一种核酸核糖体结合体系构建方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学生物学技术领域，具体设及一种核酸核糖体结合体系构建方法及 应用。
【背景技术】
[0002] 农业生产上病毒病危害严重，是仅次于真菌的第二大类病害，每年都给农业生产 造成重大损失，其防治一直W来就是病害防治中的难点，尽管长期W来人们一直致力于抗 植物病毒的研究，在目前市场上也可得到一些抗病毒的药剂，然而绝大多数抗植物病毒剂 的抗病毒活性仅仅在30%至60%之间，理想的抗植物病毒药剂依然十分缺乏。安全高效的 抗植物病毒剂研究开发一直W来就是农业生产上急需解决的重要问题。
[0003] 近年，对天然产物研究用于病害抵抗和抗植物病毒药剂开发日益引起研究者们的 关注，植物活性成分的研究是其中一个重要分枝。世界各地的不少植物中都含有抗植物病 毒的活性成分，它们将为抗植物病毒药剂开发提供优良的先导，植物是抗植物病毒活性成 分筛选及药理研究的一个重要资源库，植物提取物(植化成分）的抗病毒活性研究在世界范 围正逐步变成一个重要而有前景的研究领域。我国植物资源丰富，尤其中草药是我国的一 个传统优势，用现代技术开展植物资源的抗病毒研究，对于高效安全抗植物病毒药剂开发 和发扬我国的植物资源优势都具有重要作用；然而，在植物成分抗植物病毒实际研究中研 究者所面临的困难在于在植物中的成分通常是多样而复杂的，并且大多数活性成分在植物 体中往往含量少（甚至是痕量状态)，它们通常不能满足目前常规(传统）抗病毒药剂筛选的 要求。传统筛选由于受材料等多种因素的限制，筛选效率受到影响，尤其是病毒与寄主关系 密切，则针对药剂特定调控祀标，首先从药理角度出发去构建发展新的微量快速药物筛选 体系及研究方法，进行安全高效特异性活性成分筛选，对抗植物病毒活性物的筛选及药理 研究W及植物资源的现代化研究都具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一目的在于提供一种核酸核糖体结合体系构建方法；第二目的在于提 供所述的核酸核糖体结合体系构建方法的应用。
[0005] 本发明的第一目的是该样实现的，所述的核酸核糖体结合体系构建方法是在经 0. 1%DEPC处理过的500y1的离屯、小管中于0~5°C加入12y1核糖体麦胚抽提溶液，再依次 加入lulRNAsin(40U/ul，Takara)，2ul含 100mlKAC, 4mMMg(AC)2，20mMH巧es, 20mM DTT的溶液，lulImM/each20种氨基酸标准混合液（promega)，2.加 1lOmMATP,lullOmM GTP，0. 5ul2mM放线菌酬，1. 5ul8mM磯酸肌酸，lugTMV-RNA, 0. 5ul磯酸肌酸激酶，用 DEPC处理水补至25y1，离屯、后置于23~26°C下14~16min，然后转置于0~5°C条件下得到核 酸-核糖体结合体系。
[0006] 本发明的第二目的是该样实现的，所述的核酸核糖体结合体系构建方法用于研究 药物筛选的应用。
[0007] 目前W病毒蛋白翻译或核酸复制为祀点进行抗病毒活性药物筛选研究在动物病 毒研究中已经引起人们的注意，本发明从病毒侵染循环的特点出发，W重要经济作物烟草 上发生普遍且危害相对严重的烟草普通花叶病毒TMV作为供试病毒，选取病毒核酸（RNA) 和核糖体的结合作为筛选祀标，进行药物针对祀点的离体微量筛选体系构建，并依此进行 中草药抗植物病毒活性筛选和活性成分研究。对于发掘丰富的中草药植物资源筛选天然抗 植物病毒活性物，为人工抗植物病毒剂的仿生合成提供优良的先导，推动抗植物病毒药剂 开发及抗植物病毒剂药理相关研究具有积极作用。
[0008] 本发明构建的核酸核糖体结合体系可应用于病毒核酸-核糖体结合抑制的药物 筛选研究，结合抑制率计算公式R%=(l〇ACt/k-1)X100/lOACt/k，Act为筛选样品 和对照煙白样品)实时巧光定量PCR检测Ct差值，k为cDNA系列稀释制作的cDNA相对浓 度对数LgC与检测Ct间相对定量标准曲线（y=-kx+b)斜率绝对值。
【附图说明】
[0009] 图1为完整结合体系（S3)结合反应并离屯、分离后RNA分布的在线定位示意图。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不W任何方式对本发明加W 限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0011] 本发明所述的核酸核糖体结合体系构建方法，是在经0. 1%DEPC处理过的500y1 的离屯、小管中于0~5°C加入12y1核糖体麦胚抽提溶液，再依次加入lulRNAsin(40U/ul， Takara)，2ul含 100mlKAC, 4mMMg(AC)2, 20mMH巧es, 20mMDTT的溶液，lulImM/each 20 种氨基酸标准混合液（购于promega)，2. 5ullOmMATP,lullOmMGTP，0. 5ul2mM放 线菌酬，1. 5ul8mM磯酸肌酸，lugTMV-RNA, 0. 5ul磯酸肌酸激酶，用DEPC处理水补至 25y1，离屯、后置于23~26°C下14~16min，然后转置于0~5°C条件下得到核酸-核糖体结合 体系。
[0012] 所述的核糖体麦胚抽提溶液是经麦胚的制备、核糖体麦胚抽提物的制备步骤制备 得到，具体包括W下步骤： A、 麦胚的制备；取小麦种子，干燥至含水量12%，粉碎过孔径1mm筛，再过孔径0. 45mm 筛，收集0. 45mm筛上的麦粉颗粒，加入麦粉颗粒固液体积比2~5倍的悬浮液，悬浮得到悬浮 颗粒，去除溶剂后挑选完整麦胚，完整麦胚进一步洗漆，洗漆后加入固液体积比8~12倍的 无菌水，置于摇床上于温度3~5°C晃摇洗漆8~12min，洗漆2~4次，加入固液体积比1~3倍的 裂解液，超声处理，弃去裂解液，加入固液体积比8~12倍的DEPC处理水于摇床上震摇处理 8~12min，处理2~4次，干燥，于3~5°C保存备用； B、 核糖体麦胚抽提物的制备；称取A步骤制备的麦胚0. 05~0. 15g，置于DEPC处理过 的离屯、管中，加液氮，研磨成粉末，加入0. 5~1. 5ml的核糖体抽提缓冲液（2XBufferA; 40mMH巧es/KOH, 120mMK(AC)2，5mMMg(AC)2，2mMCaCl]，4mMDTO和8~12y1 标准混 合氨基酸（ImM/each，promega)，混摇使粉末分散，置于频率30化的振荡器上震荡抽提20~ 40s，于0~5°C静置2~4min，于3~5°C、30000xg离屯、20~40min，上清液上Se地adex G-25柱，用IXBufferA(核糖体抽提缓冲液2XBufferA倍比稀释)洗脱，W1.5ml/管 或0. 5ml/管依次收集洗脱液，并将洗脱液于3~5°C、30000g离屯、8~12min纯化处理，测 定各