专利名称：组织选择性胰岛素类似物的制作方法
技术领域：
本发明总的来说涉及到生物活性蛋白及其类似物。更具体地讲，本发明涉及组织特异性人胰岛素的类似物的和含有这些类似物的药物组合物以及它们用于治疗糖尿病的用途。本发明还提供了编码人胰岛素类似物的DNA序列以及含有该序列的微生物。描述了制备人胰岛素类似物的方法。
胰岛素是一种蛋白质，更具体地讲是一种控制糖代谢的激素。动物体内缺少胰岛素可以引起动物患有糖尿病，过量的胰岛素可以引起昏迷。胰岛素是一种由胰腺的朗格尔汉斯胰岛β-细胞产生的多肽。餐后血中葡萄糖和氨基酸的含量增高刺激胰腺分泌胰岛素。然后胰岛素作用于不同的组织(如，肌肉，肝脏和脂肪)刺激葡萄糖的摄入。胰岛素还激发糖原和脂肪的合成。在治疗糖尿病Ⅰ型和Ⅱ型时使用胰岛素的药物制剂。
某种动物，如人的胰腺不能够产生足够量的胰岛素可导致糖尿病的发生。糖尿病是一种以胰岛素分泌异常和各种代谢及血管损伤为特征的综合症。患有糖尿病的患者目前采用猪牛或重组人胰岛素治疗。但是使用胰岛素不能够完全一致地模仿内源性胰岛素的作用，而且会引起低血糖和长期并发症如动脉粥样硬化症。
来源于动物的胰岛素与人胰岛素在化学特性上不完全相同，有时会含有其它的生物活性杂质。曾努力试图建立一种方法以制备在化学特性上与人胰岛素一致并且不包含任何生物活性杂质的胰岛素。基于这种努力，建立了重组方法，以在微生物中制备人胰岛素和胰岛素原多肽，并使之分离纯化以供药用。例如，1982年7月14号公开的欧洲专利申请No.0055945，公开了制备胰岛素和胰岛素原多肽以及分离这种多肽的重组技术和方法学(该申请作为参考文献)。
如上所述，本技术能够通过重组方法制备与人胰岛素原和/或胰岛素有相同氨基酸序列的胰岛素，并且可以被纯化，用于药物制剂。但是，胰岛素具有多种功能。例如，它抑制肝脏葡萄糖的产生并激发外周葡萄糖的利用，从而控制葡萄糖的代谢。由于这些不同的功能，以及由于外源性胰岛素的典型的给药部位与自然释放位置有区别，当对糖尿病患者进行治疗时，希望所使用的胰岛素与其激发外周糖利用的能力相比能够更大程度地抑制肝脏的糖产生。为了获得更自然的结果而对于给药胰岛素与天然胰岛素作用不同的需要下面将作进一步解释。
胰岛素具有降低血流中葡萄糖浓度的总效应。这种效应是胰岛素作用于两种不同类型的组织而获得的。
胰岛素的降糖作用发生在肝脏和外周组织，以调节血中葡萄糖的水平。胰岛素与肝脏受体的相互作用引起肝脏内葡萄糖的生成减少，并且增加了肝脏储存糖，作为糖原;与外周脂肪和肌肉细胞上的受体相互作用可引起糖利用增加。这两种相互作用都引起血流中葡萄糖的浓度下降。在肝脏和外周细胞中，与受体的结合和胰岛素从系统中的消除是同时伴发出现的;也就是说，当胰岛素被利用时，它也在被消除。
在内源性胰岛素的正常作用机制中，大多数由胰腺分泌的激素与肝脏的受体相互作用。这种明显的亲合性被认为是由于肝脏与激素源最接近。一旦释放到总循环中，由于存在着大量的外周受体，绝大多数胰岛素似乎被外周细胞利用。给药的胰岛素不能够使肝脏和外周活性达到自然平衡的原因之一可能是开始向总循环系统给药时与肝脏受体相互作用的机会很少。但是，当内源性胰岛素从胰腺中释放时则会发生很高程度的这种相互作用。
胰岛素最初是在胰腺的朗格尔汉斯胰岛中以单链肽胰岛素原的形式合成的。在体外检测胰岛素原具有1-2%的天然胰岛素效能，在体内有大约15%的胰岛素效能，与胰岛素的4分钟半衰期相比具有30分钟的循环半衰期，胰岛素原在体内有相当程度的肝脏选择性(Glauber，H.S.，etal.，Diabetes(1986)35∶311-317;Peavy，D.E.etal.，J.Biol.Chem.(1985)260∶13989-13994;Davis，S.N.，etal.，Diabetes(1988)37∶74(abstract))。胰岛素原的体内肝脏选择性与胰岛素本身的体内肝脏选择性要多出50%。不过，胰岛素原大部分的用途中效能太低。
胰岛素被认为主要是以单体形式循环。该单体是一种键合的二硫化物，由21个氨基酸的A链和30个氨基酸的B链组成的双链分子。人、猪和牛胰岛素的氨基酸序列已经建立。(许多其他种的胰岛素氨基酸序列也已经确定)。前些日子开始试图区分这些肽中谁是基本的基团。通过对各种来源的胰岛素之间保留基团的观察，认为在单体表面上的较大不变区域是受体结合区。这个区包括A-链基团Al(Gly)，A5(Gln)，A19(Tyr)，和A21(Asn)以及B-链基团B24(Phe)，B25(Phe)，B26(Tyr)，B12(Val)，和B16(Tyr)。
deMeyts，R.A.等人Nature(1978)，273∶504-509，对29种胰岛素类型分子包括动物胰岛素和胰岛素原，胰岛素样生长因子和化学修饰胰岛素结合受体的能力及生物效能进行测试，deMeyts等人发现29种类似物系列中有一千倍的差别，其中显示基本基团为B链的8个羧基端基团和A链的A21(Asn)基团。
Tompkins，C.B.，等人在diabetologia(1981)20∶94-101杂志上指出某些胰岛素类似物完全是通过增加外周糖摄入而激发低血糖，而另一些则是通过降低肝脏的葡萄糖生成而完成。在这些研究中，胰岛素的A1，B29-二乙酰衍生物能够激发外周糖摄入，而A1-B29交联的胰岛素和胰岛素原降低肝脏葡萄糖的生成。
Nakagawa，S.H.，等人的近期研究J.Biol.Chem(1986)261∶7332-7341确认了B链羧基端区域的重要性。对与肝细胞受体结合的研究表明，当羧基是α-羧基酰胺化以保留羧基末端B链区的疏水特性时，胰岛素基团B26-B30可以被删除而不会降低结合或生物效能。但是，基团B25-B30或B24-B30的缺失会引起效能的降低。
当B25位的苯丙氨酸被亮氨酸或丝氨酸或被高苯丙氨酸取代后也发现效能降低;但是，B25位上被萘基-1-丙氨酸或萘基-2-丙氨酸的取代可以较小的程度降低结合活性。因B25位上的苯丙氨酸被丙氨酸、丝氨酸、亮氨酸或高苯丙氨酸取代而引起的活性降低可以通过剩余羧基端基团B26-B30的缺失而恢复正常。作者结论性指出B链羧基末端区的立体阻碍有助于胰岛素与其受体的直接作用，这种区域的负效应可以通过填充一个反映受体与B25(Phe)之β-芳香环相互作用的位点而逆转，并且指出，除B25之外，其余羧基末端基团在使此基团与受体有效地相互作用方面具有重要意义。这个小组的进一步研究(Nakagawa，S.H.，etal.，J.Biol.Chem(1987)262∶1254-1258)表明下游残基必须缺失从而逆转丝氨酸取代B25(Phe)产生的效应，并且指出残基B26(Tyr)或B27(Thr)的取代不能使这种亲合性的降低逆转。还进一步指出B29(Lys)和A1(Gly)的交联可降低胰岛素与受体的亲合性。这些研究的目的在于试图增加胰岛素的效能。
但是，同样发现糖尿病患者产生一种在B25上亮氨酸取代苯丙氨酸的突变型胰岛素。在其他两位患者发现在编码B24或B25的密码子发生突变，但是所编码的胰岛素没有进行表征(Shoelson，S.，etal.，nature(1983)302∶540-543)。
发现与受体结合能力增加和效能增加是在酪氨酸残基B26位碘化的胰岛素的一个特性(Podlecki，D.A.，etal.，Diabetes(1988)32∶697-704)。同样，Schwartz，G.P.，等人proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84∶6408-6411描述了一种与肝脏受体和外周受体都具有加强的结合活性的高活性胰岛素，它在人胰岛素B10位以天冬氨酸取代了天然的组氨酸。
其他人还报道了具有所期望的良好特异性质的胰岛素类似物。例如，Brange，J.，etal.，Nature(1988)333∶679-682，制备了在B9，B12，B10，B26，B27和B28位发生取代的类似物，这种设计是为了防止二聚物的形成。
1990年11月1日公开的国际专利申请WO90/12814公开肝脏特异性胰岛素类似物，其中在胰岛素多肽的A13，A14，A15，A19和B16位由选自下列一组中的色氨酸或其他大的疏水基团色氨酸、萘基丙氨酸，N-P-丹酰-α，γ-二氨基丁酸，亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸和其他疏水氨基酸所取代。传统描述为疏水性的自然产生的氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，或者也可以是侧链仅由碳氢化合物组成的氨基酸，例外的是蛋氨酸中有硫原子和色氨酸中有氮原子(J.Darnell，MolecularCellBiology，ScientificAmericanBooks，NewYork，1986)。相对而言，组氨酸和谷氨酰胺的侧链被认为是极性或亲水基团。
相对于WO90/12814中的内容而言，本发明提供了惊人和有益的结果，在A19位被非疏水氨基酸取代产生了在体内有肝脏选择性的胰岛素类似物。而且，本发明提供了下面的惊人和有益结论，在A14位被苯丙氨酸取代产生了外周选择性的类似物。这种A14类似物与国际专利申请WO90/12814公开的肝脏特异性用途相比有不同的显著的治疗用途。
本发明认识到了在向病人使用外源性胰岛素也即不是直接来源于胰腺的胰岛素时对于组织选择性的需求。
本发明公开了具有组织选择性的纯化人胰岛素类似物。组织选择性是指肝脏选择性和外周选择性的胰岛素类似物。肝脏选择性类似物与正常人胰岛素活性相比较，当以相同给药途径给药时，前者在体内阻碍肝脏葡萄糖产生的程度比它激发外周葡萄糖利用要大。外周选择性类似物与正常人胰岛素活性相比较，当以相同给药途径给药时，前者在体内阻碍肝脏葡萄糖产生的程度比它激发外周葡萄糖的利用要小。
本发明的一个目的就是提供在A12位含有不同于在所说位置天然产生基团的一种氨基酸残基的人胰岛素类似物，其中该类似物是肝脏选择性的。在本发明的一个实施例中，人胰岛素类似物含有A12Gly。
本发明的另一个目的是提供在A19位含有一种不同于该位置天然产生基团的氨基酸的人胰岛素类似物，并且它不是一个疏水基因，其中该类似物是肝脏选择性的。在本发明的一个实施例中，人胰岛素类似物含有A19His或A19Gln。
本发明的另一个目的是提供这样的人胰岛素类似物它在A12位含有一种不同于该位置天然产生基团的氨基酸，并且含下面的两种氨基酸或其中一种，它们是在A19位的不同于该位置天然产生基团的氨基酸和A15位的不同于该位置天然产生基团的氨基酸，其中该类似物是肝脏选择性的。在本发明的一个实施方案中，可以由甘氨酸残基取代A12位天然产生的基团和由组氨酸残基取代A19位的天然产生的基团。
本发明的另一个目的是提供在A12位含有一个氨基酸残基或在A10和A13一起含有氨基酸残基的人胰岛素类似物，其中所说的一个或几个残基不同于所说位置天然产生的一个或几个基团，其中该类似物是外周选择性的。在本发明的一个实施例中，丙氨酸基团可以取代A12位的天然产生基团;或脯氨酸基团可以取代A10位的天然产生基团和色氨酸可以取代A13位天然产生的基团。
本发明的另一方面是提供一种药物学上有效量的外周选择性人胰岛素类似物，这种类似物可以在需要用外周选择性胰岛素治疗时给动物给药，其中A14位的氨基酸是苯丙氨酸。
因此，这些组织选择性类似物可以单独或联合运用于药物组合物中，该组合物包含一种药物赋形剂材料和一种药学上有效量的人胰岛素类似物，它可以注射剂型，灌注或其他形式的剂型给需要这种药物的患者给药以有效地治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。
本发明的另一个方面是提供含有人胰岛素类似物编码序列的DNA序列和微生物。另一方面是提供制备人胰岛素类似物的方法。
本发明的基本任务是提供纯化的，化学合成的或重组的人胰岛素类似物。
本发明的优点之一是该胰岛素类似物可以配制成能有效地治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的药物制剂。
本发明的另一个优点是它为糖尿病和其他患者提供一种治疗方案，这种治疗方案与使用含有在结构上等同于人胰岛素的胰岛素制剂的治疗方案相比较有优越的临床效果。
通过阅读前面以及后面所详述的结构、合成和用途，以及参考附图，对于本领域中的熟练技术人员来说，本发明的这些和其他目的，优点及特征将是显而易见的。
图1和SEQIDNOS1-6代表了六个化学合成的寡聚核苷酸，它们与一种特定的序列结合在一起并含有一个编码人胰岛素原基团。
图2a和SEQIDNOS7-8代表了编码CAT的氨基酸1-73，一种8氨基酸接头序列和人胰岛素原的DNA序列。还表示了编码人胰岛素原蛋白的推断的氨基酸序列。图1中所述的用于构建胰岛素原cDNA的寡聚核苷酸的位置在图2b中给出。
图3表示的是对于胰岛素和A12Gly类似物来说在血糖正常和血胰岛素过高时葡萄糖的转向过程。曲线A表示外源性葡萄糖输入的速度(GIR)，曲线B表示葡萄糖消失的速度(Rd)，曲线C表示肝脏葡萄糖的产量，并且是以Ra减GIR计算出的。在稳定状态条件下，Ra＝Rd。
图4表示的是对于胰岛素、A19Gln类似物和A19His类似物的葡萄糖转向过程。曲线A表示外源性葡萄糖输入的速度。曲线B表示葡萄糖消失的速度(Rd)。曲线C表示肝脏葡萄糖的产量(HGO)，它是以Ra减GIR计算出的。
在描述本发明的人胰岛素类似物之前，描述制备这种人胰岛素类似物及含有该类似物组合物的制备方法和这种类似物的给药方法，应当明白的是本发明并不局限于所述的这种特定的组合物和方法，因为这种组合物和方法学当然可以改动。还应当明白的是本文所用的术语仅是为了描述特定的实施例，并不是为了进行限定，因为本发明的范围只能由附带的权利要求所限定。
必须指出的是本说明书和权利要求中所使用的单数形式“一个”和“这个”，除非上下文中清楚指明，它包括复数的形式。因此，例如，提及“一种组合物”，它包括这些组合物的混合物，提及“一种类似物”，它包括类似物的混合物，提及“重组合成方法”，它包括这里和前面所述的一种或几种方法类型。本说明书和权利要求中所用的术语人胰岛素类似物并不是暗示所说的类似物必须是直接或间接地来源于人体。
本发明提供了具有组织选择性的纯化人胰岛素类似物。与胰岛素的活性相比，当以相同的给药途径给药时，肝脏选择性胰岛素类似物在肝脏比在外周具有更大的活性。因此，这种组织选择性类似物可以置于药物组合物中，并且用于治疗糖尿病时与人胰岛素相比可以获得优越的临床效果。本发明的每种肝脏选择性类似物的氨基酸序列与人胰岛素的氨基酸序列。除了下面几种情况外是等同的，(a)在A12位，其中的氨基酸残基不同于所说位置天然产生的基团，或(b)在A19位，其中的氨基酸残基不同于所说位置天然产生的氨基酸，并且是非疏水性的，或(c)A12位与A15和A19位中的一个或两个相结合，其中所说位置的氨基酸残基不同于该位置天然产生的基团，并且其中的该类似物是肝脏选择性的。因此，相信A12，A15和A19氨基酸取代的几种结合会产生肝脏选择性胰岛素类似物。
本发明还提供了外周选择性的人胰岛素类似物。与正常人胰岛素活性相比，当以相同给药途径给药时，外周选择性类似物对体内肝脏葡萄糖生成的抑制程度要比它激发外周葡萄糖利用的程度小。具有正常空腹葡萄糖但葡萄糖耐受性受损的患者可以利用本发明的这种类似物。对于这种患者来说，运用该外周选择性胰岛素类似物时，与在肝脏的胰岛素活性相比，它可以在更大程度上激发胰岛素的外周活性。这种类似物可以加入到药物组合物中，用于患者以获得与人胰岛素相比更优越的临床效果。本发明的每种外周选择性类似物的氨基酸序列除了下面几种情况外与人胰岛素的氨基酸序列等同，这几种情况是(a)在A12位，其中的氨基酸残基不同于所说位置天然产生基团，或(b)A10位，其中的氨基酸残基不同于该位置天然产生的基团，和在A13位，其中的氨基酸残基不同于该位置天然产生的基团。本发明还可以运用一种药学上有效量的人胰岛素类似物治疗某种需要外周选择性胰岛素治疗的动物，其中A14位的氨基酸残基不同于天然产生的氨基酸，且是苯丙氨酸。
可以用任何已知的方法制备胰岛素。例如，可以用寡聚核苷酸构建编码胰岛素原的cDNA。也可以用一种寡聚核苷酸筛选探针从人胰岛瘤cDNA库中分离编码胰岛素原的cDNA。Bell，G.J.，等人在以前曾经描述过含有用于胰岛素原的序列的克隆分离方法，Prell，G.I，etal.，Nature(1979)282∶525-527和Chan，S.J.，etal.Boc.Natl.Acad.Sci(1981)78∶5401-5405。
化学合成和重组方法都可以用于制备本发明的类似物。对于重组物质来说，必须合成cDNA，这种合成可以通过本领域中熟练技术人员已知的方法完成，例如，运用PCR技术。当构建出合适的cDNAs时(例如，运用编码胰岛素原的DNA，进行合适的密码子取代，并进行PCR)，将其人工操作融合到质粒当中，然后运用该质粒转染微生物宿主细胞如大肠杆菌。然后使转染的宿主生长，构建的cDNAs将表达合适的胰岛素原类似物。
对表达的蛋白运用标准方法进行分离和纯化，以获得基本上纯的多肽。胰岛素原类似物最好表达为一种CAT一类似物融合蛋白。因此，在使转染的宿主细胞表达了融合蛋白之后。分离融合蛋白，然后进行cNBr切割以使所需要的胰岛素原类似物与CAT分离。该胰岛素原经过亚硫酸分解(Sulfitolysis)，再折叠，然后经过酶切割产生胰岛素类似物。然后分离胰岛素类似物并用本领域中熟练技术人员已知的蛋白纯化方法进行纯化。所得到的类似物是具有正常二硫键的再重叠多肽，以致于所得到的结构具有所需要的生物活性。将该类似物纯化到95%或更纯，最好是纯化到99%或更纯化，以用于病人。
用3H-葡萄糖作为跟综剂，可以在正常血糖，血胰岛素过高的鼠中测试本发明的类似物。根据这种技术，输入葡萄糖以保持血糖正常，还输入胰岛素或类似物。使用3H-葡萄糖，在稳定状态条件下用Steel等人的等式[Steel，et al.，Am.J.Physiol.(1956)181∶15-24，本文引用了该文献]计算外周葡萄糖的利用(Rd)和肝脏葡萄糖的生成(HGO)。
将纯化的类似物配制成可注射的药物剂型并给药以治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。药物组合物中胰岛素类似物的给药剂量典型地是每天大约0.1mg至大约10mg之间。
例如，还可以胰岛素类似物与合适的赋形剂或载体一起配制成适合于非肠道或鼻腔给药的药物组合物剂型。可以用本领域中任何已知技术制备药物组合物。如见Remington’sPharma-ceuticalSciences，17thEdition，MackPublishingCompany，Easton，PA(1985)，本文引用参考了该文献。
例如，可以将本文所述的人胰岛素类似物以这样的方法配制以便适合通过几种不同的给药途径给药，这些给药途径包括，但不局限于，静脉内注射，皮下注射，和肌肉注射。已经公知胰岛素(如，人，牛和猪胰岛素)可以配制成各种不同的剂型以用于皮下或肌肉注射，这要取决于pH，锌含量，防腐剂，等渗剂，缓冲液，和加入的碱性蛋白如鱼精蛋白，以在皮下注射时提供不同程度的吸收。参见如，JensBrange，GelenicsofInsulin，ThePhysico-ChemicalAspectsofInsulinandInsulinpreparations，Springer-Verlag，NewYork，1987。有两种普通级别的制剂特别有用，分别称之为“可溶性”，常规或快反应性”及慢反应性衍生物。这种慢反应性制剂又分为两个亚类(1)“等时效应”、“NPH”或媒介反应性和(2)“长效的”、“长反应性”。可溶性制剂可以制备成酸性或中性制剂，但是在注射部位中性制剂更好耐受，而且在储存时也会减少胰岛素类似物的分解。
可以从含有下列组成的混合物中制备适合用于药物制剂的结晶锌胰岛素类似物，该混合物含有大约1.5%的胰岛素类似物，7%氯化钠，0.1摩尔的乙酸钠，和一定量的锌离子(来源于氯化锌或乙酸锌)以足够使胰岛素类似物中的锌达到总重的0.8-0.9%，大约相当于每六个胰岛素类似物分子4个锌原子。通过加入无机酸，如盐酸水溶液，调节该溶液的pH至5.5或者如果其等电点与天然胰岛素不同则调节至该类似物的等电点引起结晶或非晶形沉淀形成。加入前形成的胰岛素类似物结晶可以加速这一过程。静置后，沉淀物会逐渐再溶解，结晶物形成，直到达到结晶形成占优势的新的平衡状态。加入能与锌离子或胰岛素分子相互反应的化合物将会改变结晶方式，而且最佳结晶条件会因特定的胰岛素类似物有所改变，这一点对于本领域中的熟练技术人员来说是公知的。通过加入添加剂如酚或其他羟基化的芳香族化合物，以及通过大幅度改变锌含量或介质的pH值，都会改变如此获得的胰岛素类似物的结晶形式。
根据下面的一些因素可以将结晶胰岛素类似物用于制备各种不同剂型的胰岛类似物，这些因素包括加入的阳离子有机化合物如珠蛋白，加入的碱性蛋白如鱼精蛋白，加入的锌离子，或胰岛素类似物颗粒的大小或物理状态，或结晶体在注射部位具有不同的吸收速度，以及不同的作用起始和持续时间。
例如，通过将锌胰岛素类似物结晶溶于pH3的稀盐酸中使胰岛素类似物浓度大约为4%，可制备出适用于皮下、肌肉或静脉内注射的可溶性，快反应性的胰岛素类似物剂型。过滤灭菌之后，可以加入保持无菌性的添加剂如酚(0.2%)或羟苯甲酸甲酯(0.1%)，等渗剂(如氯化钠0.7%或甘油1.6%)，缓冲剂(如乙酸钠0.01M)，使其在最终剂型中的浓度大约为括号中所示的浓度。用稀释的碱如0.01至0.1N的氢氧化钠小心地调节溶液的pH至中性(pH7)，这样可以避免达到局部的高pH和胰岛素类似物的降解。然后用无菌水稀释中性溶液至所希望的最终胰岛素类似物浓度，通常在1mg/ml和10mg/mL之间，以及所希望的离子强度，最好与人血清等渗。这种制剂需要储存于周围环境温度之下，0℃之上，最好是4℃以减少使用前的降解。
向中性pH的胰岛素类似物溶液中以等(等时效应isophane)比例的量加入碱性蛋白如鱼精蛋白(比如鲑精蛋白)可制备称之为等时效应(isophane)剂型的较缓慢性制剂。在加入的锌离子(大约每25mg胰岛素类似物0.2μg的锌离子)和一种酚化合物，酚或甲酚的存在下，将会形成一种鱼精蛋白与胰岛素类似物的复合物沉淀，它比可溶性胰岛素类似物从注射部位的吸收更迟缓。根据本文的公开内容可使本领域中的熟练技术人员容易地知道，如此获得的剂型的性质，尤其是沉淀物中鱼精蛋白与胰岛素类似物的比率，会受到pH、温度、加入锌的浓度和辅助物质变动的影响。这些可变因素会影响到皮下或肌肉注射后胰岛素类似物的吸收以及所得制剂的作用起始及持续时间。
通过增加制剂中锌的含量可以获得一种更迟缓反应性或超长效制剂。这种剂型的制备是向结晶胰岛素类似物的悬浮液中加入来源于乙酸锌或氯化锌的锌离子，加入的方法如同前面描述制备胰岛素类似物结晶时所述，不同的只是不加入酚。希望最终总锌离子浓度大约为0.09至0.15mg/mL，这要取决于制剂中胰岛素类似物的最终浓度，最佳量是使溶液中游离锌离子浓度大约为0.05mg/mL(未与胰岛素类似物沉淀结合的)。本文的公开内容可使本领域中的熟练技术人员知道，以这种方式得到结晶的大小和可变性会影响所得制剂在皮下或肌肉注射后的作用。
可以制备另一种迟缓形式或长效的剂型，方法是在酸性pH(如，在pH3的稀盐酸中)中溶解游离的胰岛素类似物，使胰岛素类似物的浓度在4%的范围之内，并且过滤灭菌之后，加入锌(以氯化锌或乙酸锌的形式)使最终锌浓度达到0.09至0.15mg/mL。然后用稀碱小心地调节pH至中性，以便于形成非结晶沉淀。本文的公开内容可使本领域中熟练技术人员容易地知道，如此获得的沉淀物的性质会因影响沉淀的因素而有所改变，这些因素如中性化的速度、或胰岛素类似物或锌或其他添加剂的浓度。而且这也会影响皮下或肌肉注射后胰岛素类似物的吸收以及所得制剂的作用起始速度和持续时间。
本文的公开内容会使本领域中的熟练技术人员显而易见地知道，通过对上述一般方法进行修改可以获得本文公开的胰岛素类似物的其他制剂，这样会产生广泛范围的剂型，它在皮下或肌肉注射后具有各种不同的吸收速度，以及不同的作用起始时间和持续时间。可以将胰岛素分子配制成适合于非肠道途径给药的剂型，如口腔，鼻腔、直肠和结膜给药，这对于本领域中的熟练技术人员也是公知的。本申请所述的胰岛素分子也应当是适合于以天然胰岛素(如，人、牛或猪)曾经通过这些途径进行给药的剂型给药。
应当明白的是给病人用药时的所有或任何胰岛素类似物的有效量可以由细心的给药人确定，也可以根据标准而定，如病人的体重、年龄和性别，给药途径，以及病人的反应性和病人胰腺不能产生胰岛素的程度。病人开始的剂量方案可以与其使用胰岛素所习惯的方案相类似。之后，可以根据病人的反应性调节组织选择性胰岛素类似物的给药剂量。
表达胰岛素融合蛋白胰岛素类似物是以在细菌细胞中表达的融合蛋白形式提供的。公知许多真核蛋白不能在细菌细胞中以可测量被表达，也不能以商业上可回收的水平被表达，原因是宿主使外源性蛋白进行蛋白分解。正如共同申请的系列申请No.07/391，277，申请日1989年8月8日，(PCT公开号WO90/01540，
公开日1990年2月22日)中所说(本文引用该申请作参考)，不能够以高产量表达的蛋白质可以以融合蛋白的形式表达以增加表达水平。为了实施本发明，最好使胰岛素类似物以与氯霉素乙酰转移酶(CAT)的融合蛋白形式被表达，这种酶是一种已知的选择性标记物，并且是一种在监测真核和原核表达效率方面易于检测的酶(Delegeane，A.M.，etal.，MolecularCellBiology，(1987)。7∶3994-4002)。在本发明的分离和纯化方法中开始的融合蛋白基本上与前面所述专利申请中所述的一般类型相同。下面是在前述专利参考文献中公开的融合和表达方法的简单总结。
CAT编码一种219个氨基酸的成熟蛋白，并且该基因在其全长度中含有许多方便的限制性核酸内切酶位点(5’-PvuII，EcoRI，DdeI，NcoI，和ScaI-3’)以测试基因融合用于高水平表达。可以用这些限制位点构建杂交基因序列。
利用CAT的表达构建体可以使用CAT编码基因序列的大部分或基本上平截的编码CAT蛋白的N-末端部分的序列与编码所需异源多肽的基因相连接。这些表达构建体显示出增强了各种异源蛋白的表达水平。它利用一些不同长度的CAT蛋白，大小从73至210个氨基酸。在EcoRI限制位点消化CAT核苷酸序列可以方便地形成73氨基酸CAT融合成分。同样，用ScaI消化CAT核苷酸序列可形成210氨基酸CAT融合成分。然后可以将这些以及其他CAT限制片段连接到编码所需蛋白的任何核苷酸序列上，以加强所需蛋白的表达。
将核苷酸序列翻译成蛋白的阅读框架以CAT的氨基末端部分开始，其长度长短不等，在带有或不带有接头序列的框架中延续至胰岛素原类似物序列，在其羧基端终止。向CAT序列的下游导入一个酶或化学切割位点，以从杂合蛋白中最终回收切割的产物。合适的切割序列以及优选的切割条件将在下面描述。
为了避免在CAT序列内进行内切割，可以使用惯用的位点特异性诱变技术(Zoller，M.J.，和Smith，M.，Nucl.AcidsRes.(1982)10∶6487-6500，和Adelman，J.P.，etal.，DNA(1983)2∶183-193)进行氨基酸取代。使用一种与单股噬菌体DNA互补的合成寡聚核苷酸引物来完成这一过程，产生除有限的失配外的诱变，表示所需要的突变。这些取代只有当CAT的表达基本不受影响时才能进行。如果有内在的半胱氨酸残基，可将这些残基取代以有助于减少通过二硫桥的多聚化反应。
可以用原核生物系统表达CAT融合序列;原核生物大多由各种大肠杆菌的菌株作代表(如，MC1061，DH1，RR1，W3110，MM294，MM294B，C600hfl，K803，HB101，JA221，和JM101)，但是，也可以使用其他的微生物菌株。所使用的质粒载体含有复制位点，选择性标记物，和来源于与宿主相匹配的种类的控制序列，例如，典型地是，由Bolivar等人Gene(1977)2∶95使用pBR322的衍生物，一种来源于大肠杆菌种的质粒，转化大肠杆菌。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此提供了可以在所需载体的构建过程中既可以被保留也可被破坏的多个可选择性标记物。
除了上面所述的能够促进切割和纯化产物多肽的修饰，可以将四环素抗性基因保留于举例的CAT融合载体中以用于另一种质粒选择和保存方法。
尽管大肠杆菌色氨酸启动子-操纵子序列是优选的，但是可能用不同的控制序列取代色氨酸调节序列。本文所定义的通常使用的原核控制序列包括用于转录起始的启动子，可以选择性地带有一个操纵子，带有核糖体结合位点序列，包括的这些通常使用的启动子如β-内酰胺酶(lactamase)(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang et al.，Nature(1977)198∶1056)，λ-衍生PL启动子(Shimatake et al.，Nature(1981)292∶128)和N-基因核糖体结合位点，和色氨酸-乳糖(trc)启动子系统(Amann和Brosius，Gene(1985)40∶183)。
使产生融合蛋白的转化微生物生长于合适的生长培养基中，该培养基含有能满足微生物营养需要的化合物。典型的生长培养基可含有可以同化的碳、氮、镁、钾和钠离子源，也可以含有氨基酸、嘌呤、嘧啶碱基、维生素、矿物质等。
发酵结束后，通过如交流过滤、离心或其他惯用方法收集细菌糊。浓缩糊的优选储存温度在-20℃以下，最好大约是-70℃直到下一步使用。
细胞破碎和制备融合体细菌糊浓缩之后，破碎微生物的细胞膜和细胞壁，可以通过化学方法，即用碱，或用一种象1-辛醇样的化合物，或者通过酶学方法，例如用溶菌酶，或者使用机械方法，也就是使用商业上可获得的匀质器或微量流体化仪，这些都是本领域中已知的。可通过显微术和/或加入一种染料如考马斯兰，以及监测随细胞溶解而典型增加的其在595nm的吸收值，来控制破碎的终点。这一方法步骤要进行足够长的时间以确保基本上全部细胞被破碎，并且确保基本上没有完整细胞被带到下一个方法步骤中。
细胞破碎之后，通过过滤、离心等收集含有内含体的完整细胞匀浆的不溶部分。内含体部分典型的是起始湿细胞重量的10-30%，因此CAT/胰岛素类似物融合蛋白的含量充足是有希望的。为了去除污染的细菌蛋白，用一种含有1M盐酸胍和二硫苏糖醇(DTT)，乙二胺四乙酸(EDTA)和缓冲剂的培养液洗涤内含体小丸。洗涤之后，离心使内含体沉淀，再用前面提到的培养基洗涤沉淀小丸。为了达到相对高(50-70%)产量的胰岛素类似物这种洗涤过程是重要的。通过洗涤掉一部分污染的细菌蛋白，这一步骤可使内含体蛋白的CAT-胰岛素类似物融合蛋白比率增加至大约50%。如果需要可将内含体冷冻，储存。
融合蛋白的切割切割融合蛋白使用的试剂和方法将取决于开始时结合到融合蛋白中的切割序列。这里可以使用的切割序列包括，例如，那些切割下列残基的序列，它们是蛋氨酸残基(切割剂溴化氰)，谷氨酸残基(切割剂蛋白内切酶Glu-C)，色氨酸残基(切割剂是带有尿素或带有十二烷基硫酸钠的N-氯代琥珀酰亚胺)和天冬酰胺与苷氨酸之间的断裂(切割剂是羟胺)。对于本发明来说，用溴化氰切割尤其优选。
用选择的切割剂在环境温度下处理前一步骤获得的溶解形式的内含体。使反应进行必需长时间以确保使融合蛋白基本上完全断裂。
断裂反应完成之后，干燥样本。使干燥的断裂混合物进行亚硫酸分解(Sulfitolysis)以便对带有S-磺酸盐的游离硫氢基进行修饰。使以稳定的5-磺化形式存在的修饰胰岛素类似物部分纯化，它可以通过已知的方法被再折叠，转化成活性人胰岛素类似物。再折叠技术可以使S-S键形成。使类似物折叠以获得二硫桥的形成，并转化成胰岛素。最后，通过高压液相色谱分析(HPLC)纯化胰岛素类似物。
本发明还可以下面的具体实施例作进一步说明，这些实施例不以任何方式对本发明的权利要求范围进行限定。对A12Gly胰岛素类似物的构建进行具体的描述，但是此方法可用于制备本发明的其他胰岛素类似物。
下面的实施例为的是向本领域中的普通技术人员充分公开，并且描述怎样制备、配制剂型和使用本发明的胰岛素类似物和胰岛素类似物药物制剂，并且不对发明人所认为的发明范围进行限定。曾努力保证所用数据的准确性(如，量，温度，等)，但是应当允许有一些实验错误和偏差。除非另外指明，部分是指重量部分，温度是摄氏温度，压力是或接近于空气压力。
构建胰岛素类似物胰岛素类似物的构建是通过在胰岛素原cDNA分子中进行核苷酸改变，以使所产生的cDNA分子编码类似物中所需氨基酸的取代。
通过将一系列含有人胰岛素原编码基因的化学合成寡聚核苷酸与一种人工接头在5’端结合，构建胰岛素原cDNA。1-6号的寡聚核苷酸在图1(SEQ ID NOS1-6)中描述。这些类似物按1和2，3和4，5和6配对。使每一对进行磷酸化，退火，然后按下述方法连接。为了进行激酶反应，将5μg每种寡聚核苷酸对加入到100μl含有70mM Tris pH7.6，10mM MgCl2，5mM DTT，1mM ATP的溶液中加入20单位T4多聚核苷酸激酶。混合物在37℃下保温1小时，加热到65℃10分钟使之终止反应。将上述样本加热至100℃3分钟，接着在室温下保温30分钟，然后在4℃下保温过夜，使寡聚核苷酸退火。
混合(收集)退火的寡聚核苷酸对，加入10mM ATP使浓度达到1mM，在T4DNA连接酶存在下进行连接。然后使样本在15℃下保温过夜，用KpnI和HindⅢ消化连接的DNA，通过标准方法使大约280bp片段进行凝胶纯化。
将编码胰岛素原的cDNA插入到质粒载体pUC19中(Yannish-Perron，C.，etal.，Gene(1985)33∶103-119;Roberts，R.J.，Nucl.AcidsRes.(1987)15Supplr189-r217)，通过标准方法用KpnI和HindⅢ消化质粒载体。所产生的载体命名为pPINS。用EcoRI和NdeI消化含有胰岛素原DNA的载体(pPINS)，并与用NdeI和EcoRI消化的编码CAT氨基酸1-73的DNA片段连接。所产生质粒含有的DNA序列可编码CAT的氨基酸1-73。一种8氨基酸人工接头序列(图2a)，和人胰岛素原。用这个质粒，PUC-CAT-胰岛素原构建用于胰岛素类似物的cDNA。
使用一种自动温度循环仪(PerkinElmerCetusDNAThermalCycler)通过一种酸催化的多聚合反应的反复系列构建胰岛素类似物。下面对A12Gly的构建进行描述。使用两个寡聚核苷酸引物。一个引物与cDNA末端的反义链互补，并且具有下面的序列(SEQIDNO9)5’-CCGGAATTCGAGCTCGGTACCCGG-3’。另一个引物除了编码所需氨基酸变化的核苷酸密码子外，与cDNA3’端的有意义链互补。为了构建A12Gly类似物，使用互补于有意义链的寡聚核苷酸引物，5’-GCCAAGCTTCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGAGACCGCA-3’(SEQIDNo10)。这个引物是在12位编码氨基酸Gly而不是胰岛素原中的氨基酸Ser。以相同的方式构建A19His，不同的是互补于有意义链的引物含有序列5’-GCC AAG CTT CTA GTT GCA ATG GTT TTC-3’(SEQ ID No11)，并且编码19位的组氨酸而且胰岛素原中氨基酸酪氨酸。通过使用聚合酶链反应技术(PCR)，用编码氨基酸(Gly)的所需DNA序列取代该位置的天然产生的氨基酸(Ser)。编码胰岛素原的DNA序列见图2和SEQ ID No7所示。为了进行聚合酶链反应，混合物如下10μl的10x PCR缓冲液(500mM KCl，100mM Tris-HCl pH8.3)，16μl 1.25mM脱氧核苷酸混合物(dATP，dGTP，dTTP，dCTP)，1μM寡聚核苷酸引物，1ng模板pUC-CAT-胰岛素原，10μl 100%DMSO，0.5μl(2.5单位)Taq聚合酶，和H2O，最终体积是100μl。在反应混合物上面铺少量矿物油，然后使循环仪的程序重复下列循环1.在94℃变性1分钟;
2.在55℃退火30秒;
3.在72℃合成DNA30秒。
扩增反应进行30个循环。
用酚;氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取PCR反应混合物一次，再用氯仿∶异戊醇(24∶1)提取一次。加入乙酸钠(3M的1/10体积)和2体积的100%乙醇，使样本在-70℃下保温最少15分钟。在微量离心机中于4℃离心15分钟收集沉淀的DNA。使干燥的小丸再悬浮于45μl H2O中，加入5μl 10x Kpn I缓冲液(100mM NaCl，100mM Tris-Cl pH7.5，100mM MgCl2，10mM DTT)。40单位KpnI和40单位HindⅢ，用KpnI和Hi-ndⅢ进行消化。通过在琼脂糖凝胶上电泳并从凝胶中提取，可以使大约280bpDNA片段纯化。然后通过连接反应将纯化的片段插入到含有CAT的表达载体pTrp233中(美国专利No.4，764，504)。用KpnI和HindⅢ消化表达载体。连接反应混合物的制备是，将2.5μl10x连接酶缓冲液(0.5M Tris-Cl pH7.4，0-1M MgCl2，0.1M DTT)，2.5μl10mM ATP，20ng的消化的表达载体，2.5ng PCR DNA片段，和1μl T4DNA连接酶(NEBiolabs)与水混合至最终体积为25μl。
使连接反应在室温下进行2小时，然后按照下面详述的标准方法用反应液转化感受态大肠杆菌细胞。从转化的细胞中分离出一个单一菌落，用它制备质粒。通过标准方法对这个质粒进行DNA序列测定，以确保使用编码胰岛素类似物A12Gly(SEQIDNOS12和13)的所需cDNA转化细胞，以用作产生重组胰岛素类似物的来源。
产生，分离和纯化重组胰岛素类似物表达在大肠杆菌中将人胰岛素类似物A12Gly(SEQIDNOS12和13)和A19His表达为带有部分细菌CAT蛋白的融合蛋白。常规使用这些方法对在大肠杆菌中表达为CAT融合蛋白的胰岛素类似物进行纯化。为了实施这个实施例，对胰岛素类似物A12Gly或A19His的表达进行叙述。
通过溴化氰易感性蛋氨酸连接将上述的胰岛素类似物结合到CAT序列的羧基端上。从细菌表达载体pTrp233的色氨酸启动子开始表达CAT-胰岛素类似物融合体。
用质粒转化大肠杆菌W3110(ATCC入藏号No.27325)，并选择氨苄青霉素抗性。使转化子在培养基中于37℃生长过夜，该培养基是含有M9盐，2mM MgSO4，0.1mM CaCl2，0.4%葡萄糖，0.5%酪蛋白氨基酸，40μg/ml色氨酸，2μg/ml维生素B1，和100μg/ml硫酸氨苄青霉素的完整M9培养基。用过夜的培养物(45-50ml)接种2升含有4-8μg/ml色氨酸的M9培养基。当细胞达到OD590为0.4-0.5时通过标准方法用25μg/ml吲哚丙烯酸诱导融合蛋白表达。使细胞继续在37℃下生长4-5小时。离心收集细菌糊，并储存于-20℃直到使用。
制备内含体使用一种W-225R型超声波处理器(HeatsystemsUltra-sonics，Inc.，PlainviewN.Y.)破碎大约8克细胞。将细胞悬浮于冰上的45mlTE缓冲液(10MMTrispH7.5，1mMEDTA)，1mMDTT中。将声波处理器设置到7，恒定工作循环。使用钝端两次，2分钟，有1分钟的冷却间隙。通过显微镜检查监测匀浆样本的细胞溶解情况。加入10ml的6M盐酸胍溶液至最终浓度为60ml中含有1M，以有利于内含体的洗涤。再进一步加入200ml的缓冲液(TE/DTT/盐酸胍)以改善洗涤。用RC-BGSA转头以5000-7000rpm离心10分钟使已洗涤的内含体沉淀成小丸，将其再悬浮于20ml的TE/DTT/盐酸胍中。用SS-34转头以5000Xrpm离心15分钟收集含有内含体的完整细胞匀浆的未溶解部分。将含有CAT胰岛素原类似物融合蛋白的小丸沉淀物储存于-20℃或进行溴化氰(cNBr)断裂。
融合蛋白的溴化氰断裂用cNBr切割CAT73/胰岛素原类似物融合蛋白。将内含体(大约2-3克)再悬浮于3ml的去离子水中，然后一滴滴地加到16m188%甲酸中。向已溶解的内含体加入cNBr(120mg)，用氩或氮封闭样本，然后在室温下轻轻搅拌4小时。使样本干燥过夜，将干燥的残留物储存于-20℃的干燥箱中。
亚硫酸盐溶解把干燥的切割混合物再溶于12ml的亚硫酸盐溶解缓冲液中(6M盐酸胍，50mM碳酸氢铵)，用乙醇胺(100-200ul)调PH至9.0。加入200毫克亚硫酸钠和100mg连四硫酸钠并同时搅拌，用乙醇胺调PH至9.0。于室温下搅拌反应混合物6小时使半胱氨酸和胱氨酸转化成S-磺化基团。加入1/20体积的1MHEPES和大约0.4ml的2NHCL。使PH达到7终止反应，于-2℃下储存过夜。
使反应混合物在SephadexG-15柱子上于7M尿素，20mMTrispH7.5中脱盐。将脱盐的蛋白上DEAE琼脂糖快流柱，并用7M尿素，20mMTrispH7.5冲洗，再用50MmNaCl，7M尿素，20mMTrispH7.5洗涤。利用一种GM-3梯度发生仪(Pharmacia)用200ml的线性梯度50-250mMNaCl洗脱柱子。通过UV226nm跟踪和/或在SDS-PAGE上迁移识别胰岛素原类似物磺酸盐部分。
再折叠将含有胰岛素原类似物磺酸盐的DEAE收集馏分在用50mM甘氨酸缓冲液，PH10，平衡过的G-15柱子上脱盐，通过测量在226nm处的吸收值而识别适当馏分，并收集储存。使用Bicinchoninic酸A对甘氨酸脱盐的胰岛素原类似物磺酸盐进行PierceBCA蛋白分析(Pierce，Rockford，IL)。
通过控制由β-巯基乙醇催化的硫氢基之间的交换而将胰岛素原类似物诱导为具有形成正确的分子内二硫键的折叠形式。用脱气的甘氨酸缓冲液，PH10稀释胰岛素原甘氨酸收集馏分至浓度为0.1-0.4mg/ml，然后缓慢加入0.01体积的60mMβ-巯基乙醇试剂。用氩掩盖封闭样本，置于4℃，避光保存过夜。
酶转化一般是按照欧洲专利申请No.0264250所述的方法对样本进行酶促转化，本文参考引用了上述专利申请。将再折叠的样本浓缩至大约2mg/ml。向50mm甘氨酸缓冲液PH中的胰岛素原类似物浓缩物加入1MHEPES(至最终浓度10mM)，2NHCL(调节再折叠溶液至PH7.2-7.5)，200mM CaCl2(最终浓度2.0mM)和10mMNiCl2(至最终浓度0.1mM)。将羧基肽酶B(Worthing ton，186单位/mg)，以10mM HEPES，PH7.5中0.4mg/ml的浓度加入，最终浓度为4μg/ml。以10mM HEPES PH7.5中0.1mg/ml的方式加入胰蛋白酶-TPCK(Worthington，225单位/mg)，(最终浓度为1μg/ml)。在5℃至-12℃保温样本。用反相HPLC监测转化，并在5到17个小时内完成。加入2.5M乙酸/乙酸铵PH3.5至最终浓度0.25M以终止酶转化反应。储存于5℃。向样本中加入乙腈(10%v/v)，通过HPLC进行分析，并抑制微生物的生长。
对再折叠和酶转化进行分析浓缩之后对再折叠的样本进行分析以确定是否发生了正确的折叠。用100μl的0.5m乙酸和200μl的平衡流动相(20%乙腈/0.25M乙酸/乙酸铵PH3.5)稀释，然后混合离心澄清，以制备用于分析的样本(100μl)。通过一个园孔/注射器将200-400μl样本加到一种Toso-HaasTSKODS120TSum分析柱上，该柱250×4.6mm，带有直接相连的保护柱，并且以Vydac薄膜介质(Vydac，Hesperia，CA)填充。用在0.25m乙酸/乙酸铵PH3.5的20%乙腈中平衡。用一种25-40%线性梯度的乙腈以每分钟0.5%洗脱样品。在276nm处监测柱子流出液的UV吸收值。也可以用这种色谱分析系统对酶转化后的样本进行检查。在此分析中，酶转化的样品比胰岛素原类似物跑得快，说明胰岛素原类似物已转化成胰岛素类似物。这一分析也为设计胰岛类似物制备性HPLC纯化提供了基础。
已转化类似物的HPLC纯化酶消化之后，将澄清溶液在C18反相高压液相色谱分析柱子(RP-HPLC)上进行纯化。该柱子是一种TSKODS120T10μ300×7.8mm柱子。通过一个5ml的小孔进行多次注射每跑一次柱子加30mg的总蛋白。样本加上之后，用0.25m乙酸/乙酸铵PH3.5/20%乙腈平衡柱子，然后用20%至50%的乙腈梯度洗脱。胰岛素类似物通常洗脱在28%至30%的乙腈之间。通过测定在276nm的吸收值识别的合适的吸收峰，并收集。收集纯化的类似物馏分，并确定蛋白浓度。收集的样本快速冷冻并冻干。
为了对每种纯化胰岛素类似物进行鉴别和改进，对1-20μg的样本进行肽序列和氨基酸组成分析。通过HPLC分析5-10μg的样本以测定其纯度。用90%缓冲液A/10%缓冲液B平衡Vydac218TP5415柱子。(缓冲液A是0.075%TFA(三氟乙酸)水溶液;缓冲液B是0.05%TFA/100%乙腈)以1.0ml/分钟的速度将10%至40%的线性梯度缓冲液B通过30分钟，在215nm处监测柱子流出液。样本纯度大约是85-95%。
体内方法设计体内研究以测定胰岛素类似物的效能，并确定该类似物是否具有不同于胰岛素的组织选择性。
用正常血糖、高血胰岛素降糖方法测试该类似物。在这个研究中，以不同的速度输入胰岛素类似物，同时以可变速度输入葡萄糖。外源性葡萄糖要以足以维持实验过程中的血糖正常的速度输入。另外，还输入｛D-3-3H}葡萄糖(跟踪剂)以评价葡萄糖的代谢(也即，葡萄糖的转向)。用Steele等人(Am.J.Physiol.(1956)187∶15-241)的稳定状态等式计算肝脏葡萄糖的生成量和葡萄糖的消除速度。在稳定状态条件下，葡萄糖(mg/ml)和3H葡萄糖(dpm/ml)的水平是恒定的。在这些条件下，葡萄糖生成的速度(Ra)＝葡萄糖消失的速度(Rd)。Ra还定义为葡萄糖进入葡萄糖库(大约是血容量和其他细胞外容量的体积)的速度。Ra等于肝脏生成葡萄糖的速度加上任何外源葡萄糖输入的速度。Rd等于葡萄糖离开该葡萄糖库的速度。
使用三个主要参数评价胰岛素类似物的作用。外源性输入速度(也即，葡萄糖输入速度，GIR或M)评估类似物的效能。Rd代表相对于胰岛素而言胰岛素类似物作用于外周组织的程度。最后，肝脏葡萄糖生成量(HGO)搔反映了类似物抑制肝脏生成葡萄糖的能力。HGO以Ra减M计算。作为肝脏选择性类似物，与胰岛素相比较，降低HGO的程度比激发Rd的程度要大。
在实验前4至5天，以65mg/kg的戊巴比妥给麻醉的小鼠腹膜内给药。向右颈静脉和左颈动脉插入导管。导管经皮下至颈部背侧区，然后外出。在恢复期之后，向颈动脉输入胰岛素或胰岛素类似物加葡萄糖。从颈静脉中取出血样。按照下述方法收集基础样本之后，开始输入胰岛素或类似物。在开始输入激素10分钟的间隔后，取50μl的血样以确定血浆葡萄糖含量。在激素输入过程中，以一种经验性确定的速度输入30%葡萄糖溶液以维持基础葡萄糖水平。
在输入胰岛素和冷葡萄糖之前120分钟，输入4μci3-3H-葡萄糖溶液的大丸剂，接着以20ml/分钟(有效剂量0.2μci/分)的速度连续输入10μci/ml的3-3H葡萄糖溶液，并连续输入至充满整个夹钳。在0时开始输入胰岛素或类似物。在夹钳打开前-20，-10和0分钟，以及之后通过夹钳后70，80和90分钟时分别取等份全血样，并测定血浆葡萄糖水平。按照下述方法还测定这些时间的葡萄糖比活性葡萄糖比活性 = (dpm3h - 葡萄糖)/(mg 葡萄糖)用10%TCA使血液脱蛋白，离心，使等份的上清在真空箱中蒸发掉3H2O干燥。用一种液态闪烁计数器测定样本中3H-葡萄糖的含量。通过稳定状态葡萄糖比活性(基础-20，-10和0分钟;降糖70，80，90分钟)和下列等式计算基础Ra(葡萄糖生成速度)和降糖RaRa = (3H - 葡萄糖输入速度 (dpm/分钟))/(稳定状态葡萄糖比活性 (dpm/mg))在基础条件下，稳定状态的Ra＝Rd和肝脏葡萄糖生成量的Ra。在降糖条件下，稳定状态的Ra＝Rd，但是在这些条件下，Ra＝肝脏葡萄糖生成量加上外源葡萄糖输入的速度。从计算的Rd中减去葡萄糖输入速度来确定降糖条件下肝脏葡萄糖的生成量。
体内结果体内实验数据概括在表Ⅰ中。
A12Gly以25.5，83.0，166，和255ng/kg/分钟的给药速度在动物中测试A12Gly胰岛素类似物。当以25.5ng/kg/分钟的速度输入A12gly时，Rd是12.8mg/kg/分钟而HGO是9.7mg/kg/分钟(图3和表Ⅰ)。这代表了Rd的小量激发(1.03倍)，如果存在的话，和22%的HGO抑制。在83ng/kg/分钟的剂量时，Rd是14.4mg/kg/分钟(1.16倍的激发)而HGO是5.2mg/kg/分钟(58%抑制)。在166和255ng/kg/分钟剂量时Rd分别是19.1和23.8mg/kg/分钟，而HGO分别是1.5和2.1mg/kg/分钟。这与这两个剂量的1.5和1.9倍的Rd激发和88%和83%的HGOR抑制相等。从这些数据中看出，A12Gly似乎比胰岛素在肝脏中效能更强。而比胰岛素在外周的效能稍低。A12Gly在抑制HGO方面大约是胰岛素效能的1.9倍而在激发Rd方面大约是胰岛素效能的0.75倍，这表明A12Gly是肝脏选择性的。体内肝脏与外周活性比率大约是2.6。
A19His以25.5，76.5，255和373ng/kg/分钟的剂量测试该类似物。用A19His和胰岛素研究的结果见表4和表Ⅰ。以25.5和76.5ng/kg/分钟的A19His剂量时用以维持正常血糖所必须的葡萄糖输入速度非常低(分别是3.1和2.0mg/kg/分钟)。因为这一结果，该类似物可以更高的剂量输入。在255ng/kg/分钟剂量时，Rd是15.7mg/kg/分钟(1.16倍激发)而HGO是7.4mg/kg/分钟(45%抑制)。在373mg/kg/分钟剂量时，Rd是16.0mg/kg/分钟(1.19倍激发)，而HGO是7.2mg/kg/分钟(47%抑制)。这些结果表明当HGO被抑制大约50%时，Rd的激发就很小。通过将A19His的数据与胰岛素的数据比较，可以发现A19His的效能比胰岛素低。但是，A19His抑制HGO的效能(大约0.3)比它激发Rd的效能强。为了从这些数据中确定外周效能(Rd)以及体内肝脏活性与外周活性的比率，必须外推Rd曲线。如果估计外周效能是大约0.10，那么该比率大约是3。这些结果表明A19His在体内是肝脏选择性的。
A12Gly/A19His
以与上述类似物相似的方式制备的A12Gly/A19His在一个分子中含有两个取代，这两个取代各自表现为肝脏选择性。以100ng/kg/分钟，333ng/kg/分钟和1000ng/kg/分钟的剂量对动物进行实验。在100ng/kg/分钟剂量时，Rd是14.5mg/kg/分钟(1.1倍的激发)而HGO是8.3mg/kg/分钟(36%抑制)。在333ng/kg/分钟剂量时，Rd是16.7mg/kg/分钟(1.3倍激发)而HGO是217mg/kg/分钟(79%抑制)。在1000ng/kg/分钟剂量时，Rd被2.0倍激发而HGO被80%抑制(表Ⅰ)。这些结果表明A12gly/A19his是肝脏选择性的(表Ⅰ)。当与用A19His处理的动物比较时，A12Gly/A19His在激发Rd方面与A19His相似，而在抑制HGO方面比A19His更强。A12Gly/A19His似乎是4倍肝脏选择性。
A19Gln以与上述类似物相似的方式制备的A19Gln按333和1000ng/kg/分钟的剂量进行测试(图4和表Ⅰ)。在333ng/kg/分钟剂量时，Rd是13.3mg/kg/分钟(1.1倍激发)而HGO是7.4mg/kg/分钟(40%抑制)。在1000ng/kg/分钟剂量时，Rd是14.7(1.2倍激发)而HGO是6.1(51%抑制)。这些体内数据与用A19His获得的数据相似，表明A19Gln是肝脏选择性的。
A14Phe和A10Pro/A13Trp以100和333ng/kg/分钟的剂量输入按上述类似物相似方法制备的每种类似物。每种类似物激发Rd的程度大约相同，并且发现与胰岛素激发相似(表Ⅰ)。两种类似物在抑制HGO方面比胰岛素的作用差，表明它们是外周选择性的。
A14Gly以41.5，100，333和415ng/kg/分钟的剂量测试A14Gly。在41.5ng/kg/分钟剂量时，Rd是13.8mg/kg/分钟(1.1倍激发)而HGO是12.3mg/kg/分钟(6%抑制)。在100ng/kg/分钟剂量时，Rd是16.3mg/kg/分钟(1.4倍激发)而HGO是5.5mg/kg/分钟(55%抑制)。在333ng/kg/分钟剂量时，Rd是21.7mg/kg/分钟(1.7倍激发)而HGO是2.5mg/kg/分钟(82%抑制)。在415ng/kg/分钟剂量时，Rd是22.2mg/kg/分钟(1.6倍激发)而HGO是5.7mg/kg/分钟(60%抑制)(表Ⅰ)。这些结果表明A14Gly是体内肝脏选择性的。
A12Thr以100和333ng/kg/分钟的剂量测试A12Thr。在100ng/kg/分钟剂量时，Rd是20.1ng/kg/分钟(1.6倍激发)而HGO是9.6mg/kg/分钟(24%抑制)。在333ng/kg/分钟剂量时，Rd是39.2ng/kg/分钟(3.1倍激发)而HGO是3.4mg/kg/分钟(69%抑制)。这些结果表明A12Thr是外周选择性的。
表Ⅰ体内实验数据-览表RdHGOGIR类似物mg/kg/分mg/kg/分mg/kg/分胰岛素基础13.5±0.413.5±0.4041.513.0±0.311.3±0.31.7±0.68314.7±1.37.8±1.16.9±0.810017.8±1.09.1±0.78.8±1.216626.1±0.86.4±1.119.7±0.5
41534.3±1.63.5±0.730.8±1.7人A12Gly基础12.4±0.6812.4±0.68025.512.8±2.19.7±2.43.0±0.883.014.4±0.85.2±0.49.2±1.216619.1±1.41.5±1.117.7±2.225523.8±1.42.1±1.421.7±1.3表I(续)RdHGOGIR类似物mg/kg/分mg/kg/分mg/kg/分人A19His基础13.5±0.813.5±0.8025.512.59.43.176.512.610.62.025515.7±0.67.4±0.98.3±1.237316.0±0.77.2±0.48.8±0.9人A19Gln基础12.5±0.712.5±0.7033313.1±1.07.4±1.15.8±0.3100014.7±0.96.1±1.08.6±0.6人A12Gly/A19His
基础13.0±0.413.0±0.4010014.5±0.68.3±1.06.1±1.033316.7±1.81.7±0.614.0±2.0100026.4±2.63.1±1.123.4±1.6人A14Phe基础15.5±0.615.5±0.6010021.2±0.912.9±1.48.4±2.333332.3±4.06.2±2.626.1±2.9表I(续)RdHGOGIR类似物mg/kg/分mg/kg/分mg/kg/分人A10Pro/A13Trp基础12.7±1.212.7±1.2010018.8±1.910.2±1.88.5±0.533331.3±1.98.9±2.722.4±1.9人A12Ala基础13.6±0.913.6±0.9010019.3±1.39.7±1.39.6±0.433329.1±2.76.1±0.922.9±3.1100048.6±2.16.2±0.542.4±2.2
RdHGOGIR类似物mg/kg/分mg/kg/分mg/kg/分A14Gly基础13.2±0.613.2±0.6041.513.8±1.112.3±0.81.6±0.510016.3±0.85.5±1.210.8±1.033321.7±1.52.5±1.119.5±2.241522.2±1.05.7±0.916.5±1.7RdHGOGIR类似物mg/kg/分mg/kg/分mg/kg/分A12Thr基础12.7±0.412.7±0.4010020.1±0.89.6±1.110.5±0.633339.2±1.53.4±1.235.9±1.6如本文所示本发明可以认为是最实用而且优选的方案。但是应当认识到在本发明范围之内可以与之有所不同，并且在阅读本说明书后本领域中的熟练技术人员可以进行明显的改进。
权利要求
1.一种人胰岛素类似物，在A12位含在一种不同于该位置天然产生基团的氨基酸残基，其中该类似物是肝脏选择性的。
2.一种人胰岛素类似物，在A19位含有一种不同于该位置天然产生基团的氨基酸残基，并且它不是一种疏水性残基，其中该类似物是肝脏选择性的。
3.一种胰岛素类似物，在A12位含有一种不同于该位置天然产生基团的氨基酸残基，并且还具有下面一种或两种氨基酸残基，它们是在A19位不同于该位置天然产生基团的氨基酸和A15位不同于该位置天然产生基团的氨基酸，其中该类似物是肝脏选择性的。
4.一种根据权利要求1的人胰岛素类似物，含有A12Gly。
5.一种根据权利要求2的人胰岛素类似物，含有A19His。
6.一种根据权利要求2的人胰岛素类似物，含有A19Gln。
7.一种根据权利要求3的人胰岛素类似物，含有A12Gly和A19His。
8.一种人DNA序列，它含有编码如权利要求1的人胰岛素类似物的序列。
9.一种人DNA序列，它含有一种编码权利要求2的人胰岛素类似物的序列。
10.一种人DNA序列，它含有一种编码权利要求3人胰岛素类似物的序列。
11.一种微生物，它含有一种宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求8的DNA序列。
12.一种微生物，它含有一种宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求9的DNA序列。
13.一种微生物，它含有一种宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求10的DNA序列。
14.一种制备人胰岛素类似物的方法，它包括培养权利要求11所说的微生物。
15.一种制备人胰岛素类似物的方法，它包括培养权利要求12所述的微生物。
16.一种制备人胰岛素类似物的方法，它包括培养一种权利要求13所述的微生物。
17.一种人胰岛素类似物，在A12位含有一种迄基酸残基，或在A10和A13位还含有氨基酸残基，其中所说一个或几个残基不同于该位置天然产生的残基，并且其中该类似物是外周选择性的。
18.一种根据权利要求17的人胰岛素类似物，它含有A12Ala。
19.一种根据权利要求17的人胰岛素类似物，它含有A10Pro和A13Trp。
20.一种DNA序列，它含有权利要求17的人胰岛素类似物的编码序列。
21.一种微生物，它含有一种宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求20的DNA序列。
22.一种制备人胰岛素类似物的方法，包括培养一种权利要求21所说的微生物。
23.一种药物组合物，它含有一种药物赋形剂材料和药物有效量的权利要求1的人胰岛素类似物。
24.一种药物组合物，它含有一种药物赋形剂材料和药物有效量的权利要求2的人胰岛素类似物。
25.一种药物组合物，它含有一种药物赋形剂材料和药物有效量的权利要求3的人胰岛素类似物。
26.一种药物组合物，它含有一种药物赋形剂材料和药物有效量的权利要求17的人胰岛素类似物。
27.一种治疗动物的方法，包括给需要这种治疗的动物使用药物有效量的权利要求1的人胰岛素类似物。
28.一种治疗动物的方法，包括给需要这种治疗的动物使用药物有效量的权利要求2的人胰岛素类似物。
29.一种治疗动物的方法，包括给需要这种治疗的动物使用药物有效量的权利要求3的人胰岛素类似物。
30.一种治疗动物的方法，包括给需要这种治疗的动物使用药物有效量的权利要求17的人胰岛素类似物。
31.一种治疗动物的方法，它包括给需要外周选择性人胰岛素治疗的动物使用药物有效量的人胰岛素类似物，其中A14位的氨基酸残基不同于天然的氨基酸，它是苯丙氨基酸。
32.一种人胰岛素类似物，它在A12位含有一种不同于该位置天然产生基团的氨基酸残基，其中该类似物是外周选择性的。
33.一种人胰岛素类似物，它在A14位含有一种不同于该位置天然产生基团的氨基酸，其中该类似物是肝脏选择性的。
34.一种人胰岛素类似物，它在A12和A14位各含有一种不同于该位置天然产生基团的氨基酸残基，其中该类似物是肝脏选择性的。
35.一种根据权利要求32的人胰岛素类似物，它含有A12Thr。
36.一种根据权利要求33的人胰岛素类似物，它含在A14Gly。
37.一种根据权利要求34的人胰岛素类似物，它含有A12Thr和A14Gly。
38.一种人DNA序列，它含有权利要求32的人胰岛素类似物的编码序列。
39.一种人DNA序列，它含有权利要求33的人胰岛素类似物的编码序列。
40.一种人DNA序列，它含有权利要求34的人胰岛素类似物的编码序列。
41.一种微生物，它含有一种宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求38的DNA序列。
42.一种微生物，它含有一种宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求39的DNA序列。
43.一种微生物，它含有一种宿主细胞，该宿主细胞含有权利要求40的DNA序列。
44.一种制备人胰岛素类似物的方法，它包括培养权利要求41的微生物。
45.一种制备人胰岛素类似物的方法，它包括培养权利要求42的微生物。
46.一种制备人胰岛素类似物的方法，它包括培养权利要求43的微生物。
47.一种药物组合物，它含有一种药物赋形剂材料和药物有效量的权利要求32的人胰岛素类似物。
48.一种药物组合物，它含有一种药物赋形剂材料和药物有效量的权利要求33的人胰岛素类似物。
49.一种药物组合物，它含有一种药物赋形剂材料和药物有效量的权利要求34的人胰岛素类似物。
50.一种治疗动物的方法，包括给需要治疗的动物使用药物有效量的权利要求32的人胰岛素类似物。
51.一种治疗动物的方法，包括给需要治疗的动物使用药物有效量的权利要求33的人胰岛素类似物。
52.一种治疗动物的方法，包括给需要治疗的动物使用药物有效量的权利要求34的人胰岛素类似物。
全文摘要
本发明公开了人胰岛素类似物，这些类似物是组织选择性的。因此，当用于治疗糖尿病患者时，与人胰岛素相比较，含有本发明类似物的药物制剂可以带来突出的监床效果。该类似物是在氨基酸残基A12、A15或A19位被修饰，并且不同于该位置天然产生的基团，而且是肝脏选择性的。还公开了在氨基酸残基A12或A14或氨基酸残基A10和A13位修饰的人胰岛素类似物，这些残基都不同于该位置天然产生的基团，并且是外周选择性的，还提供了含有人胰岛素类似物编码序列的DNA序列及微生物。叙述了制备人胰岛素类似物的方法。
文档编号A61K38/00GK1073976SQ9211045
公开日1993年7月7日 申请日期1992年8月8日 优先权日1991年8月8日
发明者安迪·罗宾·让, 拉森·埃里克·罗伯特 申请人:西奥斯股份有限公司, 弗埃塞股份有限公司