专利名称：细菌核糖体核糖核酸体外扩增－基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细菌核糖体核糖核酸体外扩增-基因芯片。
细菌感染是临床上常见疾病，败血症是其典型的代表，早期诊断非常重要，可大大降低死亡率和并发症。目前临床上用于细菌鉴定的常用方法有血培养，免疫学和血清学检测等。血培养需时长，培养阳性率低，而免疫学及血清学检测敏感性及特异性均低。因此，临床上缺乏一种快速、准确地诊断细菌感染的方法，给临床的早期诊断带来了困难。近几年来，随着分子诊断技术的发展和应用，感染性疾病的诊断也由传统的表型特征的鉴定发展到分子水平的分析。PCR技术是近几年来发展起来的一项分子生物学技术，为临床提供了早期、快速、敏感的检测手段。但一般PCR通常只检测特定病原体，在病原体未明时，需用多种不同引物对不同的病原微生物进行PCR扩增，费时费力，使临床检测病原菌的PCR技术的应用受到限制。
本发明的目的是提供一种细菌核糖体核糖核酸体外扩增-基因芯片。
为了达到上述目的本发明采取下列措施细菌核糖体核糖核酸体外扩增-基因芯片，它是在固相载体上设有如下探针1) universal bacterial probe2) Gram-positve universal probe3) Gram-negative probe 14) Gram-negative probe 25) Bacteroides-Flavobacterium probe6) Haemophilus species probe7) Streptococcus pneumoniae probe8) Escherichia coil-enteric bacterium probe9) Listeria monocytogenes probe10) Streptococcus agalactiae probe11) Neisseria meningitidis probe12) Bacillus probe13) Corynebacterium probe14) Propionibacterium probe
15) Coagulase-negative Staphylococcus probe Ⅰ16) Coagulase-negative Staphylococcus probe Ⅱ17) Staphylococcus aureus probe本发明的优点1)快速rRNA基因PCR扩增只需2小时，基因芯片，杂交也仅6～8小时，而常规的血培养至少3～5天。缩短了诊断时间。
2)特异rRNA基因分子生物学方法只检出是否细菌等原核生物感染，与真菌、病毒及人基因组DNA无交叉反应。
3)敏感rRNA基因PCR最小检出量达10-12g，相当于3个细菌，血培养需100个细菌以上，且只能检出在常规培养基中能生长的细菌，对于需特殊培养(如L型细菌)，厌氧(如厌氧菌)，难以培养(如结核菌)或无法培养的细菌(如放线菌)，则只能用rRNA基因PCR解决。
4)准确rRNA基因PCR-基因芯片不仅能诊断细菌感染，还可区分系G+/G-感染，指导临床用药，并进一步设计对特异细菌的探针，制作芯片，诊断系何种细菌感染。
5)实用可检测在正常情况下无菌的任何体液，包括血、脑脊液、腹水、胸水等，可诊断败血症，菌血症，化脓性脑膜炎，结核性脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎、肝硬化腹水等感染。
下面结合附图
作详细说明附图是细菌核糖体核糖核酸体外扩增-基因芯片的结构示意图。
细菌核糖体核糖核酸(ribosomal RNA，rRNA)按沉降系数分为3种，分别是5S、16S、23S rRNA。rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因中。除细菌外，也存在于衣原体、支原体、立克次氏体、螺旋体、放线菌等原核生物中，但不存在于非原核生物如病毒、真菌等的体内。它的内部结构由保守区及可变区两部分组成，保守区在长期的进化过程中，因不时突变在不同细菌间存在较大差异，两者互相交替排列。
在保守区设计共同引物PCR进行PCR扩增-检测细菌存在与否(PCR技术)。
在可变区设计探针(通用探针、革兰氏阳性(G+)，革兰氏阴性(G-)探针-区分细菌G+/G-菌(杂交，反相杂交)。在可变区设计针对特定细菌的探针，检测特异细菌[(SSCP(单链构象多态性)，RFLP(限制性片段长度分析)，基因芯片等]。
本发明的制作方法1)引物5’端生物素修饰。采用β-氰乙基磷酸酰胺法将5’-Amino-link合成到引物5’端并纯化。
2)寡核苷酸探针末端加尾采用TdT末端加尾法。
3)芯片阵列的设计及芯片制备。阵列设计采用计算机辅助设计，芯片材料采用玻璃片、硅片、尼龙膜、硝酸纤维膜、凝胶或杂交膜，这些材料已被国外普遍采用并证明可行。低密度芯片制备采用探针合成后再用TLC点样仪点于片基上的方法，探针连接采用氨基化探针与环氧活化的玻璃片共价或生物素-亲和素非共价结合的方法。
权利要求
1．一种细菌核糖体核糖核酸体外扩增-基因芯片，其特征在于在固相载体上设有如下探针1) universal bacterial probe2) Gram-positve universal probe3) Gram-negative probe 14) Gram-negative probe 25) Bacteroides-Flavobacterium probe6) Haemophilus species probe7) Streptococcus pneumoniae probe8) Escherichia coil-enteric bacterium probe9) Listeria monocytogenes probe10) Streptococcus agalactiae probe11) Neisseria meningitidis probe12) Bacillus probe13) Corynebacterium probe14) Propionibacterium probe15) Coagulase-negative Staphylococcus probe Ⅰ16) Coagulase-negative Staphylococcus probe Ⅱ17) Staphylococcus aureus probe
2．根据权利要求1所述的一种细菌核糖体核糖核酸体外扩增一基因芯片，其特征在于所说的固相载体为玻片、硅片、尼龙膜、硝酸纤维膜、凝胶。
全文摘要
本发明公开了一种细菌核糖体核糖核酸体外扩增－基因芯片。它在固相载体上设有如下:1)universal bacterialprobe,2)Gram－positve universal probe,3)Gram－negativeprobe1,4)Gram－negative probe2,5)Bacteroides－Flavobacteriumprobe,6)Haemophilus species probe,7)Streptococcus pneumoniaeprobe,8)Escherichia coli－enteric bacterium probe,9)Listeriamonocytogenes probe等17种探针。本发明具有快速、特异、敏感、准确、实用等优点。
文档编号C12Q1/68GK1300855SQ00125919
公开日2001年6月27日 申请日期2000年8月23日 优先权日1999年12月17日
发明者尚世强, 俞锡林, 赵正言 申请人:浙江大学