人胰岛素甲酯的生产方法
【专利摘要】本发明涉及通过酶反应生产人胰岛素甲酯。本发明还涉及人胰岛素甲酯的生产及其纯度的提高。
【专利说明】
人胰岛素甲酯的生产方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求申请号为6021/CHE/2013,2013年12月23日向印度专利局提交的印度 临时专利申请的权益和优先权。在此，通过引用将2013年12月23日提交的所述申请的全部 内容结合于本文中用于所有目的，包括结合未包含于本文中且涉及遵循PCT第4.18条的PCT 第20.5(a)条的说明书、权利要求书或附图的元素或部分。
技术领域
[0003] 本发明涉及通过酶反应生产人胰岛素甲酯。本发明还涉及人胰岛素甲酯的生产和 纯度的提高。
【背景技术】
[0004] 胰岛素是参与调节血液葡萄糖浓度的胰腺激素。例如，人、猪和牛胰岛素，胰岛素 类似物和混合胰岛素提供给胰岛素依赖型糖尿病患者，以控制其血糖浓度。
[0005] 本发明描述了涉及通过酶反应生产人胰岛素甲酯的方法。本发明还涉及人胰岛素 甲酯的生产和纯度的提高。
【发明内容】
[0006] 因此，本发明涉及通过酶反应生产人胰岛素甲酯；以及提高人胰岛素甲酯的纯度。
【附图说明】
[0007] 图1:展示了由本发明的结晶过程获得的人胰岛素前体微晶的显微图像；
[0008] 图2:展示了由本发明的结晶过程获得的人胰岛素甲酯微晶的显微图像；
[0009] 图3:展示了由本发明的结晶过程获得的人胰岛素前体微晶的显微图像；
[0010] 图4:展示了由本发明的结晶过程获得的人胰岛素甲酯微晶的显微图像。
【具体实施方式】
[0011] 本发明涉及通过酶反应生产人胰岛素甲酯。
[0012] 本发明进一步涉及人胰岛素甲酯的生产及纯度的提高。
[0013] 在本发明的实施例中，二氧六环诱导胰蛋白酶对胰岛素前体的切割。
[0014] 在另一实施例中，本发明使酶反应期间杂质des B(23-29)和环化形式的desB-30 的水平分别下降40%和60%。
[0015] 在另一实施例中，本发明使人胰岛素甲酯的纯度比二甲基甲酰胺作为反应溶剂的 类似方法提高10 %。
[0016] 结合下面的具体实施例，可以更充分地理解本发明，其中，实施例仅用于阐述的目 的，而不是意图限制本发明的范围。
[0017] 实施例
[0018] 实施例1:
[0019] 步骤 1:
[0020] 使存在于色谱洗脱池的人胰岛素前体根据下面的条件结晶，以生产尺寸在2-9wn 之间的针形微晶体。结晶溶液含有浓度为12g/l的人胰岛素前体，每克人胰岛素前体0.08ml 苯酚和2. lml4%W/V氯化锌溶液，以及1 %W/V氯化钠，并且使用2.5N氢氧化钠将溶液的pH调 节至4.6且温度维持在22-25 °C。
[0021]上述结晶过程得到94%的产量。
[0022] 步骤 2:
[0023] 由步骤1中获得的晶体制备反应混合物，以实现下面的条件:80mg/ml人胰岛素前 体、27.5 %V/V二氧六环溶剂、0.1M碳酸钠、0.1M碳酸氢钠、5mM EDTA和1400U/ml胰蛋白酶， 且pH调节至9.5。反应混合物在25°(：培养，直到在10-1611实现85%(168830转化率。
[0024] 报道的以由人胰岛素前体产生desB30为目标，使用含50%V/V DMF、0.15M三羟甲 基氨基甲烷和胰蛋白酶的反应混合物进行的类似方法在反应结束时展示了劣质的纯度分 布图，如表1所描述。
[0025]表1:水解反应结束时反相色谱纯度分布图
[0027]因此，当前使用二氧六环、碳酸钠、碳酸氢钠盐的方法展示相对于产物desB30,纯 度提高11 %。步骤3:
[0028] 此后，通过将L苏氨酸甲酯偶联至desB30将来自步骤2的上述反应混合物用于产生 人胰岛素甲酯。
[0029] 制备偶联反应混合物，实现下面的条件:20mg/ml的desB30、100mg/ml的LTME、由分 别为8.2%、17.0%、31.8%￥/￥的二氧六环、01^和01^0组成的57%￥/￥总溶剂、0.1511三羟甲 基氨基甲烷、1400U/ml胰蛋白酶，且pH调节至6.6。反应混合物在25 °C培养，直到在8-12h相 对于desB30实现MME转化率大于91 %。
[0030] 报道的以由desB30产生人胰岛素甲酯为目标，使用含57%V/V DMF、90mg/ml L苏 氨酸甲酯和胰蛋白酶的反应混合物进行的类似方法在反应结束时展示了劣质的纯度分布 图，如表2所描述。
[0031 ]表2:偶联反应结束时反相色谱纯度分布图
[0033] 因此，使用DMS0作为共溶剂，以产生人胰岛素甲酯(mME)作为目标的当前方法展 示了相对于产物desB30,纯度提高10%，且产物相关杂质，即，环化形式的desB30和desB (23-29)分别下降60%和40%。
[0034] 步骤 4:
[0035]使根据步骤3生产的MME根据下面的条件下结晶，从而生产尺寸在7-15_之间的 菱形晶体。在每克MME中，结晶溶液含22ml柠檬酸缓冲液、5.5ml 4%氯化锌溶液，且使用1N NaOH将溶液pH调节至6.5，此后，用纯净水稀释溶液以使有机溶剂浓度降低至12.5%，且温 度维持在2-8 °C。
[0036] 上述结晶过程展示了 90%的产量。
[0037]由上述结晶过程获得的晶体的纯度分布图表明des B(23_29)水平下降且相比由 基于DMF的方法获得的晶体，人胰岛素甲酯晶体的纯度提高。
[0038]表3:人胰岛素甲酯晶体的反相色谱纯度分布图
[0040] 实施例2:
[0041] 使存在于色谱洗脱池的人胰岛素前体根据下面的条件结晶，从而生产尺寸在3-6y m之间的3维微晶体。结晶溶液含有浓度为12g/l的人胰岛素前体，每克人胰岛素前体0.08ml 苯酚、2.1ml 4%W/V氯化锌溶液和11ml柠檬酸缓冲液，使用2.5N氢氧化钠将溶液的pH调节 到4.6且温度维持在22-25°C。
[0042] 上述结晶过程展示了 94%的产量。
[0043] 实施例3:
[0044]使根据实施例1，步骤3生产的MME根据下面的条件结晶，从而生产尺寸在10-15M1 之间的菱形晶体。在每克MME中，结晶溶液含16.5ml柠檬酸缓冲液、5.0ml 4%氯化锌溶液， 且使用IN NaOH将溶液pH调节至6.0，此后，用纯净水稀释溶液以使有机溶剂浓度降低至 12.5 %，且温度维持在2-8 °C。
[0045] 上述结晶过程展示了 95%的产量。
[0046] 实施例4:
[0047] 步骤 1:
[0048] 由实施例1的步骤1中获得的晶体制备反应混合物，以实现下面的条件:70mg/ml人 胰岛素前体、40%V/V DMF溶剂、0.08M碳酸钠、0.08M碳酸氢钠，和1400U/ml胰蛋白酶，且pH 调节至9.2。反应混合物在25°(：培养，直到在10-1611实现84%(168830转化率。
[0049] 报道的以由人胰岛素前体产生desB30为目标，使用含50%V/V DMF、0.15M三羟甲 基氨基甲烷和胰蛋白酶的反应混合物进行的类似方法在反应结束时展示了劣质的纯度分 布图，如表4所描述。
[0050]表4:水解反应结束时反相色谱纯度分布图
[0052]因此，当前使用DMF、碳酸钠、碳酸氢钠盐的方法展示相对于产物desB30,纯度提高 10 %。步骤2:
[0053] 此后，通过将L苏氨酸甲酯偶联至desB30将来自步骤1的上述反应混合物用于产生 人胰岛素甲酯。
[0054] 制备偶联反应混合物，实现下面的条件:20mg/ml desB30、100mg/ml LTME、57%V/ V DMF、1400U/ml的胰蛋白酶，且pH调节至6.6。反应混合物在25°C培养，直到在8-12h相对于 desB30实现MME转化率大于91 %。
[0055] 报道的以由desB30生产人胰岛素甲酯为目标，使用含30mg/ml desB30、57%V/V DMF、90mg/ml L-苏氨酸甲酯和1400U/ml胰蛋白酶的反应混合物进行的类似方法在反应结 束时展示了劣质的纯度分布图，如表5所描述。
[0056]表5:偶联反应结束时反相色谱纯度分布图
[0058]因此，使用碳酸钠和碳酸氢钠作为缓冲盐，且DMF作为共溶剂，以产生人胰岛素甲 酯作为目标的当前方法展示了相对于产物人胰岛素甲酯，纯度提高9%，且产物相关杂质， 艮P，环化形式的desB30和desB(23-29)分别下降50%和19%。
[0059] 实施例4阐释了碳酸钠和碳酸氢钠盐在控制胰蛋白酶形成环化形式的desB30中的 作用。
[0060]表6:
[0061 ]梯度程序
[0063] 实施例5:
[0064] 步骤 1:
[0065] 由实施例1的步骤1中获得的晶体制备反应混合物，以实现下面的条件:70mg/ml人 胰岛素前体、40%V/V DMF溶剂、0.08M碳酸钠、0.08M碳酸氢钠，0.075M的L组氨酸和700U/ml 胰蛋白酶，且pH调节至9.2。反应混合物在25 °C培养，直到在4-6h实现84 % desB30转化率。报 道的在没有L组氨酸的情况下，以由人胰岛素前体产生desB30为目标，根据实施例4的阐释 的类似方法表明反应速率较慢且消耗的胰蛋白酶多100%。
[0066]表7:水解反应结束时反相色谱纯度分布图*。*分析方法细节
[0067]
[0068] 因此，使用DMF、碳酸钠、碳酸氢钠和L组氨酸的当前方法表明反应速率提高且在步 骤1中胰蛋白酶消耗减少50%。
[0069] 步骤 2:
[0070] 此后，通过将L苏氨酸甲酯偶联至desB30将来自步骤1的上述反应混合物用于产生 人胰岛素甲酯。
[0071] 制备偶联反应混合物，实现下面的条件：20mg/ml的desB30、90mg/ml的LTME、57% V/VDMF、5mM氯化钙、800U/ml的胰蛋白酶，且pH调节至6.4。反应混合物在25 °C培养，直到在 8-12h相对于desB30实现MME转化率大于91 %。
[0072]以由desB30产生的人胰岛素甲酯为目标根据实施例4阐释的类似方法消耗的胰蛋 白酶高75 %。
[0073]在上述反应结束时纯度分布图如下：
[0074]表8:偶联反应结束时反相色谱纯度分布图*。*分析方法细节
[0076]因此，如实施例5的阐释，使用碳酸钠、碳酸氢钠和L组氨酸，且DMF作为共溶剂，以 产生人胰岛素甲酯作为目标的当前方法表明反应速率提高且总胰蛋白酶的消耗下降45%。
[0077]实施例5阐释了 L组氨酸在提高总反应速率中的作用。
[0078] 实施例6:
[0079] 由实施例1的步骤1中获得的晶体制备反应混合物，以实现下面的条件:80mg/ml人 胰岛素前体、25%V/V叔丁醇、0.1M碳酸钠、0.1M碳酸氢钠，和700U/ml胰蛋白酶，且pH调节至 9.2。反应混合物在25°(：培养，直到在4-611实现86%(168830转化率。
[0080] 因此，使用叔丁醇作为反应溶剂的当前方法表明相比如实施例5的步骤1中所阐释 的DMF，环化形式的desB30下降73%。
[0081] 上述反应结束时纯化分布图如下
[0082]表9:水解反应结束时反相色谱纯度分布图*。*分析方法细节
[0083]
[0084] *分析方法细节
[0085] 设备
[0086] ?分析型HPLC系统
[0087] ? ACE C18,5wn，4.6X250mm [0088]使用的流动相
[0089] 流动相A: 0 ? 1 % V/V三氟乙酸水溶液
[0090] 吸取lmL三氟乙酸至量筒中，并用纯净水将体积补充至1000mL。将混合物用超声处 理5分钟。
[0091] 流动相B:100%乙腈(HPLC级）
[0092] 色谱条件：
[0093] 柱：ACE 300-C18,5wn;4.6X 250mm(水）
[0094] 柱温度:40°C [0095]小瓶室温度:4°C
[0096] 监测的波长：220nm
[0097] 注射体积（Std.): 10yL
[0098] 分析时间：25min。
[0099] 表10:梯度程序
【主权项】
1. 一种获得人胰岛素甲酯的方法，所述人胰岛素甲酯为成熟的人类胰岛素，其中该胰 岛素 A链的C端苏氨酸-30的羧基被甲基化，所述方法包括： 在存在胰蛋白酶的情况下，用溶剂中的L苏氨酸甲酯接触desB30,所述溶剂包括 (a) 水、二甲亚砜和二甲基甲酰胺，水/二甲亚砜的比率为约l:l(v/v)至约l:0.5(v/v)， 水/二甲基甲酰胺的比率为约l:〇.6(v/v)至约l:0.3( v/v);或 (b) 水和二甲基甲酰胺，水/二甲基甲酰胺的比率为约l:1.6(v/v)至约l:0.9(v/v)。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，desB30与L苏氨酸甲酯接触时所处的所述 溶剂包括： (a) 水、二甲亚砜和二甲基甲酰胺，并且在所述溶剂中水/二甲亚砜的比率为约1:0.8 (>八)至约1:0.7(>八），且水/二甲基甲酰胺的比率为约1:0.45(>八)至约1:0.35(>八） ；或 (b) 水和二甲基甲酰胺，水/二甲基甲酰胺的比率为约l:1.5(v/v)至约l:l.l(v/v)。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，desB30与L苏氨酸甲酯接触时所处的所 述溶剂包括水、二甲亚砜和二甲基甲酰胺，且其中所述溶剂进一步包括二氧六环，其中二氧 六环以1:0.2(v/v)或更小的水/二氧六环的比率存在于所述溶剂中。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述溶剂中的水/二甲基甲酰胺的比率为 约1:0.74(v/v)，水/二甲基甲酰胺的比率为约1:0.4(v/v)，且水/二氧六环的比率为约1: 0.19(v/v)〇5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，desB30与L苏氨酸甲酯接触时 所处的所述溶剂包括水和二甲基甲酰胺，并且其中所述溶剂确实至少基本上不含有三羟甲 基氨基甲烷(Tris)。6. 根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，desB30与L苏氨酸甲酯接触时所 处的所述溶剂包括，含量约〇. 03至约0.3M的碳酸盐和/或碳酸氢盐， 其中，可选地，所述碳酸盐为碳酸钠和/或碳酸钾，或其各自的水合物，和/或其中可选 地，所述碳酸氢盐为碳酸氢钠和/或碳酸氢钾，或其水合物。7. 根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，desB30由前体胰岛素获得，所述 前体胰岛素包括SwissProt/Uniprot登录号为F6MZK5的人类肽或其自然变体，或其中des30 由SwissProt/Uniprot登录号为P01308的人前胰岛素原或其自然变体获得。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述desB30通过前体胰岛素与胰蛋白酶在 约0.05M至0.125M的组氨酸缓冲液中接触获得，该组氨酸缓冲液包括(a)水和二氧六环，水/ 二氧六环的比率为约l:〇.5(v/v)至约l :0.3(v/v);或(b)水和二甲基甲酰胺，水/二甲基甲 酰胺的比率为约1:0.9(v/v)至约1:0.3(v/v)。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在获得desB30中，所述溶剂还包括含量为 约0.05至约0.3M的碳酸盐和碳酸氢盐，并且其中可选地，在该范围中pH为约8.5至约10.0。10. 根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在获得des30中，所述溶剂确实至少基 本不含有三羟甲基氨基甲烷(Tris)。11. 根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在每毫克desB30约20U或更多 胰蛋白酶，或可选地，每毫克desB30约50U或更多胰蛋白酶的存在下，使desB30与L苏氨酸甲 酯接触，和/或 其中desB30通过使前体胰岛素与胰蛋白酶接触获得，所述前体胰岛素包括SwissProt/ Uniprot登录号为F6MZK5的人类肽或其自然变体，或SwissProt/Uniprot登录号为P01308的 人类肽或其自然变体，其中在每毫克desB30约10U或更多胰蛋白酶，或可选地，每毫克 desB30约20U或更多胰蛋白酶的存在下，使desB30与L苏氨酸甲酯接触。12. 根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，desB30与L苏氨酸甲酯的接触 在约6.0至约7.5的pH范围中进行。13. 根据前面任一项权利要求所述的方法，其特征在于，进一步包括在7小时或更长的 时段之后，于约18°C至约30°C，可选地约25°C的温度收集生产的人胰岛素甲酯。14. 根据权利要求13所述的方法，其特征在于，通过加入柠檬酸缓冲液和氯化锌，使生 产的人胰岛素甲酯结晶，且使溶液维持在约12°C或更低的温度， 其中可选地，氯化锌的含量为每克人胰岛素甲酯约0.5mmo 1至约5mmo 1，优选每克人胰 岛素甲酯约lmmol至约2mmol氯化锌，且柠檬酸缓冲液由0.02至0.06摩尔柠檬酸和0.2至0.6 摩尔正磷酸氢二钠组成。15. 根据权利要求14所述的方法，其特征在于，使生产的人胰岛素甲酯结晶包括，在加 入柠檬酸和氯化锌之后，用水将溶剂稀释，从而使有机溶剂的浓度约为13%或更小。
【文档编号】C07K14/62GK105849273SQ201480070790
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年12月22日
【发明人】马德哈万·布德, 帕尔塔·哈扎拉, 迪内希·钱纳巴萨帕·古达尔, 斯里坎特·G·萨蒂亚纳拉扬
【申请人】拜康研究有限公司