专利名称：：制备成熟胰岛素多肽的方法制备成熟胰岛素多肽的方法发明领域本发明涉及在酵母中制备成熟人胰岛素类似物的方法。发明背景胰岛素是在胰岛J3细胞中产生的多肽激素。有活性的胰岛素分子是由通过两个二硫键相连的B-链和A-链组成的双链分子。胰岛素以结构为B-C-A的前体分子胰岛素原形式合成，其中C-肽链将B-链的C-末端氨基酸残基与A-链的N-末端氨基酸残基相连。成熟的双链胰岛素通过在位于与A-和B-链的接点处的碱性氨基酸残基对处切割C-肽形成。A-和B-链通过分别位于A7和B7以及A20和B19Cys残基之间的两个二硫键保持在一起。此外，生物学活性的胰岛素分子还在A6和All位Cys残基之间有一个内部二硫键。在开发出重组DNA技术之后，已经描述了许多在基因修饰宿主细胞中生产胰岛素及其前体的方法。因此在例如Fmnk,B.H.,Pettee,J.M.,Zimmerman,R.E.&Burck,P丄In:PeptidesSynthesis-Structure-Function.ProceedingsoftheSeventhAmericanPeptideSymposium(D.H.Rich和E.Gross,eds).PierceChemicalCompany,p.729(1981)中公开了从大肠杆菌(￡.co/O中制备胰岛素的方法。由于大肠杆菌不具备将所表达的多肽进行折叠的细胞机器且不确立在成熟胰岛素中连接A-和B-链的二硫键，所以，该策略包括了许多体外加工步骤，比如在重折叠过程中体外确立二碌b键以及随后的C-肽切割。与大肠杆菌形成对比，真核生物包含折叠和确立二硫键所必需的机器，且由此看来似乎是用于在基因修饰生物中生产成熟胰岛素的好候选者。美国专利US4,914,026公开了一种在酵母中生产成熟胰岛素的方法，其通过下述实现，在酵母宿主细胞中插入与酵母a-因子前导序列相连的人胰岛素原基因并在一定条件下使转化酵母细胞在营养培养基中生长，由此表达和分泌成熟形式的胰岛素原。Thim等人，ProcNatl.Acad.Sci.USA，第83巻，第6766誦6770页，公开了人胰岛素原以及多种带有经过修饰的C-肽的胰岛素前体的表达，所迷经过修饰的C-肽例如RREAENLQKR(SEEQIDNO:1)、RREAPLQKR(SEQIDNO:2)、RREALQKR(SEQIDNO:3)、KREALQKR(SEQIDNO:4)和RRLQKR(SEQIDNO:5)。SEQIDNO:5还公开于Thim等人，FEBSLetters,第212巻，第2期，第307-312页。此外，WO97/03089公开了式为BZA的胰岛素前体的表达，其中B和A是通过至少一个二硫键相连的人胰岛素A和B肽链，Z是包含至少一个蛋白酶剪切位点的多肽，例如KREQKLISEEALVDKR(SEQIDNO:6)。然而，所公开的胰岛素前体仅在培养基中产生微量分泌的成熟胰岛素。欧洲专利申请0163529A、PCT专利申请号WO95/02059和WO90/10075公开了基于胰岛素或胰岛素类似物前体在酵母中的表达来制备胰岛素和胰岛素类似物的方法，这些胰岛素或胰岛素类似物前体在从发酵液体培养基中初始回收后被酶促转化为成熟胰岛素或胰岛素类似物。这些前体分子包含特定的经过修饰的C-肽，且还包含胰岛素B-链的N-末端延伸。经过修饰的C-肽和可能的B-肽N-末端延伸被设计成不在酵母中细胞^皮切割，且由此前体作为单链肽分泌，其中A-和B-链仍然通过经过修饰的C-肽连接但具有正确定位的二硫键。之后通过许多随后的体外酶促步骤以切割C-肽和可能的N-末端延伸得到成熟的胰岛素或胰岛素类似物产物。这些酶促步骤是耗时的，常常是昂贵的，并且导入随后在进一步的下游加工步骤比如昂贵的层析步骤等中必须被除去的额外杂质。美国专利号6,348,327中公开了在不能天然形成分泌颗粒的基因工程改造的动物细胞中制备成熟胰岛素的方法。本发明的目的是开发能够分泌完全加工的成熟人胰岛素类似物的真菌菌抹，由此避免昂贵且费时的下游纯化方法步骤。发明概述一方面，本发明涉及通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞制备成熟人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。根据本发明的人胰岛素类似物在真菌细胞内将作为单链前体表达，且将在该细胞内被切割，并以成熟、双链人胰岛素类似物分泌，无需进一步的体外加工。位于连接肽与胰岛素分子A-和B-链各接点处的切割位点可以相同或不同，但通常是相同的，且在一种实施方案中，位于与A-和B-链接点处的切割位点均为Kex2切割位点。在另一种实施方案中，切割位点为Ypsl位点。连接肽将具有经过最优化以确保在真菌细胞内发生切割以分泌正确成熟化的胰岛素类似物多肽的氨基酸组成。在本发明的一种实施方案中，对于与A-链接近的切割位点倒数第二位的氨基酸残基选自Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met和Ala。在本发明的另一种实施方案中，连接肽在对于与A-链接近的切割位点倒数第二位将包含Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Val或Ala氨基酸残基。在本发明的又一种实施方案中，连接肽在该位置将包含Leu或lie氨基酸残基。我们还发现，相同位置的氨基酸残基不应当是Asp、Glu或Gly。人胰岛素中C-肽的大小是35个氨基酸残基。因此在本发明的一个方面，该连接肽为约与天然C-肽相同长度。在一种实施方案中，连接肽将为2-35、2-34、2-33、2-31、2-30、2-29、2-28、2-27、2-26、2-25、2-24、2-23、2-22、2画21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个氨基酸残基。在又一种实施方案中，连接肽将为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3陽25、3-24、3-23、3國22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3画11、3-10、3-9、3画8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。在又一种实施方案中，连接肽将由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031、32、33、34或35个氨基酸残基组成。真菌细胞将分泌大量正确加工的人胰岛素类似物，且在一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约50mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。在另一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约80mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。在另一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约100mg/L正确加工的成熟双链人胰烏素类似物。对来自胰岛素类似物前体分子的连接肽的切割越有效，靶蛋白的终产量越高。因此，连接肽的氨基酸组成使得能够分别对其与A-和B-链接点处的切割位点进行有效切割将是令人满意的。在本发明的一种实施方案中，至少50%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。在另一种实施方案中，至少60%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。在又一种实施方案中，至少70%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。在又一种实施方案中，至少75%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。在又一种实施方案中，至少85%或至少95%表达的单链胰岛素前体分子被切割成成熟双链分子。真菌细胞可以是任何能够表达和分泌成熟胰岛素类似物的真菌细胞。然而，酵母，尤其是啤酒糖酵母(S.cerev/wae),已显示为最适于本发明目的的。人胰岛素分子有三个螺旋结构，一个在B-链中，且两个在A-链中。A-链含有通过A9-A11位环相连的两个螺旋部分A2-A8和A13-A19，且在胰岛素的T-状态构象中，残基B9-B19形成B-链的中央a-螺旋。已显示，胰岛素分子中的特定突变将增强这些螺旋结构的稳定性，从而导向高的生物学活性(参见N:Kaarsholm等人，Biochemistry1993,32，10773-10778)。由本发明方法制备的胰岛素类似物通常将含有对人胰岛素类似物分子螺旋结构具有稳定作用从而导致更高产量分泌的突变。因此，在一种实施方案中，由本发明方法制备的胰岛素类似物在胰岛素分子A8、B10和A14位中的一个或多个位置将含有突变，且在又一种实施方案中，这些位置的天然氨基酸残基可突变为选自Asp、Glu、His、Gln和Arg的氨基酸残基。胰岛素分子的其它突变包括在B28和B29位的突变、在A18位的突变、B30或B1氨基酸残基的缺失以及A21氨基酸残基的突变。在本发明的一种实施方案中，B28位氨基酸残基是Asp且B29位氨基酸残基是Lys。在本发明的另一种实施方案中，B28位氨基酸残基是Asp,B29位氨基酸残基是Pro,且B30位氨基酸残基是Thr。在本发明的又一种实施方案中，A18位的氨基酸是Gln。在本发明的又一种实施方案中，A21位的氨基酸残基是Gly。在本发明的另一种实施方案中，B10位的氨基酸残基是Glu。在本发明的另一种实施方案中，A8位的氨基酸残基是His。在本发明的另一种实施方案中，A14位的氨基酸残基是Glu。在本发明的又一种实施方案中，B10位的氨基酸残基是Glu,A8位的氨基酸残基是His，且A14位的氨基酸残基是Glu。在本发明的又一种实施方案中，B30位的氨基酸残基缺失。在一种实施方案中，人胰岛素前体类似物具有氨基酸序列B(l-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)其中，B(l-30)是人胰岛素B-链或其类似物，A(l-21)是人胰岛素A-链或其类似物，各X和各Y各自独立为Lys或Arg或Ypsl位点，且Z为1至约35个氨基酸残基的肽序列，附带条件是人胰岛素A-和/或B-链中至少一个天然氨基酸残基突变为另一个氨基酸残基。在一种实施方案中，序列X-X和Y-Y均为Lys-Arg。在另一种实施方案中，序列X-X和Y-Y均为Arg-Arg、Lys-Lys或Arg-Lys。在又一种实施方案中，X-X是Lys-Arg且Y-Y是Arg-Arg,或X-X是Arg-Arg且Y-Y是Lys-Arg。在一种实施方案中，Z的大小为2-35、2-34、2-33、2-31、2-30、2-29、2-28、2-27、2-26、2國25、2-24、2-23、2-22、2-21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2國13、2-12、2-11、2陽10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3个氨基酸残基。在又一种实施方案中，Z的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3画12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。在本发明的一种实施方案中，Z的大小可以是2、3、4、5、7、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031、32、33、34和35个氨基酸残基。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-20个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-19个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-18个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-15个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-14个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-13个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-12个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-11个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-10个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-9个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-8个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-7个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-6个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-5个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的另一种实施方案中，Z是3-4个氨基酸残基的氨基酸序列。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基选自Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Phe、Trp、Val、Met和Ala。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Leu。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Ile。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Tyr。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Arg。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Lys。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是His。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Pro。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Phe。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Trp。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数笫二位的氨基酸残基是Met。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数第二位的氨基酸残基是Val。在本发明的一种实施方案中，对于切割位点Y-Y倒数笫二位的氨基酸残基是Ala。在本发明的一种实施方案中，Z具有序列AspGlyLeuGly(SEQIDNo:7)。其余的Z为任何可编码的氨基酸残基，它们可以相同或不同。然而，在一种实施方案中，Z中对于切割位点Y-Y倒数笫二位的氨基酸残基不是Asp、Glu或Gly。另一方面，本发明涉及编码含有连接肽的人胰岛素类似物前体的DNA序列，所述连接肽被设计为使得能够在真菌细胞内对切割位点进行有效切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。另一方面，本发明涉及含有编码含有连接肽的人胰岛素类似物前体的DNA序列的表达载体，所述连接肽被设计为使得能够在真菌细胞内对切割位点进行有效切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。在又一方面，本发明涉及含有表达载体的转化的真菌细胞，所述表达载体含有编码含有连接肽的人胰岛素类似物前体的DNA序列，所述连接肽被设计为使得能够在真菌细胞内对切割位点进行有效切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。用本发明方法生产的人胰岛素类似物可用于治疗对胰岛素敏感的状态。因此，它们可用于治疗l型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症，例如有些时候可以在严重受伤者和做了重大外科手术的人中看到的。在有利的情况下，胰岛素类似物也可以以与其它类型的胰岛素的混合物使用，例如具有更快开始作用的胰岛素类似物。胰岛素类似物的例子描述于，例如公开号为EP214826、EP375437和EP383472的欧洲专利申请中。另一方面，本发明涉及含有人胰岛素类似物与适宜的药学可接受佐剂和添加剂，比如一种或多种适于稳定、保存或等渗性的试剂组合的药物制剂。附图简述图1显示称作pSA50的酵母质粒例子。该质粒包含表达盒，所述表达盒含有插入到该质粒中哞酒糖酵母TPI基因转录启动子和转录终止子之间的EcoRI-Z6al片段。图2显示实施例3中所述的包含胰岛素前体B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q的NcoI-XbalDNA片段(SEQIDN0:8),及其相应氨基酸序列(SEQIDNO.10)。图3显示对起始体积为1.25L的发酵罐的物料添加速率(g物料/分钟)的时间曲线。还显示了作为时间函数的发酵罐中废气中的二氧化碳浓度。以及图4显示在600nm处测量的光密度和计算得到的每升发酵液体培养基胰岛素的浓度的时间曲线(包括desB30胰岛素)。发明详述通过直接向发酵液体培养基中分泌成熟产物来生产胰岛素需要对含有在两个末端都侧接切割位点的连接肽的胰岛素前体进行细胞内加工。这样的连接肽可以是B-KR(W)nKR-A型，其中B是人胰岛素的B-链，且W是长度不同的肽链。高尔基体蛋白酶Kexl和Kex2促成细胞内加工。切割是多步骤过程，其中第一步的Kex2将切割与A-链附着的KR序列并将单链分子转化为双链分子。之后Kex2将切除连接肽W以得到双链中间体胰岛素分子，其中二肽KR仍然与B-链的C-末端氨基酸相连。最后，Kexl将除去最后的KR肽序列，从而得到成熟的双链分子。试验已显示，对A链接点处的切割位点的有效切割对于切割过程的进一步发展是重要的，且本发明的连接肽被设计成能够实现对A-链Kex2的切割位点的有效体内切割，从而导致产生高产量的分泌的双链胰岛素分子而无需额外的体外加工步骤。从酵母中分泌大量活性成熟双链人胰岛素类似物将显著减少为产生纯度足够高以用于药用目的的人胰岛素类似物所必需的下游纯化步骤的数目。因此，在美国专利号4916212中公开的在酵母中制备胰岛素的方法中，胰岛素前体在两个步骤中被转化为人胰岛素，即，转肽作用以将单链胰岛素前体B(1-29)-Alal画Ala隱Lys國A(1-21)转化为人胰岛素酯，以及之后将胰岛素酯水解为人胰岛素。各转化步骤将需要初始分离步骤，以及至少一个随后的纯化步骤。因此需要包括至少一个酶促转化的至少六个额外步骤来生产成熟的双链胰岛素。已熟知的是，没有酶促切割达到100%切割，从而导致未切割杂质或部分切割的杂质，在药物产品的情况下这些杂质必须被有效除去。因此，各切割步骤之后将有至少一个分离或纯化步骤，通常是借助交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等的层析纯化。可商业规模应用的层析柱材料是非常昂贵的，且因此减少这样的层析步骤的数目对于生产经济有显著的影响。此外减少下游转化和纯化步骤将减少工作量和在该过程中所消耗的时间，且因此进一步提高生产经济。在本发明的方法中，其中成熟双链胰岛素类似物可直接以高产量从培养液体培养基中分离出来，需要更少的下游加工步骤来生产纯度足够于药物用途的产品。除了稳定化胰岛素分子中的螺旋结构的修饰外，用本发明的方法生产的胰岛素类似物还可以在A-和或B-链的特定位置进行修饰。因此，B28位的氨基酸残基可以是Asp。在另一组胰岛素类似物中，Bl位的氨基酸残基已缺失。该组胰岛素类似物的具体例子是desBl人胰岛素。在另一组胰岛素类似物中，B30位的氨基酸残基已缺失。在另一组胰岛素类似物中，B28位的氨基酸残基是Lys且B29位的氨基酸残基是Pro。在另一组胰岛素类似物中，A18位的氨基酸残基可以是Gln,且在又一种实施方案中，A21位的氨基酸残基可以是Gly。编码胰岛素前体类似物的DNA序列可以是基因组或cDNA起源的，例如可以是通过制备基因组或cDNA文库以及利用根据标准技术(参见，i^H口,Sambrook,J,Fritsch,EF禾口Maniatis,T,Mo/ecw/orC7om力g.'爿丄aZ)ora/o,少Mz聰a/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1989)合成的寡核普酸探针杂交筛选编码全部或部分多肽的DNA序列来获得的。编码胰岛素前体的DNA序列也可以用确定的标准方法合成制《寻,侈'H口,Beaucage和Caruthers,7Wra/zet/rawZ^〃era22(1981),1859-1869所述的亚磷酰胺(phosphoamidite)方法，或由Matthes等人，￡"MSOJow"a/3(1984),801—805所述的方法。DNA序列还可以用具体引物通过聚合酶链反应制备，例如US4,683,202或Saiki等人，Sc/e"ce239(1988),487—491中所述的。可将DNA序列插入任何可经历重组DNA程序的载体中，且载体的选择通常将依赖于其所将导入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制，例如质粒。作为选择，该载体可以是当其被导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。载体优选为其中编码胰岛素前体的DNA序列与DNA转录所需的其它部分，比如启动子，可操作地连接的表达载体。该启动子可以是任何在所选的宿主细胞中显示出转录活性的DNA序列，并且可衍生自编码该与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。适于在酵母宿主细胞中使用的启动子的例子包括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.255(1980),12073—12080;Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1(1982),419-434)或醇脱氢酶基因(Young等人,inGeneticEngineeringofMicroorganismsforChemicals(Hollaender等人，eds.),PlenumPress,NewYork,1982)的启动子、或TPI1(US4,599,311)或ADH2-4c(R画11等人，Nature304(1983),652-654)启动子。如果必需的话，编码胰岛素前体的DNA序列还可以是与适宜的终止子、多腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列可操作地连接的。本发明的重组载体还可含有使载体能够在正被讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。为指导胰岛素进入宿主细胞的分泌途径，可向重组载体提供分泌信号序列(也已知为前导序列、前序列原或前序列)。该分泌信号序列以正确的读框与编码胰岛素前体的DNA序列相连。分泌信号序列通常定位于编码肽的DNA序列的5'。信号肽可以是天然存在的信号肽、或其功能性部分，或者它可以是合成肽。为了在酵母中有效分泌，也可将编码前导肽的序列插入信号序列下游和编码胰岛素前体的DNA序列的上游。被导入DNA序列或重组载体的酵母宿主细胞可以是任何能够表达胰岛素前体的酵母细胞，且包括糖酵母属物种(S"cc/^ram，yc^w/.)或裂殖糖酵母属物种(Sc/nzoyacc/zaram^c^),尤其是菌林啤酒糖酵母或克鲁弗利氏糖酵母(S"cc/"raw;/c^/Ww少veh)。其它的适宜酵母细胞的例子是菌抹克鲁维氏酵母属(《/z^vwomyc^)，比如乳克鲁维氏酵母(I./ac〃力，汉逊氏酵母属(/a朋e"w/a),例如多形汉逊氏酵母(7/./omor;7/2a)或毕赤氏酵母属CPzc/na),例如，巴斯德毕赤氏酵母(尸./"Wo^)(cf.Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.3459-3465;US4,882,279)。用异源DNA转化酵母细胞和从其生产异源多肽的方法描述于例如US4,599,311、US4,931,373、US4,870,008、5，037,743和US4,845,075。所转化的细胞通过由选择标记确定的表型来选择，所述表型通常是药物抗性或在无特定营养物(例如亮氨酸)存在下生长的能力。在酵母中使用的优选载体是在US4,931,373中公开的P0T1载体。本发明的方法是所谓的发酵法。该发酵优选在无菌搅拌罐中进行，所述搅拌罐带有添加由空气、氧和氨组成但不限于此的压缩无菌气体的供应线。发酵罐可包含用于监控pH、温度、压力、搅拌速率、溶解氧水平、液体含量、泡沫水平、物料添加速率以及酸和碱添加速率的设备/传感器。温度可以在约25至约35、约26至约31、或约26至约29。C范围内。pH将在约4.0至约6.8或约5.0至约6.5范围内。控制搅拌以确保最小溶解氧浓度为最小5%饱和。此外，发酵罐可装备有监控细胞密度水平、不考虑其物理-化学形式的代谢物和产物浓度的光学设备。利用对气体进入和气体排出发酵罐的气体分析来监控挥发性化合物的形成和消耗。所有监控的变量的信号可用于控制目的，从而允许将这些变量维持在预定范围内或者根据关于时间预定的概况持续变化。作为选择，响应于来自其它监控的变量的信号变化来控制变量。溶材料形式或以包括聚集材料在内的;溶材料形式的细胞内材;牛存^:产物的形成是组成型的或者诱导的，且依赖于或不依赖于微生物生长。发酵过程在工作体积为100mL至200.000L范围内的罐内实施。发酵过程可以作为分批过程、补料分批过程、重复补料分批过程或连续过程操作。发酵过程中所使用的培养细胞的培养基可以是任何适于生长宿主细胞的常规培养基，比如基本培养基或含有适当补料的复合培养基。适宜的培养基可获自商业提供者，或者可以根据已公开的配方(例如，在美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)目录中的)制备。因此该培养基将包含至少一种碳源，一种或几种氮源，包括钾盐、钠盐、镁盐、磷酸盐、硝酸盐和硫酸盐在内的必需的盐，痕量金属，水溶性维生素，加工助剂，包括但不限于蛋白酶抑制剂、稳定剂、配体、消泡剂和诱导物。培养基可包含在包括加热灭菌在内的一些操作条件下在液体培养基中部分沉淀或分散的组分。培养基可通过将几种液体和气溶体混合来制备。这些溶液可以在进入发酵罐之前混合，或者它们可以作为分开的液体流以预定比率供应入发酵罐中。不同的培养基组分液体溶液之间的比率可在发酵过程的不同阶段发生变化，这意味着培养基总组成可以在发酵过程期间变化。适宜的发酵培养基可包含20至60mM的PO^盐，50至70mM的K+，20至35mM的S042-，4至6mM的Na+,6至13mM的Mg2+,0.5至1.5mM的Mn2+,0.02至0.04mM的Cu2+,0.1至0.3mM的Fe2+,0.01至0.05mM的Zn2+,痕量Co、Mo和Ni，作为复合氨基酸源的部分添加，1至40g/L的酵母提取物，选自m-肌醇(100至250mg/L)、泛酸钓(2至20mg/L)、盐酸硫胺素(0.5至20mg/L)、吡。多醇(0.2至20mg/L)、烟酸烟酰胺(2至7mg/L)、生物素(0.03至0.8mg/L)、柠檬酸二氬胆碱(0.1至0.2mg/L)的维生素，比如柠檬酸这样的配体，H20(0.5至7g/L)和作为碳源的葡萄糖(50至200g/L)。以400至1800mM的量持续加入作为气体NH3或液体NH4OH的氮。以自来水作为天然钓和cr源。之后可以通过常规方法从培养基中回收由细胞生产的肽，所述常规方法包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，借助盐(例如硫酸铵)从上清液或者滤液中沉淀蛋白质组分，依赖于正被讨论的蛋白的类型用多种层析法纯化，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。胰岛素或胰岛素类似物从培养液体培养基中分离出来之后可以，例如通过酰化尤其是B29Lys残基的s-氨基基团，转化为酰化形式。对胰岛素的酰化方法是本领域熟知的，且公开于例如，EP专利792,290和894,095以及美国专利号5,693,609、5,646,242、5,922,675、5,750,497和6,011,007。酰化胰岛素的例子为N出"-十四烷酰des(B30)人胰岛素、N孤、石胆酰(lithocholoyl)-丫-谷氨酰des(B30)人胰岛素、NsB29—(Na-(HOOC(CH2)14CO)-Y-Glu)des(B30)人胰岛素或NsB29—(Na-(HOOC(CH2)16CO)-，Glu)des(B30)人胰岛素。"desB30"或"B(l-29)"意指缺乏B30氨基酸残基的天然胰岛素B链，B(l-30)意指人胰岛素的天然B链，且"A(1-21)"意指天然胰岛素A链。A18Q人胰岛素是在人胰岛素A-链A18位为Gln的胰岛素类似物。B10E、A8H、A14E分别是B10位为Glu、A8位为His及A14位为Glu的胰岛素类似物。"B1"、"A1"等分别意指胰岛素B链1位(从N末端开始计数)的氨基酸残基以及胰岛素A链1位(从N末端开始计数)的氨基酸残基。具体位置的氨基酸残基还可用例如，PheW表示，其意指B1位的氨基酸残基为苯丙氨酸残基。"C-肽"意指将胰岛素分子的A-和B-肽链连接在一起的肽序列，包括各末端的切割位点。"连接肽"分别意指与A-和B-链各接点处的两个切割位点之间的肽序列。"成熟人胰岛素类似物"意指具有与天然人胰岛素分子相同结构构象的活性双链胰岛素类似物，例如，在Cys"和CysB7以及Cys扁和CysB19之间带有二硫键，以及在Cys^和CysA"之间带有内部二硫键，但是与相应位置的天然氨基酸残基相比，在A和/或B-链的一个或多个位置带有特定的突变。本文所使用的"胰岛素类似物"意指多肽，其具有形式上可通过缺失和/或取代至少一个存在于天然胰岛素中的氨基酸残基和/或通过添加至少一个氨基酸残基，源自天然存在的胰岛素(例如人胰岛素)结构的分子结构。所添加和/或取代的氨基酸残基可以是可编码氨基酸或其它天然存在的氨基酸残基或纯合成的氨基酸残基。与人胰岛素相比，胰岛素类似物通常将不包含超过约7个突变，更一般不超过5个且甚至更一般最多3个突变。胰岛素类似物可以是这样的，其中B链28位可以从天然的Pro残基修饰为Asp、Lys或Ile。B29位的Lys还可以修饰为Pro。而且，A21位的Asn可修饰为Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val,尤其是Gly、Ala、Ser或Thr，且尤其是Gly。此外，B3位的Asn可修饰为Lys或Asp。胰岛素类似物的其它例子是des(B30)人胰岛素，其中Bl和B2中的一个或者二者均被缺失的胰岛素类似物；其中A-链和/或B-链具有N-末端延伸的胰岛素类似物和其中A-链和/或B-链具有C-末端延伸的胰岛素类似物。其它胰岛素类似物是这样的，其中B26-B30中的一个或多个已被缺失。本文中所使用的"胰岛素衍生物"意指已经过化学修饰的天然存在的胰岛素或胰岛素类似物，例如，通过向胰岛素主链中的一个或多个位置导入侧链，或通过氧化或还原胰岛素中氨基酸残基基团，或将游离氨基基团或羟基基团酰化。"Kex2"意指优先催化在两个碱性残基(赖氨酸或精氨酸)序列后切割的枯草杆菌蛋白酶样内切蛋白酶(Rockwell,NC，Krysan，DJ，Komiyama,T&Fuller,RS2002PrecursorProcessingbyKex2/FurinProteases.Chem.Rev.102:4525-4548)。"Kexl"意指优先催化去除C-末端赖氨酰和/或精氨酰残基的丝氨酸羧肽酶(ShiltonBH,ThomasDY,CyglerM1997CrystalstructureofKexldeltap,aprohormone-processingcarboxypeptidasefrom5"acc/^o，cescerev^z'ae.Biochemistry36:9002-9012)。"Ypsl，，意指在缺乏天然前a交配因子(pro-alpha-matingfactor)加工酶Kex2的酵母突变体中部分抑制前a交配因子加工缺陷的天冬氨酰蛋白酶(Egel-Mitani等人，Yeast6，1990，pp.127-137)。"正确加工的"意指在所需切割位点酶切，从而得到具有正确氨基酸残基序列的所需产物。"尸Or，是粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸异构酶基因，且"77V/"是啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶基因。术语"信号肽"被理解为意指在蛋白质前体形式中作为N-末端序列存在的前-肽。信号肽的功能是使异源蛋白能够容易地转运到内质网中。信号肽通常在该加工过程中被切除。信号肽可以是与产生蛋白质的宿主生物异源或同源的。丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获自米曲霉(J^wg"/MoO^ae)TAKA淀粉酶基因、黑色曲霉(A^erg/〃wmgw)中性淀粉酶基因、米黑根毛霉(i^/zomwcorw/e/^)天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐质霉(//wm/co/a/cmwgwoM)纤维素酶或脂肪酶基因、或米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶基因、曲霉属物种(Ay/erg/〃wsp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶、编码米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶的基因的信号肽编码区。信号肽优选源自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑色曲霉中性a-淀粉酶、黑色曲霉酸稳定淀粉酶或黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。可用于酵母宿主细胞的有用信号肽获自啤酒糖酵母a-因子和啤酒糖酵母转化酶基因。可与本发明的DNA构建体使用的许多信号肽包括酵母天冬氨酸蛋白酶3(Ypsl)信号肽或其任何功能类似物(Egel-Mitani等人(1990)YEAST6:127-137和US5,726,038)和MFa/基因的a-因子信号(Thorner(1981)inTheMolecularBiologyoftheYeastSacc/zfaromvcesStrathern等人，eds.,pp143-180,ColdSpringHarborLaboratory,NY和US4,870,008,小鼠唾液淀粉酶信号肽(参看O.Hagenbuchle等人,Nature289,1981,pp.643-646)、修饰的叛肽酶信号肽(参看L.A.Vails等人，Cell48，1987,pp.887-897)和酵母BAR1信号肽(参看WO87/02670)。术语"前-肽，，意指多肽序列，其功能为允许将所表达的多肽从内质网导向高尔基体并进一步导向分泌小泡以分泌进入培养基(即，多肽穿过细胞壁或至少穿过细胞膜输出到酵母细胞的周质间隙内)。前肽可以是酵母a-因子前肽，参见US4,546,082和4,870,008.作为选择，前肽可以是合成前肽，也就是说自然界中未曾发现的前肽。适宜的合成前肽是US5,395,922、5，795,746、5,162，498、WO89/02463、WO92/11378和WO98/32867中公开的那些。本发明的多核苷酸序列还可以是混合基因组、cDNA和合成来源的。例如，可将编码前导肽的基因组或cDNA序列与编码A和B链的基因组或cDNA序列相连，之后可以才艮据熟知的方法，通过插入用于同源重组的编码所需氨基酸序列的合成寡核苷酸或优选用适宜的寡核香酸通过PCR产生所需序列，对该DNA序列进行位点修饰。本发明包括载体，所迷载体能够在所选择的微生物或宿主细胞中复制的载体，且带有编码本发明的胰岛素前体的多核苷酸序列。该重组载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖染色体的复制,例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含任何确保自我复制的工具。作为选择，该载体可以是当其被导入宿主细胞时整合到基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒、或者两个或更多个共同包含全部将被导入宿主细胞基因组中的DNA的载体或质粒、或转座子。载体可以是线性或闭环质粒，且优选将包含允许载体稳定整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。在一种实施方案中，重组表达载体能够在酵母中复制。能够使载体在酵母中复制的序列的例子为酵母质粒2nm复制基因REP1-3和复制起点。载体还可包含选择标记，例如，产物补偿宿主细胞缺陷的基因或赋予药物抗性的基因，所述药物例如氨千青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨曱蝶呤。用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括am必(乙酰胺酶)、(鸟氨酸氨曱酰基转移酶)、/,G(乳清酸核苷-5，-磷酸脱羧酶)和(邻氨基苯甲酸合酶。用于酵母宿主细胞的合适标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。酵母优选的选择标记是粟酒裂殖糖酵母TPI基因(Russell(1985)Gene40:125-130)。载体中，多核苷酸序列与适宜的启动子序列可操作地连接。该启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，而且可获自编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。在丝状真菌宿主细胞中指导转录的适宜启动子的例子是获自米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉中性ot-淀粉酶、和黑色曲霉酸稳定a-淀粉酶基因的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子是哞酒糖酵母MFal、TPI、ADH或PGK启动子。本发明的多核苷酸构建体通常也与适宜的终止子可操作地连接。酵母中适宜的终止子是TPI终止子(Alber等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:419-434)。用于分别连接编码胰岛素前体的DNA序列、启动子以及任选地终止子和/或分泌信号序列，以及把它们插入包含复制所必需信息的适宜载体的方法，是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork,1989)。可以理解，可以通过首先制备包含编码本发明胰岛素前体的完整DNA序列的DNA构建体，和随后将该片段插入适宜的表达载体中，或通过连接前顺序插入包含各元件(比如信号、前肽、经过修饰的C-肽、A和B链)遗传信息的DNA片段，来构建载体。本发明还涉及含有编码本发明胰岛素前体的多核苷酸序列的重组真菌细胞。如前述，将含有这样的多核苷酸序列的栽体导入宿主细胞中，从而该载体作为染色体整合体或作为自我复制的染色体外载体维持。术语"宿主细胞"包含亲本细胞的由于复制过程中发生突变而导致与亲本细胞不相同的任何子代。本发明中所使用的宿主细胞是真菌细胞。本文所使用的"真菌"包括子嚢菌门(爿scowycoto)、4旦子菌门(Sas/Aowyco^r)、壶菌门(C7^f"Womycoto)和4妻合菌门(Zygowycoto)(长口Hawksworth等人,Jz>wwoW/2awt/5&^y、Z)z'c/v'ow(3^yo/77zeFwwgz',8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人,1995,同上，第171页所引述的)以及所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995,同上)。在一种实施方案中，真菌宿主细胞是酵母细胞。本文所使用的"酵母"包括产子嚢酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子(basidiosporogenous)酵母和属于半知菌的酵母(芽孢纲(Blastomycetes))。产子嚢酵母分作蚀精霉科(S戸歸/雄謹c騰)和糖酵母科(S"cc/zaramyc"aceae)。后者包含四个亚科，裂殖糖酵母亚科(Sc/^o^cc/wTOmycoWeae)(*如，粟酒裂殖糖酵母属(Sc/n'zosacc/zaromyc^))、拿逊氏酵母亚禾牛(TW/^isom'o/c/eae)、油月旨酵母亚科(丄—mycoz'(ieae)和糖酵母亚科(Sacc/z"r謹少co油ae)(辨如，毕赤氏酵母属(尸/c/na)、克鲁维氏酵母属(《/t(yvwomyc^)和糖酵母属(5""cc/artwy/ce《))。产4旦孑包子酵母包4舌丄ewcay/o〃'6^'w、纟工冬孑包属(i^^/os;wn力wm)、锁掷酵母属(S/onJ/oZw/w)、线黑粉酵母属(Fz7o^w,Wwm)和线黑粉菌属(F歸認c/幽)。属于半知菌的酵母分作两个科,掷孑包酵母科(iS/wo6o/蘭ycetocefle)(伊/如，5VraZ)o/簡yc^和布氏弹孢酵母属(Sw〃era))和隐球酵母科(07ptococcaceae)(*如，假丝酵母属(Om&^))。由于酵母分类将来可能发生变化，所以为了本发明的目的，酵母应4姿照5Zo/ogy爿c"W""o/(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.，和Davenport,R.R.，eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)所述的进行定义。酵母的生物学和酵母遗传学操作是本领域熟知的(参见，辨如，^oc/zem/W^a"c/GewWcso/Teos"Bacil,M.，Horecker,B丄和Stopani，A.O.M.编，笫二版，1987;r/zer^w",Rose,A.H.，和Harrison,J.S.编，第二版，1987;以及T7zeM/ecw/arWo/ogy/7ze7ea>stSacc/zaramycM,Strathern等人编，1981)。酵母宿主细胞可选自假丝酵母属、克鲁维氏酵母属、糖酵母属、裂殖糖酵母属、毕赤氏酵母属、汉逊氏酵母属、耶罗威亚酵母属()^TOW/")的物种的细胞。在一种实施方案中，酵母宿主细胞是卡尔斯伯糖酵母(Sacc/zarom少c^ccjrAs"^ge腦's)、啤酒糖酵母(5^cc/7(ar函yc^cereWw'ae)、糖化糖酵母(5^cc/zar麵少cesdz'(^Wcz^)、iSacc/z"r讓Fes(iowgAxs7'/、克鲁弗利氏冲唐酵母(Sacc/^rw^yces^:/wyven')、Sacc/an7附yceswor6e服'A、卵形糖酵母(S"cc/z(3r纖yc^ovz》nm、)、粟酒裂殖糖酵母(Sc/z/zas^cc/^omyces/麵6e)、葡萄汁糖酵母(5V7cc/zor謂ycesmw麵)、克鲁弗利氏毕赤氏酵母(尸纟c/na^^veh)>解脂耶罗威亚酵母(7amw/a/0。/jw7ca)、产朊假丝酵母(OmoWaw"fe)、可可假丝酵母(Ca"c/,Wa)和发酵性丝孢酵母(GeoiWc/zwm/erme"to朋)。其它可用的酵母宿主细胞是乳克鲁维氏酵母(A7w"eramyc^/acto)、脆壁克鲁维氏酵母(^"—veromyces/rag〃/s)、多形汉逊氏酵母(//(mye"w/a/o/，or//za)、巴斯德毕赤氏酵母(尸/c/z/a/^Won^)、解脂耶罗威亚酵母(/—一ca)、粟酒裂殖糖酵母(Sc/n'm^"cc/2(ar謹jA^p謂6e)、f/幼7go、麦芽糖假丝酵母(Ca"力Wam"/to化)、季也蒙氏毕赤氏酵母(尸/c/n'agw/〃ermowc/〃)禾口尸/c/n'"me//zawo//o/(参看Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132,1986,第3459-3465页；US4,882,279和US4,879,231)。在一种实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。"丝状真菌"包括真菌门(五wmycoto)和卵菌门亚类的所有丝状形式(如Hawksworth等人所定义的，1995,见前述)。丝状真菌的特征在于，由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的营养菌丝体。丝状真菌宿主细胞可选自支顶孢属(Jc"momw附)、曲霉属(^4^erg"/uy)、镰孢属(Fw^nwm)、腐质霉属(//w,mco/a)、毛霉属(Mwco"、毁丝霉属(A^ce/Zop/^/zorat)、《连孑包霉属(iVewros/9on3)、青霉属(尸em'cz〃zwm)、草根霉属(T7^/av^)、弯颈霉属(7W;^oc/a力wm)和木霉属(7Wc/zc^e/7wa)。"可编码氨基酸"或"可编码氨基酸残基"这一表达用于表示可由核苷酸三联体(密码子)编码的氨基酸或氨基酸残基。本发明上下文中，氨基酸三字母或单字母表示法以下表中所示的常规的含义使用。除非明确指明，本文所提到的氨基酸是L-氨基酸。此外，除非另外说明，肽的氨基酸序列的左右末端分别为N-和C-末端。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>发酵意指增殖浸没在液体培养基中的微生物的无菌过程。发酵优选在无菌搅拌罐中进行，所述搅拌罐带有添加由空气、氧和氨组成但不限于此的压缩无菌气体的供应线。发酵罐可包含用于监控pH、温度、压力、搅拌速率、溶解氧水平、液体含量、泡沫水平、物料添加速率以及酸和碱添加速率的设备/传感器。此外，发酵罐可装备有监控细胞密度水平、不考虑其物理-化学形式的代谢物和产物浓度的光学设备。利用对气体进入和气体排出发酵罐的气体分析来监控挥发性化合物的形成和消耗。所有监控的变量的信号可用于控制目的，从而允许将这些变量维持在预定范围内或者根据关于时间预定的概况持续变化。作为选择，响应于来自其它监控的变量的信号变化来控制变量。发酵过程中所生产的所需产物以可溶性细胞外材料存在，或者以可溶材料形式或以包括聚集材料在内的不溶材料形式的细胞内材料存在。产物的形成是组成型的或者诱导的，且依赖于或不依赖于微生物生长。发酵过程在工作体积为100mL至200.000L范围内的罐内实施。发酵过程可以作为分批过程、补料分批过程、重复补料分批过程或连续过程操作。分批过程意指，在将微生物加入罐中之前发酵罐中含有无菌培养基的发酵。在该过程期间，自动或手工加入酸、碱、消泡剂、抑制剂、稳定剂和"i秀导物。酸和石咸以'液体溶'液或气体组分加入。这些《且分可通过一条补料线加入，或者它们可以在分离的线中供应于发酵罐。发酵过程期间，为了分析目的仅取出发酵罐内容物。在发酵过程结尾收获发酵罐中的所有内容物。然而，对于连续分批过程，仅部分收获发酵罐中的内容物，并用新鲜无菌培养基重新填充发酵罐，从而允许发生另一批发酵。补料分批过程是在加入微生物之前仅向发酵罐中填入部分培养基的发酵。将剩余的培养基组分或剩余量的已部分添加的培养基组分作为一次脉沖、作为一系列不连续的脉沖或作为以恒定或可变速率添加的连续流供应给发酵罐。分批过程可以在补料分批过程之前，之后为补料分批操作模式。过程期间加入发酵罐的培养基组分由生长限制组分、微溶组分、挥发性组分或在液体环境中稳定性有限的组分组成但不限于此。微生物的生长速率可通过速率调节来控制，通过此调节来向发酵罐中添加培养基组分。在该过程期间自动或手工加入酸、碱、消泡剂、抑制剂、稳定剂和诱导物。酸和^咸以液体溶液的部分或气体组分加入。补料分批过程期间，所有组分可通过一条补料线加入，或者它们可以在分离的线中供应于发酵罐。补料分批过程期间，为了分析目的仅取出发酵罐内容物。在过程结尾收获发酵罐中的所有内容物。补料分批过程的一种变化方式是重复补料分批过程(Repeated-Fed-batchprocess)。重复补料分批发酵的实施类似于补料分批过程，但是在过程期间一次或几次取出部分发酵罐内容物。部分取出发酵罐内容物后可加入新鲜培养基。新鲜培养基加入后在重新开始补料分批过程操作之前可接着分批过程。新鲜培养基的组成以及补料分批过程期间加入的培养基无需相同。连续过程意指，在加入微生物以及发酵开始之前向罐中加入一些培养基的发酵。连续加入含有生长所必需的所有培养基组分以及抑制剂、诱导物、消泡剂、酸、碱和稳定产物的组分的新鲜培养基。这些组分可以通过一条补料线加入，或者它们可以在分离的供应线中向发酵罐供应，以提高所使用的培养基的稳定性或提高其品质。酸和碱作为液体溶液的部分抑或作为气体组分加入。所有组分作为一系列不连续的脉沖或作为以恒定或可变速率添加的连续流加入发酵罐。为将发酵罐内容物维持在预定范围内，连续收获发酵罐的内容物。微生物的生长可通过向发酵罐中添加培养基的速率以及调节发酵罐内容物来控制。培养基意指包含下述的液体溶液，至少一种碳源，一种或几种氮源，包括钾盐、钠盐、镁盐、磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐在内的必需盐，痕量金属，水溶性维生素，加工助剂，包括但不限于蛋白酶抑制剂、稳定剂、配体、消泡剂和诱导物。培养基可包含，在包括加热灭菌在内的一些操作条件下，在液体培养基中部分沉淀或分散的组分。可通过将几种液体和气溶体混合来制备培养基。这些溶液可以在进入发酵罐之前混合，或者它们可以作为分开的液体流以预定比率供应入发酵罐中。不同这^味j培养基总组成可以在发酵i程期间变化。下、丄包含不同培养基组分的浓度范围列表。这些浓度以所加入的培养基组分总量除以发酵罐中初始培养基体积来计算。连续培养的培养基浓度以进入发酵罐中的培养基中的浓度包括在其中。下表是对发酵培养基的一般组分的评论。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>含有本发明胰岛素类似物的药物组合物可用于治疗对胰岛素敏感的状态。因此，它们可用于治疗1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症，例如有些时候可以在严重受伤者和做了重大外科手术的人中看到的。对任何患者的最佳剂量水平将依赖于多种因素，包括所使用的具体胰岛素衍生物的效力、患者年龄、体重、身体活性以及饮食、与其它药物的可能组合以及所治疗的状态的严重程度。推荐由本领域技术人员以类似于已知胰岛素组合物的方式来确定本发明胰岛素衍生物对各单独患者的曰剂量。胰岛素类似物的药物组合物将包含通常的佐剂和添加剂，且优选配制成水溶液。例如，使用氯化钠、乙酸钠或甘油将水性培养基制成等渗的。此外，水性培养基可包含锌离子、緩沖液和防腐剂。可将组合物的pH值调至所需值，且其可为约4至约8.5。在本发明的一种实施方案中，制剂的pH选自2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9和10.0。药物组合物将包含一种或多种适于稳定、保存或等渗性的试剂这样的通常的佐剂，例如，锌离子、酚、甲酚、对羟基苯曱酸酯(parabene)、氯化钠、甘油或甘露糖醇。药物中所使用的緩冲液可选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、和三羟曱基氨基曱烷、,二(羟乙基)甘氨酸、#-[2-羟-1,1-二羟曱基乙基]甘氨酸、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。药学可接受防腐剂可选自酚、邻甲酚、间甲酴、对曱盼、对羟基苯曱酸曱酯、对羟基苯曱酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、节醇、氯代丁醇、和乙基汞硫代水杨酸钠(thiomerosal)、溴硝丙二醇(bron叩ol)、安息香酸、咪唑烷脲(imidurea)、氯己定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯曱酸乙酯、氯化卡乙氧铵、氯酚醚(3对氯苯氧基丙烷-l,2-二醇)或其混合物。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以O.lmg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的又一种实施方案中，防腐剂以10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些具体的防腐剂的每一种构成本发明的一种替代实施方案。药物组合物中的防腐剂的使用是本领域技术人员熟知的。为方便起见，可参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版,1995。等渗剂可选自盐(例如，氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、糖醇(例如，甘油、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)聚乙二醇(例如，PEG400)或其混合物。可以使用任何糖，比如单糖、二糖或多糖、或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、普鲁分支葡聚糖、糊精、环糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一种实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇的定义是，具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，且包括例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一种实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上述糖或糖醇可单独或组合使用。对于用量没有固定的限制，只效果产生不利作用。在一种实施方案中，糖或糖醇浓度为约1mg/ml至约150mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为1mg/ml至50mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为1mg/ml至7mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为8mg/ml至24mg/ml。在本发明的又一种实施方案中，等渗剂的存在浓度为25mg/ml至50mg/ml。等渗剂在药物组合物中的使用是本领域技术人员熟知的。为方便起见，可参见Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。本文中所引述的所有参考文献，包括公开出版物、专利申请和专利，均全文引入本文作为参考，且程度如同各参考文献单独或具体指明引入本文作为参考，且全文引入本文(至法律所允许的最大程度)。本文所使用的所有标题和副标题仅为方便而使用，且不应当理解为以任何方式限制本发明。本文中所提供的任何和所有实施例、或例举式语言(例如，"比如......这样的")的使用仅意欲更好地阐述本发明，且不限制本发明的范围，除非另外声明。本发明说明书中的任何语言均不应当被解释为将任何非请求保持的要素视为对于本发明的实践来说关键的。的专利文献的有效性、可专利性和/或可实施性的任何观点。如适用的法律所允许的，本发明包括对本文所附权利要求书中所述主题的所有改变或等同方案。实施例通用程序所有表达质粒均为C-POT型，类似于EP171,142中所描述的那些。这些是基于2p的表达载体，其特征在于包含粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸异构酶基因(POT)以在啤酒糖酵母中选择和稳定质粒。这些质粒还包含啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶启动子和终止子序列。这些序列类似于质粒pKFN訓3(描述于WO9010075)中的相应序列。通过转化宿主菌株哞酒糖酵母菌株MT663或ME1719制备酵母转化体。酵母菌抹MT663(MATa/MATapep4-3/pep4-3HlS4/his4Atpi::LEU2/Atpi::LEU2Cir')与申请WO92111378关联，保藏于DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen,且所得保藏号为DSM6278。啤酒糖酵母菌抹ME1719(MATa/aleu2/leu2pep4-3/pep4-3Atpi:丄EU2/Atpi::LEU2Aura3/Aum3Aypsl::URA3/Aypsl::ura3Cir十)描述于WO98/01535。MT663或ME1719在YPGaL(1%细菌用酵母提取物，2%细菌用蛋白胨，2%半乳糖，1%乳酸)上生长至600nm处O.D.为0.6。通过离心收获100ml培养物，用10ml水洗涤，再次离心并重悬于10ml含有1.2M山梨糖醇、25mMNa2EDTApH二8.0和6.7mglml二硫苏糖醇(d池iotreitol)的溶液中。30°C下温育该悬浮液15分钟，离心，并将细胞重悬于10ml含有1.2M山梨糖醇、10mMNa2EDTA.0.1M柠檬酸钠、pH05.8和2mgNovozymC3234的溶液中。将悬浮液在30。C下温育30分钟，通过离心收集细胞，在10ml1.2M的山梨糖醇和10mlCAS(1.2M山梨糖醇，10mMCaCl2,10mMTrisHC1(Tris=三(羟曱基(-氨基甲烷)pH:7.5)中洗涤，并重悬于2mlCAS中。为进行转化，将1mlCAS-悬浮的细胞与约0.1mg质粒DNA混合，且在室温下放置15分钟。加入1ml(20%聚乙二醇4000，10mMCaCl2,10mMTrisHC1，pH=7.5),并将混合物在室温下再放置30分钟。离心混合物，将沉淀重悬于0.1mlSOS(1.2M山梨糖醇，33%vlvYPD,6.7mMCaCl2)中并于30。C温育2小时。之后离心悬浮液并将沉淀重悬于0.5ml的1.2M山梨糖醇中。之后，于52。C下加入6ml的上层琼脂(Sherman等人，(1982),MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratory的SC培养基(含有1.2M山梨糖醇加2.5%琼脂))，之后将悬浮液倒入含有相同的琼脂固化的含山梨糖醇培养基平板顶部上。实施例1构建Al8Q-胰岛素的酵母表达系统图1显示名为pSA50的酵母质粒。该质粒含有表达盒，该表达盒包含插入到质粒的哞酒糖酵母TPI基因的转录启动子和转录终止子之间的五coRI—X6al片段。在质粒pSA50中，五coRI-X6al片段编码由MFal*前前导序列原、二元加工内肽酶KEX2的Lys-Arg切割位点、和胰岛素前体B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q组成的融合产物。按照下述构建包含编码胰岛素前体B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q的序列的DNA片段。将2.5pmol寡核普酸ASA-SCI-2(对应于图2中的序歹'j1279-1358)和SCI-kex2-3(对应于图2中的序列1425-1337——反向引物)混合入含有10X高保真緩沖液、2.5mMdNTP、1^1高保真聚合酶和76nlH20的PCR反应物中。一个循环(94。C下30秒，50。C下30秒，72。C下l分钟)后，加入100pmol寡核苷酸ASA-SCI1(对应于图2中的1252-1301)和ASA誦SCI-7(对应于序列1464-1407——反向引物)后进行如上的9个循环。所得PCR片段用Roche的PCR纯化试剂盒纯化，用Ncol和Xbal消化，并最终在琼脂糖凝胶上跑电泳并用GFX-PCR凝胶带纯化试剂盒(AmershamBiosciences#27-9602-01)纯化。将片段与来自上述("通用程序")C-POT型表达载体的Ncol-Xbal载体片段相连。使表达质粒在大肠杆菌中增殖，在存在氨千青霉素的条件下生长，并用标准技术分离(Sambrook等人，1989)。利用适宜的限制性核酸酶(例如，EcoRI,M:ol，检查质粒DNA中的插入片段，并通过序列分析显示包含正确胰岛素前体B(l-3O)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q序列(图2)。将质粒pSA50转化入啤酒糖酵母菌抹MT663。通过在YPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)琼脂(2%)平板上作为碳源的葡萄糖利用选择携带质粒pSA50的酵母转化体，并将所得菌抹命名为ySA63。实施例2人胰岛素类似物的生产采用与实施例1中所述方法相应的方法制备含编码特定人胰岛素类似物的DNA的质粒。如实施例1所述用质粒转化啤酒糖酵母菌林并分离转化体。所有的胰岛素类似物前体均有C-肽KRDGLGKR(SEQIDN0:9)。将用表达胰岛素类似物的质粒转化的啤酒糖酵母菌抹MT663接种到5ml由以下组成的培养基中5g/L(NH4)2S04、184mg/L(NH4)2HP04、2.88g/LKH2P04、1.42g/LMgS047H20、1.28g/L、K2S04、10.00g/L琥珀酸、10.00g/L水解酪蛋白氨基酸、0.0112g/LFeS047H20、0.0086g/LMnS04H20、0.0014g/LCuS04.5H20、0.00185g/LZnS047H20、0.0129g/LCaC12.2H20、0.071g/L柠檬酸、28.0mg/Lm誦肌醇、14.0mg/L氯化胆碱、2.8mg/L硫胺素、2.8mg/L烟酰胺、2.1mg/LCa-泛酸、0.14mg/L生物素、0.14mg/L叶酸、40g/L葡萄糖。30。C下培养3天。离心后，取出上清液以进行定量HPLC分析，通过该方法测量分泌的胰岛素类似物浓度。通过LC/MS分析确定胰岛素类似物的特性。产量(mg/1)示于下表<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>实施例3补料分批发酵将表达B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q的啤酒糖酵母菌抹ySA63接种到由酵母提取物(Difco):20g/L和蛋白胨(Bacto):10g/L和60g/L葡萄糖和0.1mL消泡剂(PEO/PPO嵌段共聚物)组成的培养基中。加热灭菌前将培养基的pH调至6.5-6.6。将葡萄糖分开灭菌，并加入其余无菌组分中。将200mL培养物(于500mL三角瓶中)于30。C下在定轨摇床上及于250rpm温育16-30小时。将50mL摇瓶培养物转移到含有1.2L由下述组成的生长培养基的发酵罐50g/L液体酵母提取物(50%干物质)、3.6g/LKH2P04、2.3g/LK2S04、1.5g/LMgS04'7H20、0.064g/KFeS04.7H20、0.016g/LMnS04.H20、0.011g/LCuS04.5H20、0.016g/LZnS04'7H20、0.8g/L斗宁檬酸、2g/Lm-肌醇、0.2g/L氯化胆碱、0.2g/L盐酸硫胺素、0.1g/L盐酸吡。多醇、0.2g/L烟酰胺、1g/LCa-泛酸、0.005g/L生物素、0.05g/L对氨基苯甲酸、0.66mL/L消泡剂(PEO/PPO嵌段共聚物)和21g/L葡萄糖。除葡萄糖之外的所有组分均加热灭菌。将葡萄糖单独灭菌且加入发酵罐。30。C下培养，其中pH设定点为5.9,且通气速率为lvvm。通过加入NH40H来使培养基pH保持在调定点。对溶解氧与废气组成(氧、二氧化碳和乙醇)共同进行监控。发酵过程从持续23小时的分批生长阶段开始，该过程中发酵消耗葡萄糖，之后在之前形成的乙醇上进行需氧分批生长。随后，当废气中的乙醇水平开始下降时，开始添加由50%(w/w)葡萄糖组成的物料溶液。物料添加速率遵循图3所示的曲线，包括为将废气中的乙醇水平维持在250ppm以下进行人工调节。在该过程期间，通过测量稀释的发酵样品在600nm处的光密度来监控生长。利用HPLC对样品的胰岛素浓度进行定量，所述样品为用酸性乙醇(552g乙醇、340g去离子水和5mL浓疏酸)以1:1体积比稀释并以3000-5000xg离心的。计算每升发酵液体培养基中的胰岛素浓度时，包括了对由酵母细胞所占的体积的校正，其中假定沉淀中细胞为菱形包装(rhombicpackaging)。所报告的胰岛素浓度包括完整胰岛素和desB30胰岛素。69小时后停止添加葡萄糖溶液，但在收获产物之前再继续发酵4小时。光密度和胰岛素浓度相对时间作图示于图4，其显示37mg/L发酵液体培养基的最终胰岛素浓度。权利要求1.通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备成熟人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。2.根据权利要求l的方法，其中所述切割位点是Kex2切割位点。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述连接肽中对于与A-链接近的切割位点倒数第二位的氨基酸残基选自Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Met、Val、Ala和Phe。4.根据权利要求3的方法，其中所述氨基酸残基选自Leu和Ile。5.根据权利要求1-4的方法，其中所述连接肽的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3画16、3-15、3-14、3画13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。6.根据权利要求1的方法，其中所述胰岛素类似物具有在A8、B10、A18和A14位中至少之一的突变。7.根据权利要求6的方法，其中所述突变选自Asp、Glu、His、Gln和Arg。8.根据权利要求6的方法，其中所述胰岛素类似物B10Glu、A8His、A14Glu人胰岛素。9.根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约50mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。10.根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约80mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。11.根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约100mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。12.根据权利要求1-11的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞。13.根据权利要求l的方法，其中所述人胰岛素前体类似物具有氨基酸序列B(l-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)其中B(l-30)是人胰岛素B-链或其类似物，A(1-21)是人胰岛素A-链或其类似物，各X和各Y各自独立为Lys或Arg或Ypsl位点，且Z为1至约35个氨基酸残基的肽序列，附带条件是人胰岛素A-和/或B-链中至少一个天然氨基酸残基突变为另一个氨基酸残基。14.根据权利要求13的方法，其中Z的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3國9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4个氨基酸残基。15.根据权利要求13的方法，其中X-X和Y-Y均为Kex2位点。16.编码具有以下氨基酸序列的胰岛素前体的DNA序列B(l-30)-X曙X-Z-Y-Y-A(l-21)其中，B(l-30)是人胰岛素B-链或其类似物，A(l-21)是人胰岛素A-链或其类似物，各X和各Y各自独立为Lys或Arg或Ypsl位点，且Z为1至约35个氨基酸残基的肽序列，附带条件是人胰岛素A-和/或B-链中至少一个天然氨基酸残基突变为另一个氨基酸残基。17.含有根据权利要求16的DNA序列的表达载体。18.用根据权利要求17的载体转化的酵母细胞。全文摘要本发明涉及通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌大量正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。文档编号C07K14/62GK101243190SQ200680029943公开日2008年8月13日申请日期2006年8月15日优先权日2005年8月16日发明者A·S·安德森,L·H·克里斯滕森申请人:诺沃-诺迪斯克有限公司