离子通道的制作方法

专利名称：：离子通道的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新近鉴别的核酸、由这些核酸编码的多肽，以及它们的生产和用途。更具体地，本发明的核酸和多肽涉及离子通道亚基，下文中称作“Kv9.2”。本发明还涉及抑制或活化这种核酸和多肽的作用。
背景技术：
：离子通道是多亚基膜结合蛋白，它在细胞行使功能时发挥至关重要的作用。它们控制许多离子跨越细胞膜的的通过，包括钠、钾、氯以及钙。由于离子携带电荷，离子通道是基本细胞电学特性(包括细胞静息电位)的重要介导者。它们的故障和缺陷涉及多种疾病和症状，包括癫痫、高血压和囊性纤维化。钾通道分布于细胞的表面膜中并选择性地允许钾离子通过，人们认为它在控制细胞膜电位中发挥重要作用。特别是，在神经和肌肉细胞中，它通过控制动作电位的频率、持久性等负责中枢和外周神经的神经传递、心脏起搏、肌肉收缩等。另外，已显示它还涉及激素的分泌、细胞体积的调节、细胞的增殖等。人们认为钾通道基因家族是最大和最多样的离子通道家族。根据跨膜结构域的数量，例如两个、四个或六个结构域，将其分成许多的亚家族。具有两个结构域的亚家族包括GIRK、IRK、CIR和ROMK，它们具有高度保守的孔结构域。Twik-1和Twik-样通道以及TREK、TASK-1和TASK-2和TRAAK具有4个跨膜结构域，并涉及维持跨膜的稳态钾离子电位。Shaker-样和eag型通道具有六个结构域，且是最大的亚家族。Shaker型是具有非常高的多样性的家族，并可进一步分成许多亚家族Kv1、Kv2、Kv3和Kv4。另一方面，eag类型由eag、eag-相关基因和elk组成，其相关基因包括对应于KAT基因簇的超极化活化型钾通道以及由环核苷酸活化的阳离子通道。1987年，与Shaker通道(Kv1)的克隆一起报道了第一个编码Kv通道的完整核苷酸序列。用ShakercDNA低严谨性筛选cDNA文库导致衍生自三种不同基因的K+通道cDNAsShab(Kv2)，Shaw(Kv3)和Shal(Kv4)的分离。这些序列与Shaker同源，具有～40％的同一性。在核心区域中与Shaker具有＞60％的同源性的Kvl家族是最大的通道家族，具有至少七个成员。除涉及Shaker、Shab、Shal和Shaw的四个哺乳动物亚家族外，还描述了另外五个亚家族(Kv5-9)。最近，克隆和在异源表达系统中表达了30多个Kv通道。这些通道常常在电压敏感性、电流动力学和稳态激活和失活方面显示不同。Kv通道作为四聚体存在，通过4个6-跨膜-跨越-亚基结合形成功能通道构成。不但同样的亚基可结合形成功能通道，而且不同的亚基也可体外和体内结合形成功能异数通道。这些异数通道具有独特的特性，即常常表现出观察到的相应的同数通道特性的混合。此外，个别Kv-亚基在单独表达时是无功能的。例如，最近鉴别的哺乳动物Kv家族的成员Kv9.3亚基，其本身不形成功能同数通道，而仅在异数复合体中行使功能，在异数复合体中它产生改变的电压敏感性和动力学。辅助亚基可与Kv亚基结合，以增加更为多样的Kv通道功能。当前，阐述了四种Kv亚基基因家族。所有的都是胞质蛋白，质量约40kDa，具有保守的核心序列和可变NH2末端。已显示Kv亚基赋予亚基功能作用，包括快和慢失活，改变电压敏感性和延缓钝化。另外，亚基可作为细胞氧化还原传感器发挥作用，因为在异源表达系统中它似乎赋予Kv4.2通道O2敏感性。先前已显示钾电压-门控通道、延迟整流器、亚家族S、成员-2(Kv9.2)mRNA在胰岛中表达，但显示不与胰岛素发生共局部化(colocalize)，表明它与控制胰岛素的分泌无关(Yan，L.，等，Diabetes2004.53.597-607).。现在我们发现Kv9.2钾通道对保持血糖非常重要。在敲除Kv9.2的动物中血液葡萄糖水平显著不同(即低)于野生型动物。因此，该基因控制和调节糖和脂肪的代谢。发明综述根据本发明第一个方面，我们提供了具有功能已被破坏的内源基因的转基因非人动物，其中Kv9.2基因包含显示为SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO4的核酸序列，或者与它们具有至少70％的序列同一性的序列。优选地，转基因非人动物在Kv9.2基因或其部分中具有缺失。优选地，转基因非人动物当与野生型动物比较时显示下列表现型中的任何一个或组合(a)血液葡萄糖水平降低；(b)优选地当用旷场试验(OpenFieldTest)和/或正迷宫试验(PlusMazeTest)检测时，焦虑增加。根据本发明第二方面，本文提供一种转基因非人动物，其中该动物的至少部分或全部Kv9.2基因用来自另一动物、优选地是另一物种、更优选地是人的Kv9.2基因的序列取代。优选地，所述转基因非人动物是小鼠。优选地，所述转基因非人动物包含功能已被破坏的Kv9.2基因，优选地在Kv9.2基因中有缺失，其中Kv9.2基因包含SEQIDNO4显示的核酸序列或与之具有至少70％的序列同一性的序列。根据本发明第三个方面，我们提供一种分离的细胞或组织，所述细胞或组织来自根据本发明第一或第二个方面所述的非人转基因动物。作为本发明的第四个方面，本文提供一种具有功能已被破坏的内源Kv9.2基因的细胞，其中Kv9.2基因包含SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO4显示的核酸序列，或者与它们具有至少70％的序列同一性的序列。根据本发明第五个方面，我们提供所述转基因非人动物、所述细胞或组织或者所述细胞用作焦虑或糖尿病的模型的用途。第六个方面，本发明提供所述转基因非人动物、所述细胞或组织或者所述细胞用作与Kv9.2有关的疾病的模型的用途。本发明第七个方面，本文提供所述转基因非人动物、所述细胞或组织或者所述细胞在鉴别Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂的方法中的用途，所述Kv9.2多肽包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列，或者与它们具有至少70％的序列同一性的序列。根据本发明第八个方面，我们提供鉴别Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂的方法，所述Kv9.2多肽包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列，或者与它们具有至少70％的序列同一性的序列，所述方法包括给予动物候选化合物，所述动物优选地是根据本发明第一个方面所述的野生型或转基因非人动物，并测定如下表现型中任何一个的变化(a)血液葡萄糖水平；和(b)焦虑，优选地用旷场试验和/或正迷宫试验检测。优选地，所述方法鉴别Kv9.2多肽的激动剂，并包含鉴别能够引起动物显示表现型(a)-(b)中的任何一个增加的候选化合物。换句话说，或者另外，所述方法鉴别Kv9.2多肽的拮抗剂，并包含鉴别能够引起动物显示表现型(a)-(b)中的任何一项或这样的表现型减少的候选化合物。根据本发明第九个方面，我们提供鉴别Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂的方法，所述Kv9.2多肽包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与这些序列具有至少70％的序列同一性的序列，所述方法包括将候选化合物与细胞或组织接触，优选地为野生型细胞或组织或所述的细胞或组织或所述的细胞，并测定细胞或组织细胞传导或动力学的改变。优选地，所述方法鉴别Kv9.2多肽的激动剂，并包括鉴别能够提高细胞的传导或动力学的候选化合物。换句话说，或者另外，所述方法鉴别Kv9.2多肽的拮抗剂，并包括鉴别能够降低细胞的传导或动力学的候选化合物。根据本发明第十个方面，本文提供鉴别适合于治疗或缓和焦虑或糖尿病，优选地Kv9.2相关疾病的化合物的方法，所述方法包括将含有SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与这些序列具有至少70％的序列同一性的序列的Kv9.2多肽与候选化合物接触，并确定该候选化合物是否是Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂。作为本发明第十一个方面，我们提供Kv9.2多核苷酸的用途，所述Kv9.2多核苷酸含有SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO4显示的核酸序列或与这些序列具有至少70％的序列同一性的序列，用于鉴别治疗焦虑或糖尿病，优选地Kv9.2相关疾病的Kv9.2多核苷酸的激动剂或拮抗剂。根据本发明第十二个方面，我们提供Kv9.2多肽的用途，所述Kv9.2多肽含有SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与这些序列具有至少70％的序列同一性的序列，用于鉴别治疗焦虑或糖尿病，优选地Kv9.2相关疾病的Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂。根据本发明第十三个方面，我们提供Kv9.2多肽的拮抗剂，所述Kv9.2多肽含有SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与这些序列具有至少70％的序列同一性的序列，用于在治疗个体的焦虑或糖尿病，优选地Kv9.2相关疾病的方法中使用。根据本发明第十四个方面，本文提供Kv9.2多肽的拮抗剂的用途，所述Kv9.2多肽含有SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与这些序列具有至少70％的序列同一性的序列，用于制备治疗个体的焦虑或糖尿病，优选地Kv9.2相关疾病的药物组合物。根据本发明第十五个方面，我们提供治疗患有焦虑或糖尿病的个体的方法，优选地是患有Kv9.2相关疾病的个体，所述方法包括给予个体Kv9.2的拮抗剂。根据本发明第十六个方面，我们提供诊断个体焦虑或糖尿病、优选地Kv9.2相关疾病的方法，所述方法包括检测个体或个体的细胞或组织中Kv9.2的表达、水平或活性的变化。优选地，Kv9.2相关疾病选自由下列组成的组I型和II型糖尿病、高胰岛素血症(hyperinsulinaemia)、胰岛素分泌过多症、胰岛素抗性(insulinresistance)、糖尿病并发症包括糖尿病相关的血管病、糖尿病相关的肾病和糖尿病相关的神经病，以及治疗低血糖、高脂血症(hyperlipoidemia)(它们是HDL、LDL或VLDL)、异常脂血症(dyslipoidemia)、无论其起因是原发于或继发于糖尿病、甲状腺机能亢进/减退、肢端肥大症、肝功能衰竭、肾衰竭、胰腺瘤、胰腺炎以及酒精诱导的低血糖。换句话说，或另外，Kv9.2相关疾病选自由下列组成的组社交焦虑症(socialanxiety)、外伤后应激反应障碍(posttraumaticstressdisorder)、恐惧症(phobias)、社交恐惧症(socialphobia)、特殊恐惧症(specialphobias)、惊恐性障碍(panicdisorder)、强制性障碍(obsessivecompulsivedisorder)、急性应激反应障碍(acutestressdisorder)、分离焦虑性疾病(separationanxietydisorder)、广泛性焦虑性疾病(generalizedanxietydisorder)、重性抑郁症(majordepression)、精神抑郁症(dysthymia)、两极障碍(bipolardisorder)、季节性情感障碍(seasonalaffectivedisorder)、产后抑郁症(postnataldepression)、躁狂抑郁症(maniacdepression)、两极抑郁症(bipolardepression)、焦虑症(anxiety)、焦虑性疾病(anxietydisorders)、焦虑相关行为(anxiety-relatedbehavior)和广泛性焦虑性疾病、广场恐怖症(agoraphobia)、急性应激反应障碍(acutestressdisorder)和DSM-IV中所列的那些惊恐性障碍(panicdisorders)及抑郁(depression)。根据本发明第十七个方面，我们提供Kv9.2多肽，所述多肽包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列，或与它们具有至少70％的序列同一性的其同源物、变体或衍生物。根据本发明第十八个方面，我们提供编码根据本发明第十八个方面所述的多肽的核酸。优选地，所述核酸包含SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO4显示的序列，或与它们具有至少70％的序列同一性的其同源物、变体或衍生物。附图的简要描述图1是显示用于产生Kv9.2缺陷小鼠的敲除载体的图解。图2显示由人RT-PCR筛选得到的Kv9.2基因表达的结果。图3是显示分析血液葡萄糖水平(mmol/L)结果的图表。图4显示敲除质粒载体的核苷酸序列。图5是显示分析旷场试验结果的图表；图5A是在外周(左侧)和中央(右侧)区域移行的全距离(实心柱型是敲除动物)；图5B是在外周(左侧)和中央(右侧)区域移行的时间(实心柱型是敲除动物)；和图5C是进入实心带(filedzone)的数量(实心柱型是敲除动物)。图6是分析正迷宫试验结果的图表，该图表显示花费在迷宫闭锁臂和开放臂中的时间(实心柱型是敲除动物，阴影柱型是野生型动物)。序列列表SEQIDNO1显示人Kv9.2的cDNA序列。SEQIDNO2显示衍生自SEQIDNO1的可读框。SEQIDNO3显示人Kv9.2的氨基酸序列。SEQIDNO4显示小鼠Kv9.2的cDNA的可读框。SEQIDNO5显示小鼠Ky9.2的氨基酸序列。SEQIDNOs.6-18显示用于构建敲除质粒的基因型引物。SEQIDNOs19显示敲除质粒载体序列。除非另外说明，本发明的实施将利用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术，这些技术是本领域普通的技术人员能力之内的。这些技术阐述于相关文献中。参见例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，第二版，1-3卷，ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel，F.M.等(1995和定期增刊；CurrentProtocolsinMolecularBiology，9，13，和16章，JohnWiley&Sohs，NewYork，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques，JohnWiley&Sons；J.M.Polak和JamesO’D.McGee，1990，InSituHybridizationPrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach，IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology，AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.IbyEdwardHarlow，DavidLane，EdHarlow(1999，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManualbyEdHarlow(Editor)，DavidLane(Editor)(1988，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ISBN0-87969-314-2)，1855，Lars-IngeLarsson“ImmunocytochemistryTheoryandPractice”，CRCPressinc.，BacaRaton，Florida，1988，ISBN0-8493-6078-1，JohnD.Pound(编辑)；“ImmunochemicalProtocols，vol80”，连续地“MethodsinMolecularBiology”，HumanaPress，Totowa，NewJersey，1998，ISBN0-89603-493-3，HandbookofDrugScreening，RamakrishnaSeethala编辑，PrabhavathiB.Fernandes(2001，NewYork，NY，MarcelDekker，ISBN0-8247-0562-9)；LabRefAHandbookofRecipes，Reagents，和OtherReferenceToolsforUseattheBench，JaneRoskams和LindaRodgers编辑，2002，ColdSpringHarborLaboratory，ISBN0-87969-630-3；和TheMerckManualofDiagnosisandTherapy(第17版，Beers，M.H.，和Berkow，R，编辑，ISBN0911910107，JohnWiley&Sons)。这些常用文献本文全部引用作为参考。发明的详细描述Kv9.2亚基本发明大体上涉及离子通道及其亚基的用途，具体地涉及在治疗、减轻或诊断包括糖尿病或焦虑症的Kv9.2相关疾病中，电压门控钾离子通道的Kv9.2亚基及其同源物、变体或衍生物的用途。这一内容及本发明其它的实施例将在下文中进一步详细描述。Kv9.2亚基的表达特征如在实施例中所显示的，聚合酶链反应(PCR)扩增Kv9.2cDNA检测Kv9.2的表达，在包括前列腺、肝脏、生殖器官、肌肉和脑等许多器官中的丰度不同。使用SEQIDNO1的Kv9.2cDNA通过BLASTN搜索人EST数据源，在cDNA文库中发现同一性。这表明Kv9.2在正常或不正常的组织中表达，例如U69192人婴儿大脑AA776703人的睾丸A1681499人的肺AW292826人的卵巢因此，Kv9.2多肽、核酸、探针、抗体、表达载体和配体，对于在这些和其它组织中与Kv9.2亚基的过量、不足和异常表达有关的疾病的检测、诊断、治疗和其它分析是有用的。Kv9.2亚基相关疾病根据本文描述的方法和组合物，Kv9.2亚基用于治疗和诊断一系列的疾病。方便起见，这些疾病被称作Kv9.2相关疾病。本文中，我们证明了人Kv9.2定位于智人(Homosapiens)染色体8q22。因此，在一个具体的实施方案中，Kv9.2亚基可用于治疗或诊断定位于(mapsto)这一基因座、染色体带、区域、臂或相同染色体的疾病。已经被确定为与Kv9.2亚基的染色体位置相关于相同的基因座、染色体带、区域、臂或染色体的已知的疾病包括肾小管性酸中毒-骨硬化症综合症(Renaltubularacidosis-osteopetrosissyndrome)、Dihydropyrimidinuria、科恩氏综合症(Cohensyndrome)、和伴随喉部畸形的克-费二氏(Klippel-Feil)综合症。然而，迄今为止，在发现离子通道被增量或减量调节的情况下，无任何特殊的疾病与离子通道有关。如在实施例中所证实的，Kv9.2缺陷的敲除小鼠显示一定范围的表现型。具体地，实施例5证明，在Kv9.2敲除小鼠中血液葡萄糖水平明显高于相应的野生型小鼠。因此，Kv9.2活性的缺乏与血糖水平的降低有关。我们因此公开了一种优选地用于治疗糖尿病的降低个体血糖水平的方法，所述方法包括在该个体中降低Kv9.2的水平或活性。如其它文献所记录的，这可通过下调Kv9.2的表达，或通过使用Kv9.2的拮抗剂完成。具体地，通过这种方法调节血液葡萄糖可用于治疗的疾病包括，但不限于，1型和II型糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素分泌过多症、胰岛素抗性、糖尿病并发症包括糖尿病相关的血管病、糖尿病相关的肾病和糖尿病相关的神经病，以及低血糖的治疗。此外，还可用于治疗高脂血症(hyperlipoidemia)(它们是HDL、LDL或VLDL)、异常脂血症(dyslipoidemia)、原发或继发糖尿病、甲状腺机能亢进/减退、肢端肥大症、肝功能衰竭、肾衰竭、胰腺瘤、胰腺炎以及酒精诱导的低血糖。Kv9.2敲除小鼠因此可进一步用作这些疾病中任何一种的模型。此外，实施例6描述了旷场试验，其中Kv9.2敲除小鼠显示比它们的野生型同伴更焦虑。因此，Kv9.2活性的缺乏与应激反应的提高有关。我们因此公开了一种降低个体应激反应或焦虑或二者都被降低的方法，所述方法包括在该个体中提高Kv9.2的水平或活性。如其它文献所记录的，这可通过上调Kv9.2的表达，或使用Kv9.2的激动剂完成。Kv9.2和Kv9.2活性的调节子，具体包括Kv9.2的拮抗剂，可用于治疗或缓解以应激反应和焦虑为特征的疾病或症状。这种疾病包括社交焦虑症、外伤后应激反应障碍(posttraumaticstressdisorder)、恐惧症、社交恐惧症、特殊恐惧症、惊恐性障碍(panicdisorder)、强制性障碍、急性应激反应障碍(acutestressdisorder)、分离焦虑性疾病、广泛性焦虑性疾病、重性抑郁症(majordepression)、精神抑郁症、两极障碍(bipolardisorder)、季节性情感障碍、产后抑郁症、躁狂抑郁症、两极抑郁症。Kv9.2敲除小鼠因此可进一步用作这些疾病中任何一种的模型。在一个优选的实施例中，Kv9.2相关疾病包括以应激反应或焦虑为症状的疾病。在特别优选的实施例中，Kv9.2相关疾病包括上文列出的焦虑和应激反应相关疾病。另外，还发现基因具有影响神经障碍的作用，包括焦虑、焦虑性疾病、焦虑相关行为和广泛性焦虑性疾病、惊恐性障碍、广场恐怖症、社交恐怖症、强制性障碍、外伤后应激反应障碍、急性应激反应障碍和DSM-IV中所列的那些惊恐性障碍及抑郁。如上文所记录的，使用本文描述的任何方法和组合物，Kv9.2亚基可用于诊断和/或治疗这些特定疾病中的任何一种疾病。具体地，我们设想使用核酸、包含Kv9.2核酸的载体、多肽，包括它们的同源物、变体或衍生物，药物组合物、宿主细胞和包含Kv9.2核酸和/或多肽的转基因动物，用于治疗或诊断上文列出的特定疾病。此外，我们设想在诊断或治疗上述特定疾病中，使用能够与Kv9.2相互作用或结合的化合物，优选地Kv9.2异数或同数离子通道的拮抗物，优选地能够调节离子通道的动力学或降低其传导性的化合物，Kv9.2亚基的抗体，以及制备或鉴别这些物质的方法。具体地，在生产用于治疗或预防特定疾病的疫苗中，我们使用这些化合物、组合物、分子等中的任何一种。我们还公开了用于检测个体特定疾病的诊断试剂盒。通过使用Kv9.2亚基鉴别这些或其他可治疗的或可诊断的具体疾病的联接定位(linkagemapping)方法是本领域已知的，也在本文的其它章节中描述。焦虑和应激反应焦虑和应激反应，以及有这种表现的障碍，包括Kv9.2相关疾病是本领域熟知的。概括描述如下焦虑和应激反应也称作情绪紧张、不安、神经过敏和忧惧。应激反应可来自使个体感觉沮丧、愤怒或担忧的任何情况或想法。对某个人产生压力的因素，对另一个人未必产生压力。焦虑是忧惧或恐惧情绪。这种不安情绪的来源不总是已知的或可识别的，它可增加个体感觉的痛苦。应激反应是正常生活的一部分。数量少时，应激反应可以是有益的——它可激励个体更加富有生产力。然而，过于紧张，或对于压力产生强烈的反应是有害的。这可使个体总体上身体不佳，并产生特定的生理或心理疾病，例如感染、心脏病、或抑郁。持续不断的应激反应常常导致焦虑和不健康的身体行为，例如过量饮食和酗酒或滥用药物。情感状态如悲痛或压抑，以及健康状况如甲状腺亢进、低血糖或心脏病发作也可引起应激反应。焦虑常常伴随着身体症状，包括颤搐或发抖、肌肉紧张、头痛、出汗、口腔干燥、吞咽困难、腹痛(这可以是应激反应的唯一症状，尤其在小孩中)。有时，伴随焦虑的还有其它症状头晕眼花，心率加快或不规则，呼吸急促，腹泻或频繁小便，疲劳，易怒，包括情绪失控、睡眠困难和做恶梦，注意力下降和性问题。Kv9.2及其调节子可用于治疗或减轻所有这些症状。焦虑障碍是一组涉及过分焦虑的精神疾病。它们包括广泛性焦虑性疾病、特殊恐怖症、强迫性障碍、和社交恐惧症。参见上文提出的Kv9.2相关疾病。某些药物，包括娱乐的和治疗的，由于它们的副作用或停止服用都可引起焦虑症状。这种药物包括咖啡因、酒精、尼古丁、感冒治疗药(coldremedies)、解充血药、用于哮喘的支气管扩张药、三环抗抑郁剂、可卡因、安非他明、减肥药、ADHD药物和甲状腺药物。我们公开Kv9.2及其调节子与这些药物结合使用的用途，以减轻它们的应激反应和/或焦虑诱导影响。贫乏的饮食也可造成应激反应或焦虑-例如，低水平的维生素B12。行为焦虑与特定条件有关，例如接受测试或进行公开演讲。外伤后应激反应障碍(PTSD)是一种应激反应障碍，它在外伤事件例如战争、身体或性攻击或自然灾难后产生。在非常罕见的情况下，肾上腺瘤(嗜铬细胞瘤)可以引起焦虑。其发生是由于负责焦虑感觉和症状的激素过量生产所致。(改编自MedlinePlus，http/www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003211.htm)Kv9.2亚基的同一性和相似性如通过编码人Kv9.2的扩增cDNA产物的测序结果显示，Kv9.2结构上与离子通道家族的其它蛋白相关。SEQIDNO1的cDNA序列包含一个可读框(SEQIDNO2，核苷酸41-3352)，该可读框编码SEQIDNO3中显示的1104个氨基酸的多肽。发现人Kv9.2定位于智人染色体8q22。使用pfam的HMM结构预测软件(http//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml)分析Kv9.2多肽(SEOIDNO3)证实Kv9.2肽是离子通道亚基。人Kv9.2亚基的小鼠同源物被克隆，其核酸序列和氨基酸序列分别显示为SEQIDNO4和SEQIDNO5。SEQIDNO4的小鼠Kv9.2亚基cDNA显示与人Kv9.2亚基(SEQIDNO2)序列具有高度的同一性，而小鼠Kv9.2亚基的氨基酸序列(SEQIDNO5)显示与人Kv9.2亚基(SEQIDNO3)具有高度的同一性和相似性。因此人和小鼠Kv9.2离子通道亚基是离子通道一个大家族的成员。Kv9.2亚基多肽如本文所使用的，术语“Kv9.2亚基多肽”是指包含显示为SEQIDNO3或SEQIDNO5的氨基酸序列，或其同源物、变体或衍生物的多肽。优选地，所述多肽包含或是以SEQIDNO3显示的序列的同源物、变体或衍生物。“多肽”是指包含通过肽键或修饰的肽键相互结合的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质，即肽同构物。“多肽”指短链，通常称作肽、寡肽或寡聚体，也指长链，通常称作蛋白质。多肽可包含20个编码基因的氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通过天然过程例如翻译后加工修饰的氨基酸序列，或通过本领域已知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这些修饰方法较好地描述于基础课本中，更详细地描述于专著中，在长篇的研究文献中也有描述。修饰可发生于多肽的任何区域，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解在给定的多肽中，相同类型的修饰可在相同位点或在几个位点以不同的程度存在。而且，给定多肽可包含多种类型的修饰。作为遍在蛋白化的结果，多肽可以是分支的；也可以是环状的，具有或不具有分支。环状、分支和分支环状多肽可产生自翻译后自然过程，或可通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价结合、亚铁血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂类或脂类衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、形成二硫键、脱甲基作用、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化作用、糖基化、GPI锚形成、羟基化作用、碘化作用、甲基化、豆蔻酰化、氧化作用、蛋白水解加工、磷酸化作用、异戊二烯化、外消旋化、selenoylation、硫酸盐化作用、转移-RNA介导的向蛋白质中增加氨基酸，例如精氨酰化和遍在蛋白化。参见，例如(Proteins-StructureandMolecularProperties，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman和Company，NewYork，1993和Wold，F.，PosttranslationalProteinModificationsPerspectivesandProspects，PosttranslationalCovalentModificationofProteins，B.C.Johnson中的1-12页，编辑，AcademicPress，NewYork，1983；Seifter等，“蛋白质修饰和非蛋白辅因子分析”，MethEnzymol(1990)182626-646和Rattan等，“蛋白合成翻译后修饰和老化”，AnnNYAcadSci(1992)66348-62。本文使用的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括对序列进行任何的取代、变异、修饰、代替、缺失或添加一个(或多个)氨基酸。除非上下文中认可其它含义，涉及到“Kv9.2”、“Kv9.2亚基”、“Kv9.2离子通道”包括提及Kv9.2的这种变体、同源物、衍生物和片段。优选地，当表达以形成同数通道或与其它Kv家族成员结合形成异数通道时，获得的氨基酸序列当应用于Kv9.2时具有离子通道活性。优选地，获得的核酸具有与SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的Kv9.2离子通道亚基相同的活性(或当与所指出的其它通道结合时活性的可能性)。特别地，当与所指出的其它通道结合时，如果获得的氨基酸序列具有离子通道活性，优选地Kv9.2离子通道活性，那么术语“同源物”涵盖结构和/或功能上的同一性。关于序列同一性(即相似性)，优选地具有至少70％，更优选地至少75％，更优选地至少85％，更优选地至少90％的序列同一性。更优选地具有至少95％、更优选地至少98％的序列同一性。这些术语还包括衍生自Kv9.2亚基核酸序列的等位变异的氨基酸的多肽。当涉及例如包含Kv9.的离子通道的离子通道的“通道活性”或“生物活性”时，这些术语是指包含Kv9.2的离子通道的代谢或生理机能，包括相似的活性或改进的活性或者具有减少的不良副作用的这些活性。还包括含有Kv9.2的离子通道的抗原和免疫原性活性。离子通道活性的实例，以及分析和定量这些活性的方法是本领域已知的，并在本文的其它章节中详细描述。如本文所使用的，“缺失”定义为在核苷酸或氨基酸序列中的变化，其中分别缺少一个或多个核苷酸或氨基酸残基。如本文所使用的，“插入”或“添加”是指当与天然产生的物质比较时，分别导致增加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸或氨基酸变化。如本文所使用的，“取代”分别是由不同的核苷酸或氨基酸代替一个或多个核苷酸或氨基酸产生的。本文描述的Kv9.2多肽也具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，这产生沉默改变并产生功能等同的氨基酸序列。有计划的氨基酸取代可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/两亲性特征等的相似性进行。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似的亲水性值、包含不带电极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。例如可依据下表进行保守取代。第二栏相同单元中的氨基酸、优选地在第三栏同一行中的氨基酸可相互取代。Kv9.2多肽可进一步包含异源氨基酸序列，典型地在N-末端或C-末端，优选地在N-末端。异源序列可包含影响细胞内或细胞外蛋白导向的序列(例如前导序列)。异源序列还可包括提高多肽的免疫原性和/或便于多肽鉴别、提取和/或纯化的序列。另一个异源序列特别优选的是多氨基酸序列，例如优选地N-末端的多组氨酸。至少10个氨基酸，较佳地至少17个氨基酸但少于50个氨基酸的多组氨酸序列是特别优选的。Kv9.2多肽可以是“成熟”蛋白的形式，或者可以是较大蛋白例如融合蛋白的一部分。包括含有分泌或前导序列、前序列、辅助纯化的序列(例如多组氨酸残基)的附加氨基酸序列，或者在重组生产过程中用于稳定的附加序列常常是有利的。通过重组方法，使用已知的技术方便地制备Kv9.2多肽。然而，也可通过合成方法，使用本领域熟练的技术人员已知的技术例如固相合成制备。这种多肽也可制成融合蛋白，例如以辅助提取和纯化。融合蛋白配偶体的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录活化功能域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体和感兴趣的蛋白序列之间包含蛋白水解酶切位点也是有利的，以允许除去融合蛋白序列，例如凝血酶酶切位点。优选地，融合蛋白不会阻碍感兴趣序列的蛋白功能。Kv9.2多肽可以是基本上分离的形式。这一术语是指通过人工从天然状态进行改造。如果“分离的”组合物或物质在自然状态下发生，它就已经从其最初的环境中被改变或除去，或者二者兼有。例如，天然存在于活动物体内的多核苷酸、核酸或多肽不是“分离的”，但是从其自然状态的共存原料中分离的相同的多核苷酸、核酸或多肽是分离的，如本文使用的术语。然而，应当理解Kv9.2离子通道蛋白可与不会干扰蛋白预期的效果的载体或稀释剂混合，并仍被认为是基本上分离的。这里描述的多肽还可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，它通常包含制品中的蛋白，其中制品中超过90％，例如95％、98％或99％的蛋白是Kv9.2多肽。我们进一步描述包含部分Kv9.2多肽的肽。因此，包括Kv9.2亚基的片段及其同源物、变体或衍生物。所述肽长度可以在2和200个氨基酸之间，优选地在4和40个氨基酸之间。所述肽可以衍生自本文公开的Kv9.2多肽，例如通过用适当的酶例如胰蛋白酶进行消化。换句话说，肽、片段等可以通过重组方法制备或合成方法合成。术语“肽”包括本领域已知的各种合成的肽的变异，例如retroinversoD肽。该肽可以是抗原决定子和/或T-细胞表位。该肽在体内可具有免疫原性。优选地，该肽能够在体内诱导中和抗体。通过对比来自不同物种的Kv9.2亚基序列，可以确定不同种类之间氨基酸序列的哪些区域是保守的(“同源区域”)，和不同种类之间哪些区域发生变化(“异源区域”)。因此，Kv9.2多肽可包含对应于至少部分的同源区域的序列。在至少两个物种之间同源区域显示高度的同源性。例如，使用上文描述的试验方法，同源区域在氨基酸水平上可显示至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％的同一性。如下文更为详细的阐述的，包含对应于同源区域的序列的肽可用于治疗策略。换句话说，Kv9.2亚基肽可包含对应于至少部分异源区域的序列。在至少两个物种之间，异源区域显示低水平的同源性。Kv9.2多核苷酸和核酸如在本文其它章节所进一步详细描述的，我们描述了Kv9.2多核苷酸、Kv9.2核苷酸和Kv9.2核酸、生产方法以及它们的用途等。术语“Kv9.2多核苷酸”、“Kv9.2核苷酸”和“Kv9.2核酸”可交替使用，是指包含SEQIDNOl、SEQIDNO2和SEQIDNO4显示的核酸序列的多核苷酸/核酸，或其同源物、变体或衍生物。优选地，多核苷酸/核酸包含或就是核酸序列SEQIDNO1或SEQIDNO2，最优选地SEQIDNO2的同源物、变体或衍生物。这些术语还包括能够编码多肽和/或肽(即Kv9.2多肽)的核酸序列。这样，Kv9.2多核苷酸和核酸具有能够编码包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，或其同源物、变体或衍生物。优选地，Kv9.2多核苷酸和核酸具有能够编码包含SEQIDNO3显示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，或其同源物、变体或衍生物。“多核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它们可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。无限制地，“多核苷酸”包括单-和双-链DNA，单链和双链区域混合的DNA，单链和双链RNA，和单链和双链区域混合的RNA，包含DNA和RNA的杂交分子，所述DNA和RNA可以是单链的，或更典型地，是双链的或单链和双链区域的混合物。此外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或者RNA和DNA都包含的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA和RNA，以及因稳定或其它原因主链被修饰的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括，例如三苯甲基化碱基和稀有碱基例如次黄苷。DNA和RNA进行了多种修饰；因此，“多核苷酸”包括在自然状况下典型发现的化学、酶促或代谢修饰形式的多核苷酸，以及病毒和细胞所特有的化学形式的DNA和RNA。“多核苷酸”还包含相对短的多核苷酸，常常称作寡核苷酸。本领域熟练的技术人员应当理解，遗传密码子简并的结果，使得许多核苷酸序列可编码相同的多肽。如本文所使用的，术语“核苷酸序列”是指核苷酸序列、寡核苷酸序列、多核苷酸序列及它们的变体、同源物、片段和衍生物(例如它们的部分)。核苷酸序列可以是基因组的或合成的或重组起源的DNA或RNA，它们可以是双链的或单链的，不论代表有义链或反义链或它们的组合。术语核酸序列可使用重组DNA技术制备(例如，重组DNA)。优选地，术语“核苷酸序列”指DNA。本文使用的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括对Kv9.2核苷酸序列的序列进行的任何取代、变异、修饰、替代、缺失或添加一个(或多个)核酸。除非上下文另外认可的，涉及到“Kv9.2”、“Kv9.2亚基”和“Kv9.2离子通道”包括提到的Kv9.2的这种变体、同源物、衍生物和片段。优选地，获得的核苷酸序列编码具有Kv9.2亚基活性的多肽，优选地至少具有与SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的Kv9.2亚基相同的活性。优选地，术语“同源物”是指关于结构和/或功能具有同一性。优选地，这样获得的核苷酸序列编码一种多肽，该多肽当被表达形成同数通道或与其它Kv家族成员结合形成异数通道时具有离子通道活性。关于序列同一性(即相似性)，优选地具有至少70％，更优选地至少75％，更优选地至少85％，更优选地至少90％的序列同一性。更优选地具有至少95％，更优选地至少98％的序列同一性。这些术语还包括序列的等位变异。序列同源性的计算关于本文提出的任何序列的序列同一性可通过对任何一个或多个序列与另一个序列进行简单的“眼球”比较(即一种严格比较)，以确定另一个序列与该序列是否具有例如至少70％的序列同一性。相对序列同一性还可通过商业购得的计算机程序进行测定，该程序可使用任何适合于测定同一性的算法(使用例如缺省参数)计算两个或多个序列之间的％同一性。这种计算机程序典型的例子是CLUSTAL。其它测定两个序列之间同一性和相似性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等1984NucleicAcidsResearch12387)和FASTA(Atschul等1990JMolecBiol403-410)。可计算邻接序列的％同源性，即一个序列与另一个序列进行序列对比，一个序列中的各个氨基酸与另一个序列中的相应的氨基酸直接比较，一次一个残基。这称作“无缺口”序列对比。典型地，这种无缺口序列对比仅对残基数量相对少的序列进行。尽管这是一个非常简单和一致的方法，但是它没有考虑到，例如在其它方面一样的序列对中，一个插入或缺失将引起随后的氨基酸残基排序混乱，这样当进行整体对比时，潜在地导致％同源性大大减少。因此，设计用于产生最佳序列对比的大多数序列对比方法考虑到可能的插入和缺失，而不过分对整个的同源性得分进行罚分。这通过在序列对比中插入“缺口”以设法最大化局部同源性完成。然而，这些更为复杂的方法分配“缺口惩罚”到序列对比中发生的各个缺口，因此，对于相同数量的同一性氨基酸，具有尽可能少的缺口地序列对比(在两个对照序列之间反映出较高的相关性)获得比具有许多缺口的序列更高的得分。典型地使用“亲族缺口代价(Affinegapcosts)”，对于缺口的存在它要求相对高的代价，对于缺口中各个随后的残基它要求较少的罚分。这是最常用的缺口评分系统。当然，高缺口惩罚将产生具有较少缺口的最佳的序列对比。大多数序列对比程序允许修改缺口罚分。然而，当使用这种序列对比软件时，使用默认值是优选的。例如，当使用GCGWisconsinBestfit软件包时，氨基酸序列的默认缺口罚分对于缺口是-12，对于各个延伸是-4。因此，考虑到缺口罚分，计算最大％同源性首先需要产生最佳的序列对比。进行这种序列对比的适当的计算机程序是GCGWisconsinBestfit软件包(UniversityofWisconsin，U.S.A.；Devereux等，1984，NucleicAcidsResearch12387)。可进行序列对比的其它软件的例子包括，但不限于BLAST软件包(Ausubel等，1999同上-18章)、FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和对比工具GENEWORKS组合(suit)。BLAST和FASTA对于脱机和联机搜索都是可用的(Ausubel等，1999同上，7-58到7-60)。尽管最终的％同源性可依据同一性测定，但是序列对比过程本身典型地不是基于全或无(all-or-nothing)成对比较。取而代之，通常使用分级(scaled)相似性评分矩阵，它基于化学相似性或进化距离对各个成对对比赋予评分。这种通常使用的矩阵的例子是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组的默认矩阵。GCGWisconsin程序通常使用公开的默认值或者提供的常规符号对照表。使用GCG软件包公开的默认值是优选的，或者在其它软件的情况下使用默认矩阵，例如BLOSUM62。采用BLAST算法将参数设为默认值是有利的。BLAST算法详细描述于http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blasthelp.html，本文引入作为参考。可定义并可在定义的默认参数上方便地设定搜索参数。优选地，当用BLAST评价时，“基本上同一”等同于用EXPECT值相匹配时至少约7、优选地至少约9和最优选地10或更多的序列。BLAST搜索中EXPECT的默认域值(threshold)通常是10。BLAST(基础局部比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool))是为程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx使用的试探性搜索算法；这些程序使用Karlin和Altschul统计方法(Karlin和Altschul1990，ProcNatl.Acad.Sci.USA872264-68；Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-7；参见http//www.ncbi.nih.gov/BLAST/blasthelp.html)并稍加改进显示它们的发现的重要性。BLAST程序适合于序列相似性搜索，例如鉴别查询序列的同源物。对于序列数据库相似性搜索的基本问题的讨论参见Altschul等(1994)NatureGenetics6119-129。在http//www.ncbi.nlm.njh.gov上可得到上述五种BLAST程序，进行下列作业blastp-将氨基酸查询序列与蛋白序列数据库比较；blastn-将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库比较；blastx-将核苷酸查询序列(两条链)的六-读框(six-frame)概念(conceptual)翻译产物与蛋白序列数据库比较；tblastn-将蛋白质查询序列与以全部六个读框(两条链)动态翻译的核苷酸序列数据库比较；tblastx-将核苷酸查询序列的六个读框翻译产物与核苷酸序列数据库的六个读框翻译产物比较。BLAST使用下列搜索参数直方图(HISTOGRAM)——显示各个搜索得分的直方图；缺省即为“是”(参见BLAST手册(BLASTManual)中的参数H)。描述(DESCRIPTIONS)——限制对报告给所指定的数字的配比序列的简短描述的数量；缺省限制为100个描述。(参见手册中的参数V)。预期(EXPECT)——报告针对数据库序列的配比的统计学显著性阈值；缺省值是10，因此根据Karlin和Altschul(1990)随机性模型，预期仅仅偶然地发现10配比。如果赋予配比的统计学显著性大于EXPECT阈值，该配比将不被报道。较低的EXPECT阈值更加严格，致使更少的随机配比被报告。分数值是可接受的(参见BLAST手册中的参数E)。截断(CUTOFF)——报告高得分片段对的截断得分。从EXPECT值计算缺省值(见上文)。仅当数据库序列的HSP的统计学显著性至少与得分等于CUTOFF值的独立的HSP一样高时，才报告数据库序列的HSP。较高的CUTOFF值更严格，致使较少随机配比被报告(参见BLAST手册中的参数S)。典型地，显著性阈值可使用EXPECT更直观地控制。序列对比(ALIGNMENTS)——限制数据库序列到为报告了高得分片段对(HSPs)所指定的数量；缺省限制是50。如果碰巧比这一数量更多的数据库序列满足报告的统计学显著性阈值(参见下面的EXPECT和CUTOFF)，仅报告显示最大统计学显著性的配比(参见BLAST手册中的参数B)。矩阵(MATRIX)——为BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX指定可交替使用的评分矩阵。缺省矩阵是BLOSUM62(Henikoff&Henikoff，1992)。有效的可替换的选择包括PAM40、PAMl20、PAM250和IDENTITY。没有可替换的评分矩阵用于BLASTN；在BLASTN请求中指定MATRIX指令返回出错反应。链(STRAND)——限定TBLASTN搜索至仅仅数据库序列的顶部或底部链；或者限定BLASTN、BLASTX或TBLASTX搜索仅至查询序列顶部或底部链上的读框。过滤(FILTER)——掩蔽如使用Wootton&Federhen(1993)ComputersandChemistry17149-163的SEG程序所测定的具有低组合复杂性的查询序列的片段，或者如使用Claverie&States(1993)ComputersandChemistry17191-201的XNU程序测定的由短周期性内部重复序列组成的片段，或者对于BLASTN使用TatusovandLipman的DUST程序(参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。过滤可从blast输出中除去统计学上显著但生物学上无意义的报告(例如针对共同的酸性-、碱性-或脯氨酸丰富的区域的查询结果)，留下可用于针对数据库序列进行特定配比的、查询序列中更具有生物学意义的区域。通过过滤程序发现的低复杂性序列在核苷酸序列中使用字母“N”代替(例如，“NNNNNNNNNNNNN”)，而在蛋白质序列中使用字母“X”代替低复杂性序列(例如“XXXXXXXXX”)。过滤仅用于查询序列(或其翻译产物)，不适用于数据库序列。对于BLASTN缺省过滤是DUST，对于其它程序是SEG。当在SWISS-PROT中应用于序列时，没有任何东西被SEG、XNU或二者掩蔽是正常的，所以不要期望过滤总能产生效果。此外，在某些情况下，序列完全被掩蔽，显示针对未过滤的查询序列报告的任何匹配的统计学显著性是令人怀疑的。NCBI-gi-除入藏登记和/或基因座名称外，在输出中引起NCBIgi标识符被显示。最优选地，序列对比使用http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上提供的简单BLAST搜索算法进行。在一些实施方案中，当测定序列同一性时不使用缺口罚分。杂交本文还包含能够与这里提出的序列杂交的核苷酸序列，或者其任何片断或衍生物，或者与上述任何物质的补体杂交的核苷酸序列。杂交是指“核酸链与补体链通过碱基配对结合的过程(CoombsJ(1994)DictionaryofBiotechnology，StocktonPress，NewYorkNY)以及如在DieffenbachCW和GSDveksler(1995，PCRPrimer，aLaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，PlainviewNY)中描述的以聚合酶链反应技术进行的扩增过程。如Berger和Kimmel(1987，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology，152卷，AcademicPress，SanDiegoCA)中所讲授的，杂交条件取决于核酸结合复合物的解链温度，并赋予如下文说明的讨论确定的“严格性”。能够与本文提出的核苷酸序列或者它们的补体选择性杂交的核苷酸序列，通常与本文提出的相应的核苷酸序列至少20，优选地至少25或30，例如至少40、60或100或更多连续核苷酸的区域具有至少70％，优选地至少75％，更优选地至少85％或90％，甚至更优选地至少95％或98％的同源性。优选的核苷酸序列将包含与SEQIDNO1，2或4同源的区域，优选地与其中一个序列具有至少70％、80％或90％和更优选地至少95％的同源性。术语“选择性杂交”是指用作探针的核苷酸序列在发现靶核苷酸序列与探针以显著高于背景的水平杂交的条件下使用。背景杂交可因其它核苷酸序列的存在而发生，例如在被筛选的cDNA或基因组DNA文库中。在这一事件中，背景是指由探针和基因组非特异性DNA成员之间相互作用产生的信号水平，该水平与用靶DNA观察到的特异性相互作用的强度相比小于10倍，优选地小于100倍。可测定相互作用的强度，例如通过放射性标记探针，例如用32P。在中度至最严格条件下能够与本文提出的核苷酸序列杂交的核苷酸序列也包括在本文范围内。如Berger和Kimmel(1987，GuidetoMolecularCloningTechniques，MethodsinEnzymology，152卷，AcademicPress，SanDiegoCA)中所讲授的，杂交条件取决于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，并赋予如下文说明的确定的“严格性”。最严格条件典型地发生在Tm-5℃(低于探针Tm5℃)；高严格条件低于Tm约5℃-10℃；中度严格条件低于Tm约10℃-20℃；低严格条件低于Tm约20℃-25℃。本领域熟练的技术人员应当理解，最严格杂交可用于鉴别或检测相同的核苷酸序列，而中度(或低)严格杂交可用于鉴别或检测相似或相关的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，我们描述了能够在严格条件下(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})与一个或多个Kv9.2亚基核苷酸序列杂交的核苷酸序列。当核苷酸序列是双链时，双螺旋的链，无论单独或者结合存在的都包括。当核苷酸序列是单链时，应当理解该核苷酸序列的互补序列也包括在本文的范围内。本文进一步描述了能够杂交与本文提出的序列互补的序列的核苷酸序列，或其片段或衍生物。同样地，包括这样的核苷酸序列，该序列与能够杂交本文描述的序列的序列互补。这些类型的核苷酸序列是变体核苷酸序列的例子。在这个方面，术语“变体”包括这样的序列，该序列互补于能够杂交本文提出的核苷酸序列的序列。但是，优选地，术语“变体”包括这样的序列，该序列互补于在严格条件下(例如65℃和0.1xSSC{1xSSC＝0.15MNaCl，0.015柠檬酸钠pH7.0})能够杂交本文提出的核苷酸序列的序列。克隆Kv9.2亚基和同源物我们进一步描述了互补于本文提出的序列的核苷酸序列，或其任何片段或衍生物。如果序列互补于它的片段，那么在其它有机体中该序列可用作鉴别和克隆相似亚基序列的探针。因此，本文公开的内容使从人和其它动物种类例如小鼠、猪、羊、等克隆Kv9.2、其同源物和其它结构或功能相关的基因能够完成。与包含于SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO4的核苷酸序列或其片段相同或基本相同的多核苷酸可用作cDNA和基因组DNA的杂交探针，以从适当的文库分离编码Kv9.2亚基的部分或全长cDNA和基因组克隆。这种探针还可以用于分离具有序列相似性、优选地与Kv9.2基因具有高度的序列相似性的其它基因的cDNA和基因组克隆(包括从人以外的动物种类编码同源物和直向同源物的基因)。杂交筛选、克隆和序列技术是本领域熟练的技术人员已知的，并描述于例如Sambrook等(见上文)。典型地，适合用作探针的核苷酸序列与指示物的核苷酸序列具有70％的同一性，优选地80％的同一性，更优选地90％的同一性，甚至更优选地95％的同一性。探针通常包含至少15个核苷酸。优选地，这种探针具有至少30个核苷酸，并可具有至少50个核苷酸。特别优选的探针的范围在150和500个核苷酸之间，更特别地约300个核苷酸。在一个实施方案中，为了获得编码Kv9.2多肽、包括来自人以外的其它动物种类的同源物和直向同源物的多核苷酸，进行的步骤包括用具有SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO4或其片段的标记探针在严格杂交条件下筛选适当的文库，和分离包含所述多核苷酸序列的部分或全长eDNA和基因组克隆。这种杂交技术是本领域熟练的技术人员已知的。严格杂交条件如上文所述，或者在另一种条件下42℃过夜培养，溶液中含有50％甲酰胺、5XSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5XDenhardt’s溶液、10％葡萄糖硫酸酯和20mg/ml变性、剪切的大麻哈鱼精子DNA，随后用0.1XSSC在约65℃下洗涤过滤器。含有离子通道的Kv9.2的功能分析通过序列分析或功能分析可检验克隆推定的Kv9.2离子通道多核苷酸。具体地，可检验如所描述的转染的非洲爪蟾卵母细胞(Xenopusoocytes)的传导力作为指示和量化Kv9.2活性的方法，用于下文描述的筛选分析。这种非洲爪蟾卵母细胞电生理学分析方便地称为“Kv9.2的功能分析(电生理学)”。可如下在“Kv9.2的功能分析(电生理学)”中分析推定的Kv9.2离子通道亚基或同源物的活性。依据标准程序用RNA聚合酶体外合成来自编码Kv9.2cDNA的线性化质粒模板的加帽的RNA转录物。体外转录物悬浮于终浓度为0.2mg/ml的水溶液中。从成年雌性蟾蜍中除去卵巢叶，获得阶段V的去囊泡卵母细胞，使用显微注射器具以50nl颗粒(bolus)注射RNA转录物(10ng/卵母细胞)。也可注射编码例如Kv2.1、Kv4.2的其它Kv亚基的RNA以形成异数通道。使用两个电极的电压钳测定个体非洲爪蟾卵母细胞对于激动剂暴露的反应的电流。在由NaCl115、KCl2.5、CaCl21.8、NaOH-HEPES10、pH7.2(单位为Mm)组成的标准介质中在室温下记录电流。如下文进一步详细描述的，非洲爪蟾系统也可用于筛选已知的配体和活化配体的组织/细胞提取物。其它的功能分析方法包括膜片钳电生理、Rb通量、荧光能量共振转移(FRET)分析和FLIPR分析，包括使用电压灵敏染料观察细胞的膜电压。FLIPR分析描述于Whiteaker等，JBiomolScreen.2001Oct；6(5)305-1，而基于FRET的分析描述于Falconer等，JBiomolScreen.2002Oct；7(5)460-5。具体地，我们公开了检测Rb通量的分析方法，以及检测Rb通量变化的筛选方法，以鉴别Kv9.2的激动剂和拮抗剂。测定放射性标记的Rb通量的方法概述于Rezazadeh等JBiomolScreen.2004Oct；9(7)588-97和非放射性标记Rb通量分析描述于AssayDrugDevTechnol.2004Oct；2(5)525-34。优选地，分析中测定％Rb外向流量。本文中这种功能分析被称作“Kv9.2功能分析(Rb通量)”。具体地，我们公开了一种方法，该方法中Kv9.2的拮抗剂降低了适当转染细胞的％Rb外向流量。优选地，在Kv9.2拮抗剂存在的情况下，％Rb外向流量降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。我们进一步公开了一种方法，其中Kv9.2的激动剂提高了适当转染细胞的％Rb外向流量。优选地，在Kv9.2激动剂存在的情况下，％Rb外向流量提高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。细胞释放的外向流量Rb+的动力学分析可使用如下方程表达为剩余百分数(percentageremaining)R＝[Rb溶解产物/(Rb上清液+Rb溶解产物)]×100在不同的时间点去极化作用和激动剂刺激的Rb+外向流量(RS)可根据如下方程确定RS＝(1-[(R总-R-R基数)/-R基数])×100可进一步分析Kv9.2多肽的动力学，包括活化、钝化和灭活。活化时间是完全电流在标准条件下穿过含有Kv9.2的离子通道而建立所花费的时间，钝化时间是在标准条件下完全电流达到零所用的时间。这里提出的调节、增加或降低Kv9.2动力学，优选地是指调节、增加或降低Kv9.2活化时间或Kv9.2钝化时间，或者二者都包括。在优选的实施方案中，活化时间常数用作活化时间的量度，钝化时间常数用作钝化时间的量度。典型的含有Kv9.2的离子通道的活化时间常数是21ms。典型的半灭活电压V1/2灭活是-33mV，V1/2灭活可分析作为灭活的其它或另一种动力学参数。调节剂，例如含有Kv9.2的离子通道的起始剂(opener)、激动剂、阻断剂和拮抗剂能够改变，例如增加或降低含有Kv9.2的离子通道的动力学，优选地活化时间、灭活时间、钝化时间、钝化动力学、半灭活电压等中任何一个或多个。具体地，激动剂和起始剂(opener)是能够降低活化时间和/或钝化时间的分子(优选地为活化时间和/或钝化时间常数)，优选地降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，即例如通过降低活化时间到20ms、18ms、16ms或15ms或更少。相似地，Kv9.2的拮抗剂或阻断剂能够增加活化时间和/或钝化时间，优选地增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，即例如通过提高活化时间到22ms、25ms、27ms或更多。动力学以及具体地活化时间可优选地使用“Kv9.2的功能分析(电生理学)”测定，取电流的时程并确定建立完全电流所用的时间。相似地，使用“Kv9.2的功能分析(电生理学)”测定灭活时间，取电流的时程并确定完全电流降至零时所用的时间。换句话说，可分析钝化动力学，该钝化动力学用于测定在前脉冲(例如+50MV持续500ms)后的复极化脉冲(例如到-40mV)后离子通道钝化所花费的时间。含有Kv9.2的离子通道的钝化动力学典型的值是44ms。Kv9.2的表达分析为了设计治疗Kv9.2相关疾病的有益的疗法，确定Kv9.2的表达概况是有用的(不论是野生型还是特殊的突变型)。因此，可使用本领域已知的方法测定表达Kv9.2的器官、组织和细胞类型(以及发育阶段)。例如，可进行常规或“电子”RNA印迹法。也可使用反转录酶PCR(RT-PCR)分析Kv9.2基因或突变体的表达。测定Kv9.2表达概括的更加灵敏的方法包括如本领域已知的RNA酶保护分析。RNA印迹分析是用于检测基因转录物存在的实验室技术，包括标记的核苷酸序列与结合了特定细胞类型或组织的RNA的膜杂交(Sambrook，见上文，第7章和Ausubel，F.M.等，见上文，4和16章)。适用于BLAST的模拟计算机技术(“电子RNA印迹”)可用于在例如GenBank或LIFESEQ数据库(IncytePharmaceuticals)的核苷酸数据库中查找相同或相关的分子。这种类型的分析具有优势，即它们可能比以多膜为基础的杂交快。此外，可修改计算机搜索的敏感性，以确定是否任何特定的匹配都被分类为恰当的或同源的。如本文其它章节所进一步详细描述的，本文描述的多核苷酸和多肽可用作发现治疗和诊断动物和人疾病的搜索试剂和材料。Kv9.2多肽的表达我们进一步公开了生产Kv9.2多肽的方法。所述方法通常包括在适当的条件下(即在表达Kv9.2多肽的条件下)培养宿主细胞，该宿主细胞含有编码具有或不具有其它Kv家族成员的Kv9.2多肽的核酸或其同源物、变体或衍生物。为了表达包含Kv9.2的生物活性离子通道，将编码Kv9.2亚基或其同源物、变体或衍生物的核苷酸序列插入适当的表达载体，即含有转录和翻译插入的编码序列所需元件的载体。用于构建含有编码Kv9.2亚基的序列以及适当的转录和翻译控制元件的表达载体的方法是本领域熟练的技术人员已知的。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。这些技术描述于Sambrook，J.等(1989；MolecularCloning，ALaboratoryManual，4、8和16-17章，ColdSpringHarborPress，Plainview，N.Y.)和Ausubel，F.M.等(1995和定期增刊；CurrentProtocolsinMolecularBiology，9、13和16章，JohnWiley&Sons，NewYork，N.Y.)。可利用各种表达载体/宿主系统包含和表达编码Kv9.2亚基的序列。它们包括，但不限于，微生物例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))或用细菌表达载体转化的植物细胞系统(例如，Ti或pBR322质粒)；或动物细胞系统。这种用途不为采用的宿主细胞所限制。“控制元件”或“调节元件”是载体的那些非翻译区域(例如增强子、启动子和5’和3’不翻译区域)，它们与宿主细胞蛋白相互作用进行转录和翻译。这些元件可长度和特异性不同。根据所利用的载体系统和宿主，可使用任何数量的适当的转录和翻译元件，包括组成型和可诱导的启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可使用可诱导的启动子，例如BLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，LaJolla，Calif.)或PSPORT1质粒(GIBCO/BRL)的杂合lacZ启动子等。杆状病毒多角体蛋白启动子可用于昆虫细胞。衍生自植物细胞基因组(例如热休克、RUBISCO和贮藏蛋白基因)或植物病毒(例如病毒启动子或前导序列)的启动子或增强子可克隆进入载体。在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子是优选的。如果需要生产含有编码Kv9.2亚基的多拷贝序列的细胞系，可使用具有适当的选择性标记、基于SV40或EBV的载体。在细菌系统中，根据Kv9.2亚基的用途可选择许多表达载体。例如，当诱导抗体需要大量Kv9.2亚基时，可使用指导易于纯化的融合蛋白高水平表达的载体。这种载体包括，但不限于，多功能E.coli克隆和表达载体例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码Kv9.2亚基的序列连接到载体具有氨基末端Met和随后β-半乳糖苷酶的7个残基的序列的读框中，这样杂合蛋白产生，pIN载体(VanHeeke，G.和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)等。pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)也可用于表达外源多肽为具有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这种融合蛋白是可溶的，并通过吸附到谷胱苷肽-琼脂糖玻珠上并在游离谷胱甘肽存在的条件下洗提容易地从溶解细胞中纯化。可设计用这种系统制备的蛋白质以包含肝素、凝血酶或XA因子蛋白酶酶切位点，这样克隆的感兴趣的多肽可任意从GST部分释放。在酿酒酵母中，可使用许多含有组成型或诱导型启动子的载体，例如α因子、醇氧化酶和PGH。关于综述参见Ausubel(见上文)和Grant等(1987；MethodsEnzymol.153516-544)。在使用植物表达载体的情况下，编码Kv9.2亚基的序列的表达可由许多启动子中的任何一个驱动。例如，病毒启动子如CaMV的35S和19S启动子可单独或与来自TMV的ω前导序列结合使用(Takamatsu，N.(1987)EMBOJ.6307-311)。另外，可使用植物启动子例如RUBISCO的小亚基或热休克启动子(Coruzzi，G.等(1984)EMBOJ.31671-1680；Broglie，R.等(1984)Science224838-843；和Winter，J.等(1991)ResultsProbl.CellDiffer.1785-105)。这些构建物可通过直接DNA转化或病原介导的转化引入植物细胞。这种技术描述于大量可普遍获得的综述中(参见，例如Hobbs，S.或Murry，L.E.，McGrawHillYearbookofScienceandTechnology(1992)McGrawHill，NewYork，N.Y.；191-196页)。昆虫系统也可用于表达Kv9.2亚基。例如，在一个这样的系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)用作载体以在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。编码Kv9.2亚基的序列可克隆进入病毒的非必需区，例如多角体蛋白基因，并在多角体蛋白启动子的控制下。Kv9.2亚基的成功插入致使多角体蛋白基因失活，并产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。然后重组病毒可用于感染，例如草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，其中包含Kv9.2的离子通道可被表达(Engelhard，E.K.等(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.913224-3227)。在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多以病毒基础的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，编码Kv9.2亚基的序列可连接进入由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。在病毒基因组的非必需E1和E3区域插入可用于获得能够在感染的宿主细胞中表达Kv9.2亚基的活病毒(Logan，J.和T.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.813655-3659.)。此外，转录增强子，例如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子，可用于在哺乳动物宿主细胞中提高表达。因此，例如，含有Kv9.2的离子通道在人胚胎肾3(HEK293)细胞或者粘着的CHO细胞中表达。为了使离子通道的表达最大化，典型地在插入pCDN或pCDNA3载体之前，从受体cDNA中除去所有5’和3’非翻译区(UTR)。通过脂转染用单独的离子通道cDNA转染细胞，并在400mg/mlG418存在的情况下选择。选择3周后，收集单个克隆，并扩展用于进一步的分析。仅用载体转染的HEK293或CHO用作负对照。为了分离稳定表达单个离子通道的细胞系，典型地选择约24个克隆，并通过RNA印迹进行分析。在分析的G418-抗性克隆的约50％中通常检测通道mRNA。还可使用人的人工染色体(HAC)，传递比可包含并在质粒中表达的DNA片段大的DNA片段。为了治疗的目的构建约6kb到10Mb的HAC并通过常规输送方法(脂质体、聚阳离子氨基聚合物或小泡)传递。也可使用特定的起始信号，以更为有效地翻译编码Kv9.2亚基的序列。这种信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在编码Kv9.2亚基的序列及其起始密码子和上游序列插入适当的表达载体的情况下，不需要额外的转录或翻译控制信号。然而，仅插入编码序列或其片段的情况下，应提供包含ATG起始密码子的外源翻译控制信号。此外，起始密码子应位于恰当的读框中，以确保全部插入序列的翻译。外源翻译因子和起始密码子可具有各种起源，包括天然的和合成的。如文献中所描述的，表达效率可通过包含适合于所使用的具体细胞系统的增强子提高(Scharf，D.等(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20125-162)。此外，依据调节插入序列的表达或以所欲的形式加工表达蛋白的能力可选择宿主细胞株。多肽的这种修饰包括，但不限于，乙酰化作用、羧化作用、糖基化作用、磷酸化作用、脂化作用和酰化作用。酶切蛋白的“前原”(prepro)形式的翻译后加工也可用于促进正确的插入、折叠和/或功能。对于翻译后的活性具有特定的细胞结构和特有的机制的不同的宿主细胞(例如CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38)购自AmericanTypeCultureCollection(ATCC，Bethesda，Md.)，并可进行选择，以确保恰当地修饰和加工外源蛋白。为了长期高产重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，能够稳定表达Kv9.2同数或异数离子通道的细胞系可使用这样的表达载体转化，该表达载体在相同或不同的载体上可包含病毒的复制起点和/或内源表达元件以及可选择的标记基因。引入载体后，在改换成选择性培养基前，可将细胞在富集培养基中培育约1-2天。可选择的标记的目的是赋予对选择的抗性，且它的存在允许成功表达引入序列的细胞的生长和回收。稳定转化细胞的抗性克隆可使用适合这一细胞类型的组织培养技术增殖。可使用任何数量的选择系统回收转化的细胞系。这些系统包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler，M.等(1977)Cell11223-32)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Lowy，I.等(1980)Cell22817-23)，它们可分别在tk-或apr-细胞中使用。并且，抗代谢物、抗生素或除草剂抗性可用作选择的基础。例如，dhfr赋予氨甲喋呤抗性(Wigler，M.等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.773567-70)；npt赋予氨基糖苷新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin，F.等(1981)J.Mol.Biol.1501-14)；als或pat分别赋予chlorsulfuron和膦丝菌素乙酰基转移酶抗性(Murry，见上文)。已描述了其它可选择的基因，例如trpB，它允许细胞代替色氨酸利用吲哚，或hisD，它允许细胞代替组氨酸利用histinol(Hartman，S.C.和R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51.)。最近，可见标记的使用得到了普及，这种标记例如花色素苷、β-葡糖酸苷酶及其底物GUS和荧光素酶及其底物虫荧光素。这种标记不仅可用于鉴别转化体，还可用于确定归因于特定载体系统的瞬时或稳定蛋白质表达的量(Rhodes，C.A.等(1995)MethodsMol.Biol.55121-131)。尽管标记基因表达的存在或缺乏表明感兴趣的基因也存在，基因的存在和表达需要确定。例如，如果编码Kv9.2亚基的序列插入标记基因序列内部，可通过标记基因功能的缺失鉴别包含编码Kv9.2亚基的序列的转化的细胞。另外，标记基因可在单个启动子的控制下与编码Kv9.2亚基的序列串联排列。响应诱导或选择的标记基因的表达通常也显示串联基因的表达。此外，包含编码Kv9.2亚基的核苷酸序列并表达Kv9.2亚基的宿主细胞可通过各种本领域熟练的技术人员已知的方法鉴别。这些方法包括但不限于，DNA-DNA、DNA-RNA杂交以及蛋白质生物测定或免疫测定技术，它包括用于检测和、或定量核苷酸或蛋白序列的以膜、溶液或芯片为基础的技术。编码Kv9.2亚基的多核苷酸序列的存在可通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交或使用探针或片段或编码Kv9.2亚基的多核苷酸的片段扩增进行检测。以核酸扩增为基础的分析涉及使用基于编码Kv9.2亚基的序列的寡核苷酸或寡聚体检测包含编码Kv9.2亚基的DNA或RNA的转化体。使用特异于蛋白质的多克隆或单克隆抗体，检测和测定Kv9.2亚基的表达的各种方法是本领域已知的。这种技术的实施例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。利用与Kv9.2亚基上的两个无干扰表位反应的单克隆抗体的两位点、单克隆基础的免疫测定是优选的，但也可使用竞争结合测定。本领域详细描述了这些和其它测定方法，例如在Hampton，R.等(1990；SerologicalMethods，aLaboratoryManual，SectionIV，APSPress，StPaul，Minn.)的Maddox，D.E.等(1983；J.Exp.Med.1581211-1216)中。各种标记和结合技术是本领域熟练的技术人员已知的，并可用于各种核酸和氨基酸测定。生产用于检测与编码Kv9.2亚基的多核苷酸相关的序列的标记杂交或PCR探针的方法包括寡标记、切口平移、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。另外，编码Kv9.2亚基的序列或其任何片段可克隆进入载体，生产mRNA探针。这种载体是本领域已知的，商业购得，并可通过添加适当的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6和标记核苷酸用于体外合成RNA探针。这些方法可使用各种商业购得的试剂盒进行，例如Pharmacia&Upjohn(Kalamazoo，Mich.)、Promega(Madison，Wis.)和U.S.BiochemicalCorp.(Cleveland，Ohio)提供的试剂盒。可用于方便检测的适当的报道分子或标记物包括放射性核素、酶、荧光的、化学发光的或显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。用编码Kv9.2亚基的核苷酸序列转化的宿主细胞可在适合于从细胞培养物中表达和回收蛋白的条件下培养。根据所用的序列和/或载体，由转化细胞生产的蛋白质可位于细胞膜，分泌或包含于细胞内。本领域的技术人员应当理解，可设计包含编码Kv9.2亚基的多核苷酸的表达载体以含有指导Kv9.2亚基通过原核或真核生物细胞膜分泌的信号序列。其它构建物可用于连接编码Kv9.2亚基的序列与编码促进可溶蛋白纯化的多肽功能域的核苷酸序列。这种促进纯化的功能域包括但不限于金属螯合肽，例如允许在固定化金属上纯化的组氨酸-色氨酸组件，允许在固定化免疫球蛋白上纯化的蛋白A功能域；以及在FLAGS延伸/亲和纯化系统中使用的功能域(ImmunexCorp.，Seattle，Wash.)。在纯化功能域和Kv9.2亚基编码序列之间包含可酶切的接头序列，例如特异于因子XA或肠激酶的接头序列(Invitrogen，SanDiego，Calif.)可用于促进纯化。一个这样的表达载体用于表达包含Kv9.2亚基的融合蛋白以及在硫氧还蛋白或肠激酶酶切位点前编码6个组氨酸残基的核酸。组氨酸残基促进在固定化金属离子亲和层析上的纯化(IMIAC；描述于Porath，J.等(1992)Prot.Exp.Purif.3263-281)，而肠激酶酶切位点提供了从融合蛋白纯化Kv9.2亚基的方法。包含融合蛋白的载体的讨论描述于Kroll，D.J.等(1993；DNACellBiol.12441-453)中。Kv9.2亚基的片段不仅可通过重组技术生产，还可通过使用固相技术直接进行肽的合成(MerrifieldJ.(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154)。蛋白质合成可通过手工技术或自动控制进行。自动合成可例如使用AppliedBiosystems431A肽合成仪(PerkinElmer)完成。Kv9.2亚基的各个片段可单独合成，然后结合产生全长分子。生物传感器Kv9.2多肽、核酸、探针、抗体、表达载体和配体作为生物传感器(以及对于生物传感器的生产)是有用的。依据Aizawa(1988)，Anal.Chem.Symp.17683，生物传感器被定义为用于分子识别的靶的独特组合，例如具有固定化抗体或例如Kv9.2的通道的选择性层，以及用于传递测定值的转导器。一组这样的生物传感器将检测由于通道与周围介质相互作用引起的表层光学特性的改变。这种技术中特别提及的是椭圆对称法和表面胞质基因共振。结合Kv9.2的生物传感器可用于检测Kv9.2配体的存在或水平。这种生物传感器的构建是本领域已知的。因此，表达Kv9.2的细胞系可用作报道基因系统，通过受体-促进形成[3H]肌醇磷酸或其它第二信使检测配体例如ATP(Watt等，1998，JBiolChem5月29；273(22)14053-8)。受体-配体生物传感器还描述于Hoffman等2000，ProcNatlAcadSciUSAOct10；97(21)11215-20。包含Kv9.2的光学和其它生物传感器也可用于检测与G-蛋白和其它蛋白相互作用的水平和存在，如由例如Figler等，1997，BiochemistryDec23；36(51)16288-99和Sarrio等，2000，MolCellBiol2000Jul；20(14)5164-74)描述的。生物传感器的传感器单元描述于例如US5,492,840。筛选分析Kv9.2多肽，包括同源物、变体和衍生物，不论是天然的还是重组的，可用于筛选与Kv9.2亚基或者包含Kv9.2的离子通道结合的化合物的过程，该化合物活化(激动剂)或抑制Kv9.2的活化(拮抗剂或阻断剂)。因此，这种多肽还可用于在例如细胞、无细胞制剂、化学文库和天然产物混合物中评估小分子底物与配体的结合。这些底物和配体可以是天然底物和配体，或者可以是结构或功能模拟物质。参见Coligan等，CurrentProtocolsinImmunology1(2)第5章(1991)。Kv9.2离子通道多肽负责多种生物学功能，包括多种病理学。因此，希望找到一方面刺激包含Kv9.2的离子通道，另一方面可抑制Kv9.2离子通道功能的化合物和药物。对于例如焦虑、应激反应、抑郁或糖尿病等病症通常将激动剂和拮抗剂用于治疗和预防目的。合理设计可能能够与Kv9.2离子通道蛋白相互作用的候选化合物可基于多肽分子形状的结构研究。一种确定哪个位点与特定的其它蛋白相互作用的方法是物理结构测定，例如X-射线晶体学或二维NMR技术。这些技术对于确定哪些氨基酸残基形成分子接触区提供指导。关于蛋白质结构测定的详细描述参见例如Blundell和Johnson(1976)ProteinCrystallography，AcademicPress，NewYork。另一种合理设计使用一种筛选方法，该方法通常涉及生产在细胞表面表达Kv9.2离子通道多肽的适当的细胞。这种细胞包括来自动物、酵母、果蝇(Drosophila)或E.coli的细胞。然后表达Kv9.2的细胞(或包含表达蛋白的细胞膜)与测试化合物接触，观察结合或者功能反应的刺激或抑制。例如可将Kv9.2mRNA或多肽注入非洲爪蟾卵母细胞，如其它章节进一步详细描述的，通过使用电压钳测定检测因与测试化合物接触诱导的电流。除用Kv9.2亚基或包含Kv9.2的离子通道分别检测各个候选化合物外，可有利地生产和筛选候选配体的文库或库(bank)。因此，例如装配了超过200个推定的配体库用于筛选。该库包含递质、激素和已知通过离子通道发生作用的趋化因子；天然发生的化合物，该化合物可以是推定的离子通道激动剂，非哺乳动物的、尚未鉴别到其哺乳动物副本的生物活性肽；以及在自然界没有发现的化合物，但它用未知的天然配体激活离子通道。使用功能(例如Rb通量测定、FRET测定、FLIPR测定、完全细胞电生理学、卵母细胞电生理学，参见其它章节)以及其它章节进一步详细描述的结合测定，将该文库用于筛选Kv9.2亚基或包含Kv9.2的离子通道的已知配体。然而存在的大量的哺乳动物离子通道，迄今为止，对其没有任何相关的活化配体(激动剂)或钝化配体(拮抗剂)。因而，这些受体的活化配体不包含在目前鉴别的配体库中。因此，还可针对组织提取物功能筛选Kv9.2(使用卵母细胞电生理学等功能筛选)来鉴别天然配体。可将产生正功能反应的提取物继续分级分离，用本文描述的方法测定级份，直到将活化的配体分离和鉴别出来。另一种方法涉及通过测定包含Kv9.2的离子通道的抑制或刺激筛选离子通道抑制剂。这种方法包括或者单独用Kv9.2亚基转染真核细胞以形成同数通道，或者用其它Kv通道亚基转染真核细胞以形成异数通道，而在细胞表面表达离子通道。然后在包含Kv9.2的离子通道的存在的情况下将该细胞与潜在的拮抗剂接触。可使用完全细胞电生理学检验该细胞，以测定电流传导或动力学的改变。检测Kv9.2激动剂或拮抗剂的另一种方法是如美国专利5,482,835中描述的以酵母为基础的技术，该专利本文引入作为参考。在一个优选的实施方案中，筛选采用检测传导的改变来筛选Kv9.2的激动剂和拮抗剂。具体地，我们公开了一种方法，其中Kv9.2的拮抗剂降低适当转染的细胞的传导性。优选地，在Kv9.2的拮抗剂存在的情况下传导性降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。优选地，在Kv9.2的拮抗剂存在的情况下传导性降低了1pS、2pS、3pS、4pS、5pS、10pS、15pS、25pS、35pS、45pS、60pS、70pS或更多。我们还公开了一种方法，其中Kv9.2的激动机提高适当转染的细胞的传导性。优选地，在Kv9.2的激动剂存在的情况下传导性提高了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。优选地，在Kv9.2的激动剂存在的情况下传导性提高了1pS、2pS、3pS、4pS、5pS、10pS、15pS、25pS、35pS、45pS、60pS、70pS或更多。在另一个优选的实施方案中，筛选采用检测放射性标记的Rb通量，优选地％Rb通量的变化来筛选Kv9.2的激动剂和拮抗剂。优选地，筛选采用上文“Kv9.2的功能测定(Rb通量)”(FunctionalAssayofKv9.2(Rbflux))题目下描述的功能测定进行。具体地，我们公开了一种方法，其中，Kv9.2的拮抗剂降低了适当转染的细胞的％Rb外向通量(efflux)。优选地，在Kv9.2的拮抗剂存在的情况下％Rb外向通量降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。我们进一步公开了一种方法，其中Kv9.2的激动剂提高了适当转染的细胞的％Rb外向通量。优选地，在Kv9.2的激动剂存在的情况下％Rb外向通量提高了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更多。当候选化合物是蛋白质时，具体地是抗体或肽，候选化合物的文库可使用噬菌体展示技术筛选。噬菌体展示是一种利用重组噬菌体的分子筛选方法。该技术包括用编码来自候选化合物文库的一种化合物的基因转化噬菌体，这样各个噬菌体或噬菌粒表达具体的候选化合物。转化的噬菌体(它优选地粘附在固相支持体上)表达适当的候选化合物，并在其噬菌体外壳上展示它。能够与Kv9.2多肽或肽结合的具体候选化合物通过基于亲和作用的选择策略富集。然后表征成功的候选试剂。噬菌体展示具有优于标准亲和配体筛选技术的优势。噬菌体表面显示三维构象的候选试剂，更类似于其天然发生的构象。这允许为了筛选的目的更专一和更高亲和性的结合。筛选化合物文库的另一种方法利用真核或原核宿主细胞，该细胞用表达化合物文库的重组DNA分子稳定转化。这种细胞，或者是活的或者以固定的形式，可用于标准结合配偶体测定。参见Parce等(1989)Science246243-247；和Owicki等(1990)Proc.Nat’lAcad.Sci.USA87；4007-4011，它描述了检测细胞反应的敏感方法。竞争性测定特别有用，这里表达化合物文库的细胞与已知结合Kv9.2多肽的标记抗体(例如125I-抗体)和检验样品接触或培养，所述检测样品例如其与结合组合物的结合亲和性被测定的候选化合物。然后分离多肽的结合和游离标记结合配偶体以评估结合的程度。结合的检验样品的量与结合多肽的标记抗体的量成反比。众多技术中的任何一种可用于将结合的和游离的结合配偶体分离，以评估结合的程度。这一分离步骤可典型地包括如下过程，例如附着于过滤器随后洗涤，附着于塑料随后洗涤，或细胞膜离心。另一种方法是使用溶解的、未纯化的或溶解纯化的多肽或肽，例如从转化的真核或原核宿主细胞提取的多肽或肽。这允许具有提高了特异性、自动控制能力和高药物检测生产率的优势的“分子”结合测定。另一种候选化合物筛选技术包括一种方法，该方法对于例如对Kv9.2多肽具有适当的结合亲和性的新化合物提供高生产率的筛选，它详细描述于国际专利申请WO84/03564(CommonwealthSerumLabs.)，发表于1984年9月13日。首先，在固相底物例如塑料别针和一些其它的适当的表面上合成大量不同的小肽测验化合物，参见Fodor等(1991)。然后所有的塑料针与溶解的Kv9.2多肽反应并洗涤。下一步包括检测结合的多肽。这样鉴别出与多肽特异性相互作用的化合物。配体结合测定提供了确定药理学的直接方法，并适合于高生产率的形式。可将纯化的配体放射性标记到高比活性(50-2000Ci/mmol)用于结合研究。然后确定放射性标记的过程没有减少配体对其靶的活性。使缓冲剂、离子、pH和其它调节子例如核苷酸的测定条件最优化，以建立对于膜和完全细胞受体或离子通道来源的噪声比率可使用的信号。对于这些测定，特异性结合定义为总相关放射性减去过量的未标记竞争配体存在的情况下测定的放射性。可能的情况下，使用一个以上的竞争配体确定剩余的非特异性结合。该测定可简单地测试候选化合物的结合，其中与具有受体或离子通道的细胞的粘附可通过与候选化合物直接或间接有关的标记的方法，或者在涉及与标记竞争者的竞争的分析中检测。此外，这些测定可使用适合于在它们的表面具有靶子的细胞的检测系统，检测该候选化合物是否导致通过活化靶子产生的信号。活化抑制剂通常在已知激动剂存在的情况下测定，并在观察候选化合物存在的情况下激动剂对活化的影响。此外，该测定可简单的包含如下步骤，将候选化合物与含有Kv9.2多肽的溶液混合形成混合物，测定混合物中含有Kv9.2的离子通道活性，并将混合物的Kv9.2离子通道活性与标准进行比较。Kv9.2亚基cDNA、蛋白和蛋白的抗体也可用于构型测定，来检测添加的化合物对细胞中Kv9.2亚基mRNA和蛋白质生产的影响。例如，使用单克隆和多克隆抗体通过本领域已知的标准方法构建ELISA，以测定Kv9.2亚基蛋白分泌的或细胞相关水平，这可用于从适当操纵的细胞或组织中发现可抑制或增强Kv9.2亚基生产的试剂(分别称作激动剂或拮抗剂)。进行筛选测定的标准方法是本领域熟知的。潜在的Kv9.2离子通道拮抗剂和阻断剂的例子包括抗体或者，在某些情况下，核苷酸及其同源物，包括嘌呤和嘌呤同源物、与含有Kv9.2的离子通道的配体紧密相关的寡核苷酸或蛋白质，例如配体片段或与离子通道结合但不引起反应的小分子，这样阻止了通道的活性。我们因此还提供了能够特异性结合Kv9.2多肽和/或肽的化合物。术语“化合物”是指化学化合物(天然发生的或合成的)，例如生物大分子(例如，核酸、蛋白、非肽或有机分子)，或由生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(具体是哺乳动物)细胞或组织制备的提取物，甚至是无机成分或分子。优选的化合物是抗体。进行这种筛选所需的材料可包装到筛选试剂盒。这种筛选试剂盒用于鉴别Kv9.2多肽的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶等降低或加强Kv9.2离子通道多肽的生产的化合物。所述筛选试剂盒包括(a)aKv9.2多肽；(b)表达Kv9.2多肽的重组细胞；(c)表达Kv9.2多肽的细胞膜；或(d)Kv9.2多肽的抗体。筛选试剂盒可任选的包含使用说明书。转基因动物我们进一步公开了与正常的表达水平相比能够以正常、提高或降低的水平表达天然或重组Kv9.2亚基和/或含Kv9.2的离子通道或同源物、变体或衍生物的转基因动物。优选地，这种转基因动物是非人哺乳动物，例如猪、羊或啮齿动物。最优选的转基因动物是小鼠或大鼠。我们公开的转基因动物，其中全部或部分天然Kv9.2基因由来自另一个有机体的Kv9.2序列所取代。优选地该有机体是另一个物种，最优选的是人。在特别优选的实施方案中，我们公开了其整个Kv9.2基因基本上都由人Kv9.2基因取代的小鼠。这种转基因动物以及Kv9.2野生型动物可用于筛选Kv9.2的激动剂和/或拮抗剂。例如，这种测定可包括将野生型或转基因动物或其部分，优选地是转基因动物的细胞、组织或器官与候选物质接触，测定Kv9.2相关表现型，例如焦虑或血糖水平下降。还可进行采用衍生自相关动物的细胞的以细胞为基础的筛选并测定对传导性或动力学的影响。我们进一步公开了包含功能遭到破坏的Kv9.2基因的转基因动物，其中本文中公开的Kv9.2的任何一个或多个功能部分或全部消除。本文包括转基因动物(“Kv9.2敲除”动物)，所述转基因动物由于Kv9.2基因的一个或多个丧失功能的突变，包括缺失，不表达包含离子通道的功能Kv9.2。本文还包括功能部分丧失的突变体，例如未完全敲除的，它可例如在Kv9.2基因经选择的部分中具有缺失。这种动物可通过选择性替代或缺失相关的Kv9.2序列部分(例如具有重要功能的蛋白质区域)产生。这种全部或部分丧失功能的突变体用作Kv9.2相关疾病的模型，具体是焦虑和糖尿病。显示功能部分损失的动物可与候选物质接触以鉴别增强表现型的物质，也就是说，增加(在Kv9.2的情况下)痛觉减退或观察到的减少应激反应水平表现型。其它参数例如传导性或动力学的减少也可使用本文其它章节的鉴别方法检测。部分和全部敲除也可用于鉴别Kv9.2的选择性激动剂和/或拮抗剂。例如，激动剂和/或拮抗剂可给予野生型和Kv9.2缺陷的动物(敲除的)。将看到Kv9.2的选择性激动剂或拮抗剂对野生型动物有影响，而在Kv9.2缺陷的动物中没有。详细地，设计特异性分析以评价潜在的药物(候选配体或化合物)来确定该药物在包含Kv9.2的离子通道缺陷的情况下它是否产生生理反应。这可通过如上文讨论的给予转基因动物药物然后分析动物的具体反应来完成。也可进行类似的以细胞为基础的方法，该方法采用衍生自相关动物的细胞并测定对传导性或动力学的作用。这种动物还可用于检测通过本文描述的筛选方法鉴别的药物的功效。在另一个实施方案中，将具有部分功能丧失表现型的转基因动物用于筛选。在这样一个实施方案中，筛选可包括分析向野生型表现型的部分或全部恢复或逆转。也可进行使用衍生自相关动物的细胞并测定对传导性或动力学的作用的细胞基础的筛选。发现能够这样的候选化合物可被认做Kv9.2激动剂或类似物。这种激动剂可用于例如提高血糖水平，或者降低个体的应激反应或焦虑水平。在优选的实施方案中，转基因Kv9.2动物，具体是Kv9.2敲除动物(功能完全丧失)，显示实施例中提出的表现型，优选地如本文提出的检验所测定的。因此，Kv9.2动物，具体是Kv9.2敲除动物优选地显示任何一个或多个下列特征血糖水平下降，焦虑增加。在特别优选的实施方案中，当与相应的野生型小鼠比较时，转基因Kv9.2动物，具体是Kv9.2敲除动物，显示至少10％，优选地至少20％，更优选地至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％更高或较低的(根据具体情况而定)测定参数。因此，例如，当与野生型小鼠比较时，使用实施例中提出的旷场分析检测，Kv9.2缺陷小鼠优选地具有统计学上提高的固定性，或减少的移动时间和/或提高的外周持久(permanance)时间。还可见整个移动距离的减少。显然，现在公开的Kv9.2缺陷的转基因动物的表现型可有效地用于使用野生型动物的筛选，以检测引起与Kv9.2功能丧失相似的作用的化合物。换句话说，野生型动物可与候选化合物接触，观察到的相应Kv9.2表现型的改变，例如焦虑水平、血液葡萄糖水平等，用来鉴别Kv9.2功能的调节子，具体的是拮抗剂。使用本文其它章节的鉴别方法也可检测细胞的表现型，例如传导性下降或动力学的改变或降低。通过这种筛选鉴别的化合物可用作Kv9.2的拮抗剂，例如用作止痛药或应激反应缓解药，特别是用于治疗或缓解Kv9.2相关疾病。上文描述的筛选可涉及观察任一适当的参数，例如行为、生理或生化反应。优选的反应包括生理反应，并可包括一个或多个下列特征疾病抗性的改变；炎症反应的改变；肿瘤易感性的改变血压改变；新血管形成；饮食行为的改变；体重改变；骨密度改变；体温的改变；胰岛素分泌；促性腺激素分泌；鼻和支气管分泌；血管收缩；记忆丧失；焦虑；焦虑状态的改变；反射减退或反射亢进；或应激反应。还可使用生化参数，例如传导性或动力学的变化。优选地，传导性使用“Kv9.2的功能测定(电生理学)”测定，动力学(活化和/或钝化时间，优选地活化时间和/或钝化时间常数)如该部分中描述的方法测定。这在以细胞为基础的筛选中特别有用。在优选的实施方案中，与Kv9.2激动剂接触的细胞的传导性(例如野生型或功能部分丧失的细胞)提高至少10％，优选地至少20％，更优选地至少+30％，更优选地至少40％，更优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％。在优选的实施方案中，使用本文中其它章节描述的“Kv9.2的功能测定(电生理学)”测定传导性。在优选的实施方案中，动力学，例如细胞的活化时间和/或钝化时间(例如野生型或功能部分丧失的细胞)，优选地与Kv9.2激动剂接触的活化时间和/或钝化时间常数提高至少10％，优选地至少20％，更优选地至少+30％，更优选地至少40％，更优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％。在优选的实施方案中，使用本文中其它章节描述的“Kv9.2的功能测定(电生理学)”测定动力学。在优选的实施方案中，与Kv9.2激动剂接触的野生型或Kv9.2部分敲除动物的血液葡萄糖水平提高至少10％，优选地至少20％，更优选地至少+30％，更优选地至少40％，更优选地至少50％，更优选地至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％。在优选的实施方案中，Kv9.2的拮抗剂是这样的拮抗剂，与这种拮抗剂接触的野生型或部分功能损失的动物显示至少部分程度上与Kv9.2部分或全部功能丧失的突变体至少部分同一的表现型。也就是说，优选的拮抗剂这样的拮抗剂，它引起焦虑提高，或血糖水平下降，或传导性下降，或动力学改变或下降，或上述任何表现型的组合。优选地，相关表现型以与Kv9.2敲除动物相同的程度进行表达。在优选的实施方案中，与Kv9.2拮抗剂接触的野生型或部分功能丧失的细胞的传导性是Kv9.2缺陷细胞传导性的+80％以内，优选地+70％以内，更优选地+60％以内，更优选地+50％以内，更优选地+40％以内，更优选地+30％以内，更优选地+20％以内，更优选地+10％以内，更优选地+5％以内。在优选的实施方案中，这使用本文中其它章节描述的“Kv9.2的功能测定(电生理学)”进行测定。在优选的实施方案中，动力学，即与Kv9.2拮抗剂接触的野生型或Kv9.2部分功能丧失细胞的活化时间和/或钝化时间，优选地活化时间和/或钝化时间常数，是Kv9.2缺陷细胞动力学(或相关时间)的+80％以内，优选地+70％以内，更优选地+60％以内，更优选地+50％以内，更优选地+40％以内，更优选地+30％以内，更优选地+20％以内，更优选地+10％以内，更优选地+5％以内。在优选的实施方案中，这使用本文中其它章节描述的“Kv9.2的功能测定(电生理学)”进行测定。在优选的实施方案中，与Kv9.2拮抗剂接触的野生型或部分Kv9.2敲除动物的血液葡萄糖水平是Kv9.2缺陷的转基因动物的血液葡萄糖水平的+80％以内，优选地+70％以内，更优选地+60％以内，更优选地+50％以内，更优选地+40％以内，更优选地+30％以内，更优选地+20％以内，更优选地+10％以内，更优选地+5％以内。衍生自敲除Kv9.2的动物的组织可用于结合分析，以测定潜在的药物(候选配体或化合物)是否与Kv9.2结合。这种分析可通过从经基因工程使包含Kv9.2的离子通道生产缺陷的转基因动物获得第一离子通道制剂和从已知结合任何鉴别的Kv9.2配体或化合物的来源获得第二离子通道制剂进行。通常，除获得的来源外，第一和第二离子通道制剂在各个方面都相似。例如，如果来自转基因动物的脑组织(如上文和下文描述的)用于测定，来自正常(野生型)动物的可比较的脑组织用作第二离子通道制剂的来源。单独地和在候选配体或化合物存在的情况下，每一个离子通道制剂用已知结合包含Kv9.2的离子通道的配体培育。优选地，候选配体或化合物以几种不同的浓度进行测定。对于第一和第二离子通道制剂，测定用测试化合物替代已知配体结合的程度。衍生自转基因动物的组织可直接用于测定，或者可加工该组织以分离其本身用于测定的膜或膜蛋白。优选的转基因动物是小鼠。可使用适合于结合测定的任何方法标记配体。这一方法包括，没有限制，放射性的、酶促的、荧光的或化学发光标记(以及上文进一步详细描述的其它标记技术)。此外，可通过给予表达功能Kv9.2的野生型动物和被鉴别显示与减少或消除Kv9.2功能表达有关的任何表现型特征的动物候选化合物等，鉴别Kv9.2或含有Kv9.2的离子通道的拮抗剂。下文中进一步详细描述了生产非人转基因动物的详细方法。可将转基因构建物引入动物种系制备转基因哺乳动物。例如，一个或几个拷贝的构建物可通过标准转基因技术引入哺乳动物胚胎的基因组。在一个示范性的实施方案中，通过将转基因引入非人动物种系生产转基因非人动物。各个发育阶段的胚胎靶细胞可用于引入转基因。依据胚胎靶细胞的发育阶段使用不同的方法。针对总体上健康、良好胚胎产率、胚胎中可见良好前核、和良好的生殖适应性，选择任何动物的特定种系。此外，单倍型是显著性因子。将转基因引入胚胎可通过本领域已知的任何方法完成，例如显微注射、电穿孔或脂转染。例如，可通过显微注射构建物进入受精的哺乳动物卵的前核，导致一个或多个拷贝的构建物保留于发育中的哺乳动物细胞中，将Kv9.2转基因引入哺乳动物。在将转基因构建物引入受精卵后，该卵可体外培养不同的时间，或者再移植到替代宿主，或者二者都进行。也可体外培养至成熟。一种常见方法是依据不同的物种体外培养胚胎约1-7天，然后将它们再移植到替代宿主中。可通过组织片段的DNA印迹分析检测转基因操纵的胚胎的子代中构建物的存在。如果一个或多个拷贝的外源克隆构建物保持稳定地整合进入这种转基因胚胎的基因组，可能建立携带转基因增加的构建物的永久转基因哺乳动物种系。转基因改变的哺乳动物的胎仔出生后可测定构建物掺入子代的基因组。优选地，这一测定通过杂交相应于编码所欲重组蛋白产物或其片段的DNA序列的探针到子代染色体上完成。那些在它们的基因组中发现含有至少一个拷贝的构建物的哺乳动物子代生长直至成熟。为了本文的目的，合子基本上是能够发育成为完整的有机体的二倍体细胞的结构。一般地，该合子包含一个卵子，该卵子含有通过来自一个配子或两个配子的两个单倍体核融合、天然或人工形成的核。因此，配子核必须是天然可配伍的，即该配子核产生能够进行分化和发育成为功能有机体的活的合子。通常，整倍体合子是优选的。如果获得非整倍体合子，那么对于配子起源的有机体的整倍体数量，染色体数量的改变不超过一个。除相似的生物学因素外，物理因素也控制着可添加到合子的核或到形成部分合子核的遗传物质中的外源遗传物质的量(例如体积)。如果没有除去遗传物质，那么可添加的外源遗传物质的量为没有被物理破坏而将被吸收的量所限制。通常插入的外源遗传物质的量不超过约10皮升。添加的物理作用肯定没有如物理破坏合子的成活力那么大。DNA序列的数量和种类的生物学限制依赖于具体的合子和外源遗传物质的功能而改变，并对本领域熟练的技术人员是显而易见的，因为获得的合子的遗传物质，包括外源遗传物质，必须在生物学上能够起始和保持合子分化和发育成为功能有机体。添加到合子的转基因构建物拷贝的数量取决于添加的外源遗传物质的总量，并且是能够使遗传转化发生的量。理论上仅需要一个拷贝；然而通常，为了确保一个拷贝能够行使功能而利用大量拷贝，例如转基因构建物的1,000-20,000个拷贝。使用超过一个功能拷贝的各个插入的外源DNA序列以增强外源DNA序列的表现型表达常常是有利的。可利用允许添加外源遗传物质到核遗传物质的任何技术，只要它不破坏细胞、核膜或其它存在的细胞或遗传结构。外源遗传物质优选地通过显微注射插入核遗传物质。细胞和细胞结构的显微注射是本领域已知并使用的。使用标准方法完成再移植。通常，将替代宿主麻痹，将胚胎嵌入输卵管。移植到具体宿主的胚胎的数量将依物种而改变，但通常与天然产生的物种的子代的数量具可比性。可通过任何适当的方法筛选替代宿主的转基因后代中转基因的存在或表达。筛选常常使用与至少部分的转基因互补的探针，通过DNA印迹或RNA印迹分析完成。使用由转基因编码的蛋白质的抗体的蛋白质印迹分析可用作筛选转基因产物存在的另一种或附加的方法。典型地，从尾部组织制备DNA并用DNA印迹分析或PCR分析转基因。另外，尽管任何组织或细胞类型可用于这一分析，使用DNA印迹分析或PCR检测相信以最高的水平表达转基因的组织或细胞中转基因的存在和表达。评价转基因存在的另外或附加方法包括，没有限制，适当的生化测定例如酶和/或免疫测定、具体标记或酶活的组织学染色、流式细胞计量分析等。血液分析也可用于检测血液中转基因产物的存在，也可用于评价转基因对各种类型的血细胞水平和其它血液组成的作用。转基因动物的子代可通过转基因动物与适当的配偶体交配获得，或通过从转基因动物获得的卵和/或精子体外受精获得。当与配偶体进行交配时，该配偶体可以是或不是转基因和/或敲除动物；如果它是转基因的，它可包含相同或不同的转基因，或二者都包含。另外，配偶体可以是亲本种系。当使用体外受精时，受精胚胎可植入替代宿主或体外培养，或者二者都进行。使用任一方法，使用上文描述的方法或其它适当的方法可评价该子代转基因的存在。依据本文描述的方法生产的转基因动物将包含外源遗传物质。如上文提出的，在某些实施方案中，外源遗传物质是导致Kv9.2亚基或包含Kv9.2的离子通道的生产的DNA序列。此外，在这样的实施方案中，该序列与转录控制因子例如启动子结合，这优选地允许转基因产物在特定类型的细胞中表达。逆转录病毒感染也可用于引导转基因进入非人动物。正在发育的非人胚胎可体外培养到胚泡期。在这段时间中，卵裂球可以是逆转录病毒感染的目标((Jaenich，R.(1976)PNAS731260-1264)。卵裂球的有效感染通过酶处理以除去透明带获得(操纵小鼠胚胎(ManipulatingtheMouseEmbryo)，Hogan编辑(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1986)。用于引导转基因的病毒载体系统典型地是携带转基因的复制缺陷型病毒(Jahner等(1985)PNAS826927-6931；VanderPutten等(1985)PNAS826148-6152)。通过在单层生产病毒的细胞上培养卵裂球方便而有效地获得转染(VanderPutten，见上文；Stewart等(1987)EMBOJ.6383-388)。另外，感染可在以后的阶段进行。可将病毒或生产病毒的细胞注射进入囊胚腔(Jahner等(1982)Nature298623-628)。对于转基因来说大多数建立者是嵌合的，因为掺入仅发生在形成转基因非人动物的细胞的亚型中。此外，建立者可在基因组的不同位置包含转基因的各种逆转录病毒的插入，这些插入通常在后代中分离。此外，还可通过宫内逆转录病毒感染中期妊娠胚胎将转基因引入种系(Jahner等(1982)见上文)。用于转基因引入的第三种类型的靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞从体外培养的植入前胚胎获得并与胚胎融合(Evans等(1981)Nature292154-156；Bradley等(1984)Nature309255-258；Gossler等(1986)PNAS839065-9069；和Robertson等(1986)Nature322445-448)。转基因可通过DNA转染或通过逆转录病毒-介导的转导有效地引入ES细胞。此后，这样转化的ES细胞可与来自非人动物的胚泡结合。其后，该ES细胞定居胚胎并导致获得嵌合动物的种系。相关论述参见Jaenisch，R.(1988)Science2401468-1474。我们还提供了非人转基因动物，这里转基因动物表征为具有改变的Kv9.2基因，优选地如上文所述，作为Kv9.2亚基或含有Kv9.2的离子通道功能的模型。基因的改变包括缺失或其它功能丧失的突变，引入具有定向或随机突变的核苷酸序列的外源基因，从另一物种引入外源基因，或者它们的组合。对于改变转基因动物可以是纯合的或是杂合的。从其衍生的动物和细胞对于筛选可调节Kv9.2亚基或包含Kv9.2的离子通道功能的生物活性剂是有用的。筛选方法对于确定调节血液葡萄糖的潜在的疗法的特异性和作用具有特别的用处，治疗的疾病包括，I型和II型糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素分泌过多症、胰岛素抗性、糖尿病并发症包括糖尿病相关的血管病、糖尿病相关的肾病和糖尿病相关的神经病，以及治疗低血糖的治疗。同样，高脂(它们是HDL、LDL或VLDL)血症的治疗、异常脂血症，无论其起因是原发于或继发于糖尿病、甲状腺机能亢进/减退、肢端肥大症、肝功能衰竭、肾衰竭、胰腺瘤、胰腺炎以及酒精诱导的低血糖。同样治疗的神经疾病包括焦虑症、焦虑性疾病、焦虑相关行为和广泛性焦虑性疾病、惊恐性障碍、广场恐怖症、社交恐怖症、强制性障碍、外伤后应激反应障碍、急性应激反应障碍和DSM-IV中所列的那些惊恐性障碍及抑郁。所述动物用作研究正常组织和器官中(例如脑、心脏、脾、和肝)Kv9.2亚基或包含Kv9.2的离子通道的作用以及对这些组织或器官功能的影响的模型。另一个方面涉及转基因非人动物，该动物具有功能破坏的内源Kv9.2基因，但该动物还在它的基因组中携带并表达编码异源Kv9.2蛋白(即来自另一物种的Kv9.2)的转基因。优选地，该动物是小鼠，异源Kv9.2是人的Kv9.2。衍生自这种已经与人Kv9.2重组的动物的动物或细胞系可用于鉴别体内和体外抑制人Kv9.2的试剂。例如，在被检测的试剂存在或不存在的情况下通过人Kv9.2诱导信号传导的刺激物可给予动物或细胞系，并测定动物或细胞系的反应。体内或体外抑制人Kv9.2的试剂可基于与该试剂不存在时的反应进行比较，该试剂存在时反应的下降来鉴别。我们还提供了Kv9.2缺陷的转基因非人动物(“Kv9.2亚基敲除动物”)。这种动物是一种表达降低的或无Kv9.2亚基或包含Kv9.2的离子通道活性的动物，优选地作为内源Kv9.2亚基基因组序列被破坏或缺失的结果。优选地，这种动物不表达Kv9.2亚基或包含Kv9.2的离子通道活性。更优选地，该动物不表达显示为SEQIDNO3或SEQIDNO5的包含Kv9.2的离子通道的活性。如下文中进一步详细描述的，Kv9.2离子通道敲除的动物可通过本领域已知的各种方法产生。本公开还涉及用于功能性地破坏宿主细胞中Kv9.2基因的核酸构建物。所述核酸构建物包括a)非同源替代部分；b)位于非同源替代部分上游的第一同源区域，该第一同源区域具有与第一Kv9.2基因序列基本上相同的核苷酸序列；和c)位于非同源替代部分下游的第二同源区域，该第二同源区域具有与第二Kv9.2基因序列基本上相同的核苷酸序列，第二Kv9.2基因序列位于天然发生的内源Kv9.2基因的第一Kv9.2基因序列的下游。此外，第一和第二同源区域具有足够的长度在用于当将核酸分子引入宿主细胞中时核酸构建物和宿主细胞中的内源Kv9.2基因之间进行同源重组。在一个优选的实施方案中，非同源替代部分包括表达报道基因，优选地包括lacZ和正选择表达盒，优选地包括操作性地与一个或多个调控元件连接的新霉素磷酸转移酶基因。优选地，第一和第二Kv9.2基因序列衍生自SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNO4，或者它们的同源物、变体或衍生物。另一方面涉及上文描述的核酸构建物已掺入其中的重组载体。另一个方面涉及已将核酸构建物引入其中的宿主细胞，因此允许核酸构建物和宿主细胞的内源Kv9.2基因之间的同源重组，导致内源Kv9.2基因的功能遭到破坏。该宿主细胞可以是来自肝脏、脑、脾或心脏的通常表达Kv9.2的哺乳动物细胞，或者是多能细胞，例如小鼠胚胎干细胞。已将核酸构建物引入其中并与内源Kv9.2基因同源重组的胚胎干细胞进一步发育，产生转基因非人动物，该动物具有来自胚胎干细胞并因此在其基因组中携带Kv9.2基因破坏的细胞。可选择并培育在其种系中携带破坏的Kv9.2基因的动物以产生在全部体细胞和生殖细胞中具有Kv9.2基因破坏的动物。然后可培育这种小鼠到对于Kv9.2基因破坏具有纯合性。抗体本文使用的术语“抗体”，除非相反的规定，包括但不限于，多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和通过Fab表达文库产生的片段。这种片段包括对靶物质保留其结合活性的完整抗体的片段、Fv、F(ab’)和F(ab’)2片段、以及单链抗体(scFv)、融合蛋白和其它包含抗体的抗原结合位点的合成蛋白质。该抗体及其片段可以是人源化的抗体，例如EP-A-239400中描述的。此外，也可使用例如美国专利5,545,807和6,075,181中描述的具有全部人可变区的抗体(或其片段)。中和抗体,即那些抑制氨基酸序列物质生物活性的抗体，对于诊断和治疗是特别优选的。可使用标准技术，例如通过免疫或通过使用噬菌体展示文库生产抗体。可使用一种多肽或肽通过已知的技术生产抗体。这种抗体可能能够特异性地结合Kv9.2蛋白或同源物、片段等。如果想要获得多克隆抗体，可用包含Kv9.2多肽或肽的免疫原性组合物免疫选择的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)。依据宿主种类，可使用各种佐剂提高免疫反应。这种佐剂包括，但不限于，弗氏佐剂、矿物凝胶例如氢氧化铝，和表面活性物质例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚。BCG(卡介苗BacilliCalmette-Guerin)和Corynebacteriumparvum是潜在有用的人佐剂，如果将纯化的氨基酸序列物质给予免疫调和的个体用于刺激系统性防御可使用这些佐剂。收集免疫动物的血清并依据已知程序处理。如果包含针对可从多肽获得的表位的多克隆抗体的血清含有针对其它抗原的抗体，那么多克隆抗体可用免疫亲和层析纯化。生产和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了制备这种抗体，我们还提供了与另一个氨基酸序列半抗原化(haptenise)的Kv9.2氨基酸序列或其片段，用作动物或人体内的免疫原。针对可从Kv9.2多肽获得的表位的单克隆抗体也可由本领域熟练的技术人员方便地生产。通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是已知的。无限增殖的生产抗体的细胞系可通过细胞融合产生，也可使用其它技术，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用埃-巴二氏病毒转染。可筛选针对轨道表位(orbitepitope)生产的系列单克隆抗体的各种性质，即筛选同种型和表位亲和性。可使用提供通过培养中的传代细胞系生产抗体分子的任何技术制备单克隆抗体。这些技术包括但不限于，最初由Koehler和Milstein(1975Nature256495-497)描述的杂交瘤技术、三体瘤(trioma)技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等(1983)ImmunolToday472；Cote等(1983)ProcNatlAcadSci802026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，77-96，AlanR.Liss，Inc.，1985)。此外，可使用开发用于生产“嵌合抗体”的技术，剪接小鼠抗体基因到人抗体基因上，以获得具有适当的抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等(1984)ProcNatlAcadSci816851-6855；Neuberger等(1984)Nature312604-608；Takeda等(1985)Nature314452-454)。另外，描述用于生产单链抗体的技术(美国专利4,946,779)可适合于生产物质特异性单链抗体。指向从Kv9.2多肽和肽获得的表位的单克隆和多克隆抗体具体用于诊断，中性抗体用于被动免疫治疗。具体地，单克隆抗体可用于产生抗独特型抗体。抗独特型抗体是免疫球蛋白，它携带需要保护的物质和/或试剂的“内部图像”。产生抗独特型抗体的技术是本领域已知的。这些抗独特型抗体也可用于治疗。还可如Orlandi等(1989，ProcNatlAcadSci863833-3837)以及WinterG和MilsteinC(1991；Nature349293-299)公开的，通过诱导淋巴细胞种群的体内生产或通过筛选重组免疫球蛋白文库或系列高度特异性的结合试剂生产抗体。也可生产包含多肽或肽的特异性结合位点的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于，可由胃蛋白酶消化抗体分子生产的F(ab’)2片段，和通过减少F(ab’)2片段的二硫键产生的Fab片段。另外，可构建Fab表达文库，使得能够快速和方便地鉴别具有所欲特性的单克隆Fab片段(HuseWD等(1989)Science2561275-1281)。生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778)也适合于生产Kv9.2多肽的单链抗体。并且，转基因小鼠或包括其它哺乳动物的其它有机体可用于表达人源化抗体。可使用上述抗体分离或鉴别表达多肽的克隆或通过亲和层析纯化多肽。Kv9.2亚基多肽的抗体也可用于调节血液葡萄糖治疗疾病，包括，I型和II型糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素分泌过多症、胰岛素抗性、糖尿病并发症包括糖尿病相关的血管病、糖尿病相关的肾病和糖尿病相关的神经病，以及治疗低血糖、高脂(它们是HDL、LDL或VLDL)血症、异常脂血症，无论其起因是原发于或继发于糖尿病、甲状腺机能亢进/减退、肢端肥大症、肝功能衰竭、肾衰竭、胰腺瘤、胰腺炎以及酒精诱导的低血糖。诊断分析我们进一步描述了Kv9.2亚基多核苷酸和多肽(及其同源物、变体和衍生物)在作为诊断试剂用于诊断或遗传分析中的用途。在这样的分析中还可使用互补或能够杂交Kv9.2亚基核酸(包括同源物、变体和衍生物)的核酸以及Kv9.2多肽的抗体。检测与功能异常有关的Kv9.2亚基基因的突变型将提供一种诊断方法，该方法可增加或详细说明对由于Kv9.2亚基的不足表达、过量表达或改变表达引起的疾病或疾病易感性的诊断。可通过各种技术在DNA水平上检测携带Kv9.2亚基基因(包括控制序列)突变的个体。例如，可从患者分离DNA，并确定Kv9.2的DNA多态性模式。将鉴别的模式与已知患有与过量-、不足或异常表达Kv9.2相关疾病的患者对照进行比较。然后可鉴别表达与相关疾病有关的遗传多态性模式的患者。Kv9.2亚基基因的遗传分析可通过本领域已知的任何技术进行。例如，可通过确定Kv9.2等位基因的DNA序列，通过RFLP或SNP分析等筛选个体。可通过检测Kv9.2基因序列或控制其表达的任何序列中DNA多态性的存在鉴别患者具有与过量-、不足或异常表达Kv9.2相关的疾病的遗传倾向。然后，治疗这样鉴别的患者以预防Kv9.2相关疾病的发生，或者Kv9.2在相关疾病的早期更强地治疗，以预防疾病的进一步发生或发展。Kv9.2相关疾病包括I型和II型糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素分泌过多症、胰岛素抗性、糖尿病并发症包括糖尿病相关的血管病、糖尿病相关的肾病和糖尿病相关的神经病，以及治疗低血糖、高脂(它们是HDL、LDL或VLDL)血症、异常脂血症，无论其起因是原发于或继发于糖尿病、甲状腺机能亢进/减退、肢端肥大症、肝功能衰竭、肾衰竭、胰腺瘤、胰腺炎以及酒精诱导的低血糖。还用于治疗神经疾病，包括焦虑症、焦虑性疾病、焦虑相关行为和广泛性焦虑性障碍、惊恐性障碍、广场恐怖症、社交恐怖症、强制性障碍、外伤后应激反应障碍、急性应激反应障碍和DSM-IV中所列的那些焦虑障碍及抑郁。我们进一步公开了鉴别与Kv9.2相关疾病相关的患者遗传多态性模式的试剂盒。该试剂盒包括DNA样品收集手段和测定遗传多态性模式的手段，然后将多态性模式与对照样品相比较以确定患者对Kv9.2相关疾病的易感性。还提供了诊断Kv9.2相关疾病的试剂盒，该试剂盒包括Kv9.2多肽和/或这种多肽的抗体(或其片段)。用于诊断的核酸可从被试者细胞中获得，例如从血液、尿、唾液、组织活体解剖或尸体解剖材料获得。在一个优选的实施方案中，从通过刺破患者手指将血液收集在吸水纸上得到的血细胞获得DNA。在另一个优选的实施方案中，血液在AmpliCard.TM上收集(UniversityofSheffield，DepartmentofMedicineandPharmacology，RoyalHallamshireHospital，Sheffield，EnglandS102JF)。DNA可直接用于检测，或者分析前可使用PCR或其它扩增技术酶促扩增。可制备指向感兴趣的基因中特异性多态型DNA区域的寡核苷酸DNA引物，这样在PCR反应中获得靶序列的扩增。RNA或cDNA也可以类似的方式用作模板。然后使用限制酶分析从模板DNA扩增的DNA序列，以确定在扩增的序列中存在的遗传多态性，并因此提供患者的遗传多态性分布图。限制片段长度可通过凝胶分析鉴定。另外，或者同时可使用例如SNP(单核苷酸多态性)分析技术。缺失和插入可通过与正常基因型比较扩增产物大小的改变进行检测。通过将扩增的DNA与标记的Kv9.2亚基核苷酸序列杂交鉴别点突变。可通过RNA酶消化或通过解链温度的差异将匹配良好的序列与错配的双链体区别开来。还可通过在变性剂存在或不存在的情况下DNA片段在凝胶中电泳迁移率的改变或通过直接DNA测序检测DNA序列的差异。参见，例如Myers等，Science(1985)2301242。序列在特定位置的改变也可通过核酸酶保护分析揭示，例如RNA酶和S1保护或化学切割方法。参见Cotton等，ProcNatlAcadSciUSA(1985)854397-4401。在另一个实施方案中，可构建包含Kv9.2亚基核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针阵列，有效筛选例如遗传突变。阵列技术方法是已知的并具有普遍的适用性，可用于解答在分子遗传学中提出的各种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性。(参见例如M.Chee等，Science，274卷，610-613(1996))。单链构象多态性(SSCP)可用于检测突变体和野生型核酸之间电泳迁移率的差异(Orita等(1989)ProcNatl.Acad.SciUSA862766，还参见Cotton(1993)MutatRes285125-144；和Hayashi(1992)GenetAnalTechAppl973-79)。可将样品和对照核酸的单链DNA片段变性并使之复性。单链核酸的二级结构依照序列而改变，获得的电泳迁移率的改变使得能够检测即使是一个碱基的改变。可标记DNA片段并用标记探针检测。测定的敏感性可使用RNA(而不是DNA)增强，RNA二级结构对于序列的改变更加敏感。在一个优选的实施例中，被试者方法利用异源双链分析以电泳迁移率的改变为基础分离双链的异源双链分子(Keen等(1991)TrendsGenet75)。通过使用描述的方法检测Kv9.2亚基基因的突变，诊断分析提供了诊断或测定对疾病例如焦虑或糖尿病的易感性的方法。可在样品中检测到Kv9.2亚基多肽和核酸的存在。因此，上文列出的感染和疾病可通过如下方法诊断，该方法包括从衍生自被试者的样品测定Kv9.2亚基多肽或Kv9.2亚基mRNA异常降低或提高的水平。样品可包括来自这样的有机体的细胞或组织样品，该有机体患有或怀疑患有与提高、降低或以其它方式异常表达Kv9.2亚基(包括表达水平或模式在空间或时间上的改变)相关的疾病。作为诊断疾病的一种方法，可有效地将患有或怀疑患有这种疾病的有机体中Kv9.2的表达水平或模式与正常有机体中的表达水平或模式进行比较。因此，大体上，我们公开了一种通过将样品与特异于所述核酸的至少一种核酸探针接触并测定所述样品中核酸的存在，检测样品中包含Kv9.2亚基核酸的核酸存在的方法。例如，该核酸探针可与Kv9.2亚基核酸或其部分特异性地结合，且检测两个核酸之间的结合；也可检测复合物本身的存在。此外，我们公开了一种通过将细胞样品与能够结合多肽的抗体接触并监视所述样品中多肽的存在，检测Kv9.2亚基多肽的存在的方法。这可通过测定抗体和多肽之间形成的复合物的存在或测定多肽和抗体之间的结合方便的完成。检测两个本体之间结合的方法是本领域已知的，包括FRET(荧光共振能量转移)、表面细胞基质共振等。可使用本领域已知的任何定量多核苷酸的方法测定RNA水平上表达的降低或提高，例如PCR、RT-PCR、RNA酶保护、RNA印迹和其它杂交方法。可用于测定宿主样品中的蛋白质例如Kv9.2亚基水平的分析技术是本领域熟练的技术人员已知的。这种分析方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、蛋白质印迹分析和ELISA测定。本公开还涉及用于诊断疾病和对疾病(包括感染)，例如焦虑或糖尿病，的易感性的试剂盒。该诊断试剂盒包括Kv9.2亚基多核苷酸或其片段；互补核苷酸序列；Kv9.2亚基多肽或其片段，或Kv9.2亚基多肽的抗体。染色体测定Kv9.2核苷酸序列对于染色体的鉴别也是有价值的。该序列特异性地靶向并可与个体人染色体上的具体位置杂交。如上文所述，发现人Kv9.2亚基定位于智人染色体8q22。将相关序列定位于染色体在把那些序列与基因相关疾病联系起来的过程中是重要的第一步。一旦序列定位于精确的染色体位置，染色体上序列的物理位置可与基因图谱数据相关。这种数据存在于例如V.McKusick，人类孟德尔遗传(通过JohnsHopkinsUniversityWelchMedicalLibrary在线获得)。然后通过连锁分析鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性(物理上毗邻基因的共遗传)。在受到侵袭和未受侵袭的个体之间cDNA或基因组序列的差别也可被测定。如果在受到侵袭的个体中的一些或全部中观察到突变，而在任何正常个体中没有观察到突变，那么突变可能是引起疾病的原因。预防和治疗方法我们提供了治疗与Kv9.2亚基活性过量和不足相关的疾病的方法。如果Kv9.2亚基活性过量，可利用以下几种方法。一种方法包括给予被试者如上文描述的抑制剂化合物(拮抗剂)以及有效量的药物可接受的载体，通过阻断配体与Kv9.2亚基的结合或通过抑制第二信号抑制激活，从而缓解异常的状况。在另一种方法中，给予可溶形式的Kv9.2亚基多肽，其仍能够与内源Kv9.2亚基竞争结合配体。这种竞争者的典型的实施方案包括Kv9.2亚基多肽的片段。在另一种方法中，编码内源Kv9.2亚基的基因的表达可使用表达阻断技术抑制。已知的这种技术包括使用反义序列，其或者是内部产生的或者是分别给予的。参见例如，O’Connor，JNeurochem(1991)56560，作为基因表达反义抑制剂的寡脱氧核苷酸(OligodeoxvnucleotidesasAntisenseInhibitorsofGeneExpression)，CRCPress，BocaRaton，Fla.(1988)。另外，可提供与基因形成三链螺旋的寡核苷酸。参见例如，Lee等，NucleicAcidsRes(1979)63073；Cooney等，Science(1988)241456；Dervan等，Science(1991)2511360。可直接给予这些寡聚体或者体内表达有关的寡聚体。为了治疗与Kv9.2亚基及其活性表达不足有关的疾病，也可使用以下几种方法。一种方法包括给予被试者活化包含Kv9.2的离子通道的治疗有效量的化合物，即上文所述的激动剂或开放剂，与药物可接受的载体结合，从而缓解异常的状况。另外，可使用基因疗法通过被试者体内的相关细胞影响Kv9.2亚基的内源生产。例如，如上文所述，可将Kv9.2多肽进行工程改造用于在复制缺陷型反转录病毒载体中进行表达。然后可将该反转录病毒表达构建物分离并引入用包含编码Kv9.2多肽的RNA的反转录病毒质粒转导的包装细胞，这样包装细胞就产生了包含感兴趣的基因的感染性病毒颗粒。这些生产细胞可给予被试者用于体内工程改造细胞和体内表达多肽。关于基因疗法的综述参见HumanMolecularGenetics，TStrachan和APRead，BIOSScientificPublishersLtd(1996)中的第20章，基因疗法和其它分子遗传基础的治疗方法(GeneTherapyandotherMolecularGenetic-basedTherapeuticApproaches)(本文引用作为参考)。制剂和给药肽，例如可溶形式的Kv9.2亚基多肽，以及激动剂和拮抗剂肽和小分子肽，可与适当的药物载体结合配制。这种制剂包括治疗有效量的多肽或化合物，以及药物可接受的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及它们的组合。制剂应与给予方式相适应，并为本领域熟知。我们进一步公开了药物包和试剂盒，它们包括用上述组合物中的一种或多种成分填充的一个或多个容器。Kv9.2多肽和其它化合物可单独或与其它化合物结合使用，例如治疗性化合物。系统给予药物组合物优选的方式包括注射，典型地通过静脉注射。可使用其它注射途径，例如皮下、肌肉或腹膜内注射。系统给药的其它方法包括使用渗透剂例如胆汁盐或梭链孢酸或其它洗涤剂跨粘膜和经皮肤给药。此外，如果适当地配制成肠或胶囊制剂，那么也可以口服。这些化合物也可以药膏、贴剂、凝胶等的形式局部和/或定位给予。需要的剂量范围取决于肽的选择、给药途径、制剂的特性、被试者病症的特性以及主治医生的判断。然而，适当的剂量在0.1-100μg/kg受试者的范围内。但是，考虑到可使用的化合物的多样性以及各种给药途径的不同功效，所需剂量的大幅变化是可以预料到的。例如，口服给药比通过静脉注射给药需要更高的剂量。如本领域所熟知的，这些剂量水平的变化可使用标准经验程序调整到最优化。以常常被称作上文描述的“基因疗法”的治疗形式，也可在被试者体内内源产生用于治疗的多肽。因此，例如，来自被试者的细胞可例如通过使用反转录病毒质粒载体，用多核苷酸例如DNA或RNA进行基因工程改造以先体外后体内编码多肽。然后将这些细胞引入被试者。药物组合物我们还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括给予的治疗有效量的Kv9.2多肽、多核苷酸、肽、载体或抗体以及任选地药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括它们的组合)。该药物组合物可在人和兽医药中用于人或动物，并典型地包含任一一种或多种药物可接受的稀释剂、载体或赋形剂。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药学领域所熟知的，并描述于例如Remington’sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCo.(A.R.Gennaro编辑，1985)。药学载体、赋形剂或稀释剂的选择可依据所欲的给药途径和标准药学实践进行挑选。该药物组合物可包含作为载体、赋形剂或稀释剂的，或除此以外，任何适当的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂层剂、加溶剂。防腐剂、稳定剂、染料、甚至调味剂也包含在药物组合物中。防腐剂的例子包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。还可使用抗氧化剂和悬浮剂。不同的组合物/制剂需求取决于不同的传递系统。例如，配制本文描述的药物组合物以使用微型真空泵传递，或通过粘膜途径，例如作为鼻喷雾剂或用于吸入的气溶胶或可摄取的溶液，或在肠胃外给药，其中组合物以可注射的形式配制，用于通过例如静脉、肌肉或皮下途径传递。另外，可设计用以上两种途径传递的制剂。当药剂通过胃肠粘膜进行传递时，药剂在通过胃肠道转移的过程中应能够保持稳定；例如它应能够抵御蛋白水解酶降解，在酸性pH下稳定以及抵御胆汁的洗涤剂作用。适当地，药物组合物可以通过吸入给予，以栓剂或阴道栓剂的形式给予，局部地以洗液、溶液、药膏、软膏或隔离粉剂的形式给予，通过皮肤贴剂，以含有例如淀粉或乳糖赋形剂的片剂形式、或以单独或与赋形剂混合的胶囊或卵状小体、或以包含调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液的形式口服，或者它们可经肠胃外注射给予，例如静脉、肌肉或皮下注射。对于肠胃外给予，组合物最好以无菌水溶液的形式使用，该水溶液可包含其它的物质，例如足够的盐或单糖以使该溶液与血液等渗。对于口腔或舌下给予组合物可以通过常规方式配制的片剂或糖锭形式给予。疫苗另一个实施方案涉及在哺乳动物体内诱导免疫反应的方法，所述方法包括用Kv9.2亚基多肽或其片段接种哺乳动物，足以产生抗体和/或T细胞免疫反应，以保护所述动物免于作为下列疾病的结果的异常的血糖水平，这些疾病包括但不限于，I型和II型糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素分泌过多症、胰岛素抗性、糖尿病并发症包括糖尿病相关的血管病、糖尿病相关的肾病和糖尿病相关的神经病，以及治疗低血糖、高脂(它们是HDL、LDL或VLDL)血症、异常脂血症、无论其起因是原发于或继发于糖尿病、甲状腺机能亢进/减退、肢端肥大症、肝功能衰竭、肾衰竭、胰腺瘤、胰腺炎以及酒精诱导的低血糖。另一个实施方案涉及在哺乳动物体内诱导免疫反应的方法，所述方法包括为了诱导这种免疫反应以产生保护所述动物免于疾病的抗体，通过指导体内Kv9.2亚基多核苷酸表达的载体传递Kv9.2多肽。另一个实施方案涉及一种免疫/疫苗制剂(组合物)，当将其引入哺乳动物宿主时，在该哺乳动物中诱导对Kv9.2多肽的免疫反应，其中该组合物包括Kv9.2多肽或Kv9.2基因。疫苗制剂可进一步包含适当的载体。由于Kv9.2多肽在胃中可被分解，它优选地通过肠胃外给予(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内等注射)。适合于肠胃外给予的制剂包括水成的和非水无菌注射液，它可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与接受者的血液等渗的溶液，以及可包括悬浮剂或加厚剂的水成和非水无菌悬浮剂。该制剂可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并可贮藏在冻干条件下，在即将使用前仅需要添加无菌液体载体。疫苗制剂还可包括用于增强制剂免疫原性的佐剂系统，例如水包油系统和本领域已知的其它系统。剂量取决于疫苗的特异性活性，并可通过常规试验容易地测定。可从一个或多个Kv9.2多肽或肽制备疫苗。包含免疫原性的多肽或肽作为活性成分的疫苗的制备是本领域熟练的技术人员已知的。典型地，将这种疫苗制备成血管注射剂，或者为液体溶液或者为悬浮剂；适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式也可制备。还可将制剂乳化，或者蛋白包被于脂质体中。具有活性的免疫原性成分常常与药物可接受的并可与活性成分相容的赋形剂混合。适当的赋形剂是，例如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等及它们的组合。此外，如果需要，疫苗可包含少量的辅助物质，例如润湿或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强疫苗有效性的佐剂。有效的佐剂的例子包括但不限于氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，被称作降-MDP)、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(CGP19835A，被称作MTP-PE)，以及RIBI，它包含从细菌提取的三种成分，2％的角鲨烯/Tween80乳液中的单磷酰脂A、海藻糖dimycolate和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐剂和其它试剂的其它例子包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、硅、高岭土、碳、油包水乳剂、水包油乳剂、胞壁酰二肽、细菌内毒素、脂质X、Corynebacteriumparvum(Propionobacteriumacnes)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、多核糖核苷酸、藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂角苷、脂质体、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物或其它合成佐剂。这种佐剂可商业购自各种来源，例如Merck佐剂65(MerckandCompany，Inc.，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，Michigan)。典型地，使用的佐剂例如Amphigen(水包油)、Alhydrogel(氢氧化铝)或Amphigen和Alhydrogel的混合物。经许可用于人的仅氢氧化铝。免疫原和佐剂的比例可在宽泛的范围里变动，只要二者都以有效的量存在。例如，氢氧化铝可以疫苗混合物(Al2O3基础的)的约5％的量存在。便利地，配制疫苗使之包含的免疫原的终浓度范围为0.2-200μg/ml，优选地5-50μg/ml，最优选地15μg/ml。配制后，可将疫苗装入无菌容器，然后密封并在低温下保存，例如4℃下，或可将其冻干。冻干法允许以稳定的形式长期保存。该疫苗通过例如皮下或肌肉注射方便地经肠胃外给予。适合于其它方式给药的另外的制剂包括栓剂和，在某些情况下，口服制剂。对于栓剂，常规的粘合剂和载体可包括例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；这种栓剂可由包含活性成分的混合物组成，该活性成分的范围为0.5％-10％，优选地1％-2％。口服制剂包括正常使用的赋形剂，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、或者粉剂的形式，并包含10％-95％的活性成分，优选地25％-70％。在疫苗组合物冻干的情况下，给药前可将冻干的材料重构，例如作为悬浮剂。重构优选地在缓冲液中进行。用于口服给予患者的胶囊、片剂和丸剂可用肠包被供给，这种肠包被包含例如Eudragit“S”、Eudragit“L”、醋酸纤维素、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素。可将Kv9.2多肽配制成中和或盐形式的疫苗。药物可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)，其为与例如盐酸或磷酸等无机酸形成的，或者与例如乙酸、草酸、酒石酸和马来酸等有机酸形成。与游离羧基形成的盐也可衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因。给药典型地，医生将确定最适合于被试者个体的实际剂量，并且该剂量将随着年龄、体重和具体患者的反应而改变。下面的剂量是可仿效的一般病例。当然，可以有使用较高或较低剂量范围的个别的情况。药物和疫苗组合物可通过直接注射给予。可配制组合物用于肠胃外、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内或经皮肤给予。典型地，可以0.01-30mg/kg体重、优选地0.1-10mg/kg、更优选地0.1-1mg/kg体重的剂量给予各个蛋白质。术语“给予”包括通过病毒或非病毒技术传递。病毒传递机制包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体和杆状病毒载体。非病毒传递机制包括脂类介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染剂、阳离子表面亲水脂分子(CFAs)以及它们的组合。这种传递机制的途径包括但不限于粘膜、鼻、口、肠胃外、胃肠道、局部或舌下途径。术语“给予”包括但不限于通过粘膜途径传递，例如，作为用于吸入的鼻喷雾剂或气溶胶或作为可摄取的溶液；肠胃外途径，其中传递通过可注射的形式进行，例如，通过静脉、肌肉内或皮下途径。术语“共给予”是指给予每个例如Kv9.2多肽以及添加的物质例如佐剂的位点和时间，使得免疫系统得到必要的调节。因此，尽管有时多肽和佐剂可以在同一时刻并在同一位点给予，但可能在与佐剂不同的时间以及不同的位点给予多肽是有利的。多肽和佐剂甚至可以用相同的传递载体传递，并且多肽和抗原可以偶联和/或非偶联，和/或遗传偶联和/或非偶联。Kv9.2多肽、多核苷酸、肽、核苷酸、抗体和任选地佐剂可作为单剂量或以多剂量分别给予或共给予宿主被试者。疫苗组合物和药物组合物可通过多种不同的途径给予，例如注射(它包括肠胃外、皮下和肌肉内注射)、鼻内、粘膜、口、阴道内、尿道或经眼给予。疫苗和药物组合物可通过例如皮下或肌肉注射常规肠胃外给予。适合于其它方式给予的另外的制剂包括栓剂以及，在某些情况下，口服制剂。对于栓剂，可包括常规的粘合剂和载体，例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这种栓剂可由包含活性成分的混合物组成，该活性成分的范围为0.5％-10％，可以是1％-2％。口服制剂包括正常使用的赋形剂，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂、或者粉剂的形式，并包含10％-95％的活性成分，优选地25％-70％。在疫苗组合物冻干的情况下，给药前可将冻干的物质重构，例如作为悬浮剂。重构优选地在缓冲液中进行。其它方面现在以下列编号的段落陈述本发明其它的方面和实施方案；应当理解本发明包括这些方面段落1.一种Kv9.2多肽，所述Kv9.2多肽包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列，或其同源物、变体或衍生物。段落2.一种核酸，所述核酸编码根据段落1所述的多肽。段落3.一种根据段落2所述的核酸，所述核酸包含SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO4显示的核酸序列，或其同源物、变体或衍生物。段落4.一种多肽，所述多肽包含根据段落1所述的多肽的片段。段落5.一种根据段落3所述的多肽，所述多肽包含在SEQIDNO3和SEQIDNO5之间同源的一个或多个区域，或者所述多肽包含在SEQIDNO3和SEQIDNO5之间异源的一个或多个区域。段落6.一种编码根据段落4或5所述的多肽的核酸。段落7.一种包含根据段落2、3或6所述的核酸的载体。段落8.一种包含根据段落2、3或6所述的核酸或根据段落7所述的载体的宿主细胞。段落9.一种转基因非人动物，所述动物包含根据段落2、3或6所述的核酸或根据段落7所述的载体。段落10.一种根据段落9所述的转基因非人动物，所述动物是小鼠。段落11.在鉴别能够与Kv9.2亚基特异性相互作用的化合物的方法中，根据段落1、4或5所述的多肽的用途。段落12.在鉴别能够与Kv9.2亚基特异性相互作用的化合物的方法中，根据段落9或10所述的转基因非人动物的用途。段落13.一种鉴别包含Kv9.2的离子通道拮抗剂的方法，所述方法包括将表达Kv9.2的细胞与候选化合物接触，并测定通道的动力学和传导性是否改变。段落14.一种鉴别能够提高通道的传导水平或调节通道的电流动力学的化合物的方法，所述方法包括将表达包含Kv9.2的离子通道的细胞与候选化合物接触。段落15.一种鉴别能够与Kv9.2多肽结合的化合物的方法，所述方法包括将Kv9.2多肽与候选化合物接触，并确定候选化合物是否与Kv9.2多肽结合。段落16.一种通过根据段落11-15中的任何一个段落所述的方法鉴别的化合物。段落17.一种能够与段落1、4或5所述的多肽特异性结合的化合物。段落18.在生产抗体的方法中，根据段落1、4或5所述的多肽或其部分，或者根据段落2、3或6的核酸的用途。段落19.一种抗体，其能够与根据段落1、4或5所述的多肽或其部分或者由根据段落2、3或6所述的核酸编码的多肽或其部分特异性结合。段落20.一种药物组合物，该组合物包含任何一种或多种下列物质以及药学上可接受的载体或稀释剂根据段落1、4或5的多肽或其部分；根据段落2、3或6的核酸或其部分；根据段落7的载体；根据段落8的细胞；根据段落16或17的化合物；和根据段落19的抗体。段落21.一种疫苗组合物，该组合物包含任何一种或多种下列物质根据段落1、4或5所述的多肽或其部分；根据段落2、3或6的核酸或其部分；根据段落7所述的载体；根据段落8的细胞；根据段落16或17的化合物；和根据段落19的抗体。段落22.一种用于疾病或疾病易感性的诊断试剂盒，所述试剂盒包括任何一种或多种下列物质根据段落1、4或5的多肽或其部分；根据段落2、3或6的核酸或其部分；根据段落7的载体；根据段落8的细胞；根据段落16或17的化合物；和根据段落19的抗体。段落23.一种治疗患者的方法，所述患者患有与含有Kv9.2的离子通道活性增强有关的疾病，所述方法包括给予患者含有Kv9.2的离子通道的拮抗剂。段落24.一种治疗患者的方法，所述患者患有与含有Kv9.2的离子通道活性降低有关的疾病，所述方法包括给予患者含有Kv9.2的离子通道的激动剂。段落25.一种根据段落23或24所述的方法，其中Kv9.2亚基包含具有SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的序列的多肽。段落26.一种在患者中治疗和/或预防疾病的方法，所述方法包括给予患者任何一种或多种下列物质的步骤根据段落1、4或5的多肽或其部分；根据段落2、3或6的核酸或其部分；根据段落7的载体；根据段落8的细胞；根据段落16或17的化合物；和根据段落19的抗体；根据段落20的药物组合物；和根据段落20的疫苗。段落27.一种试剂，所述试剂包含根据段落1、4或5的多肽或其部分；根据段落2、3或6的核酸或其部分；根据段落7的载体；根据段落8的细胞；根据段落16或17的化合物；和/或根据段落19的抗体，所述试剂用于治疗或预防疾病的方法。段落28.根据段落1、4或5的多肽或其部分；根据段落2、3或6的核酸或其部分；根据段落7的载体；根据段落8的细胞；根据段落16或17的化合物；和/或根据段落19的抗体在制备用于治疗或预防疾病的药物组合物中的用途。段落29.一种非人转基因动物，其特征为所述转基因动物包含改变的Kv9.2基因。段落30.一种根据段落29所述的非人转基因动物，其中变化选自由下列组成的组Kv9.2缺失，导致功能丧失的Kv9.2突变，将具有定向或随机突变的核苷酸序列的外源基因引入Kv9.2，将来自另一物种的外源基因引入Kv9.2，或这些情形的任何组合。段落31.一种具有功能遭到破坏的内源Kv9.2基因的非人转基因动物，其中所述转基因动物包含其自身的基因组，并表达编码异源Kv9.2蛋白的转基因。段落32.一种用于在宿主细胞中功能性地破坏Kv9.2基因的核酸构建物，所述核酸构建物包括(a)非同源替代部分；(b)位于非同源替代部分上游的第一同源区域，该第一同源区域具有与第一Kv9.2基因序列基本上相同的核苷酸序列；和(c)位于非同源替代部分下游的第二同源区域，该第二同源区域具有与第二Kv9.2基因序列基本上相同的核苷酸序列，第二Kv9.2基因序列位于天然发生的内源Kv9.2基因的第一Kv9.2基因序列的下游。段落33.一种生产Kv9.2多肽的方法，所述方法包括在编码Kv9.2多肽的核酸被表达的条件下，培养根据段落8所述的宿主细胞。段落34.一种检测样品中根据段落2、3或6所述的核酸的存在的方法，所述方法包括将样品与特异于所述核酸的至少一种核酸探针接触，并检测所述样品中核酸的存在。段落35.一种检测样品中根据段落1、4或5所述的多肽的存在的方法，所述方法包括将样品与根据段落19所述的抗体接触，并检测所述样品中多肽的存在。段落36.一种诊断由提高、降低或以其它方式异常表达的Kv9.2亚基引起或与之相关的疾病或综合征的方法，所述方法包括如下步骤(a)在患有或怀疑患有这种疾病的动物体内检测Kv9.2亚基的表达水平或模式；和(b)将表达的水平或模式与正常动物的进行比较。实施例实施例1.转基因的Kv9.2敲除小鼠构建Kv9.2基因导向载体使用基因组资料库的同源性搜索通过生物信息学鉴别Kv9.2基因。由各种资料库装配226kb的基因组毗连群。该毗连群提供足够的侧翼序列信息，以设计同源臂以能够克隆进入导向载体。鼠Kv9.2基因具有一个编码外显子，设计导向策略以除去大多数的编码序列。在被缺失的区域旁侧的1.7kb的5’同源臂和4.0kb的3’同源臂通过PCR扩增，并将片段克隆进入导向载体。合成用于扩增臂的各个寡核苷酸引物的5’末端，以包含稀有酶切的限制性酶的不同识别位点，该位点与载体多接头的克隆位点匹配，并不存在于臂的本身。在Kv9.2的情况下，引物设计为下表中列出的引物，具有AgeI/NotI的5’臂克隆位点和AscI/FseI的3’臂克隆位点(使用的导向载体的结构，包括相关的限制性酶切位点在图1中显示)。除臂引物对((5’臂F/5’臂R)和(3’臂F/3’臂R))外，设计对Kv9.2基因座具有特异性的其它引物用于如下目的5’和3’探针引物对(5’prF/5’prR和3’prF/3’prR)，以扩增各个臂外部和延伸于各个臂之外的非重复基因组DNA的两个短的150-300bp的片段，以允许DNA印迹分析在单独的推定的定向克隆中的导向的基因座；当用于使用载体特异性引物的多重PCR，在这种情况下，是Asc403时，使得区分野生型、杂合子和纯合小鼠的小鼠基因型引物对(hetF和hetR)；最后，与5’臂区域末端上游退火的导向筛选引物(5’scr)，当与对载体(TK5IBLMNL)的5’末端具有特异性的引物配对时，它产生导向事件特异性2.0kb的扩增产物，在这种情况下是DR1。这一扩增产物可仅衍生自细胞的模板DNA，该细胞中发生了所希望的基因组改变，并使得能够从含有随机整合的载体拷贝的克隆背景中鉴别出正确导向的细胞。这些引物的位置以及用于导向策略的Kv9.2基因座区域的基因组结构以SEQIDNO19显示。选择同源臂的位置以功能性地破坏Kv9.2基因。制备导向载体，其中将要被缺失的Kv9.2区域用非同源序列取代，该非同源序列包括选择盒上游的内源基因表达报道基因(读框独立的1acZ基因)，该选择盒包括与Kv9.2基因同方向排列的promoted新霉素磷酸转移酶基因(neo)。一旦5’和3’同源臂被克隆进入导向载体TK5IBLMNL(参见图4)，使用标准分子生物学技术制备大量高度纯化的DNA制剂。20μg新鲜制备的不含内毒素的DNA用另一种稀有酶切(rare-cutting)的限制性内切酶PmeI限制性酶切，该位点存在于氨苄青霉素抗性基因和细菌的复制起点之间的载体主链中的唯一位点。然后沉淀线性化的DNA并在100μl的磷酸盐缓冲盐溶液中重悬浮，准备用于电穿孔。电穿孔24小时后，转染的细胞在含有200μg/ml新霉素的培养基中培育9天。挑取克隆放入96孔平板，使用PCR筛选(使用上文描述的引物5′prF和DR1)，以鉴别在内源Kv9.2基因和导向构建物之间已经发生了同源重组的克隆前将克隆复制并扩展。阳性克隆可以1-5％的比率鉴别。将这些克隆扩展，使得复制物被冷冻，制备足够的高质量的DNA，用于DNA印迹证实使用如上文所述制备的外部5’和3’探针的导向事件，所有这些都使用标准方法(Russ等，Nature2000Mar2；404(6773)95-99)。当用诊断限制性内切酶消化的DNA的DNA印迹与外部探针杂交时，同源定向的ES细胞克隆通过突变体带以及未改变的野生型带的存在证实。例如，当与5’外部探针杂交时用AflII消化的野生型基因组DNA将产生6.2kb的带，与3’外部探针杂交时将产生7.0kb的带，而包含导向等位基因的相似消化的基因组DNA将产生除野生型带外的～17kb的敲除特异性带。实施例2.转基因的Kv9.2敲除的小鼠生产Kv9.2GPCR缺陷小鼠C57BL/6雌性和雄性小鼠交配，在妊娠3.5天时分离胚泡。实施例2.转基因Kv9.2剔除小鼠生产Kv9.2GPCR缺陷的小鼠C57BL/6雌性和雄性小鼠交配，在妊娠3.5天时分离胚泡。每个胚泡注入取自选择的克隆的10-12个细胞，将7-8个胚泡植入假妊娠的F1雌体的子宫。产生出一窝包括几个高水平的(达到100％)野灰色雄性的嵌合小仔(野灰色毛色显示来自导向克隆的细胞的作用)。这些雄性嵌合体与雌性MF1和129小鼠交配，分别通过野灰色毛色和通过PCR基因型测定确定种系的传递。PCR基因型测定使用引物hetF和hetR以及第三个、载体特异性引物(Asc403)在溶解的剪断的尾巴上进行。这一多重PCR允许从野生型基因座(如果存在)从引物hetF和hetR扩增给出的241bp的带。剔除小鼠中缺失hetF位点，所以这一扩增从导向的等位基因就无法进行。然而，Asc403引物将与退火到恰好3’臂内的区域的hetR引物结合从导向基因座扩增434bp的带。因此，这一多重PCR揭示小仔的基因型如下野生型样品显示单一的241bp的带；杂合DNA样品产生241bp和434bp两个带；纯合样品仅显示导向特异的434bp的带。表1.Kv9.2引物序列musKv9.25′prFCTCTCAATTCAGGTGGCACCCTTAGAG-SeqIDNo.6musKv9.25′prRCACAGAATTCCCAATCATAAGACATAG-SeqIDNo.7musKv9.25′scrDR1CTCTCAATTCAGGTGGCACCCTTAGAG-SeqIDNo.8musKv9.25′armFAgeAaaaccggtATGTCCAGATCCTCATACATGGCACAC-SeqIDNo.9AaagcggccgcGACGTCGGTATCGGACACATCCCACAG-SeqIDNo.musKv9.25′armRNot10musKv9.23′armFAscTttggcgcgccTTGCTGATCTGCTGCTTGTGGTTCTAG-SeaIDNo.11AaaggccggccAATGTAACCATCGCTTCTGTAACCCAG-SeaIDNo.musKv9.23′armRFsc12musKv9.23′prFAGCAGAGCAGGTATGGCGTGGCATGTC-SeqIDNo.13musKv9.23′prRCTGGGGGAGCTCTCGTGCTATGATGAG-SeqIDNo.14musKv9.2hetFCCCATTTCTATCGGCGCCAAAAGCAAC-SeqIDNo.15musKv9.2hetRa403GTGCTAGAACCACAAGCAGCAGATCAG-SeqIDNo.16Asc403CAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGG-SeaIDNo.17DR1CATGCCGCCTGCGCCCTATTGATCATG-SeqIDNo.18实施例3.生物学数据基因表达模式(人RT-PCR)对人的组织使用RT-PCR，基因的表达显示于肺、脑、脾，稍少地，显示于前列腺、肝、生殖器官和肌肉。这在图2中显示。实施例4.生物学数据基因表达模式(LacZ染色的结构)LacZ染色以如下方式进行解剖组织的Xgal染色。制作大器官的有代表性的组织切片。将整个的小器官和管剪开，这样固定剂和染色剂可以穿透。组织在PBS(磷酸盐缓冲盐溶液)中充分漂洗，除去血液和肠内容物。将组织放入固定剂中(含2％甲醛、0.2％戊二醛、0.02％NP40、1mMMgCl2、0.23mM脱氧胆酸钠的PBS)30-45分钟。随后，在PBS中清洗3个5分钟，在30℃将组织放入Xgal染色溶液中(含有4mM亚铁氰化钾、4mM高铁氰化钾、2mMMgCl2，1mg/mlX-gal的PBS)18小时。组织用PBS清洗3次，在4％的甲醛中后固定24小时，贮存在70％的乙醇中前用PBS再次清洗。为了鉴别Xgal染色的组织，用腊包埋脱水的组织，切出7μm的切片，用0.01％的番红复染(9-10分钟)。使用LacZ染色，发现Kv9.2在脑中被表达，具体是在脑皮层、海马、海马回、苍白球(ventatepallidum)、中枢扁桃核(centralamydaloidnucleus)(CeL)，丘脑核以及脑皮层。此外，在心脏、脾、肺和睾丸中也看到染色的证据。实施例5.生物学数据生理学/生化学(血糖)从取自禁食过夜(14-16小时)的动物尾静脉的血液样品读取血糖读数。使用血糖监测器测定血糖。检查Kv9.2基因剔除的动物并与未剔除的同窝配偶(野生型)进行比较。剔除的动物的血糖水平为3.24±2.1mmol/l，与之相比较，野生型动物的血糖水平为4.69±0.38mmol/l(P＝0.006)。因此，Kv9.2剔除的动物与野生型动物相比显示血糖水平下降。该结果显示于图3中。实施例6.生物学数据行为分析(旷野试验OpenFieldTest)在旷野试验中检测剔除和野生型对照小鼠。参见Carola，V.，F.D′Olimpio，等，(2002)“用于在近亲交配的小鼠中评估与焦虑相关的行为的抬高的正-迷宫和旷野试验的评价”。简言之，将小鼠放入侧面透明的Perspex盒当中，用录像机记录一段时间内小鼠的活动。分析小鼠移动的距离、移动花费的时间以及小鼠在任何时间时的位置。对照动物通常花费大部分时间围绕盒子的周边移动，有时穿过中央区域。记录与这一正常模式的差异，具体的是在盒子的中央区域花费的时间量，该时间量的增加意味着动物焦虑性的减少。在录像机上记录一段时间内小鼠的运动并进行分析。结果显示剔除小鼠的移动少于野生型对照(WT1161.39±170.8cm；KO636.84±193.62p＝0.05ANOVA)。(图5A)分析这些数据显示剔除小鼠整体花费非常少的时间在周围区域和中央区域运动，即与野生型对照小鼠的运动相比，它们好像被冻僵一样，较长时间不移动(图5B)。Kv9.2剔除小鼠因而显示不活动性的增加。在中央区域运动花费的时间是WT56.2±12.7s；KO23.3±8.5sp＝0.01ANOVA，试验总的时间是300s，在周围区域运动花费的时间是WT44.3±4.4；KO24.7±7.9。Kv9.2剔除小鼠因此还显示移动时间的减少和外周不动时间的增加。进入外周和中央区域的总次数，即小鼠穿过旷野的次数在剔除小鼠中也大幅减少(WT7.3±2；KO2±1p＜0.01ANOVA)(图5C)。实施例7.生物学数据行为分析(正迷宫)在正迷宫中检验剔除和野生型对照小鼠。简单地说，使用抬高的正迷宫和录像跟踪测定小鼠的焦虑。该试验通过增加高度和开放性成分，利用小鼠探寻新环境的倾向与对照射明亮的开放区域厌恶的特性之间的冲突。两个交替的栏杆(arm)关闭，其具有高的黑暗的墙壁；另外两个栏杆则打开。小鼠更喜欢关闭的栏杆，但会冒险进入开放的栏杆。参见Pellow等，‘在抬高的正迷宫中确认从开放关闭栏杆的进入作为测定大鼠焦虑性方法’(1985)。尽管记录剔除小鼠与对照野生型小鼠相比移动了相似的距离，但是数据分析显示与对照小鼠相比，它们在关闭的栏杆中度过了明显更长的时间(认为安全)，并较少进入开放的栏杆(它被认为不安全)(图6)。这证明Kv9.2剔除小鼠具有焦虑表现型，因此Kv9.2与焦虑障碍有关。本文中提到的每个申请和专利，和上述各个申请和专利中引用或参考的每篇文献，包括在处理各个申请和专利的过程中(“申请引用的文献”)以及在各个申请和专利中以及任何申请引用的文献中引用或提到的任何产品的任何制造商的说明或目录本文引用作为参考。此外，本文中引用的所有文献，本文引用的文献中引用和参考的所有文献，以及本文引用或提到的任何产品的任何制造商的说明或目录本文引用作为参考。本发明描述的方法和系统的各种修正和变化对本领域熟练的技术人员来说是显而易见的，它们不背离本发明的范围和精神。尽管本发明结合具体优选的实施例进行描述，应当理解如权利要求所要求的本发明不应不适当地限制在这些具体的实施例中，可在本发明的范围内对其进行很多修正和添加。当然，描述的用于完成本发明的方式的各种修正(这对分子生物学或相关领域熟练的技术人员是显而易见的)在本发明的权利要求范围内。此外，在独立权利要求的特征不背离本发明范围的情况下，可进行其后的从属权利要求特征的各种组合。权利要求1.一种具有功能遭到破坏的内源基因的转基因非人动物，其中，所述Kv9.2基因包含SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO4显示的核酸序列或者与所述序列具有至少70％的序列同一性的序列。2.根据权利要求1所述的转基因非人动物，所述转基因非人动物在Kv9.2基因或其部分中具有缺失。3.根据权利要求1或2所述的转基因非人动物，所述转基因非人动物显示下列表现型中的任何一个或它们的组合与野生型动物相比(a)血糖水平下降；(b)焦虑性增加，优选地如在旷野试验和/或正迷宫试验中测定的。4.一种转基因非人动物，其中所述动物至少部分或全部Kv9.2基因用来自另一个动物，优选是另一物种，更优选是人的Kv9.2基因的序列取代。5.根据前述任何一项权利要求所述的转基因非人动物，所述动物是小鼠。6.根据权利要求5所述的转基因非人动物，所述动物包含功能遭到破坏的Kv9.2基因，优选地Kv9.2基因中有缺失，其中Kv9.2基因包含SEQIDNO4显示的核酸序列或者与其具有至少70％的序列同一性的序列。7.一种来自根据前述任何一项权利要求所述的非人转基因动物的分离的细胞或组织。8.一种具有功能遭到破坏的内源Kv9.2基因的细胞，其中所述Kv9.2基因包含SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO4显示的核酸序列，或者与所述序列具有至少70％的序列同一性的序列。9.根据权利要求1-6中的任何一项所述的转基因非人动物、根据权利要求7所述的细胞或组织、或者根据权利要求8所述的细胞作为焦虑或糖尿病模型的用途。10.根据权利要求1-6中的任何一项所述的转基因非人动物、根据权利要求7所述的细胞或组织、或者根据权利要求8所述的细胞作为与Kv9.2相关的疾病模型的用途。11.根据权利要求1-6中的任何一项所述的非人转基因动物、根据权利要求7所述的其分离的细胞或组织、或者根据权利要求8所述的细胞在鉴别Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂的方法中的用途，所述Kv9.2多肽包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与所述序列具有至少70％的序列同一性的序列。12.一种鉴别具有SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与所述序列具有至少70％的序列同一性的序列的Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂的方法，所述方法包括给予动物候选化合物，所述动物优选地是野生型动物或根据权利要求1-6中的任何一项所述的转基因非人动物，并测定任一下列表现型的变化(a)血糖水平；和(b)焦虑性，优选地如在旷野试验和/或正迷宫试验中测定的。13.一种鉴别根据权利要求12所述的Kv9.2多肽的激动剂的方法，所述方法包括鉴别能够引起动物显示(a)-(b)中任一表现型增高的候选化合物。14.一种鉴别根据权利要求12所述的Kv9.2多肽的拮抗剂的方法，所述方法包括鉴别能够引起动物显示(a)-(b)中任一表现型或所述表现型降低的候选化合物。15.一种鉴别具有SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与所述序列具有至少70％的序列同一性的序列的Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂的方法，所述方法包括将候选化合物与细胞或组织接触，所述细胞或组织优选地是野生型细胞或组织，或者根据权利要求7所述的细胞或组织，或者根据权利要求8所述的细胞，并测定细胞或组织细胞的传导性或动力学的变化。16.一种鉴别根据权利要求15所述的Kv9.2多肽的激动剂的方法，所述方法包括鉴别能够增高细胞传导性或动力学的候选化合物。17.一种鉴别根据权利要求15所述的Kv9.2多肽的拮抗剂的方法，所述方法包括鉴别能够降低细胞传导性或动力学的候选化合物。18.一种鉴别适合于治疗或缓解焦虑或糖尿病，优选是与Kv9.2相关的疾病的化合物的方法，所述方法包括将包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与所述序列具有至少70％的序列同一性的序列的Kv9.2多肽与候选化合物接触，并确定所述候选化合物是否是Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂。19.包含SEQIDNO1、SEQIDNO2或SEQIDNO4显示的核酸序列或与其具有至少70％的序列同一性的序列的Kv9.2多核苷酸用于鉴别Kv9.2多核苷酸的激动剂或拮抗剂的用途，所述Kv9.2多核苷酸的激动剂或拮抗剂用于治疗焦虑或糖尿病，优选与Kv9.2相关的疾病。20.包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与其具有至少70％的序列同一性的序列的Kv9.2多肽用于鉴别Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂的用途，所述Kv9.2多肽的激动剂或拮抗剂用于治疗焦虑或糖尿病，优选与Kv9.2相关的疾病。21.一种具有SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与其具有至少70％的序列同一性的序列的Kv9.2多肽的拮抗剂，在治疗个体中焦虑或糖尿病，优选与Kv9.2相关的疾病的方法中的用途。22.Kv9.2多肽的拮抗剂在制备治疗个体中焦虑或糖尿病、优选与Kv9.2相关的疾病的药物组合物中的用途，所述Kv9.2多肽具有SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列或与其具有至少70％的序列同一性的序列。23.一种治疗患有焦虑或糖尿病，优选患有与Kv9.2相关的疾病的个体的方法，所述方法包括给予所述个体Kv9.2的拮抗剂。24.一种诊断个体中焦虑或糖尿病，优选Kv9.2相关疾病的方法，所述方法包括检测个体或其细胞或组织中Kv9.2的表达、水平或活性的变化。25.根据权利要求10、19、20或22所述的用途，根据权利要求18、23或24所述的方法，或根据权利要求21所述的拮抗剂，其中所述与Kv9.2相关的疾病选自由下列组成的组I型和II型糖尿病、高胰岛素血症、胰岛素分泌过多症、胰岛素抗性、糖尿病并发症包括糖尿病相关的血管病、糖尿病相关的肾病和糖尿病相关的神经病，以及治疗低血糖、高脂(它们是HDL、LDL或VLDL)血症、异常脂血症、无论其起因是原发于或是继发于糖尿病、甲状腺机能亢进/减退、肢端肥大症、肝功能衰竭、肾衰竭、胰腺瘤、胰腺炎以及酒精诱导的低血糖。26.根据权利要求10、19、20或22所述的用途，根据权利要求18、23或24所述的方法，或根据权利要求21所述的拮抗剂，其中所述Kv9.2相关疾病选自由下列组成的组社交焦虑症、外伤后应激反应障碍、恐惧症、社交恐惧症、特殊恐惧症、惊恐性障碍强制性障碍、急性应激反应障碍、分离焦虑性疾病、广泛性焦虑性疾病、重性抑郁症、精神抑郁症、两极障碍、季节性情感障碍、产后抑郁症、躁狂抑郁症、两极抑郁症、焦虑症、焦虑性疾病、焦虑相关行为和广泛性焦虑性疾病、广场恐怖症、急性应激反应障碍和DSM-IV中所列的那些惊恐性障碍及抑郁。27.一种Kv9.2多肽，其中所述Kv9.2多肽包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列，或与所述序列具有至少70％的序列同一性的其同源物、变体或衍生物。28.一种编码根据权利要求27所述的多肽的核酸。29.一种根据权利要求28所述的核酸，所述核酸包含SEQIDNo1、SEQIDNo2或SEQIDNO4显示的核酸序列，或与其具有至少70％的序列同一性的其同源物、变体或衍生物。全文摘要本发明公开了包含SEQIDNO3或SEQIDNO5显示的氨基酸序列的Kv9.2多肽及其同源物、变体和衍生物。还公开了能够编码Kv9.2多肽的核酸，具体是包含SEQIDNo.1、SEQIDNo.2或SEQIDNO4显示的核酸的核酸。文档编号C12Q1/68GK1976949SQ200580021599公开日2007年6月6日申请日期2005年4月28日优先权日2004年4月28日发明者尼科拉·布赖斯,马克·卡尔顿,约翰·狄克逊,伊莎贝拉·马林格,德克·扎恩申请人:帕拉迪姆医疗有限公司