专利名称：一种艾塞那肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种工业化大规模制备艾塞那肽的方法，特别涉及采用固相合成法制备艾塞那肽，属于多肽合成技术领域。
背景技术：
糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病，高血糖主要是由于胰岛素分泌或作用的缺陷引起。全世界糖尿病患者已超过1.5亿，其中II型糖尿病患者占90%以上。
艾塞那肽是一种治疗II型糖尿病的药物，由美国礼来公司开发，属于肠促胰岛素类似物，是肠促胰岛素类似物家族的第一个成员，可以模拟自然状态下分泌的人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)在体内的生理行为，与GLP-1的效果类似，可促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，抑制不适当的葡萄糖依赖的胰高血糖素分泌，减慢胃排空，改善外周组织对胰岛素的敏感性，充分控制血糖。临床上主要用于治疗二甲双胍、磺酰脲类或二甲双胍和磺酰脲类联合应用不能很好控制血糖的II型糖尿病。
艾塞那肽是一个由39个氨基酸组成的多肽，具有如下结构:
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-GlU-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-1Ie-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 0
目前艾塞那肽的制备工艺主要有三种:一种是利用基因重组技术获得艾塞那肽的全序列，参见CN1635117A、CN1693459A中公开的方法。
第二种是采用液相合成艾塞那肽，或者固相和液相结合制备艾塞那肽，比如W02006119388先用固相法合成艾塞那肽类似物，再在液相中合成艾塞那肽；CN101835794A公开了用固相化学法合成三个不同的肽中间片段，然后再用液相化学将另外的氨基酸物质添加至片段上；W02011006644公开了用固相化学合成四个艾塞那肽片段，再将几个片段在液相中偶联得到艾塞那肽。
第三种方法是固相合成法。由于液相合成艾塞那肽步骤复杂，工艺控制点较多，副产物多，工艺不稳定，因此，艾塞那肽多采用第三种方法固相合成法来制备，比如US6902744、CN101538324、CN101357938中均公开了采用固相化学合成艾塞那肽的方法，用氨基树脂依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，先制备得到侧链保护的由三十九个氨基酸成链的艾塞那肽-树脂，然后将艾塞那肽分子从树脂上切割下来，再经过多次纯化制得艾塞那肽。由于艾塞那肽分子中第[1-2]肽片段为His-Gly，在固相化学法依次接入Fmoc-Gly以及Fmoc-His (Trt)过程，由于Gly和His这两个氨基酸的分子特性,导致产品中产生以下的杂质:艾塞那肽[D-His1]、艾塞那肽[Des Gly2]，这些杂质与艾塞那肽自身的极性非常相近，在纯化的过程中很难完全去除，产品收率无法得到有效的提高 ，导致产品纯度降低，影响产品的质量以及用药安全。发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种采用固相合成法制备艾塞那肽的方法，可用于工业上大规模生产艾塞那肽。
术语说明:
氨基树脂:由含有氨基或酰胺基的单体与醛类(主要是甲醛)缩聚而得的热固性树脂。
侧链保护基团:指与氨基酸的侧链(即氨基酸通式H2N-C(R) (H)-COOH中的R基)偶联的化学部分，其有助于防止侧链的一部分与肽合成、加工等步骤中使用的化学物质反应。
缩合剂:能引起缩合反应的试剂，在多肽合成中，尤指能促进氨基与羧基偶联形成肽键的试剂。
活化助剂:在多肽缩合反应中，能够协助缩合剂更好的促进缩合反应的试剂，如:抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。
本发明的技术方案如下:
一种艾塞那肽的制备方法，包括步骤如下:
(I)以氨基树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述氨基树脂上的Fmoc保护基；
(2)将步骤(I)脱除Fmoc保护基的氨基树脂采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，所述的偶联是在活化助剂和缩合剂存在下进行的固相偶联反应，以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行固相偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂:
Fmoc-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Leu-Ser (tBu)-Lys (Boc) -Gln ( Trt) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Val-Arg (Pbf) -Leu-Phe-1le-Glu (OtBu) -Trp (Boc) -Leu-Lys (Boc) -Asn (Trt) -Gly-Gly-Pro-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (tBu)-树脂；
所述的各Fmoc保护的氨基酸的用量与氨基树脂的用量的摩尔比为2 5:1 ;
(3)将步骤(2)制备的侧链全保护的艾塞那肽[3-39]肽-树脂与R1-His (R2)-Gly-OH 二肽片段在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，接入[1_2]肽组氨酸和甘氨酸(His-Gly)，得到侧链全保护艾塞那肽-树脂:
R1-His (R2) -Gly-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Leu-Ser (tBu) -Lys (Boc) -Gln (Trt) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Val-Arg (Pbf)-Leu-Phe-1le-Glu (OtBu) -Trp (Boc) -Leu-Lys (Boc) -Asn (Trt) -Gly-Pro-Ser (tBu) -Ser (tBu)-Gly-Ala-Pro-Pr o-Pro-Ser (tBu)-树脂，其中，R1-His (R2)-Gly 对应的结构为:
权利要求
1.一种艾塞那肽的制备方法，包括步骤如下: (1)以氨基树脂为原料，加入脱保护剂，脱除所述氨基树脂上的Fmoc保护基； (2)将步骤(I)脱除Fmoc保护基的氨基树脂采用逐一偶联的方式依次连接Fmoc保护的氨基酸，所述的偶联是在活化助剂和缩合剂存在下进行的固相偶联反应，以茚三酮检测阴性为反应终点，反应完毕用脱保护剂脱除Fmoc保护基，再与下一个Fmoc保护的氨基酸进行固相偶联反应；重复操作直至合成得到侧链全保护艾塞那肽[3-39]肽-树脂:Fmoc-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Leu-Ser (tBu) -Lys (Boc) -Gln (Trt) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Val-Arg (Pbf) -Leu-Phe-1le-Glu (OtBu) -Trp (Boc) -Leu-Lys (Boc) -Asn (Trt) -Gly-Gly-Pro-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (tBu)-树脂； 所述的各Fmoc保护的氨基酸的用量与氨基树脂的用量的摩尔比为2 5:1 ; (3)将步骤(2)制备的侧链全保护的艾塞那肽[3-39]肽-树脂与R1-His(R2)-Gly-OH二肽片段在活化助剂和缩合剂存在下进行固相偶联反应，接入[1-2]肽组氨酸和甘氨酸(His-Gly)，得到侧链全保护艾塞那肽-树脂: R1-His (R2) -Gly-Glu (OtBu) -Gly-Thr (tBu) -Phe-Thr (tBu) -Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Leu-Ser (tBu) -Lys (Boc) -Gln (Trt) -Met-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Val-Arg (Pbf) -Leu-Phe-1le-Glu (OtBu) -Trp (Boc) -Leu-Lys (Boc) -Asn (Trt) -Gly-Pro-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Gly-Ala-Pro-Pr o-Pro-Ser (tBu)-树脂，其中，R1-His (R2)-Gly 对应的结构为:
2.如权利要求1所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于:步骤(I)所述的氨基树脂选自 Rink Amide 树脂、Rink Amide MBHA 树脂、Sieber Amide 树脂或 Rink Amide AM 树脂。
3.如权利要求1所述的艾塞那肽的制备方法，其特征在于:步骤(I)所述的氨基树脂的荷载量为 0.3 1.5mmol/g,优选 0.3 0.8mmol/g。
4.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于:步骤(2)及步骤(3)所述的缩合剂选自N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)、2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑_1_基)_1，I, 3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、苯并三氮唑-N，N，N，，N’ -四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)或0-苯并三氮唑-N，N，N’，N-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU);优选为N，N- 二异丙基碳二亚胺(DIC)、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、2- (7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1,3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU);缩合剂的用量与氨基树脂中氨基的摩尔比为2 6:1。
5.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于:步骤(2)及步骤(3)所述的活化助剂选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt);优选为1-羟基苯并三唑(HOBt);活化助剂与氨基树脂中氨基的摩尔比为2 6:1。
6.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于:步骤(2)所述的固相偶联反应时间为60 30min，优选60 120min。
7.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于:步骤(4)所述的酸解剂为三氟乙酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)、水、苯酚组成的混合物，三氟乙酸:1，2-乙二硫醇:水:苯酚=85 90:2 5:2 5:2 5体积比；所述的酸解剂的用量与艾塞那肽-树脂之比为5 20ml/g ;优选8 15ml/g,更优选10ml/g。
8.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于:步骤(4)所述的裂解反应时间为I 5h，优选为1.5 3.5h。
9.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于:步骤(3)所述的二肽片段R1-His(R2)-Gly-OH的制备步骤如下: 将起始原料R1-His(R2)-0H、甘氨酸甲酯按照摩尔比1:1的比例溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加入与起始原料R1-His(R2)-OH等摩尔的缩合剂、活化助剂，搅拌反应10 30h，加入水和有机溶剂萃取，依次用饱和碳酸氢钠溶液、梓檬酸水溶液、饱和食盐水溶液洗漆有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩得R1-His (R2) -Gly-OMe ;将R1-His (R2) -Gly-OMe用四氢呋喃/水(v/v=3:l体积比)混合溶液溶解，冰浴下加入IM的LiOH水溶液，反应完毕后加入0.5M的盐酸水溶液，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，柱层析纯化得二肽片段R1-His(R2)-Gly-OH ；其中札、R2的定义如式I所述。
10.根据权利要求1所述的艾塞那肽的合成方法，其特征在于:所述步骤(4)得到的艾塞那肽粗品经反相 高效液相色谱纯化，冻干得到艾塞那肽纯品。
全文摘要
本发明涉及一种艾塞那肽的制备方法。该方法以氨基树脂为原料，先将氨基树脂脱保护，再用逐一偶联的方式依次连接有Fmoc保护的氨基酸，获得侧链全保护基的艾塞那肽[3-39]肽-树脂，再用同样的方法偶联R1-His(R2)-Gly-OH完成His-Gly两个氨基酸片段的连接。本发明方法用于大规模工业化制备艾塞那肽，产品纯度大于99.0%，艾塞那肽[D-His1]杂质、艾塞那肽[Des Gly2]杂质均小于0.1%。
文档编号C07K1/20GK103224558SQ20131011380
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月3日 优先权日2013年4月3日
发明者田振平, 韩荣刚, 高永宏, 张道广, 彭海涛, 董佃强 申请人:齐鲁制药有限公司