氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在dna测序中的用途
【专利摘要】本发明公开了一种氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在DNA测序中的用途；所述合成方法包括如下步骤：式(Ⅲ)化合物在碱性条件下去保护基得式(Ⅱ)化合物；进一步去甲基得式(Ⅰ)化合物，即7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷；其中，R1为H或OH，R2为I、Br或Cl，R3为H或本发明的氮杂化鸟嘌呤核苷是用于DNA测序的新型试剂，与8位未取代氮的鸟嘌呤核苷相比，具有更好的碱基识别效果、更稳定的DNA链结构。同时，现有技术中8位氮取代鸟嘌呤核苷的合成方法复杂，产率低，尚未商业化生产，而本发明的合成方法所需原料简单易得，采用常规化学合成反应，且收率较高，适用于广泛推广使用。
【专利说明】氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在DNA测序中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一种氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在DNA测序中的用途。
【背景技术】
[0002]2001年人类基因组工作草图的发表，标志着后基因组时代的到来，人们对测序技术的需求没有减少反而增加，DNA测序技术依旧处于高速发展时期。近年来，人类基因组计划促进了 DNA测序效率的提高和测序成本的下降，但是目前的DNA测序方法依然存在成本高和耗时长的问题，这影响了 DNA测序技术的市场化应用，阻碍了科学的发展。科学家们一直致力于发展高通量、低成本的测序技术，因此，三代高通量测序技术即单分子测序技术应运而生。
[0003]三代测序技术的核心是直接对单个DNA分子进行测序，不做任何的DNA扩增反应，从而减少成本，提高通量。单分子测序技术虽然已有商业化产品，但是都还存在技术上的难点，尚未达到规模化测序的要求。尽管如此，当前国内市场上的高通量测序平台仍被进口产品所垄断，产品范围涵盖了测序平台中的硬件和试剂等配套产品。因此，国家863计划、973计划和“十二五”技术都将研发新一代测序技术及配套产品的研发列为重点发展方向，旨在改变目前的市场格局，建立我国自主的高通量测序平台，是一项具有战略性的意义工作。
[0004]DNA合成测序的可逆终端选取U，C，A，G四个碱基的核苷酸与敏感性连接单元和荧光标记化合物，通过化学合成方式得到。合成测序的首要工作是合成四个不同碱基核苷酸及其衍生物。文献报道发现，四个不同碱基(U，C，A，G)的含取代基核苷及其衍生物，合成方式复杂且价格高昂。与此同时，8位取代氮的鸟嘌呤核苷被证明具有优良的生物活性和测序识别效果，但该种鸟嘌呤核苷及其衍生物的合成报道尚未报道。合成8位取代氮的鸟嘌呤核苷及其衍生物具有广阔的理论研究价值和市场应用前景。我们在专利申请CN201310489397.0, CN201310489350.4中分别报道了鸟嘌呤核苷两种不同的合成方法，本发明中8位取代氮的鸟嘌呤核苷包括7-去氮-7-卤素-8-氮-2’ -脱氧鸟嘌呤核苷和7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷，其具有更佳的测序识别效果和生物活性，并且合成方法更高效而实用，反应条件温和，反应过程有效且可控，适用于大规模生产。专利CN201310489350.4和专利CN201310489397.0中，糖苷化反应所需原料价格高昂，反应的产率很低，不适用于规模化生产。本专利中选取简单易得的原料，高产率地首次合成了 7-去氮-7-卤素-8-氮-2 ’ -脱氧鸟嘌呤核苷和7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷，进而合成得到可被聚合酶识别的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮_2’_脱氧鸟嘌呤核苷酸和7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸，从而参与DNA与RNA链延伸反应，达到单分子测序的效果。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种氮杂化鸟嘌呤核苷及其合成方法和在DNA测序中的用途。具体提供了氮杂化鸟嘌呤核苷酸的合成方法，中间体化合物7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷、7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2脱氧鸟嘌呤核苷酸以及化合物7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸的合成方法；本发明的方法合成原料简单易得，反应条件温和，作简单，适用于规模化生产。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
[0007]第一方面，本发明涉及一种7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷的合成方法，所述方法包括如下步骤:
[0008]A、式(III)化合物在碱性条件下去保护基得式(II )化合物；
[0009]B、所述式(II )化合物在碱性条件下去甲基得式(I )化合物，即所述7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷；
【权利要求】
1.一种7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: A、式(III)化合物在碱性条件下去保护基得式(II)化合物； B、所述式(II)化合物在碱性条件下去甲基得式(I )化合物，即所述7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷；
2.如权利要求1所述的7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷的合成方法，其特征在于，所述式(III)化合物通过式(IV)化合物与式(VI)化合物发生糖苷化反应制备而得，
3.如权利要求2所述的7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷的合成方法，其特征在
于，所述式(IV )化合物通过在式(V)化合物
4.如权利要求3所述的7-去氮-7-卤素-8-氮-鸟嘌呤核苷的合成方法，其特征在于，所述式(V)化合物是通过如下步骤制备而得的: A、式(VDI)化合物的合成:2_氨基-4，6-二羟基嘧啶在三氯氧磷的作用下，反应得到式(VDI)化合物，
5.一种7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’ -脱氧鸟嘌呤核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: A、化合物dG(8-aza)(AP3)的合成:在Cu1、Pd (PPh3) 4和TEA存在的条件下，三氟乙酰丙炔胺和由如权利要求1所述的方法合成得到的式(I )化合物反应，得化合物dG(8_aza)(AP3)，式(I )中 R1 为 H，
6.—种7-去氮-rJ-丙炔胺-8-氮-鸟嘌呤核苷酸的合成方法,其特征在于，所述方法包括如下步骤: A、化合物G(8-aza)(AP3)的合成:在Cul、Pd(PPh3)4和TEA存在的条件下，三氟乙酰丙炔胺和由如权利要求1所述的方法合成得到的式(I )化合物反应，得化合物G(8-aza)(AP3)，式(I )中 R1 为 0H，
7.—种如权利要求5所述的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’ -脱氧鸟嘌呤核苷酸在参与DNA链延伸反应中的用途。
8.—种如权利要求5所述的7-去氮-7-丙炔胺-8-氮-2’ -脱氧鸟嘌呤核苷酸在合成荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸作为可逆终端中的用途。
9.一种荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸可逆终端dG (8-aza) TP (AP3)-SS-Texas Red的合成方法，其特征在于，包括如下步骤: A、化合物dG(8-aza) (AP3) -SPDP的合成:在TEA存在的条件下，如权利要求5所述的化合物 dG (8-aza) (AP3)和 SPDP 反应，得化合物 dG(8_aza) (AP3) -SPDP,
10.一种如权利要求9所述的荧光素标记氮杂化鸟嘌呤核苷酸可逆终端dG(8_aza)TP (AP3) -SS-Texas Red 在 DNA 测序中的用途。
【文档编号】C07H1/04GK103804447SQ201410055242
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月18日 优先权日:2014年2月18日
【发明者】沈玉梅, 魏晓飞, 龚兵, 胡蔚, 姜玉, 赵小东, 邵志峰, 李小卫, 伍新燕, 汤道年, 刘亚智 申请人:上海交通大学