链，第二链)的方法，通过在存在能够靶向核苷酸交换的蛋白质时，将母DNA双链与寡核苷酸接触，该寡核苷酸与母链相比含有至少一个错配核苷酸，其中供体寡核苷酸含有一个修饰区段，该区段具有高于母(受体)链的结合能力，和/或其中母链的甲基程度较低。因此，本发明的发明要点在于提高插入寡核苷酸(有时被称作为供体)相对于未修饰的插入寡核苷酸的结合能力，和/或修饰(去甲基化)DNA双链(有时被称作为受体链)的一条或两条链。具体实施例方式一个方面，本发明关于用于靶向改变双链DNA序列的寡核苷酸。双链DNA序列含有第一DNA序列和第二DNA序列。第二DNA序列是第一DNA序列的互补链，与第一DNA序列配对形成双链。寡核苷酸包含域，该域相对于将被改变的双链DNA序列包含至少一个错配。优选地，域是寡核苷酸中与第一链互补的包括至少一个错配的部分。优选地，域中的错配与第一DNA序列相关。寡核苷酸包含修饰区段(含有可供选择的或修饰的核苷酸)，该区段具有高于第二DNA序列(相应部分)的结合亲和性。在某个实施方案中，第二DNA序列的甲基化程度低于寡核苷酸上的区段(相应部分)。在某些实施方案中，受体链和/或寡核苷酸未发生甲基化，或者甲基化到相同程度，使得不能基于供体链和母链之间的甲基化进行区分。由于任何与甲基化相关的机制不再能够区分两条链，这排除了任何的链偏爱，而且使得耙向核苷酸交换变成统计学过程。在该实施方案中，任何TNE将从被掺入到寡核苷酸中的被修饰核苷酸(其中修饰不同于甲基化)的作用进化产生。含有错配的域以及含有修饰核苷酸的区段可能重叠。因此，在某些实施方案中，含有错配的域在寡核苷酸上的位置不同于考虑进行修饰的区段。在某些实施方案中，域掺入在该区段中。在某些实施方案中，区段掺入在域中。在某些实施方案中，域和区段位于寡核苷酸的相同位置上并具有相同长度，即它们在长度和位置上是一致的。在某些实施方案中，在域中具有一个以上的区段。对于本发明来说，这意味着含有将被掺入到DNA双链中的错配的寡核苷酸部分也可以位于在不同于该寡核苷酸部分的位置上。特别地，在某些实施方案中，其中细胞的修复系统(或者至少与该系统相关的蛋白质，或者至少与TNE相关的蛋白质)决定哪一条链含有错配以及哪一条链用作修正错配的模板。在某些实施方案中，寡核苷酸包含含有至少一个，优选至少2个，更优选至少3个修饰核苷酸的区段，和/或其中第二链含有比相应的区段部分少至少一个，优选至少2个，更优选至少3个甲基化的核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸上的区段含有4个、5个、6个、7个、8个、9个或IO个以上的修饰核苷酸。在某些实施方案中，区段被完全修饰。在某些实施方案中，第二链未发生甲基化，至少在寡核苷酸的位置上(或者在与第一链互补的区段的长度上)。在某些实施方案中，同时或连续地导入一个以上的错配。寡核苷酸在其邻近位置或间隔位置上容纳一个以上错配。在某些实施方案中，寡核苷酸包含2个、3个、4个或更多个错配核苷酸，其相邻或者远离(即不相邻)。寡核苷酸进一歩包含容纳错配核苷酸的域和区段，特别地包含数个区段。在某些实施方案中，寡核苷酸包括将被插入到受体链中的潜在插入物。这样的插入物的长度在5个以上到多达100个核苷酸之间变化。在某些实施方案中，以类似方式进行删除，引入类似长度的变化(1一100个核苷酸)。在本发明的更进一步方面，通过如下步骤实现寡核苷酸的设计确定受体链的序列，或者至少围绕将被交换的核苷酸的区段的序列。该序列通常是邻近错配的至少10个，优选15个、20个、25个或30个核苷酸，优选在错配的两侧(例如GGGGGGXGGGGGG,其中X是错配的碱基)；设计供体寡核苷酸，其与邻近错配的一个或两个区段互补并含有将被交换的期望核苷酸(例如CCCCCCYCCCCCC);提供(例如，通过合成)在期望的位置上具有修饰的供体寡核苷酸。修饰可以广泛地变化，这取决于环境。例子是CmCmCmCmCmCmYCmCmCmCmCmCm、CmCCmCCmCYCmCCmCCmC、CCCCCCYCmCmCmCmCmCm、CmCmCmCmCmCmYCCCCCC、CCCCCCmYCmCCCCC、CmCCCCCYCmCCCCC、CmCCCCCYCCCCCCm、CmCCCCCYCCCCCC等等，其中cm代表修饰核苷酸残基。对于不同的受体序列，例如ATGCGTACXGTCCATGAT，可设计具有同上文指出的修饰一样可变的相应的供体寡核苷酸，例如TACGCATGYCAGGTACTA。在存在能够进行靶向核苷酸交换的蛋白质时，例如，特别是在细胞的错配修复机制中起作用的蛋白质时，用供体寡核苷酸对DNA进行修饰。可通过电穿孔，或者其他能够呈递到细胞核或细胞质中的常规方法实现寡核苷酸的呈递。用如WO01/87914、WO03/027265、WO99/58702、WO01/92512中描述的无细胞系统，对本发明的方法进行体外测试。如本文所用，供体寡核苷酸影响TNE的能力依赖于掺入供体寡核苷酸中的修饰核苷酸的类型、位置和数量。这种能力例如，通过将常规核苷酸之间的结合亲和性(或者结合能量(吉布斯自由能))标准化为1来量化，即对于AT和GC的结合来说，结合亲和性被标准化为l。对于本发明的寡核苷酸来说，各个修饰核苷酸的相对结合亲和性(RBA)大于l。这可以用下面的公式来说明<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中RBA是总相对结合亲和性，RBA(修饰)是长度为n个核苷酸的修饰寡核苷酸的相对结合亲和性的总和，而RBA(未修饰)是长度为m个核苷酸的未修饰寡核苷酸的相对结合亲和性的总和。例如，100bp寡核苷酸含有10个修饰，每个修饰的相对结合亲和性为1.1。总RBA等于朋八=[(10*1.1)+(90*1.0)]-(100*1.0)=1。应注意的是，RBA的定义基本上与被比较的核苷酸链的长度无关。但是，当比较不同链的RBA时，优选具有大致相同长度的链或者具有可比长度的区段。应注意的是，RBA不考虑修饰是否被集合在一条链上。因此，特定的链A具有比链B更大的修饰程度意味着RBA(A)大于RBA(B)。对于上下游的区段而言，相应的RBA值被定义和使用。为了调整修饰核苷酸的位置的影响，将权重因子引入RBA值中。例如，供体寡核苷酸上邻近错配的修饰核苷酸的影响大于位于距离错配5个核苷酸的位置上的修饰核苷酸。在本发明中，RBA(供体)大于RBA(受体)。在某些实施方案中，供体的RBA值至少比受体的RBA大O.l。在某些实施方案中，供体的RBA值至少比受体的RBA大0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5。可例如通过分子建模、热力学测量等常规分析该核苷酸修饰的结合亲和性来获得RBA值。可替代地，通过测定修饰链与未修饰链之间的Tm差别来确定RBA值。可替代地，RBA可以表示为修饰链与未修饰链之间的Tm差别，通过测量一组核苷酸的Tm或者通过常规公式计算，或者通过计算和测量的组合来确定。根据本发明的供体寡核苷酸含有用于改进杂交特性的修饰，使得供体提高对靶DNA链的亲和性，以便较为容易地插入供体。供体寡核苷酸还被修饰成对核酸酶的抗性更高，以稳定三链或四链结构。供体寡核苷酸的修饰包含磷硫酰修饰，2-OMe取代，使用LNA(锁核酸)、PNA(肽核酸)、能修饰优选增强寡核苷酸和受体链间的杂交体稳定性的核苷酸和其他碱基。在这样的修饰中，特别有用的是PNA，PNA是寡核苷酸类似物，其中寡核苷酸的脱氧核糖主链被替换为肽主链。一种这样的肽主链是用通过酰胺键连接的N-(2-氨基乙基)甘氨酸重复单位构建的。肽主链的各个亚单位连接到核碱基(nucleobase)(也被称作为"碱基")上，该碱基可以是天然存在的、非天然存在的或者修饰的碱基。PNA寡聚物以高于DNA或RNA的亲和性，将序列特异地结合到互补的DNA或RNA上。因此，生成的PNA/DNA或PNA/RNA双链具有较高的解链温度(Tm)。此外，PNA/DNA或PNA/RNA双链的Tm对盐浓度的敏感性远远低于DNA/DNA或DNA/RNA双链。PNA的聚酰胺主链还对酶促降解具有较高抗性。PNA的合成在，例如WO92/20702和WO92/20703中有公开，这些文献以其全文引入本文作为参考。例如在W093/12129和1996年7月23日公布的US5,539，082中还公开了其他PNA，这些文献以其全文引入本文作为参考。此外，许多科技出版物公开了PNA的合成及其性能和用途。参见，例如，Patel，Nature,1993，365，490;Nielsenetal.，Science,1991，254，1497;Egholm，J.Am.Chem.Soc，1992,114,1895;Knudsonetal.，NucleicAcidsResearch,1996,24,494;Nielsenetal.，J.Am.Chem.Soc，1996,118,2287;Egholmetal.，Science,1991，254，1497;Egholmetal.，J.Am.Chem.Soc，1992,114,1895;以及Egholmetal.，JAm.Chem.Soc，1992,114,9677。已知的有用的修饰还有SuperA禾nSuperT，它们从EpochBiosciencesGermany获得。这些修饰核苷酸含有额外的取代，该取代插入DNA中被认为会促进碱基在DNA双链中堆积的主沟。还可以参见图4。有用的修饰还包括一种或多种来自被称作为锁核酸(LNA)的一类合成分子的单体。LNA是双环和三环的核苷酸和核苷酸类似物，以及含有这种类似物的寡核苷酸。LNA和相关类似物的基本结构和功能特性在各种出版物和专利中公开，包括WO99/14226、WO00/56748、WO00/66604、WO98/39352、美国专利US6，043，060以及美国专利US6，268,490，所有这些文献以其全文引入本文作为参考。供体寡核苷酸还可以制备成嵌合体，即含有DNA、RNA、LNA、PNA或者其组合的区段。因此，在某些实施方案中，寡核苷酸进一步含有其他核苷酸，可选择地含有非甲基化的修饰核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸对核酸酶具有抗性。这对于防止寡核苷酸被核酸酶降解并增加供体寡核苷酸找到其目标(受体分子)的机会是有利的.下面的表I给出选择的核苷酸，其表现出增加的DNA结合亲和性和/或对核酸酶降解的抗性。<table>complextableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>N、pS-氨基磷酸酯(NP)++三环-DNA++结合亲和性2-氨基-腺嘌呤+2，6-二氨基嘌呤-2'-脱氧核苷+5-丙炔基-2'-脱氧核苷(C)+5-甲基-异脱氧胞嘧啶+5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶+N、乙基-2'-脱氧胞嘧啶+SuperA禾卩superT+磷硫酰键许多可商业购买得到的核苷酸修饰已经被开发用于基因治疗的反义应用。可用于反义应用的最简单的和最广泛使用的抗核酸酶化学物质("第一代"反义寡核苷酸)是磷硫酰(PS)修饰。在这些分子中，硫原子替代了寡核苷酸磷酸主链(附图3a)中的非桥连的氧原子，产生对内切核酸酶和外切核酸酶活性的抗性。对于基因治疗来说，磷硫酰/磷酸二酯嵌合体通常在5'-端和3'-端具有l一4个PS修饰的核苷酸间的键，具有未修饰的DNA中心核。然而，磷硫酰键可以掺入到寡核苷酸中的任何期望位置上。6-氯-2-甲醇吖啶在两端或序列中间具有6-氯-2-甲醇吖啶分子的寡核苷酸能够有效地插入到双螺旋中。6-氯-2-甲醇吖啶基团结合到磷酸主链(附图3c)的游离羰基之一上。因此，吖啶标记的寡核苷酸可用于提高寡核苷酸杂合体的稳定性是关键的应用中。对3'末端增加修饰还防止寡核苷酸被外切核酸酶降解。这些寡核苷酸具有形成三链体螺旋的能力，并且由于它们相对疏水，它们比正常的寡核苷酸更容易穿过细胞膜。甲基磷酸甲基磷酸是核酸类似物，含有甲基磷酸键，替代了天然存在的带负电荷的磷酸二酯键(附图3b)。这些类似物是非离子的、疏水的，并通过被动扩散被哺乳动物细胞摄取。它们的解链温度对盐条件较不敏感。已经发现它们是有效的反义试剂，能够在mRNA水平上特异地控制病毒或细胞的基因表达。甲基磷酸通过标准的Watson-Crick碱基配对相互作用，与互补的核酸形成双链杂合体。甲基磷酸主链完全抵抗核酸酶的降解。锁核酸锁核酸(LNA)是DNA类似物，在反义基因治疗中具有令人非常感兴趣的特性。特别地，LNA能够以非常高的生物稳定性(低更新)和空前的亲和性(对目标具有非常高的结合强度)区别正确和错误的目标。实际上，己经记载的LNA亲和性的升高程度，使得所有先前报道的类似物的亲和性处于极低的(low-to-modest)范围内。LNA是RNA类似物，其中核糖在结构上受到2'-氧原子和4'-碳原子之间的亚甲基桥连的约束(附图4)。该桥连限制了呋喃核糖环的弹性，并将结构锁定为刚性的双环形式。这种所谓N型(或3'-内)构象导致含有LNA的双链体的Tm增大，从而产生较大的结合亲和性和特异性。NMR光谱研究已经从事实上证明了LNA糖的锁定N型构象，而且还揭示了LNA单体能够将与之相邻的未修饰的核苷酸扭转为N型构象。重要的是，LNA的该有利特征并不象通常在核酸类似物中观察到的那样以牺牲其他的重要特性为代价。LNA可以与DNA类似物领域中包括的所有其他化学物质自由地混合。LNA碱基被掺入到寡核苷酸中，可以短至整个LNA序列，或者长如LNA/DNA嵌合体。可将LNA放置在中间、3'端或5'端。然而，由于其刚性的双环构象，LNA残基有时扰乱核酸链的双螺旋扭曲。因此，设计具有两个或多个邻近LNA残基的寡核苷酸通常被认为是较不优选的。优选地，LNA残基用至少一个不扰乱双螺旋扭曲的(修饰)核苷酸分开，例如常规核苷酸(A、C、T或G)。最初开发的LNA单体((3-D-氧化-LNA单体)已经被修饰成新的LNA单体(附图4)。新型cx-L-氧化-LNA具有较高的抵抗3'外切核酸酶活性的稳定性，并且在有效的反义寡核苷酸的设计中，它比卩-D-氧化-LNA更为强大、更为通用。如W09914226、WO00/56748、WO00/66604中所述，还可以使用xylo-LNA和L-核糖LNA。甲基化、丙炔基化和氨基化的核苷酸胞嘧啶CS原子的甲基化是天然存在的DNAC-甲基化(植物中的5'-TG-3'和5'-mCNG-3'，以及原核生物中的5'-CmCNGG-3')。除了甲基化的生物学功能外，其化学作用在于以每个甲基化胞嘧啶1.3。C的方式提高双链的Tm。这样的甲基化C-残基(5-甲基-脱氧胞嘧啶，附图5a)可单独地掺入到寡核苷酸中，提高其双链的稳定性。在C5位置上具有丙炔基基团(具有三键的3-C链)(附图5b)能获得更好的热稳定性。单个C、丙炔基-胞嘧啶残基使Tm增加2.8'C，单个C5-丙炔基-胸苷增加1.7°C。另一种通常描述的核苷酸修饰("第二代"反义寡核苷酸)是RNA残基的2'-0甲基化。这种甲基化提供抵抗外切核酸酶活性的抗性，可被应用于任何RNA核苷酸。在附图5c中描述了双链的甲基化分子，其在核糖基2'-0和胞嘧啶C5上携带甲基基团。分子2'-0-甲基-5-甲基-核糖胞嘧啶(2'-OMe-5-Me-C)的结合亲和性和外切核酸酶抗性都升高。已经描述2'-氨基化腺嘌呤残基的热稳定性增大最多。这些所谓的2-氨基-A分子(附图5d)在朝外的环上携带额外的NH2基团，使得腺嘌呤与胸腺嘧啶形成3个而不是2个氢键，这使得每个2-氨基-A残基的Tm增大3.0。C。环己烯核酸环己烯核酸(CeNA)是五元呋喃糖环被六元环替代的核苷酸(附图6)。这使得低聚物的构象的刚性程度很高。CeNA与RNA和DNA形成稳定的双链，防止被核溶解降解。由于CeNA对RNA的结合亲和性大于对DNA的结合亲和性，而且由于CeNA/RNA双链激活RNaseH的降解作用，该分子尤其适合于治疗性反义研究。在本发明的某些实施方案中，在寡核苷酸的错配位置上的核苷酸被修饰。错配是否可以被修饰在很大程度上将取决于精确的耙向核苷酸交换机制或者利用供体和受体链之间的亲和性差异的细胞中的DNA修复机制。这同样存在于邻近或接近错配的其他经修饰位置的精确区域中。然而，基于本说明书公开的内容，考虑到本说明书其他部分描述的合适寡核苷酸的检测操作，这种寡核苷酸可被容易地设计和测试。在某些实施方案中，在寡核苷酸的错配位置上的核苷酸未被修饰。在某些实施方案中，修饰邻近于错配，优选在错配的2个、3个、4个、5个、6个或7个核苷酸中。在某些实施方案中，修饰位于错配的下游位置。在某些实施方案中，修饰位于错配的上游位置。在某些实施方案中，修饰位于距离错配的10bp-10kB的位置上，优选距离错配50-5000bp，更优选距离错配100-500bp。用作供体的寡核苷酸的长度是变化的，但是长度通常在10-500个核苷酸，优选在11-100个核苷酸，优选在15-90个，更优选在20-70个，最优选在30-60个核苷酸之间变化。一个方面，本发明关于靶向改变双链受体DNA序列的方法，包括在存在能够靶向核苷酸交换的蛋白质时，将双链受体DNA序列与供体寡核苷酸结合，其中双链受体DNA序列含有第一DNA序列，以及与第一DNA序列互补的第二DNA序列，其中供体寡核苷酸包括包含至少一个关于待改变的双链受体DNA序列，优选关于第一DNA序列的错配的域，其中供体寡核苷酸的区段被修饰以表达与寡核苷酸的该位置上的未修饰的核苷酸相比对第一DNA序列的更高的亲和性，和/或其中第二DNA的甲基化程度低于供体寡核苷酸的相应区段。本发明以其最广的形式通常可应用于各种各样的生物体，例如人、动物、植物、鱼、爬行动物、昆虫、真菌、细菌等。本发明可用于修饰任何类型的DNA，例如来自基因组DNA的DNA、线性DNA、人工染色体、核染色体DNA、细胞器染色体DNA、BAC、YAC。本发明可以在体内或体外实施。本发明以其最广的形式可应用于许多目的，用于改变细胞、通过恢复为野生型来修正突变、诱导突变、通过破坏编码区来灭活酶、通过改造编码区来改进酶的生物学活性、通过破坏编码区来修饰蛋白质。本发明还涉及基本上上文描述的寡核苷酸在改变细胞、通过恢复为野生型来修正突变、诱导突变、通过破坏编码区来灭活酶、通过改造编码区来改进酶的生物学活性、通过破坏编码区来修饰蛋白质、错配修复、靶向改变(植物)遗传物质包括基因突变、定向基因修复和基因敲除中的用途。本发明进一步涉及试剂盒，其包括一种或多种本说明书其他部分定义的寡核苷酸，可选择地与能够诱导MRM的蛋白质组合，特别地该蛋白质能够进行TNE。本发明进一步涉及通过本发明的方法获的修饰遗传物质，涉及包含修饰遗传物质的细胞和生物体，涉及如此获得的植物和植物部分。在某些实施方案中，在TNE之前，基因组DNA被去甲基，例如对基因组DNA、或者包含基因组DNA的培养物或者含有将进行TNE的基因组DNA的其他生物材料进行常规的去甲基化处理，例如使用氮杂胞苷的方法。在本发明的某些实施方案中，当寡核苷酸在远离错配的至少一个碱基对的位置上包含一个或多个LNA残基，优选一个LNA残基时，靶向核苷酸交换的比例显著增加(200-800%)。优选地，寡核苷酸在错配的任意一侧包含两个或更多个，优选两个LNA，优选各自独立地位于距离错配的至少一个碱基对的位置上。换句话说，在本发明的优选实施方案中，至少一个，优选一个LNA位于错配的任意一侧，优选独立地位于距离错配的至少一个碱基对的位置上。这可以示意性地描述为:L-N-M-N-L，其中1^一个或多个LNA残基，优选一个；N是独立地位于M的两侧的一个常规核苷酸(A、C、T或G)或者双核苷酸(即两个核苷酸)或三核苷酸(即三个核苷酸)；M代表错配的位置。因此，在某些优选的实施方案中，位于错配的侧翼的LNA残基相互距离3个或4个碱基对。在本发明的某些其他实施方案中，通过使用一个或多个5-丙炔基化核苷酸，靶向核苷酸交换的比例显著增加。丙炔基化核苷酸邻近错配，或者位于距离错配至少一个碱基对的位置上。优选地，寡核苷酸包含两个或多个，优选两个5-丙炔基化核苷酸，5-丙炔基化核苷酸位于错配的任意一侧，优选各自独立地邻近错配或者位于距离错配的至少一个碱基对的位置上。换句话说，在本发明的优选实施方案中，至少一个，优选一个5-丙炔基化核苷酸位于错配的两侧，优选各自独立地邻近错配或者位于距离错配的至少一个碱基对的位置上。这可以示意性地描述为P-N-M-N-P，其中P-—个或多个5-丙炔基化核苷酸残基，优选一个5-丙炔基化核苷酸；N是独立地在M的两侧存在零个或一个常规核苷酸(A、C、T或G)或者双核苷酸(即两个核苷酸)或三核苷酸(即三个核苷酸)；M代表错配的位置。因此，在某些优选的实施方案中，位于错配的侧翼的5-丙炔基化核苷酸残基相互距离1个(即错配本身)、2个、3个或4个碱基对。某些优选的5-丙炔基化核苷酸是5-丙炔基-2-脱氧胞嘧啶和/或5-丙炔基-2-脱氧尿嘧啶。5-丙炔基化核苷酸可以组合使用，即在某些实施方案中，寡核苷酸可以单独含有5-丙炔基-2-脱氧胞嘧啶、5-丙炔基-2-脱氧尿嘧啶，或者含有它们的组合。在本发明的某些其他实施方案中，使用N4-乙基-2'-脱氧胞嘧啶显著增加靶向核苷酸交换的比例。N4-乙基-2'-脱氧胞嘧啶邻近错配，或者位于距离错配至少一个碱基对的位置上。换句话说，在本发明的优选实施方案中，至少一个，优选一个N4-乙基-2'-脱氧胞嘧啶位于错配的两侧，优选独立地邻近错配或者位于距离错配的至少一个碱基对的位置上。这可以示意性地描述为D-N-M-N-D，其中0=—个或多个N4-乙基-2'-脱氧胞嘧啶残基，优选一个N4-乙基-2'-脱氧胞嘧啶残基；N是独立地在M的两侧存在零个或一个常规核苷酸(A、C、T或G)或者双核苷酸(即两个核苷酸)或三核苷酸(即三个核苷酸)；M代表错配的位置。因此，在某些优选的实施方案中，位于错配的侧翼的N4-乙基-2'-脱氧胞嘧啶残基相互距离l个(即错配本身)、2个、3个或4个碱基对。不受理论的约束，申请人相信，如本说明书其他部分所指出的，在寡核苷酸中掺入具有与正常DNA相比改变的特性的新核苷酸能够提高TNE的效率，。对于TNE来说重要的特性有(l)核酸酶抗性，使得寡核苷酸在植物细胞中保持完整，和(2)高结合亲和性，因此增加寡核苷酸找到并保持其同源目标结合的可能性。还被认为是重要的一个其他参数是寡核苷酸二级结构最小化。寡核苷酸本身中的小互补区会产生发夹环结构，其可能防止寡核苷酸转运到细胞核中，以及该寡核苷酸发现其目标或者TNE自身的反应。图l:显示了靶向核苷酸交换的图示说明。含有将被交换的核苷酸(X)的受体双链DNA链与含有被插入的核苷酸(Y)的供体寡核苷酸(示意性表示为NNNmNNNmYN^TNNm)接触。该三链体结构经受或接触能够发生TNE的环境或者至少与能够实施TNE的蛋白质接触，例如己知的无细胞酶混合物或者无细胞提取物(参见WO99/58702，WOO1/73002)。图2:显示某些脱氧核糖核苷类似物的化学结构(a)磷硫酰键；(b)甲基磷酸；(c)偶联到6-氯-2-甲醇吖啶上的5'末端核苷酸残基。图3:显示作为胞嘧啶核苷酸的不同锁核酸的非对映异构体的化学结构:(3-D-氧化-LNA，在C"原子的(3构象中存在2'-0-4'-C亚甲基桥连的原始的LNA结构；(b)p-D-硫代-LNA，在亚甲基桥连中存在硫原子；(x-L-氧化-LNA，在C"原子的a位置上含有2'-0-4'-C亚甲基桥连。图4:显示SuperA和SuperT的结构。图5:显示了(a)5-甲基-脱氧胞嘧啶；(b)5-丙炔基-脱氧胞嘧啶；(c)2'_o-甲基-5-甲基-胞嘧啶；(d)2-氨基-腺嘌呤的化学结构。图6:显示了环己烯核酸(CeNA)的化学结构。实施例烟草中ALS基因的靶向核苷酸交换烟草茎干培养物(shootculture)该实施例的起始材料是烟草SR1体外茎干培养物。该培养物在大广口瓶(750ml容量)中的MS20培养基中的无菌环境下生长，生长的室内温度为25/20。。(白天/夜晚)，光通量强度为80uE.m—ls—1，光周期为16/24h。MS20培养基是Murashige和Skoog氏基础培养基(Murashige，T.andSkoog，F.，P/z戸Wog/a/Vawtor謂，U:473-497，1962)，含有未添加激素的2%(w/v)蔗糖和0.8%Difco琼脂。该茎干每3周用新鲜的培养基进行继代培养。用氮杂胞苷进行去甲基化在分离原生质体的2周前，烟草体外茎干培养物在含有75^g/ml5-氮杂胞苷的MS20培养基中继代培养，使目标基因座DNA去甲基化。分离原生质体为了分离叶肉原生质体，收集培养3-6周的茎干培养植物的完全展开的叶片。从下表皮层和叶脉的外层，将叶片小心地切成厚1mm的条带。将被切割的叶片转移到含有45mlMDE基础培养基的大(100mmx100mm)Petri培养皿中，进行预胞浆分离处理30分钟。900ml总体积的MDE基础培养基含有0.25gKC1、1.0gMgS04.7H20、0.136gKH2P04、2.5g聚乙烯吡咯烷酮(MW10,000)、6mg萘乙酸和2mg6-苯甲基氨基嘌呤。用山梨糖醇将溶液的渗透压调整为600mOSm.kg"，pH调整为5.7。在进行预胞浆分离处理后，往各个Petri培养皿中加入5ml酶母液。每100ml的酶母液含有750mg纤维素酶OnozukaR10、500mg崩溃酶和250mg解析酶R10，用Whatman滤纸过滤，并过滤灭菌。将Petri培养皿密封，并在黑暗中的25"C下静止培育过夜来消化细胞壁。第二天早上，轻轻摇晃培养基以释放原生质体。将原生质体悬浮液通过500pm和lOO(im的网筛，过滤到250mlErlenmeyer烧瓶中，与等体积的KC1洗涤培养基混合，在50ml试管中以85xg离心10分钟。每升KC1洗涤培养基中含有2.0gCaCl2.2H20，用一些KC1将渗透压调整为540mOsm.kg—]。将从沉淀中收集的原生质体重悬在MLm洗涤培养基中，在10ml玻璃试管中以85xg再离心10分钟。每升MLm洗涤培养基中含有浓度为正常量一半的MS培养基(ref)中的大量营养成份(macro-nutrient)、2.2gCaCl2.2H20，用一些甘露醇将渗透压调整为540mOsm.kg"。将从第二个离心步骤的沉淀中收集的原生质体重悬在MLs洗涤培养基中，在10ml玻璃试管中以85-100xg再离心10分钟。每升MLs洗涤培养基中含有浓度为正常量一半的MS培养基(ref)中的大营养成分、2.2gCaCl2.2H20，用一些蔗糖将渗透压调整为540mOsm.kg-1。从浮动带上收集原生质体，重悬在等体积的KC1洗涤培养基中。用血球计计数它们的密度。接着，在10ml玻璃试管中以85xg再离心5分钟，以1x105ml"个原生质体的密度将沉淀重悬在电穿孔培养基中。所有溶液是无菌的，所有操作在无菌条件下进行。ALS目标基因和设计单链寡核苷酸在烟草乙酰乳酸合成酶(ALS)SurA基因(GeneBank登陆号为X07644)中，氨基酸转变P194Q使得ALS蛋白质对磺脲除草剂氯磺隆不敏感。单链寡核苷酸NtALSP194Q用作模型，通过TNE在烟草ALS基因中导入该当个核苷酸改变。NtALSP194QCGT工GCACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC3'[SEQIDNO:1]错配核苷酸位于距离5'端48个核苷酸的位置上，加下划线表示。原生质体电穿孔用PHBS作为电穿孔培养基(10mMHepes，pH7.2;0.2M甘露醇，150mMNaCL;5mMCaCL2)，在电穿孔过程中，溶液中的原生质体密度为ca.lxl06/ml，电穿孔设定为250V(625Vcm—1)电压和800pF电容，脉冲和培养之间的恢复时间为10分钟。对于每次电穿孔来说，使用ca.l-2吗寡核苷酸，20昭质体/800微升电穿孔=25吗/1111。原生质体再生和氯磺隆选择在电穿孔处理后，原生质体在冰上放置30分钟来恢复。然后以1x105原生质体ml—]的密度重新悬浮在To培养基中。T。培养基中含有(每升，pH5.7)950mgKN03、825mgNH4N03、220mgCaCl2.2H20、185mgMgS04.7H20、85mgKH2P04、27.85mgFeS04.7H20、37.25mgNa2EDTA.2H20、根据Heller氏培养基(Heller，R.，J朋投g14:1-223，1953)中的微量营养成分、根据Morel和Wetmore氏培养基(Morel，G.andR.H.Wetmore，爿w^JSW.M:138-40，1951)中的维生素、2。/。(w/v)蔗糖、3mg萘乙酸、1mg6-苯甲基氨基嘌呤，用一些甘露醇将渗透压调整为540mOsm.kg—、然后将重悬在To培养基中的原生质体与等体积的溶于T。培养基中的1.6%SeaPlaque低熔解温度琼脂混合，高压灭菌后在30°C的水浴中保持液体状态。混合后，用移液枪轻轻地将2.5ml的悬浮液等分试样添加到5cmPetri培养皿中。将培养皿密封，并在25/20°C(16/24h光周期)下黑暗中孵育孵育。在黑暗中孵育8-10天后，将琼脂培养基切成6份相等的饼形部分，并转移到10cmPetri培养皿中，每个培养皿中含有22.5ml液体MAP,AO培养基。该培养基含有(每升，pH5.7)950mgKNO3、825mgNH4N03、220mgCaCl2.2H20、185mgMgS04.7H20、85mgKH2P04、27.85mgFeS04.7H20、37.25mgNa2EDTA.2H20、根据Murashige和Skoog氏溶^夜(Murashige，T.andSkoog，F.，尸/z3;w'0/0g/fl尸/aw/an/w，473-497，1962)中十分之一初始浓度的微量营养成分、根据Morel和Wetmore氏溶液(Morel，G.andR.H.Wetmore，J!Sw.138-40，1951)中的维生素、6mg丙酮酸、均为12mg的苹果酸、富马酸和柠檬酸、3%(w/v)蔗糖、6%(w/v)甘露醇、0.03mg萘乙酸和0.1mg6-苯甲基氨基嘌呤。为了选择成功进行碱基转变的克隆，还将41nM氯磺隆添加到该溶液中。Petri培养皿在25/20°C的弱光(光通量密度为2(^E.m—s")条件下培育，光周期为16/24h。2周后，将Petri培养皿转移到全光照(80pE.m—V^条件下。在该选择过程中，大部分原生质体死亡。仅由于寡核苷酸的作用使得在目标基因中发生碱基改变而具有除草剂抗性的原生质体分化并增殖为来自原生质体的小克隆。分离后的6—8周，将来自原生质体的克隆转移到MAP,培养基中。此时琼脂糖珠完全分散，用无菌的广口移液枪转移小克隆，否则得用镊子个别地进行转移。除了甘露醇为3。/。(w/v)而不是6%，以及含有46.2mg〔组氨酸(pH5.7)夕卜，MAPJ咅养基与MAP,AO培养基具有相同的组成。该溶液用0.8%(w/v)Difco琼脂糖固化。在该固体培养基中生长2-3周后，将克隆转移到再生培养基RP中，每个10cmPetri培养皿含有50个克隆。RP培养基含有(每升，pH5.7)273mgKNO"416mgCa(N03)2.4H20、392mgMg(N03)2.6H20、57mgMgS04.7H20、233mg(NH4)2S04、271mgKH2P04、27.85mgFeS04.7H20、37.25mgNa2EDTA.2H20、根据Mumshige和Skoog氏溶i夜(Murashige，T.andSkoog，F.，尸/zjKS7'o/og/aP/awton/w，15:473-497，1962)中五分之一公布浓度的微量营养成分、根据Morel和Wetmore氏溶液(Morel，G.andR.H,Wetmore，/5饥138-40，1951)中的维生素、0.05%(w/v)蔗糖、1.8%(w/v)甘露醇、0.25mg玉米素和41nM氯磺隆，并用0.8%(w/v)Difco琼脂糖固化。目标基因的PCR扩增用DNeasy试剂盒(Qiagen)从butafenacil和氯磺隆抗性烟草小克隆中分离DNA。然后，总烟草DNA用作PCR反应中的模板。用引物5'GGTCAAGTGCCACGTAGGAT[SEQIDNO:2]和5'GGGTGCTTCACTTTCTGCTC[SEQIDNO:3]检测烟草ALS基因中的耙向密码子是否被转变，该引物对扩增该基因的776bp片段，包括密码子194。证实核苷酸转变的测序通过对从愈伤组织中获得的PCR产物进行测序，验证除草剂抗性烟草愈伤组织中的核苷酸转变。烟草ALSP194密码子的转变(CCA变为CAA)导致在密码子的第二位置产生一个双倍峰值(C/A)。检测如下的单链寡核苷酸是否在烟草ALS基因中产生导致除草剂抗性的点突变。寡核苷酸含有提高靶向核苷酸交换效率的修饰核苷酸。TACGTTGCACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC-3'[SEQIDNO:4]上述目标寡核苷酸长度为79个核苷酸。寡核苷酸中的错配在距离5'端的位置48上，加下划线表示。寡核苷酸的其他部分与ALS基因相同。修饰寡核苷酸在碱基或糖环(在这种情形下，序列中发生改变的核苷酸被显示)被改变。可替代地，连接核苷酸的磷酸键也被改变。在这种情形下，在核苷酸中插入星号(*)，指示这种键的位置。寡核苷酸l:吗啉代氨基磷酸盐G氺A承A承G氺A氺A承T承A承G氺G承A氺G承T承T承T承G承C^氺T氺(3氺A承A氺A伞A氺G承C!氺A承T承G承A承G氺T氺A氺G承G伞T承A承T氺G氺A氺T氺C!氺C1氺T氺A承C^G承T氺T氺G氺G氺A氺G氺T承T承G承A承G承G承T氺G伞T氺T承A氺T氺A承G氺G氺A氺A承C1伞A氺A氺T承G氺G*G*G*A*C[SEQIDNO:5]吗啉代氨基磷酸酯键是对磷酸主链的修饰。由于其还不能生成DNA/—吗啉代氨基磷酸盐杂合体，在实施方案中，寡核苷酸中的所有磷酸均被修饰。寡核苷酸2:2'-氟代阿拉伯核苷酸(小写字母)，寡核苷酸3:6-氯-2-甲醇吖啶修饰核苷酸(星号，*)C*AACAATAGGAGTTTCCTGAAAAGCATCAGTACCTATCATCCACGTIGCACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC*[SEQIDNO:7]CG*TIG*CACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC[SEQIDNO:8]IDNO:;]NO:10]ACG*TIG*CACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC*[SEQIDNO:11]AC*G*TIG*C*ACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC*[SEQIDNO:12]AC*GTIGC*ACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC*[SEQIDNO:13]寡核苷酸4:磷硫酰键(星号，*)C*A*A*C*AATAGGAGTTTCCTGAAAAGCATCAGTACCTATCATCctacgt;igcacttgacctgttatagcaacaatgg*g*g*a*c[seqIDNO:14]寡核苷酸5:甲基磷酸酯键(星号，*)d承A承A承G氺A承A承T氺A伞G氺G氺A承G承T氺T承T氺C!承G承T承G承A氺A承A氺A承(3承(^承A氺T氺G承A承G承T氺A承G承G承T承A伞T承C!伞A承T承C!承G氺T承A承C!氺G承T承T承G承G氺A承G承T承T氺G承A氺G氺C!承T氺G承T氺T氺A承T承A承G承(^承A承A承G承A承A氺T氺(3承G承(3*G*A*C[SEQIDNO:15]寡核苷酸6:aL-LNA(小写字母)CaAcAaTaGgAgTtTcCtGaAaAgCaTcAgTaCcTaTcAtCcTaCgTtGcAcTtGaCcTgTtAtAgCaAcAaTgGgGaC[SEQIDNO:16]cAaCaAtAgGaGtTtCcTgAaAaGcAtCaGtAcQAtCaTcQAcGtlgCaCtTgAcCtGtTaTaGcAaCaAtGgGgAc[SEQIDNO:17]寡核苷酸7:2'-0-甲基肌苷(節指示)寡核苷酸8:2'-氟基-RNA(C和U)(仅可能是C和U/T残基，用小写字母表示)CGuIGcACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAc[SEQIDNO:21]寡核苷酸9:2'-O-甲氧基乙基RNA(MOEVRNA核苷酸表示为小写字母)CGu工gCACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC[SEQIDNO:23]GuIgCACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGac[SEQIDNO:24]寡核苷酸10:NS-P、氨基磷酸酯键(星号，*)G承A"氺A氺C1承A承A氺T承A承G承G承A氺G氺T氺T承T氺C!承C^T承G承A承A氺A承A氺CJ承C!审A氺T承C!承A承(3承T承A承C!承C!氺T承A承T承C!承A承T承C!承G承T承A氺(^承G承T承T承G承(^承A氺C!氺T氺T氺G承A承C!承G承T承(3氺T氺T氺A氺T承A氺CJ承C]承A承A承C!承A承A氺T承G氺Ci承(3承G*A*C[SEQIDNO:25]寡核苷酸ll:2-氨基-腺嘌呤(小写字母)寡核苷酸12:SuperA(小写字母)寡核苷酸13:SuperT(小写字母)ACttGACCtGttAtAGCAACAAtGGGGAC[SEQIDNO:28]寡核苷酸14:5-甲基-异脱氧胞嘧啶(小写字母)GT工GcAcTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC[SEQIDNO:29]寡核苷酸15:5-丙炔基-2-脱氧核苷(小写字母)CGtlgCACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC[SEQIDNO:30]CgTIGcACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC[SEQIDNO:31]Cgt工gcACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC[SEQIDNO:32]寡核苷酸16:N^乙基-2'-脱氧胞嘧啶(小写字母)CGt工gCACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC[SEQIDNO:33]CgTIGcACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC[SEQIDNO:34]CgtlgcACTTGACCTGTTATAGCAACAATGGGGAC[SEQIDNO:35]用于本申请中的序列以及修饰的位置列举在下表中，从5'末端开始计数。x和x+l之间的主链修饰定位为x(位置4和5之间显示为4)。<table>complextableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>试。基本上，无细胞系统是在试管中进行的TNE反应物。这样的反应物具有3个成分，(l)含有功能性羧苄青霉素抗性基因和有缺陷的卡那霉素抗性基因的质粒。在卡那霉素基因(NPTII)的密码子22上的点突变(TAT变为TAG)产生一个终止密码子。(2)从含有全部TNE所需蛋白质的拟南芥中获得的总蛋白提取物，和(3)携带错配的寡核苷酸，该错配设计来将卡那霉素终止密码子的G转变为C，从而恢复卡那霉素基因的活性。将这3个成分混合，孵育1小时，分离质粒DNA，然后通过电穿孔传递给大肠杆菌。卡那霉素抗性克隆的数量是给定寡核苷酸的TNE活性的测量值。羧苄青霉素抗性克隆的数量用于计算电穿孔的效率。在下面的表中，列举了用无细胞系统测定TNE活性的寡核苷酸。在各个试验中，使用由常规DNA构成的寡核苷酸。修饰寡核苷酸的TNE活性表示为相对于常规DNA寡聚物的倍数变化，常规DNA寡聚物的TNE活性任意地设定为1。因此，低于1的倍数变化意味着修饰寡核苷酸在本试验中的工作效率低于常规的DNA，而超过l的倍数变化指示寡聚物的TNE活性得到改进。<table>complextableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>粗体的核苷酸表示修饰核苷酸的位置。LNA-锁核酸，5PC二5-丙炔基-2-脱氧胞嘧啶，5PU二5-丙炔基-2-脱氧尿嘧啶，N4-EDC二N4-乙基-脱氧胞嘧啶.所有被测试的寡聚物均用该质粒产生G:G错配。权利要求1、用于靶向改变双链DNA序列的寡核苷酸，双链DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，寡核苷酸包含能够与第一DNA序列杂交的域，该域包含至少一个关于第一DNA序列的错配，和其中寡核苷酸包含至少一个区段，该区段含有至少一个结合亲和性高于天然存在的A、C、T或G的修饰核苷酸，和其中至少一个修饰核苷酸以与互补于第一DNA序列的相对位置的核苷酸的天然存在的核苷酸相比更强地结合在第一DNA序列的相对位置的核苷酸上。2、根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含至少2个区段，优选至少3个区段，这些区段独立地含有至少1个，优选至少2个，更优选至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个修饰核苷酸。3、根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中区段邻近于或者位于3'端、5'端和域围绕错配的位置。4、根据权利要求1-3所述的寡核苷酸，其中错配位置上的核苷酸未被修饰。5、根据权利要求l-4所述的寡核苷酸，其中至少一个修饰核苷酸邻近错配，优选在错配的2个、3个、4个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸内。6、根据权利要求1-5所述的寡核苷酸，其长10_500个核苷酸。7、根据权利要求l-6所述的寡核苷酸，其中(修饰)区段是域。8、根据权利要求l-7所述的寡核苷酸，其中至少一个修饰核苷酸选自主链修饰核苷酸和/或碱基修饰核苷酸。9、根据权利要求1-8所述的寡核苷酸，其中核苷酸选自a.环己烯核酸(CeNA);b.锁核酸(LNA);c.肽核酸(PNA);d.2'-0-甲基取代核苷酸；e.甲基磷酸取代核苷酸；_f.6-氯-2-甲醇吖啶取代核苷酸；g.2'-氟基-RNAs;h.2'-0-甲氧基乙基-RNA;i.2'-0-烷基-RNA;j.三环DNA;k.N3-P5-氨基磷酸酯取代核苷酸；1.2，6-二氨基嘌呤碱基核苷酸；m.甲基化的、丙炔基化的和酰胺化的核苷酸；n.SuperA禾口SuperT。10、根据权利要求1-9所述的寡核苷酸，其中修饰核苷酸选自:a-L-LNA;(3-D-氧化-LNA;P-D-硫代-LNA;a-L-氧化-LNA;2'-0-甲基-2-氨基嘌吟；2'-0-甲基-2，6-二氨基嘌呤；2'-0-甲基-3-脱氮杂-5-氮杂胞苷；2'-0-甲基-5-氟尿嘧啶；2'-a甲基-5-甲基胞嘧啶；2'-0-甲基-5-甲基尿嘧啶；2'-0-甲基肌苷2'-氟基-核糖胞嘧啶2'-氟基-核糖尿嘧啶2'-0-甲氧基乙基核糖胞嘧啶2'-0-甲氧基乙基核糖尿嘧啶2'-0-甲氧基乙基核糖腺嘌呤2'-0-甲氧基乙基核糖鸟嘌呤2'-0-烷基胞嘧啶2'-0-烷基尿嘧啶2'-0-烷基腺嘌呤2'-0-烷基鸟嘌呤2-氨基-腺嘌呤2，6-二氨基嘌呤-2'-脱氧核苷酸5-丙炔基-2'-脱氧胞嘧啶5-丙炔基-2'-脱氧尿嘧啶5-甲基-异脱氧胞嘧啶5-甲基-2'-脱氧胞嘧啶N、乙基-2'-脱氧胞嘧啶。11、根据权利要求l-10所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含具有核酸酶抗性的核苷酸。12、根据权利要求ll所述的寡核苷酸，其中具有核酸酶抗性的核苷酸是磷硫酰修饰的核苷酸，使得寡核苷酸中包含至少一个、两个或优选至少三个磷硫酰键。13、根据权利要求ll所述的寡核苷酸，其中具有核酸酶抗性的核苷酸是2'-0甲基取代核苷酸。14、根据权利要求ll所述的寡核苷酸，其中具有核酸酶抗性的核苷酸是LNA。15、根据权利要求1-10所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸在距离错配的至少一个碱基对的位置上包含一个或多个LNA残基。16、根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中一个LNA位于错配的两侧距离错配至少一个碱基对的位置上。17、根据权利要求1-10所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸在邻近错配或者在距离错配至少一个碱基对的位置上包含一个或多个5-丙炔基化核苷酸和/或N4-乙基-2'-脱氧胞嘧啶。18、根据权利要求15所述的寡核苷酸，其中一个5-丙炔基化核苷酸或N4-乙基-2'-脱氧胞嘧啶位于错配的两侧，邻近于错配或者在距离错配至少一个碱基对的位置上。19、根据权利要求17-18所述的寡核苷酸，其中5-丙炔基化核苷酸是5-丙炔基-2-脱氧胞嘧啶和/或5-丙炔基-2-脱氧尿嘧啶和/或N4-乙基-2'-脱氧胞嘧啶。20、靶向改变双链受体DNA序列的方法，其包括在存在能够耙向核苷酸交换的蛋白质时，将双链受体DNA序列与供体寡核苷酸接触，其中双链受体DNA序列含有第一DNA序列以及与第一DNA序列互补的第二DNA序列，其中供体寡核苷酸包含域，该域相对于将被改造的双链受体DNA序列，优选相对于第一DNA序列包含至少一个错配，并且其中寡核苷酸包含至少一个区段，该区段含有至少一个结合亲和性高于天然存在的A、C、T或G的修饰核苷酸，和其中修饰核苷酸以与互补于第一DNA序列的相对位置的核苷酸的天然存在的核苷酸相比更强地结合在第一DNA序列的相对位置的核苷酸上。21、根据权利要求20所述的方法，其中修饰核苷酸在权利要求1-19中定义。22、根据权利要求20所述的方法，其中改变在细胞内进行，细胞优选选自植物细胞、真菌细胞、啮齿动物细胞、灵长类动物细胞、人细胞或酵母细胞。23、根据权利要求20所述的方法，其中蛋白质来源于细胞提取物。24、根据权利要求23所述的方法，其中细胞提取物选自植物细胞提取物、真菌细胞提取物、啮齿动物细胞提取物、灵长类动物细胞提取物、人细胞提取物或酵母细胞提取物。25、根据权利要求20或21所述的方法，其中改变是缺失、取代或插入至少一个核苷酸。26、根据权利要求21所述的方法，其中细胞是真核生物细胞、植物细胞、非人的哺乳动物细胞或人细胞。27、根据前述权利要求任一项所述的方法，其中靶DNA来自真菌、细菌、植物、哺乳动物或人。28、根据前述权利要求任一项所述的方法，其中双链DNA来自基因组DNA、线性DNA、哺乳动物人工染色体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、植物人工染色体、核染色体DNA、细胞器染色体DNA、-附加型DNA。29、根据前述权利要求任一项所述的方法，用于改变细胞、通过恢复为野生型来修正突变、诱导突变、通过破坏编码区来灭活酶、通过改造编码区来改进酶的生物学活性、通过破坏编码区来修饰蛋白质。30、如权利要求1-19中定义的寡核苷酸的用途，用于改变细胞、通过恢复为野生型来修正突变、诱导突变、通过破坏编码区来灭活酶、通过改造编码区来改进酶的生物学活性、通过破坏编码区来修饰蛋白质、错配修复、靶向改变(植物)遗传物质包括基因突变、靶向基因修复和基因敲除。31、用于双链DNA序列的增强的靶向改变的寡核苷酸的用途，双链DNA序列含有第一DNA序列和与第一DNA序列互补的第二DNA序列，寡核苷酸包含能够与第一DNA序列杂交的域，该域相对于第一DNA序列包含至少一个错配，和其中寡核苷酸包含区段，该区段含有至少一个结合亲和性高于天然存在的A、C、T或G的修饰核苷酸，和其中修饰核苷酸以与互补于第一DNA序列的相对位置的核苷酸的天然存在的核苷酸相比更强地结合在第一DNA序列的相对位置的核苷酸上。32、包含如权利要求1-19中定义的寡核苷酸的试剂盒。33、通过权利要求20-29所述的方法制备的修饰遗传物质。34、包含权利要求33所述的修饰遗传物质的细胞。35、通过权利要求20-29所述的方法制备的或者包含权利要求33所述的遗传物质的植物或植物部分。全文摘要用于双链DNA序列的靶向核苷酸交换的方法和寡核苷酸，其中供体寡核苷酸含有至少一个修饰核苷酸，该修饰核苷酸的结合亲和性高于天然存在的A、C、T或G，和/或修饰核苷酸以与互补于第一DNA序列的相对位置上的核苷酸的天然存在的核苷酸相比更强地结合到第一DNA序列的相对位置的核苷酸上。文档编号C12Q1/68GK101346474SQ200680048962公开日2009年1月14日申请日期2006年5月9日优先权日2005年12月22日发明者M·T·J·德博特,P·本多克,R·C·J·霍格斯申请人:凯津公司