管洗脱液260nm和280nm紫外吸收值，作洗脱曲线，W吸收峰作为不同组分的依据，对 相应峰的洗脱液通过琼脂糖电泳和氯仿/酪法去蛋白后核酸琼脂电泳，鉴定洗脱液，确定 含核糖体的麦胚抽提物并收集，得到目标物，置液氮中保存备用。
[0013] A步骤中所述的悬浮液为环己烧-四氯化碳溶液。
[0014] 所述的环己烧-四氯化碳溶液的体积配比为2 ;5。
[0015] A步骤中所述的裂解液为NP-40。
[0016] 所述的裂解液的浓度为0. 5%。
[0017] A步骤中所述的超声处理是在20-40化下处理2~4min。
[001引 B步骤中所述的核糖体抽提缓冲液为2XBufferA，配方具体为；40mMH巧es/KOH、 120mMK(AC)2、5mMMg(AC)2、2mMCaCl2、4mMDTT。
[0019] B步骤所述的标准混合氨基酸ImM/each(购于promega公司）。
[0020] 本发明的应用为所述的核酸核糖体结合体系构建方法用于研究药物筛选的应用。
[00川 实施例1 1、材料和方法： 1.1病毒核酸-核糖体结合体系（S3)的构建： 在经0. 1%DEPC处理过的500ul体积的离屯、小管中进行。把管置于冰上，25ul反应体系 中分别加入12ul核糖体麦胚抽提溶液，再依次加入lulRNAsin(40U/U1，Takara)，2ul溶液 A(含 100mlKAC, 4mMMg(AC)2, 20mMH巧es, 20mMDTT)，lulImM/each20 种氨基酸标 准混合液（promega)，2.加110mMATP，lull0mMGTP，0.5ul2mM放线菌酬，1.5ul8mM 磯酸肌酸，lugTMV-RNA, 0. 5ul磯酸肌酸激酶。最后用DEPC处理水补足25ul。混合再低 速点式离屯、后置于室温（23~26°C)下15分钟。然后回置于冰上。同时设置不同组成的体 系，各体系组成见表1，进行相同操作。
[0022] 表1结合反应设置各处理的组成表
【主权项】
1. 一种核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于所述的核酸核糖体结合体系构建方 法是在经0. 1%DEPC处理过的500y1的离心小管中于0~5°C加入12y1核糖体麦胚抽提 溶液，再依次加入lulRNAsin(40U/ul，Takara)，2ul含 100mMKAC, 4mMMg(AC)2, 20mM Hepes, 20mMDTT的溶液，IulImM/each20 种氨基酸标准混合液（promega)，2.5ulIOmM ATP,IulIOmMGTP，0.5ul2mM放线菌酮，1.5ul8mM磷酸肌酸，lugTMV-RNA, 0.5ul 磷酸肌酸激酶，用DEPC处理水补至25y1，离心后置于23~26°C下14~16min，然后转置于 〇~5°C条件下得到核酸-核糖体结合体系。
2. 根据权利要求1所述的核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于所述的核糖体 麦胚抽提溶液是经麦胚的制备、核糖体麦胚抽提物的制备步骤制备得到，具体包括以下步 骤： A、 麦胚的制备：取小麦种子，干燥至含水量12%，粉碎过孔径Imm筛，再过孔径0? 45mm 筛，收集0. 45mm筛上的麦粉颗粒，加入麦粉颗粒固液体积比2~5倍的悬浮液，悬浮得到悬浮 颗粒，去除溶剂后挑选完整麦胚，完整麦胚进一步洗涤，洗涤后加入固液体积比8~12倍的 无菌水，置于摇床上于温度3~5°C晃摇洗绦8~12min，洗绦2~4次，加入固液体积比]-3倍的 裂解液，超声处理，弃去裂解液，加入固液体积比8~12倍的DEPC处理水于摇床上震摇处理 8~12min，处理2~4次，干燥，于3~5°C保存备用； B、 核糖体麦胚抽提物的制备：称取A步骤制备的麦胚0. 05~0. 15g，置于DEPC处理过 的离心管中，加液氮，研磨成粉末，加入0. 5~I. 5ml的核糖体抽提缓冲液和8~12y1标 准混合氨基酸，混摇使粉末分散，置于频率30Hz的振荡器上震荡抽提20~40s，于0~5°C 静置2~4min，于3~5°C、转速30000r/min离心20~40min，上清液上SephadexG-25 柱，用IXBufferA洗脱，以I. 5ml/管或0? 5ml/管依次收集洗脱液，并将洗脱液于3~ 5°C、转速30000r/min离心8~12min纯化处理，测定各管洗脱液260nm和280nm紫外吸收 值，作洗脱曲线，以吸收峰作为不同组分的依据，对相应峰的洗脱液通过琼脂糖电泳和氯仿 /酚法去蛋白后核酸琼脂电泳，鉴定洗脱液，确定含核糖体的麦胚抽提物并收集，得到目标 物，置液氮中保存备用。
3. 根据权利要求2所述的核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于A步骤中所述的 悬浮液为环己烷-四氯化碳溶液，其体积配比为2 :5。
4. 根据权利要求2所述的核酸核糖体结合体系构建方法，，其特征在于A步骤中所述的 裂解液为NP-40。
5. 根据权利要求2所述的核酸核糖体结合体系构建方法，其特征在于B步骤中所述 的核糖体抽提缓冲液为2XBufferA，配方具体为：40mMIfepes/K0H、120mMK(AC)2、5mM Mg(AC)2、2mMCaCl2、4mMDIT。
6. -种权利要求1~5任一所述的核酸核糖体结合体系构建方法的应用，其特征在于所 述的核酸核糖体结合体系构建方法用于研宄药物筛选的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种核酸核糖体结合体系构建方法及应用。所述的核酸核糖体结合体系构建方法是在经0.1%DEPC处理过的500μl的离心小管中于0~5℃加入12μl核糖体麦胚抽提溶液，再依次加入1ul RNAsin(40U/ul，Takara)，2ul含100mM KAC,4mM Mg(AC)2,20mM Hepes, 20mM DTT的溶液，1ul 1mM/each 20种氨基酸标准混合液（promega），2.5ul 10mM ATP,1ul 10mM GTP,0.5ul 2mM 放线菌酮，1.5ul 8mM磷酸肌酸, 1ug TMV-RNA,0.5ul磷酸肌酸激酶，用DEPC处理水补至25μl，离心后置于23~26℃下14~16min，然后转置于0~5℃条件下得到核酸-核糖体结合体系。应用为所述的核酸核糖体结合体系构建方法用于研究药物筛选的应用。本发明构建的核酸核糖体结合体系可应用于病毒核酸-核糖体结合抑制的药物筛选研究。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N5-04
【公开号】CN104774801
【申请号】CN201510173632
【发明人】陈齐斌, 滕晓红, 吴德喜, 杨永红, 苏发武, 赵明富, 马晓东, 李重九
【申请人】云南农业大学
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2015年4月14日