专利名称：将核酸导入高等真核细胞内的结合体的制作方法
技术领域：
本发明属于DNA技术领域。具体地说，本发明涉及将核酸导入高等真核细胞内的方法。
在基因治疗中，需要建立一个将核酸导入活细胞内的有效系统。将基因导入细胞内是为了实现在体内合成治疗上有效的基因产物，例如在有遗传缺陷的情况下取代有缺陷的基因。“常规”基因治疗是基于用单一治疗方法达到持久治愈这一原则。但也需要这样的治疗方法，即一次性或必要时重复给予作为药物(“基因治疗剂”)的治疗上有效的DNA(或mRNA)。可进行基因治疗的遗传性疾病的例子有血友病、β-地中海贫血和“严重复合免疫缺陷症”(SCID)此乃为遗传性腺苷脱胺酶缺乏而引起的综合症。其他可能的应用是用于免疫调节，其中通过免疫接种注射编码分泌性蛋白质抗原或非分泌性蛋白质抗原的功能性核酸，以建立体液或细胞内免疫。可用编码有缺陷基因的核酸治疗的遗传缺陷还包括营养不良(营养障碍基因)、囊性纤维变性(囊性纤维变性跨膜电导调节基因)、高胆固醇血症(LDL受体基因)。当激素、生长因子或具有毒性或免疫调节活性的蛋白质需在体内被合成时，基因治疗方法也有很大应用价值。
通过使用所谓的“肿瘤疫苗”进行基因治疗也可望用于治疗肿瘤。为了提高肿瘤细胞的免疫原性，可以对其进行改变以使之有更大抗原性或使之产生某些细胞活素，以激发免疫反应。为此，可用编码细胞活素如IL-2、IL-4、γ-IFN、α-TNF的DNA转染细胞。迄今为止，已通过还原病毒载体将基因转移到自体肿瘤细胞中。
反义RNA和DNA以及核酶的活性特征能使之用作治疗剂，以阻断某些基因在体内的表达(如失调的癌基因或病毒基因)已有证据表明，短的反义寡核苷酸可进入细胞内并在其中发挥其抑制作用(Zamechiketal.，1986)，但由于核酸带有强负电荷使之难以通过细胞膜被细胞摄入，以致它们只有很低的细胞内浓度。
虽然已有多种技术可在体外将基因转移到哺乳动物细胞内，但这些技术在体内应用时却受到了限制(这些技术包括借助脂质体、电击法、微量注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖或磷酸钙沉淀等方法导入DNA)。
近年来，已发现了生物学载体，其亲代病毒的有效进入机制可引起基因转移。已将这一技术措施用于构建重组还原病毒和腺病毒载体，从而得以在体外和体内进行高效基因转化(Berkner，1988)。尽管它们很有效，但这些载体受到被转移之DNA的大小和构建的限制。此外，从其转移原始病毒之活病毒基因成分的角度来说，这些制剂是有一定危险性的。例如使用还原病毒时就存在着问题，因为它至少存在着较低频率地引起病毒感染(通过与内源病毒重组或可能继而突变成病原因子)或导致肿瘤生成的危险。再者，不可期望在每种情况下都借助还原病毒稳定地转化病人的体细胞，因为一旦出现有害影响，这只能使治疗更难以逆转。
为了避免这些限制，已发展另外一些基于转移大分子所用细胞之机制的基因转移战略。其中一个例子是通过极为有效的受体介导的胞吞作用途径将基因转移到细胞中(WuandWu，1987，Wagneretal.，1990andEP-Al0388758)。该方法使用了具有DNA结合区和对细胞表面受体有特异性之区域的双功能分子结合体(WuandWu，1987，Wagneretal.，1990)。如果识别区(下称“内在化因子”)被细胞表面受体识别，结合体即可通过受体介导的胞吞途径内在化，其中结合在结合体上的DNA也得以转移。使用该方法可使基因转移率至少能与使用常规方法的转移率相同(Zenkeetal.，1990)。
虽然该载体系统能够将大量DNA运输到具有适当细胞表面受体的细胞内，但相应的基因表达却常常不能与这一转移能力相适应(Cottenetal.，1990)。据推测，出现这种现象的原因可能是通过受体介导的胞吞作用转运到细胞内的DNA落入溶酶体内，致使DNA遭到降解(Zenkeetal.，1990;Cottenetal.，1990)。因此，进入溶酶体中的DNA没有任何特异性机制得以离开此细胞内囊泡系统，这一事实便构成了使用该转运系统时存在的固有限制。
本发明的目的在于减小或消除这些限制。
有许多病毒都能借助于一机制有效地进入真核宿主内，此机制则基本上都与上述受体介导的胞吞作用机制相当。基于这一机制的病毒感染一般都是随着病毒颗粒与细胞膜上的受体相结合而开始的。此后，病毒便进入细胞内。该内在化过程遵循一个与生理学配基或大分子进入细胞相对应的共同途径首先，细胞表面上的受体自身排列成组群，膜向内翻转形成一个由包层环绕的囊泡。然后囊泡本身脱离其笼形包被物，借助位于膜中的质子泵在其内部发生酸化。这一过程引起了病毒从核内体释放。根据病毒是否具有脂质衣壳，可将从核内体释放的病毒分为两个类型来考虑;在所谓“裸”病毒(如腺病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)的情况下，据称低pH可引起病毒蛋白质构型的改变。这样便使之暴露出在生理pH条件下不能接近的疏水区。因此这些区域便获得了与核内体膜相互作用的能力，从而导致病毒基因组从核内体释放到胞浆中。对于有外壳的病毒(如水泡性口炎病毒、SemlikiForest病毒、流感病毒)，则推测低pH可修饰某些病毒蛋白质的结构或构型，从而促进病毒外膜与核内体膜的融合。借助这一机制穿入细胞内的病毒具有某些分子特性，使之能够打破核内体膜，得以进入胞浆内。
其他病毒，如有外壳包裹的仙台病毒、HIV及某些莫罗尼白血病病毒的毒株，或者无外壳的SV40和多形瘤病毒，穿入细胞时则不需要低pH;它们可以在细胞表面上直接与膜融合(仙台病毒，可能还有HIV)，或者能够启动破开细胞膜或穿过细胞膜的机制。据推测，不依赖于pH的病毒也能够使用胞吞途径(McClureetal.，1990)。
在完成本发明前的实验中已证实，借助核酸复合体(其中核酸与多聚阳离子复合，也可偶联上内在化因子，如转铁蛋白-多聚赖氨酸结合体)进行基因转移时，可因用腺病毒、特异性还原病毒或用病毒片段处理而得以增强。这种效应是利用了下述现象而达到的;即这些病毒通过胞吞机制被摄入细胞内，而且还具有使之得以打开核内体以从囊泡系统中逃离的特异性机制，例如腺病毒(pastanetal.，1986)。从这些观察入手，通过发展含有病毒(作为其功能性构建体的整合部分)的生物接合体而解决了本发明的问题。
本发明涉及新的结合体，该接合体具有与核酸形成复合物的能力，并含有内在化因子和对核酸有亲和性以将核酸导入高等真核细胞的物质，特征在于内在化因子可以是附着在由一抗体形成的对核酸有亲和性的物质上的病毒，以这种方式它本身能够作为结合体/核酸复合体的一部分穿入细胞内，并能释放出核内体的内容物，其中复合体在进入细胞后被定位在胞浆内。
本发明还涉及包含核酸和本发明之结合体的复合体，其中所说的结合体包括内在化因子和对核酸有亲和性的物质。
本发明还涉及用于转化很少或没有病毒受体之高等真核细胞的复合体，特征在于它们进一步包含了与对核酸有亲和性的物质结合之内在化因子的第二结合体，其中内在化因子是对高等真核细胞的表面受体特异的，且其中病毒结合体和内在化因子结合体是与核酸复合的。
本发明还涉及将核酸导入高等真核细胞内的方法，特征在于用本文所述的本发明的核酸复合体之一处理细胞。本发明还涉及医药组合物，特征在于它们所含作为活性的成分是本发明的一种核酸复合体。
图1图解显示含有腺病毒衣壳上外来抗原决定基的腺病毒一多聚阳离子-DNA复合体。为了连接腺病毒和多聚阳离子DNA结合区，使用在其六位体蛋白的外部区域中含有异源抗原决定基的嵌合腺病毒p202-Ad5连接对该抗原决定基有特异性的单克隆抗体MP301。通过连接多聚赖氨酸部分使单克隆抗体有能力携带外来DNA序列。通过已连接之抗体的特异性使得多聚赖氨酸-抗体复合的DNA与腺病毒p202-Ad5发生相互作用。
图2嵌合腺病毒Ad5-p202的制备。
图3使用腺病毒-多聚阳离子-DNA复合体进行基因转移。估测特异和非特异性复合成分的各种组合，以确定它们介导报导基因转移到Hela细胞内的能力。使报导质粒PRSVL(6μg)〔DNA〕与抗体-多聚赖氨酸(9.5μg)〔MP301 pLys〕或等摩尔量未结合的多聚赖氨酸(4μg)〔pLys〕相复合。在与腺病毒结合前稀释该复合的DNA。在没有或存在非赖氨酸化单克隆抗体〔Mp301〕或等摩尔量无关单克隆抗体〔抗大鼠IgG〕的情况下，向DNA复合体(2.5×1010个DNA分子)加入抗原决定基标记的病毒〔p202-Ad5〕或无关腺病毒〔WT300〕(2.5×1010个颗粒)。对于某些实验，在同抗体-多聚赖氨酸-DNA复合体结合前先热失活腺病毒p202〔p202-Ad5(h.i.)〕。保温后，估测细胞溶胞产物的虫荧光素酶报导基因的表达。
图4确定为介导基因转移所需的腺病毒与多聚赖氨酸-抗体-复合之DNA的最适比例。使固定量的抗体-多聚赖氨酸-DNA复合体与各种摩尔比例的抗原决定基标记的腺病毒结合，并估测其介导基因向Hela细胞内转移的能力。
图5检测借助腺病毒-多聚阳离子-DNA复合体完成的基因转移。估测复合体的稀释界限可通过检测能引起可测性虫荧光素酶基因在Hela细胞内表达的介导能力来完成。点线代表虫荧光素酶基因在未处理之Hela细胞内表达的本底水平。
图6由腺病毒-多聚赖氨酸-DNA复合体介导的基因向各种细胞系内的转移。向抗体-多聚赖氨酸Mp301pLys和报导质粒DNA pRSVL间形成的复合物内加入抗原决定基标记的腺病毒p202-Ad5(2.5×1010个颗粒)。将所得的腺病毒-多聚赖氨酸-DNA复合体与Hela、HBEl、KB和MRC-5等细胞系一起保温(图3)。如前所述估测细胞溶胞产物中报导基因的表达水平。
图7由含有腺病毒和人铁传递蛋白的嵌合复合体介导的基因转移。A.由人铁传递蛋白-多聚赖氮酸-DNA复合体、腺病毒-多聚赖氨酸-DNA复合体，和含有腺病毒与人铁传递蛋白区域之结合物的三元复合体介导的基因表达的相对水平。按照已描述的方法(Wagner et al.，1990)使pRSVL DNA(6μg)与人铁传递蛋白-多聚赖氨酸结合物〔hTfpL〕结合形成铁传递蛋白-多聚赖氨酸-DNA复合体。按图3中所述制备腺病毒-多聚赖氨酸-DNA复合体〔AdpL〕。向抗原决定基标记的腺病毒p202-Ad5(2.5×1010个颗粒)内依次加入多聚赖氨酸单克隆抗体MP301pLys(2μg)、质粒DNA pRSVL(6μg)和人铁传递蛋白-多聚赖氨酸(9μg)，以形成嵌合复合体〔AdpL/hTfpL〕。输送到Hela细胞内并如前所述估计报导基因表达。B.对由腺病毒-人铁传递蛋白三元复合体介导的基因转移的相对敏感性。按上文所述形成含有结合有腺病毒和人铁传递蛋白区域的嵌合复合体。释放到Hela和HBEl细胞系内，并按图3所述分析报导基因表达。
图8。经位点特异性诱变在Ad5六位体基因序列中产生潜在的插入位点。其中体外诱变是使用含有Ad5基因组之左半部分(0-76m.u.)的质粒EcoRIAd5进行的。六位体基因位于m.u.52-60之间。六位体亚基的立体草图是根据Roberts等人(1986)的草图改制的。
本发明涉及一种为将核酸导入高等真核细胞，具有与核酸形成复合物之能力，并含有内在化因子和对核酸有亲和性之物质的结合物。该结合物的特征在于内在化因子是一种通过抗体结合到与核酸结合的物质上，通过这样的方式其本身能够作为结合物/核酸复合物的一部分穿透到细胞内，并释放核内体的内容物，其中复合物在进入细胞后定位于胞浆内。这样的结合物可用来将核酸导入具有腺病毒受体的高等真核细胞内。本发明还涉及用于转化很少有或没有病毒受体之高等真核细胞的复合物，特征在于它们进一步包含结合到对核酸有亲和性之内在化因子的第二结合物，其中内在化因子是对高等真核细胞的表面受体特异的，且其中病毒结合物和内在化因子结合物是与核酸复合的。
病毒穿入细胞内并释放核内体(结合体/核酸复合物定位于其中)内容物进入胞浆的能力在下文中称为“摄入功能”。
本发明的结合体结合了基于内在化因子结合体之载体系统的优点和病毒引入这些系统中的优点。
与由受体介导的胞吞作用引起的基因转移相比较，本发明的病毒-多聚阳离子-DNA复合体具有消除已知的分子结合系统中所固有的基本限制的优点，本发明的复合体与已知结合物不同，它们具有特异机制，能使之由细胞囊泡系统中释放出来。与生物载体相比，本发明的载体系统与重组病毒载体有着基本概念上的不同，即其中被运送的外来DNA携带于病毒颗粒的外部。因此，本发明的结合体可运送很大的基因构建体进入细胞，而没有任何因序列造成的限制。
适用本发明的病毒是根据其摄入功能限定的。适当的病毒包括能够通过受体介导的胞吞作用穿入细胞内并引起它们释放，从而使核酸由核内体释放到胞浆中的病毒。(适用于本发明之范围内的病毒进一步限定于它们即使是核酸复合体的成分也仍保留这一特性)。虽然并不希望拘泥于这一理论，但该机制可有利于核酸复合体转移到细胞内，以致病毒释放核内体内容物的能力可防止核内体与溶酶体间的融合，并进而防止在通常情况下这些细胞器内出现的酶促分解作用。
高等真核细胞是人们熟知的，且不包括酵母。(参见MolecularBiologyoftheGene，JamesD.Watsonetal.，theBenjamin/CummingsPublishingCompany，Inc.，pp.676-677(1987))。能够受腺病毒感染之高等真核细胞的例子参见Fields，B.N.andKnipe，D.M.(1990)的文献。
给定之细胞系对受病毒(作为结合体进入的促进剂/配体)转化的敏感性依赖于病毒之靶细胞表面受体的存在和数量。Svensson(1985)和Defer(1990)描述了检测Hela和KB细胞之腺病毒细胞表面受体数目的方法。其中提到腺病毒的受体是相当普遍地存在的。因此，许多细胞系可被包含腺病毒或其部分的载体系统转化。然而，某些高等真核细胞却很少有或没有病毒受体。当转化这样的细胞时，须利用结合到对核酸有亲和性之物质上的内在化因子的第二结合体，其中内在化因子是对高等真核细胞的表面受体特异的，且其中病毒结合体和内在化因子结合体与核酸相复合。可使用这种“三元复合体”成功地提高对高等真核细胞如呼吸道上皮细胞系HBE1(其具有相当低的细胞表面腺病毒受体数)的转化作用。
病毒通过受体介导的胞吞作用在感染开始时发挥摄入功能，这一性质适于作为本发明结合体之一部分，这些病毒一方面包括没有脂质衣壳的病毒如腺病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒;另一方面包括有衣壳的病毒如水泡性口炎病毒、SemlikiForest病毒、流感病毒;也可使用Moloney病毒的pH依赖性毒株。最好是使用腺病毒C亚组、5型，SemlikiForest病毒、水泡性口炎病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和莫罗尼白血病病毒。虽然尚未完全了解许多病毒的进入过程。但许多其他病毒也很可能会表现出所需的摄入功能，从而可用于本发明的方法中。
本发明的一个重要优点是，如在使用标准的重组病毒载体的情况下，被转移的外来DNA并不整合到亲本病毒的基因组中(Berkner，1988;EglitisandAnderson，1988)。因此，就被表达之外来基因序列的设计来说，因为转录并不依赖于亲本病毒基因中的启动子，本发明提供了更大的伸缩性。另外，因为病毒包装束缚并不限制可携带于外部之DNA的量，所以这一方案可大大增加可转移之外来DNA的大小。基于这些实践上的和直接的优点，这种对载体的设计可获得重要的潜在安全性保障。而常规重组病毒载体介导亲本病毒基因组成分的专性转移，这将产生潜在范危害(Ledley，1989;Anderson，1984)。因为腺病毒-多聚赖氨酸复合体选择性地利用病毒进入特性，所以该病毒基因组并不是首要的条件。这一设计有可能用功能上和/或结构上失活的病毒基因组对本系统进行修饰，以尽可能地减小因转移亲本病毒之存活基因而带来的危害。
在本发明的范围内，具有上述摄入功能的病毒除野生型者外，还包括那些丧失了除其摄入功能外的某些其他野生型功能，特别是因一种或多种突变而丧失了复制能力的突变体。但在本发明的实践中，也可以使用已丧失了它们的摄入功能的突变体，只要它们是作为本文限定之“三元复合体”的一部分，并且该突变体没有丧失其核内体裂解活性即可。
可用常规诱变方法，在负责复制功能的并可通过包装线得以补偿的病毒-蛋白区内进行突变而产生突变体。例如在使用腺病毒的情况下，这些突变体包括ts突变体(温度敏感型突变体)、E1A和E1B突变体、在MLP驱动基因中表现突变的突变体(Berkner1988)以及在某些衣壳蛋白区域中表现突变的突变体。也可使用具有相应自然突变的病毒株。例如可使用文献中已描述过的噬菌斑检测法来研究病毒复制的能力，其中用各种病毒浓度的悬浮液包被细胞培养物，并记录可借助噬菌斑显示的溶解之细胞的数目(Dulbecco1980)。
可适用于本发明范围内的其他病毒包括所谓的缺陷性病毒，即有一个或多个基因缺少病毒自动复制所需的功能，而需要辅助病毒的病毒。这类病毒的例子包括DI颗粒(缺陷性干扰颗粒)，它是由感染性标准病毒衍生来的，具有与标准病毒相同的结构蛋白质，具有突变并在复制时需要以标准病毒作为辅助病毒(Huang，1987;Holland，1990)。这类病毒的例子还包括卫星病毒(Holland，1990)。另一类是称为腺相关病毒的脊髓灰质炎病毒(Berns，K.I.，1990)。
减毒的活疫苗(Ginsberg，1980)和可作疫苗接种的病毒株也适用于本发明。
包括在本发明范围内的病毒还有失活的病毒，如，如经过用化学药物如甲醛处理、用紫外光(UV)照射、结合化学处理和紫外光照射(如补骨脂类/紫外照射)、γ射线照射或中子轰击失活的病毒，以及病毒的一部分，如没有核酸的蛋白质内容物(空病毒衣壳)，条件是它们具有完整病毒的摄入功能。
也可使用按已知方法(DavisandDulbecco，1980，HearstandThiry，1977)制备的用作疫苗的失活的病毒，然后试验它们是否适于作为本发明结合体的成分。
病毒也可以是在对于摄入功能非必需的区域中具有外来抗原决定基的嵌合病毒。但即使这样的嵌合病毒失去了它们的摄入功能，也可以将其作为上述“三元复合体”的一部分用于本发明，只要病毒没有丧失其核内体裂解特性即可。
为了选择一种病毒、一种失活的病毒或一种病毒成分以进行特定的转染试验，首先，就可以在初步试验中对该病毒进行研究，例如看它是否能在核酸/多聚阳离子复合体摄入靶细胞后发挥作用。此外，可使用生物结合体如对被转染的靶细胞有特异性的铁传递蛋白-多聚阳离子结合体或其他生物结合体进行转染试验，然后通过检测报导基因的表达来检查其提高基因转移程度的能力，从而检验其摄入功能。
当使用完整病毒时，最好在有或没有含有与对核酸有亲和性之物质连接的内在化因子的第二结合体存在下，与研究病毒加强基因转移之能力的初步试验一起进行平行试验，以观察病毒有无复制能力。在使用细胞致病病毒或对宿主细胞生长有明显损害之病毒的情况下，可用噬菌斑检测法来研究病毒复制能力。对于其他病毒，则使用对所研究的病毒特异的检测方法，如血凝试验或化学-物理学方法(使用电子显微镜)。
在本发明的范围内，优选的病毒是可以高滴度产生的、稳定的、在其天然状态下有低病原性的并可能在击靶后消除其复制能力的病毒，特别是腺病毒。如果要转染特定细胞群，最好是使用对该细胞群有特异感染力的病毒。如果意欲感染不同的细胞类型，则使用对各不同类型细胞都有感染性的病毒。
在所有情况下，为进行体内治疗应用，只使用那些有尽可能小的危险性的，特别是在细胞中有尽量小的复制危险而且病毒DNA与宿主DNA间重组的可能性小的病毒或病毒成分。
在初步试验中，使用常规紫外灭菌灯或用甲醛使腺病毒制剂失活，并令人惊奇地发现病毒失活的程度明显大于基因转移效果的降低。这一事实清楚地表明，活病毒中与正常感染机制相联系的机制可在没有消除基因转移所必需之效应的情况下受到破坏。
可用于本发明的对核酸有亲和性的物质包括均质多聚阳离子，如多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚鸟氨酸，或者有两个或多个带不同正电荷之氨基酸的异质多聚阳离子，这些多聚阳离子可能有不同的链长度，另外还包括非肽合成多聚阳离子如聚乙烯亚胺。适用的其他对核酸有亲和性的物质是有多聚阳离子性质的天然DNA结合蛋白，如组蛋白或鱼精蛋白或其类似物或片段。
本发明的复合物除含有病毒结合体外，还可含有另一种结合体，即其中对核酸有亲和性的物质(一般与病毒结合体中者是相同的)是与对靶细胞有亲和力的内在化因子偶联的。当靶细胞没有或有很少病毒受体时，本发明的这一实施方案特别适用。在另一种内在化因子-结合因子结合体，病毒可得益于第二结合体的内在化能力而结合到核酸及第二结合体上，并作为所得“结合-复合物”的一部分被摄入细胞内。
具体地说，初步试验可通过用核酸复合物进行平行转染来确定使用另一种内在化因子是否可允许或改善对核酸复合物的摄取，其中首先是使用没有任何附加内在化因子的复合物，即使用由核酸和病毒结合体组成的复合物，另一方面则使用其中核酸与另一种结合体结合的复合物，所说的另一种结合体由适合于有受体之靶细胞的附加内在化因子和对核酸有亲和性的物质组成的。如果使用附加内在化因子，它是由靶细胞如特异性表面抗原或对某细胞类型特异的受体特别限定的，因而允许核酸有针对性地转移到该类型细胞内。
本发明中所用的术语“内在化因子”是指在结合到细胞上之后经胞吞作用特别是受体介导的胞吞作用之内在化的配体或其片段，或者是通过与细胞膜的成分相融合而使之结合或内在化的因子。
适当的内在化因子包括配体铁传递蛋白(Klausner，R.D.etal.，1983)、伴清蛋白(Sennett，C.，etal.，1981)、唾液缺乏症糖蛋白(如唾液缺乏症铁传递蛋白，asialorosomucoid，唾液缺乏症胎球蛋白)(Ashwell，G.etal.，1982)，或含有半乳糖并借助唾液缺乏症糖蛋白、受体内在化的物质、甘露糖基化的糖蛋白(Stahl，P.D.etal.，1987)、溶酶体酶(Sly，W.etal.，1982)、LDL(Goldstein，J.L.etal.，1982)、经修饰的LDL(Goldstein，J.L.etal.，1979)、通过受体摄入细胞内的脂蛋白(apoB100/LDL);病毒蛋白质如HIV蛋白质gp120;抗细胞表面抗原的抗体(Mellman，I.S.etal.，1984;Kuhn，L.C.etal.，1982;Abrahamson，D.R.etal.，1982)或其片段，如抗CD4、抗CD7;细胞活素如白细胞介素-1(Mizel，S.B.etal.，1987)、白细胞介素-2(Smith，K.A.etal.，1985)、TNF(Imanure，K.etal.，1987)、干扰素(Anderson，P.etal.，1982)、集落刺激因子(Walker，F.etal.，1987)、因子和生长因子如胰岛素(Marshall，S.1985)、EGF(CarpenterG.，1984)、血小板衍生的生长因子(Heldin，C.H.etal.，1982)、转化生长因子β(Massague，J.etal.，1986)、神经生长因子(Hosang，M.etal.，1987)、类胰岛素生长因子I(Schalch，D.S.etal.，1986)、LH、FSH(Ascoli，M.etal.，1978)、生长激素(Hizuka，N.etal.，1981)、促乳素(posner，B.I.etal.，1982)、胰高血糖素(Asada-Kubota，M.etal.，1983)、甲状腺激素(Cheng，S.Y.etal.，1980)、α-L-巨球蛋白质蛋白酶(Kaplan，J.etal.，1979)以及“去武装的”毒素。配体可以是天然或合成的(参见TrendsPharmacol.Sci.10458-462，1989及其中所列文献)。
对本发明所述因子之适用性的基本要求如下a)它们能够被将向其中引入核酸的细胞类型引入细胞内(即内在化)，而且如果它们与结合因子结合它们的内在化能力不受或很少受影响，b)就这一特性来说，可通过它们所使用的途径将核酸带入细胞内。
并不拘泥于这一理论，但可以相信细胞是通过与对内在化因子特异的表面受体结合，或与病毒受体结合，也可借助受体介导的胞吞作用与两种受体结合，从而摄入结合一复合体。当病毒由核内体释放时，与病毒复合的DNA也被释放到胞浆中，从而可逃避溶酶体的降解。
病毒与对核酸有亲和性的物质结合可带来下列优点1)可使通过核酸复合体的基因转移技术具有更广泛的适用性，因为病毒本身可构成内在化因子，或者也可与连接了另一个内在化因子(例如铁传递蛋白或唾液缺乏症胎球蛋白等)的DNA复合。以这种方式，就可能使病毒在即使针对那些没有该病毒之受体的细胞发挥积极作用。
2)提高基因转移的效率，因为病毒与DNA的结合可确保它们一同被摄入细胞内。整合摄入并释放病毒和DNA也可能减少进行有效的基因转移所需的DNA和病毒用量，这一点对于体内应用是特别重要的。
在本发明的实验中，人的铁传递蛋白被用作附加内在化因子;另外，借助不含附加内在化因子-结合因子结合体的DNA与多聚赖氨酸结合之病毒的复合体来证实本发明之结合体的效能。
病毒与对核酸有亲和性之物质结合是通过对核酸有亲和性之物质与抗体的共价结合达到的。最好是使用与不参予病毒摄入功能的病毒蛋白质区域中的抗原决定基结合的抗体。
在按照本发明进行的试验中，腺病毒与多聚阳离子的结合是通过对腺病毒衣壳有特异性的抗体与多聚赖氨酸分子的共价结合达到的。已知腺病毒纤维和五位体蛋白质对于病毒的结合和其摄入细胞内是必要的，而主要衣壳蛋白质六位体在这些过程中则只有较小的重要性。因此，可使用通过识别六位体蛋白质上的抗原决定基引起腺病毒与多聚赖氨酸结合的抗体。Russell，W.C.等人(1981)介绍了非中和性抗六位体单克隆抗体。一方面，也可使用在其六位体蛋白质的表面区域中有外来抗原决定基的嵌合腺病毒来实现这种特异性结合。另一方面，可使用对异源抗原决定基特异的单克隆抗体(这一构建图解显示于图1中)。这样既可使腺病毒与多聚赖氨酸结合，而又不破坏衣壳蛋白的功能。
为实现病毒与核酸结合物质间的结合，对所用特异性抗体的要求并不严格。对特异性抗体之适用性的要求是它不能或只能部分地中和病毒的摄入功能。
就本发明来说，最好是使用抗那些对于摄入功能并非必要之病毒蛋白质区域中抗原决定基的抗体。这样的病毒蛋白区域包括上面提到腺病毒的六面体蛋白或流感病毒神经氨酸苷酶。
但也可使用对参予摄入功能的病毒蛋白质有特异性的抗体，条件是能通过保持适当的化学计算的比例，确保抗体只与病毒的部分细胞结合区偶联，而仍有足够的未结合区域供病毒与细胞结合。另外还可以使用阻断病毒之摄入功能的抗体，条件是复合体进一步含有第二结合体，后者包含了连接到对核酸有亲和性之物质上的内在化因子(即“三元复合体”)。用滴定法可确定适合特定应用的抗体量。
最好选用单克隆抗体，如果可能可用Fab′片段。
如果病毒是带有外来抗原决定基的嵌合病毒，抗体应是抗该抗原决定基的。病毒最好是其中六位体区的编码序列受到修饰的嵌合病毒，从而能针对它所包含的序列编码的异源蛋白质诱导产生相应抗体。六位体蛋白质由一个高度保守的碱性区域和三个暴露于病毒颗粒表面上的较小保守度的环组成(Robertsetal.，1986)。在这些环中有几个短的区域，其中Ad2和Ad5氨基酸序列不一样，与Ad2相比，Ad5有改变及缺失。这些是插入编码异源蛋白质之异源基因序列的潜在位点，编码的异源蛋白质可使腺病毒与对核酸有亲和性的物质免疫连接。最好在分别称为位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的氨基酸位置161-165、188-194、269-281和436-438处将异源基因序列插入Ad5基因序列中(参见图8)。通过对Ad5六位体基因的亚克隆进行位点针对性诱变的方法，可在各潜在位点产生独特的限制性位点。同时编码非保守氨基酸的核苷酸将会缺失，而留出更大空间以插入异源基因序列。一般说来，因为可在位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ处插入的氨基酸数目较小(多至大约65个氨基酸)，所以异源基因序列只编码相当于抗原决定基和最小数目侧翼序列的氨基酸。
可用肽描扫法检测特定单克隆抗体对异源蛋白质的抗原决定基特异性(参见Geysen，etal.，1984，1985，1986，1986;欧洲专利申请NO，392，369(1990)，这些文献均被列为本文参考文献)。根据本发明，可用固相合成法制备异源蛋白质的交迭8氨基酸肽。例如，由氨基酸1-8组成的肽1，由氨基酸2-9组成的肽2等。合成后，肽仍然结合于固相载体上。然后用ELISA法试验杂交瘤细胞培养物上清液或其纯化的单克隆抗体与固定化肽间的反应。一旦鉴定出抗原决定基区域，即可将编码抗原决定基区域的基因序列插入区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的任何一个限制性位点中。有许多蛋白质和对该蛋白质特异之抗体的例子。本领域普通技术人员只需用常规的实验即可选择到用于本发明的异源蛋白质-抗体结合物。例如，可将带有已知抗体的已知蛋白质编码序列插入腺病毒的六位体区域。然后用竞争结合、ELISA及其他免疫检测法检验所得嵌合病毒与标记抗体免疫结合的能力。这些免疫检测法均为本领域技术人员可常规实践的已知方法。
可用已知的肽偶联法，特别是如Wagner等人(1990)和欧洲专利申请388758号中所述的方法化学制备抗体-多聚阳离子结合体。
如果单克隆抗体在重链恒定区中具有适当的碳水化合物侧链，特别是末端唾液酸，可使用Wagner等人(1991b)所述的方法，通过将多聚阳离子连接到碳水化合物侧链上来制备结合体。
本发明的另一个方面涉及含有核酸和内在化因子与对核酸有亲和性之物质的结合体、被摄入高等真核细胞的二元和三元复合体。二元复合体的特征在于内在化因子是病毒，该因子通过抗体与对核酸有亲和性的物质结合，以这样的方法使之作为结合体/核酸复合体的一部分进入细胞内并向胞浆中释放出核内体之内容物，而复合体在进入细胞之后位于核内体中。三元复合体还包括一个与对核酸有亲和性的物质结合的内在化因子，其中该内在化因子对于高等真核细胞表面上的受体是特异的。这样的三元复合体可用来增加只有很少或没有腺病毒受体之细胞对核酸的摄入。
就核酸复合物的定性组成来说一般首要的是检测被转移到细胞内的核酸。核酸主要是由其在细胞内发挥的生物学作用限定的。而在进行基因治疗的情况下，则是由将被表达的基因或基因片段(如用于取代有缺陷的基因)或是要抑制之基因的靶序列限定的。被转移到细胞内的核酸可以是DNA或RNA，同时对核酸序列没有限制。
如果本发明应用于肿瘤细胞，以将其用作肿瘤疫苗，被导入细胞内的DNA最好编码细胞活素，如IL-2、IL-4、γ-IFNα-TNF。含有细胞活素编码DNA可能是特别有用的，如IL-2和γ-IFN。另一个有用的基因可能是多药物抗性基团(mdr)。
也可能将两个或多个不同的核酸序列导入细胞中，如一个含有处于适当调节序列控制下的两不同基因的CDNA的质粒或含有不同CDNA的两不同质粒构建体引入细胞中。
为了抑制特异性基因序列而转移到细胞内的治疗上有效的抑制性核酸包括由其中转录反义RNA和核酶的基因构建体。另外，也可将寡核苷酸导入细胞内。反义寡核苷酸最好包含15个或更多个核苷酸。寡核苷酸也可以多聚化。当向细胞内导入核酶时，最好将其作为含有稳定基因成分如tRNA基因成分之基因构建体的一部分导入。欧洲专利申请(EP-A)0387775中描述了这种类型的构建体。
除了可抑制基因如病毒基因的核酸分子外，利用其互补性，还可使用有不同类型抑制作用的基因，例如编码具有所谓反显性突变之病毒蛋白质的基因(Herskowitz，1987)。该基因在细胞内表达可产生比相应野生型蛋白质有更大优势的蛋白质，从而更好地通过抑制病毒复制使细胞获得“细胞免疫力”来保护细胞。
为复制和表达所需之病毒蛋白质的反显性突变是适用的，如Gag-、Tat和Rev突变体均显示可抑制HIV复制(Tronoet.al，1989;Greenetal.，1989;Malimetal，1989)。
获得细胞内免疫性的另一个机制包括表达含有基本病毒蛋白之结合位点的RNA分子。如所谓TAR诱捕物(TARdecoys)(Sullengeretal，1990)。
可用于基因治疗并可按本发明方法作为基因构建体的成分转移到细胞内的基因包括因子Ⅷ(血友病A)(如参见Woodetal，1984)、因子Ⅸ(血友病B)(如参见Kurachi，K.etal.，1982)、腺苷脱酰胺酶(SCID)(如参见Valerio，D.etal.，1984)、α-1抗胰蛋白酶(肺气肿)(如参见Ciliberto，G.etal.，1985)或囊性纤维变性跨膜电导调节基因(如参见Riordan，J.R.etal.，1989)。当然，还并不只限于这些例子。
核酸分子的大小范围可以很宽;可用本发明的方法将大约0.15kb(如含有核酶的tRNA基因)到大约50kb或更大的基因构建体转移到细胞内;较小的核酸分子可以作为寡核苷酸应用。
在确定抗体-多聚阳离子核酸的摩尔比时，心里应牢记核酸复合的发生。在本发明早期研究过程中，已证实选择结合体对核酸的比例，使内在化因子-多聚阳离子/核酸复合体基本上呈电中性，可实现核酸向细胞内的最佳转移。已发现如果用非共价结合的多聚阳离子取代某些铁传递蛋白-多聚阳离子结合体，则摄入细胞内的核酸量并未减少;某些情况下DNA摄入甚至有实质上的增加(Wagneretal.，1991a)。已观察到复合体内的DNA是以缩合成80-100nm直径之复曲面结构形式存在的。为此，可就电中性和达到致密结构这两个参数来选择多聚阳离子的量，而就达到电中性来说，因核酸带电情况而造成的多聚阳离子的量一般也可保证DNA结构紧密。
确定本发明复合体中所含成分之比例的适当方法是首先限定待转移至细胞内的基因构建体，并且如上所述确定适于特定转染的病毒。然后使结合了病毒的抗体与多聚阳离子结合并与基因构建体复合。从一定量的病毒开始，通过用这一恒定量的病毒和渐减浓度的DNA复合体处理靶细胞进行滴定。以这种方法即可确定DNA复合体对病毒的最适比例。第二步骤中，则用渐减浓度的病毒/DNA复合体混合物(病毒对复合体的比例恒定)处理细胞并确定最适浓度。
病毒最好是腺病毒，且腺病毒与对核酸有亲和性的物质的摩尔比例为大约1/1至1/100。
对多聚阳离子的长度没有严格要求，只要该复合物实质上呈电中性即可。聚赖氨酸链长度的优选范围为大约20至1000个赖氨酸单体。但对于已知长度的DNA，所用多聚阳离子的长度并不严格。如DNA包含6000bp和12，000个负电荷，每摩尔DNA所需多聚阳离子的量例如可以是60个聚赖氨酸200分子，30个聚赖氨酸400分子，或120个聚赖氨酸100分子等。
本领域技术人员只需借助常规实验选择其他相配合的多聚阳离子长度和多聚阳离子用量。
可以通过混合以稀溶液形式存在的核苷酸和抗体结合之多聚阳离子成分来制备本发明的复合体。DNA复合体可以按生理盐水浓度制备。另一种可能性是先使用高盐浓度(约2MNacl)，然后再经缓慢稀释或透析调到生理条件。
可根据各自的初步试验来确定混合核酸、抗体-多聚阳离子结合体及病毒成分的最佳顺序。
另一方面，本发明涉及将核酸引入高等真核细胞内的方法，其中使细胞以能导致复合体内在化并由核内体释放的方式与本发明的复合体接触。
另一方面，本发明涉及含有作为活性成分的由治疗上有活性核酸组成的复合体(最好作为基因构建体的一部分)和通过多聚阳离子偶联抗体的医药制剂。该制剂最好是冻干形式的或者在适当缓冲液中呈深冻状态，并且在使用前使病毒制品与复合体溶液混合。病毒可能已被包含在药物制品中，在此情况下它即呈深冻状态。应用中各成分可作为转染试剂盒中的分立组分存在，此也是本发明的主题。在这样的转染试剂盒中，可分别由病毒制品和/或抗体结合体提供不同的DNA和/或不同的内在化因子结合体。根据在特殊应用中使用的组分，本领域普通技术人员可以设计不同的转染试剂盒以提供最宽范围的可能性。
为治疗目的，最好以静脉内途径作全身给药。可作这种给药的靶器官可以是肝、脾、肺、骨髓和肿瘤组织。
最近已显示有可能使用成肌细胞(未成熟的肌细胞)将基因携带到小鼠的肌纤维中。因为已表明成肌细胞可将基因产物分泌到血液中，所以这种方法比治疗肌细胞的遗传缺陷如包括肌营养不良的缺陷有更广泛的应用。因此，可用工程化改造的成肌细胞输送基因产物，使之既可在血液中发挥作用又可通过血液运输。
局部应用的例子是用于肺组织(使用作为药物组合物之一部分的本发明复合体，包括例如滴注法给药的液体或吸入用的气雾剂)。另外，可将本发明的医药组合物直接注入肌肉组织或肿瘤组织中，或者在胃肠道中局部给药。
治疗应用时也可先在体外处理细胞，如骨髓细胞、血细胞或肿瘤细胞，然后回输到身内(如参见ponderetal.，1991)。
可使用任何惰性药用载体如盐水或磷酸盐缓冲盐水，另外能使本发明的组分在其中有适当溶解性的任何载体亦可用于本发明的方法中。有关配制医药组合物的方法可参见Remington′sRharma-ceuticalSciences，MackpublishingCo.，Faston，PA，Osol(ed.)(1980)。
为了确定腺病毒-抗体-多聚阳离子/DNA复合体转移基因的能力，可使用含有photinuspyralis虫荧光素酶基因(作为报导基因)的质粒(DeWetetal.，1987)作为所说的DNA。用Hela细胞作复合体的靶细胞;这些细胞具有有限量的腺病毒之细胞表面受体群(philipsonetal.，1968)。当在结合中使用本发明的结合体成分(病毒、抗体-聚赖氨酸-结合体，DNA)，可获得虫荧光素酶报导基因的高表达(图3)比较实验显示，腺病毒只使未复合的质粒DNA的转移稍有增加。还发现与抗体偶联之聚赖氨酸(没有结合到病毒上)复合的DNA没有明显被摄入HeLa细胞中的迹象。与此显著不同，如果DNA能够通过抗体结合与腺病毒相互作用，即可用复合体得到高基因表达值。如果在复合前对病毒粒子进行热处理，将终止这一效应。因为这种处理选择性地除去病毒摄入功能，而不破坏病毒的结构整合性(Deferetal.，1990)，故可从这些实验中得出这样的结论是腺病毒的特异摄入功能对基因转移的成功作出了关键性的贡献。还发现，特异性、非聚赖氨酸结合的单克隆抗体竞争嵌合腺病毒表面上的异源抗原决定基，也引起净基因表达的降低。当使用非特异性抗体时，则不出现这种效应。因此，抗体结合的DNA与相应腺病毒表面抗原决定基的特异性相互作用对于借助复合体完成功能性基因转移是必不可少的。还发现，腺病毒不能将聚赖氨酸复合的DNA明显地转移到靶细胞中。这表明复合体转移基因的能力不是基于DNA的浓缩，而是取决于抗体介导的报导基因与病毒粒子的结合。
据此，使用没有被聚赖氨酸偶联之抗体识别的抗原决定基的病毒，不能达到有这种决定基的病毒所能达到的高的基因表达水平。但该病毒可提高基因转移的程度，使之高于本底水平。因为已知腺病毒能够非特异地提高细胞通过液相摄入大分子的能力(Deferetal.，1990)，所以这一结果并不出乎意料。与能够同抗体-聚赖氨酸/DNA复合体结合的特异性病毒相比，这种非特异性运输只能使报导基因低水平表达，这一事实证明了复合体成分之特异性结合的重要性。
质粒DNA与聚赖氨酸结合体的相互作用导致DNA分子结构的明显改变，这一点可通过明显可见地缩聚成80至100nm的复曲面结构得到最清楚的定性(Wagneretal.，1991a)病毒的直径大约为10至80nm(PhiliPson，1983)。基于初步考虑，推测腺病毒对抗体-聚赖氨酸-复合之DNA的最适比例应不超过1∶1。另外，借以进行受体介导之胞吞作用初始摄入步骤的包被井的直径约为100nm(Darnelletal.，1975)。基于这一事实，推测超过这一大小的多聚体应被限制在其摄入能力内。在本发明的范围内分析这些相互关系，而使用相对于抗体-聚赖氨酸-复合DNA摩尔过量的腺病毒，显示在1∶1比例时达到报导基因的最大表达(图4)。因此发现本发明范围内使用的最佳结合体由单个腺病毒内在化区域连同单个抗体-聚赖氨酸/DNA结合区构成。
进一步研究了有这一最适比例的腺病毒-抗体-多聚阳离子结合体的基因转移效率。如果将对数稀释度的复合体加入靶细胞中，则报导基因的表达呈现相应的对数降低(图5)，而引入注目的是，将107个DNA分子加入使用这一载体系统的106个HeLa细胞中，会导致可检测水平的报导基因表达。因此，以腺病毒-多聚阳离子-DNA结合体的形式，只用少至每个细胞10个分子的DNA即可完成外来基因的有效表达。
为此，就放大DNA摄入来说，本发明的结合体明显地优于DNA基因转移载体，后者每个细胞需要大约500，000个DNA分子(Felgneretal.，1987;Felgneretal.，1989;Maurer，1989)。因为这些方法能有效地将大部分DNA运送到细胞的靶区域，即细胞质中(Felgneretal.，1989;Maloneetal.，1989;Loyteretal.，1982)，所以本发明结合体的效力可能不只是基于增加外来DNA向细胞质中的释放，可能还加强基因转移途径中的其他机制。
在对本发明作了一般性描述后，参考下列实施例将会更容易地了解本发明;这些实施例是举例说明而不是以任何方式限制本发明。本文中列出的所有专利和出版物均被全文列为本文参考文献。
实施例1抗体-聚赖氨酸结合体的制备1)嵌合腺病毒Ad-p202的制备为了造成Ad5六位体基因的改变，首先必须对该基因进行亚克隆。质粒pEcoRIA-Ad5(BerknerQndSharp，1983)含有腺病毒基因组左手部分的图单位(m.u.)0至76。六位体基因位于m.u.52和m.u.60之间。一个2.3KbpHindⅢ/SstI片段含有六位体基因中将造成改变的那个部分。因pEcoRIA-Ad5中有许多HindⅢ和SstI位点，所以必须构建几个中间体质粒，以便将已改变的六位体基因组装到初始质粒中。SalI/BamHI片段(m.u.46至60)含有无任何其他HindⅢ或SstI位点的六位体基因。首先，使用不含SstI或BamHI位点的定名为pI42的载体(先用pvuⅡ限制性消化商品质粒pIBI24(IBI，Inc.)，然后插一个EcoRI接头制得的)再次克隆从m.u.0至76的腺病毒DNA。然后删去XbaI片段(m.u.3.7至29)以除去m.u.26处的SalI位点，将所得载体称为p141-12。最后，将所需的HindⅢ/SstI片段克隆到M13mp18中，从而为诱变作好准备。使用Kunkel(1985)所述方法，用所得克隆之一进行位点针对性诱变。除去六位体基因的密码子188至194，并在该位置导入一个只一次出现的独特的pmlI位点。用PmlI切割所得克隆(167-1)并插入编码肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)P1蛋白质之氨基酸914-928的双股寡核苷酸(Inamineetal.，1988)。插入位置是在位于病毒粒子外表的六位体蛋白之环11中(Robertsetal.，1986)。PI序列含有可被单克隆抗体301识别的抗原决定基。有关单克隆抗体的制备将在下文中描述。从p167-1中分离经修饰的HindⅢ/SstI片段并重新连接到初始质粒pEcoRIA-Ad5中。图2中显示了Ad-p202的制备。
2)对嵌合腺病毒(MP301)有特异性之单克隆抗体的制备a)免疫用标准方法制备单克隆抗体。
使用肺炎支原体株M-129(ATCC＃29342)作为抗原。在培养瓶中培养后(Huetal.，1977)用PBS洗3次，收获肺炎支原体并悬浮于0.5mlPBS中。用10μg抗原进行免疫按下述程序免疫3只约6周龄的BALB/C小鼠第1次免疫每只小鼠使用约10μg加在弗氏完全佐剂中的抗原，腹腔免疫。
第2次免疫每只小鼠使用约10μg加在弗氏不完全佐剂中的抗原，第1次免疫后3周皮下注射。
第3次免疫每只小鼠使用10μg加在弗氏不完全佐剂中的抗原，于第2次免疫后2周进行腹腔免疫。
1周后取小鼠血清样品，检测血清滴度。经尾静脉注射10μg抗原对有最高滴度的小鼠进行加强免疫;3天后取出小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞融合。
b)融合使用Kohler和Milstein(1975)的方法，用PEG4000(50%，在无血清培养基中)使大约108个脾细胞与大约108个Sp2/0 Ag14细胞系(ATCC CRL-1581)的骨髓瘤细胞融合。使细胞在HAT选择培养基中生长2周，然后在HT培养基中生长1周，最后在正常培养基中(DMEM加10%FCS加青霉素、链霉素)生长1周。使用放射免疫吸附法(RIA)筛选产生抗体的克隆，并使用Western吸印法检测它对肺炎支原体P1蛋白质的特异性。使用“软琼脂”方法得到单克隆。
c)单克隆抗体MP301对腺病毒Ad-p202中和作用的研究为了确定单克隆抗体MP301是否可以中和病毒感染细胞的能力，使用HeLa细胞(在96小孔平板上2%FCS/DMEM中约含5%融合体)作为靶细胞，在一次加和一次不加抗体(7μg/ml)的情况下检测Ad-p202的滴度。制备一系列稀释度的Ad-p202，然后加于含或不含抗体的HeLa滴度板上。在37℃、5%CO2条件下保温48小时，用结晶紫染色并研究IC50(即使约50%细胞溶解的抑制浓度)。用或不用抗体得到1∶2048的滴度。
d)MP301-聚赖氨酸结合体的制备使用Wagner等人(1990)和EP-A1388758中描述的方法将单克隆抗体偶联到聚赖氨酸上。用SPDP(100nmol)的5mM乙醇溶液处理溶于1ml200nMHEPES(pH7.8)中的20.6nmol(3.3mg)单克隆抗体MP301。室温下3小时后，通过SephadexG25柱凝胶过滤经修饰的抗体，从而得到19nmol用62nmol二巯基吡啶接头修饰的抗体。在100mMHEPES(pH7.9)中，使修饰的抗体与3-巯基丙酸酯修饰的聚赖氨酸(22nmol，平均链长度300个赖氨酸单体，FITC标记的，用56nmol巯基丙酸酯接头修饰的)在氩气环境下反应。在MonoSHR5柱(Pharmacia)中经阳离子交换层析分离结合体。洗脱梯度20-100%缓冲液B。缓冲液A50mMHEPES(pH7.9);缓冲液B缓冲液A加3M氯化钠。在盐浓度为1.65M至2M时洗脱产物部分。用HBS(20mMHEPESpH7.3，150mMNaCl)透析后得到由9.1nmolMP301和9.8nmol聚赖氨酸组成的结合体。
实施例2借助腺病毒-聚阳离子-DNA复合体将基因转移到真核细胞中在完成本实施例实验过程中，试验了各种特异性和非特异性复合物成分的不同组合形式将报导基因运入Hela和其他细胞内的能力。并在HBS(150mM NaCl、20mM HEPES，pH7.3)中将6μg纯化的pRSVL-DNA稀释到总体积为350μl并用加在150μl总体积同样缓冲液中的9.5μgMp301pL纯化之，从而完成DNA与抗体偶联之聚赖氨酸的复合。(pRSVL含有处于Rous肉瘤病毒LTR增强子/启动子(Uchida et al.，1977，De Wet et al.，1987)控制下的Photinus pyralis虫荧光素酶基因，是用Triton X溶解的标准方法(Maniatis)制备，然后进行氯化铯/溴化乙锭平衡密度梯度离心、用丁醇-1脱色并在含有10mM Tris/HCl(pH7.5)、1mM EDTA的350μl HBS中(150mM NaCl、20mM HEPES，pH7.3)透析。根据为使输入的DNA达到电中性所需要的量计算抗体偶联之聚赖氨酸的量。在HBS中稀释聚赖氨酸-抗体-DNA复合物，达到终浓度为每毫升2×1011个DNA分子。
在添加2%FCS的冰冷DMEM中稀释腺病毒p202-Ad5，使其终浓度达到每毫升2×1011个病毒颗粒。将等体积的抗体-聚赖氨酸DNA与病毒混合并于室温下保温30分钟。用于基因转移的靶细胞是在含有添加了5%FCS、100国际单位青霉素/ml和100μg链霉素/ml之DMEM培养基的60mm组织培养皿中生长的HeLa细胞(300，000个细胞)。使用HBEI、KB和MRC-5细胞系作为对照。其中HBEI(一种呼吸道细胞系)生长于Willumson等人(1989)所述的F12-7X培养基中。KB和MRC-5生长于添加了10%热灭活的FCS、青霉素(100I.U./ml)、链霉素(100μg/ml)、10mM非必需氨基酸和2mM谷氨酰胺的Eagle′s基本培养基中。
在应用转染培养基之前，先将平皿在4℃下冷却30分钟，除去培养基后再加入1ml转染培养基，将细胞于4℃下保温2小时。该步骤使得DNA复合物与细胞结合而没有使之内在化。该结合步骤后，用冰冷的2%FcS/DMEM将平皿洗3次，以除去液相中未结合的反应成分。加入2ml冰冷的2%FCS/DMEM后，缓慢加热平皿。然后将平皿放入恒温箱中放置16小时(37℃，5%CO2)。为了检测报导基因的表达，制备了细胞溶解产物，将其总蛋白含量调到标准水平并准确地遵照Zenke等人(1990)所述方法研究虫荧光素酶活性(校准照度计，以使1毫微克虫荧光素酶产生50，000光单位)。
使pRSVL报导质粒DNA在没有预先与聚赖氨酸抗体结合物复合的情况下与腺病毒P202-Ad5混合(DNA+p202-Ad5)。另外，在未加特异性病毒的情况下研究与抗体偶联之聚赖氨酸复合的pRSVL-DNA(DNA+MP301pL)，并将这两个反应介质与含有所有各复合体组分的反应介质(DNA+MP301pL+p202Ad5)相比较。同时使用在复合前已热失活(45℃，30分钟)的特异性抗体来研究复合体(DNA+MP301pL+p202-Ad5)完成基因转移的能力。在加有聚赖氨酸偶联之抗体Mp301和十倍摩尔过量的非聚赖氨酸偶联之MP301(DNA+MP301pL+MP301+p202-Ad5)的条件下，或者存在Mp301pL和十倍摩尔过量之非偶联无关单克隆抗体即抗大鼠IgG(DNA+MP301pL+抗大鼠IgG+P202-Ad5)的条件下用特异性腺病毒进行竞争实验。另外，在与特异性病毒保温之前，使报导质粒DNA与非偶联的聚赖氨酸(4μg)(与抗体偶联的聚赖氨酸有等摩尔量)复合(DNA+PL+P202-Ad5)。准确按照使用特异性病毒p202-Ad5的同样方法，用缺少被MP301识别之抗原决定基的腺病毒WT300进行复合体生成反应。实验共进行三次。结果示于图3中;各数据均代表平衡值±SEM。水平点线显示未处理之HeLa细胞的本底信号。
结果为了估测腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体介导基因转移的能力，使用编码荧火虫虫荧光素酶的质粒作为报导者(DeWetetal.，1987)。使用HeLa上皮细胞系作为复合体的靶细胞，因为这些细胞具有已定义的腺病毒之细胞表面受体群(Philipsonetal.，1968)。当结合使用时，该结合体系统的组分介导虫荧光素酶报导基因的高水平表达(图3)。对照实验证明，腺病毒并不能明显地提高向靶细胞运送未结合之质粒DNA的能力。报导DNA同聚赖氨酸单克隆抗体复合也不能很好地转移到靶细胞内。相反，当使单克隆抗体结合的DNA与抗原决定基标示的腺病毒相互作用时，所得复合体可介导高水平的基因表达。如在复合体形成之前对病毒粒子进行加热处理，则可消除这种效应。因为加热处理可选择性地消除腺病毒的进入功能而没有打乱病毒的结构完整性(Deferetal.，1990)，故可以看出腺病毒的特异性内在化功能使之成为复合体之基因转移能力的重要组分。非赖氨酸化特异性单克隆抗体竞争嵌合腺病毒表面上的异源抗原决定基也减弱由复合体完成的净基因表达。使用无关单克隆抗体则看不到这种效应。因此，单克隆抗体结合的DNA与相应腺病毒表面抗原决定基间的特异性相互作用在由复合体介导的功能性基因输送中起着重要作用。与这一概念相一致，缺乏被聚赖氨酸抗体识别之抗原决定基的腺病毒的介导不能达到由具有该抗原决定基的病毒介导的高水平基因表达。另外，聚赖氨酸复合的DNA不能通过腺病毒以可检测的量转移到靶细胞中，此表明复合体的基因转移能力并不以DNA缩聚为基础，而是依赖于抗体介导的报导基因与病毒粒子的结合。
实施例3基因转移时腺病毒与抗体-聚赖氨酸/DNA之最适比例的确定在进行如图4所示之结果的实验中，使腺病毒-抗体-聚赖氨酸/DNA复合体各成分以不同比例复合，以检测它们转移基因进入HeLa细胞的能力。按实施例2所述条件进行复合体生成反应，不同的是以2.5×1010个DNA分子与抗体-聚赖氨酸结合物复合，同时加不同量的特异性腺病毒p202-Ad5。按实施例2所述培养细胞，将复合体加入细胞内，保温及检测报导基因的表达。数据所示是四次实验得到的平均值±SEM。
结果质粒DNA与聚赖氨酸结合物的相互作用导致DNA分子结构的明显改变，特征主要是它清楚地缩聚成直径80-100nm的复曲面结构(Wagneretal.，1991)。腺病毒的直径也在70-80nm范围内(Philipson，1983)。根据实验估测的结果，加入过量摩尔聚赖氨酸-抗体复合DNA的腺病毒，在统一比例时会产生报导基因表达的平台(图4)。因此，最优化的结合体包括一个单个腺病毒同源区连着一个单个聚赖氨酸-抗体DNA结合区。
实施例4腺病毒-多聚阳离子-DNA复合体之基因转移效能的检测按实施例2所述方法限制复合体的稀释，看它们是否能够有效地介导报导基因在HeLa细胞中的表达。复合体形成后，在2%FCS/DMEM中制备复合体的对数稀释液。将1ml不同的稀释液加入含有5×105个HeLa细胞的60mm组织培养皿中。保温(37℃，5%CO2)1小时后，加入3ml 5%FCS/DMEM并在同一条件下将平皿继续保温16小时。按实例2所述方法检测报导基因表达。图5中给出了虫荧光素酶表达的水平，数值以3或4次实验的均值±SEM表示。水平点线显示未处理之HeLa细胞的本底信号。
结果对1∶1最佳比例的腺病毒-聚赖氨酸结合体的基因转移效率进行检测。向靶细胞内加入按对数比例稀释的复合体，可使报导基因的表达按对数比例相应降低(图5)。很明显，用该载体系统向5×105个HeLa细胞运送5×106个DNA分子，可检测到报导基因的表达。因此，以腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体的形式每个细胞只给10个DNA分子即可检测到外源基因的表达。可见，与使用DNA介导的基因转移载体相比所用DNA的量很少，前者每个细胞需要大约500，000个DNA分子(Felgneretal.，1987;Felgneretal.，1989;Maurer，1989)。
在腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体中，腺病毒部分具有核内体破坏剂的功能，并可作为复合体的配体区域。因此，对于给定的靶细胞来说，复合体的基因转移效率应反映腺病毒之细胞表面受体的相对数目。已知HeLa和LB细胞系均具有高水平的腺病毒受体(Philipsonetal.，1968)，表明它们对于通过腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体介导的基因转移有相应高程度的敏感性(图6)。相反，复合体介导基因以低水平转移到MRC-5(PreciousandRussell，1985)和HBEl(数据未示出)，则反映这些细胞系具有相对低数目的腺病毒受体。
实施例5含有腺病毒和人铁传递蛋白的嵌合复合体的制备为了制备含有组合的腺病毒和人铁传递蛋白区域的三元复合体，在750μl2%FCS/DMEM中稀释抗原决定基标示的腺病毒p202-Ad5(2.5×1010个颗粒)并与稀释于250μl HBS中的聚赖氨酸单克隆抗体MP301pLys(2μg)混合。于室温下保温30分钟。向混合物内加入稀释在250μl HBS中的质粒pRSVL DNA(6μg)并于室温继续保温30分钟。据推断所得到的腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体具有基于总聚赖氨酸含量的不完全缩聚的DNA。为了完成DNA缩聚并利于在复合体上加入人铁传递蛋白部分，将稀释在250μlHBS中的人铁传递蛋白-聚赖氨酸结合物(Wagner et alal.，1990)加到腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体中。最后再于室温下保温30分钟。将所得嵌合复合体与组织培养细胞一起保温以实现已形成之复合体的特异性结合(4℃，2小时)。然后用冰冷的2%FCS/DMEM将平皿洗3次并在加入2ml2%FCS/DMEM后放回恒温箱(37℃，5%CO2)保温16小时。按前述方法估测报导基因的表达。
结果分子结合物基因转移载体的特异性内在化作用是受细胞表面上受体的结合体配体区域的向性支配的。在内在化之后，基因转移效率因结合体缺乏使其免于被包裹在细胞囊泡系统内的特异性机制而受到限制。腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体利用腺病毒介导的核内体破坏作用提高基因转移效率。但在这一特异构型中，该腺病毒区域也有作结合体之配体部分的功能，从而限制了该载体向含有腺病毒之表面受体的靶细胞内转移DNA的效率。利用腺病毒的核内体破坏能力的另一种方法，是构建另一种细胞表面配体部分连着腺病毒部分的三元复合体。在这一设计中，推测腺病毒在通过腺病毒途径或另一配体途径内在化后介导核内体破坏。为了评估这一设想，可构建含有人铁传递蛋白配体区域连同腺病毒区域的三元复合体。将这些嵌合复合体在HeLa细胞-一种含有腺病毒和铁传递蛋白之细胞表面受体的细胞系(HeubersandFinch，1987)中的基因转移效率与人铁传递蛋白-聚赖氨酸-DNA复合物(Wagneretal.1990)和腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体作一对比。用三元复合体完成的报导基因表达水平明显高于只具有铁传递蛋白或腺病毒配体区域的结合体(图7A)。这种增强作用的进一步放大显然并不是基于人铁传递蛋白-聚赖氨酸-DNA复合物加腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体的加合效应。由于三元复合体可通过腺病毒或铁传递蛋白途径内在化，这就进一步提示腺病毒区域有利于通过很可能是以腺病毒介导的核内体裂解作用为基础的任一途径进入细胞。
为了证明三元复合物中腺病毒区域之核内体破坏能力的选择性应用，将嵌合复合体加入对腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体表现有可变敏感性的细胞系中(图7B)。与HeLa细胞相比，呼吸道上皮细胞系HBE1显示由腺病毒-聚赖氨酸-DNA复合体介导的基因转移水平很低(图6)，这反映了该细胞系的特征是细胞表面上的腺病毒受体数相对很少。与此相反，使用腺病毒-铁传递蛋白三元复合体则表现出与在HeLa细胞中见到的差不多水平的基因表达。该细胞系对通过三元复合体介导之基因转移的敏感性与腺病毒区域通过铁传递蛋白途径内在化这一概念相符合(其中是通过介导核内体破坏来增强基因转移能力)。因此，在设计分子结合体载体时利用腺病毒的核内体裂解作用以使之具有逃避细胞囊泡系统的能力似乎是可行的。
在对本发明作了充分描述之后，应明确的一点是本领域的普通技术人员可在不影响本发明之范围或其任何实施方案的前提下对操作方式及其他参数作多种等同改变，而这些改变均应属于本发明范围内的。
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权利要求
1.一种制备能与核酸形成复合体并将所说的核酸导入高等真核细胞内的结合体的方法，所说的结合体包括内在化因子和对核酸有亲和性的物质，特征在于使作为内在化因子的病毒通过抗体结合到对核酸有亲和性之物质上，其中所说的病毒能够作为结合体/核酸复合体的一部分穿入细胞内并释放核内体的内容物至胞浆中，复合体进入细胞后位于核内体中。
2.根据权利要求/的方法，特征在于使抗体结合到所说病毒的蛋白质上，它并不参与病毒穿入细胞内并释放核内体内容物的天然功能。
3.根据权利要求1的方法，特征在于病毒是腺病毒。
4.根据权利要求3的方法，特征在于使抗体结合到腺病毒之六位体区域中的抗原决定基上。
5.根据权利要求3的方法，特征在于腺病毒是嵌合病毒，其含有编码肺炎支原体蛋白质P1之氨基酸914到928的序列，以代替相当于编码六位体蛋白质之序列的密码子188至194，且其中抗体通过免疫学方法结合到P1蛋白质上。
6.根据权利要求2的方法，特征在于抗体是单克隆抗体。
7.根据权利要求1的方法，特征在于对核酸有亲和性的物质是多聚阳离子。
8.根据权利要求7的方法，特征在于多聚阳离子是聚赖氨酸。
9.一种生产核酸与按权利要求1所述的方法得到的结合体的复合体的方法，特征在于使按权利要求1-8所述的方法得到的结合体的溶液与核酸溶液混合。
10.根据权利要求9的方法，特征在于核酸是含有治疗活性基因的基因构建体。
11.根据权利要求10的方法，特征在于基因是在基因治疗中有活性的基因或基因部分。
12.根据权利要求10的方法，特征在于基因构建体包含能由之转录特异地抑制细胞功能之RNA分子的核酸序列。
13.根据权利要求9的方法，特征在于结合体包含其本身为高等真核细胞之内在化因子的病毒。
14.根据权利要求9的方法，特征在于结合体包含其本身不是高等真核细胞之内在化因子的病毒，且复合体进一步包含一个内在化因子。
15.根据权利要求9的方法，特征在于它进一步包含结合到对核酸有亲和性之物质上的内在化因子的第二结合体，所说的内在化因子对高等真核细胞的表面受体是特异的，其中病毒结合体和内在化因子结合体是与核酸复合的。
16.根据权利要求15的方法，特征在于第二结合体中对核酸有亲和性的物质是多聚阳离子。
17.根据权利要求16的方法，其中所说的多聚阳离子是聚赖氨酸。
18.根据权利要求16的方法，特征在于第二结合体的内在化因子是铁传递蛋白。
19.一种将核酸导入高等真核细胞内的方法，其包括用按权利要求9、14或15所述的方法得到的复合体处理细胞。
20.一种制备医药组合物的方法，其包括将作为活性成分的按权利要求9、14或15所述的方法得到的复合体与医药上可接受的载体混合。
21.一种转染药盒，其包括作为分立或部分分立之组成部分的按权利要求9、14或15所述的方法得到的复合体部分。
全文摘要
将基因构建体转运到高等真核细胞内的结合体，其中病毒通过抗体结合到对核酸有亲和性的物质上。结合体与核酸的复合体在细胞中内在化，同时病毒作为复合体的一部分引起内在化并释放核内体的内容物，当复合体进入细胞后即定位于其中。在其特别适用于基因治疗的医学制剂中，核酸是治疗上有活性的基因构建体。
文档编号A61K47/48GK1071457SQ9211062
公开日1993年4月28日 申请日期1992年9月28日 优先权日1991年9月30日
发明者D·克莱尔, 平昌胡, E·瓦格纳尔, M·L·伯恩斯太尔, M·克顿 申请人:博灵格英格尔海姆国际股份公司, 北卡罗来纳查珀尔希尔大学