谷氨酸-稳定的胰岛素类似物的制作方法

谷氨酸-稳定的胰岛素类似物的制作方法【专利摘要】胰岛素类似物包含含有酸性2-残基延伸GluB31-GluB32的B链多肽，和任选的含有酸性取代GluA8的A链多肽，和另外任选的非-标准的PheB24修饰。类似物还可包含本领域已知的提高胰岛素类似物制剂在皮下注射或输注后的吸收速率的另外的B链取代。类似物可以是哺乳动物胰岛素的类似物，例如人胰岛素。还提供编码这样的胰岛素类似物的核酸。一种治疗患者的方法包括给予患者生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐。所述类似物可以高浓度给予，同时维持快速起效的特性。一种半-合成的方法是借助于通过非-标准的氨基酸取代修饰内源性胰蛋白酶位点来使用未保护的八肽。【专利说明】谷氨酸-稳定的胰岛素类似物[0001]关于联邦政府资助的研究或开发的声明本发明得到在由美国国立卫生研究院(Nat1nalInstitutesofHealth)于资助号DK40949和DK074176中签订的合作协议下的政府支持。美国政府对本发明可享有一定的权利。[0002]发明背景本发明涉及多肽激素类似物，其在大于通常用于药物制剂中的多肽浓度时，显示出增强的药学特性，例如更大的热力学稳定性、更大的生物学活性或更快的药代动力学。本发明涉及胰岛素，一种双链多肽激素，其调节脊椎动物代谢并广泛用于人和其它哺乳动物以治疗糖尿病。胰岛素的序列以图解形式示于图1中；各个残基通过鉴定氨基酸(典型地使用标准的三字母代码)、链和序列位置(典型地作为上标)来指明。[0003]当溶于其pH在如药物制剂所需的6.5-8.0的范围内的溶液中时，在位置A8、B31和B32提供的3个谷氨酸残基增加胰岛素分子的净负电荷及其锌-稳定的六聚体的净负电荷。本发明能使胰岛素类似物的制剂的浓度高于100单位/ml(U-100)，以至于(i)胰岛素类似物的热力学稳定性类似于或大于野生型胰岛素的热力学稳定性，(ii)生物学效价类似于或大于野生型胰岛素的生物学效价，(iii)快速起效药代动力学(PK)和药效学(PD)特性相对于野生型人胰岛素保持在U-100浓度，和以至于(iv)在目前临床应用中它们的促有丝分裂特性类似于野生型人胰岛素或胰岛素类似物。[0004]非-标准蛋白质包括治疗剂和疫苗的工程改造，可具有广阔的医学和社会效益。医学效益的实例将是蛋白质的药代动力学特性的最优化。进一步的社会效益的实例将是适合于高蛋白浓度的制剂的蛋白质工程改造，所述高蛋白浓度损害制剂的ρκ/ro特性。社会效益的其它实例是具有延长的保质期的蛋白制剂。治疗性蛋白的实例由胰岛素提供。含有在中性pH时的较大净负电荷和任选的非-标准的氨基酸取代的胰岛素类似物可原则上表现出关于稳定性、生物学效价或ρκ/ro或ρκ/ro对制剂中胰岛素浓度的依赖性的优越特性。后者在公共卫生方面具有特殊的重要性，因为高度浓缩的胰岛素制剂可给患有肥胖症和显著的胰岛素抵抗的患者带来医学益处；这样的患者往往是非洲-美洲妇女和其它贫穷的少数民族。在皮下注射后的胰岛素吸收的药代动力学引起的挑战影响糖尿病(dm)患者实现严格的血糖控制的能力并限制胰岛素泵的安全性和性能。[0005]胰岛素抵抗是其中这种激素的典型的靶组织(脂肪组织、肌肉和肝)需要在血流中的较高浓度的胰岛素或胰岛素类似物，以获得与健康受试者响应血流中正常浓度的胰岛素时表现出的相同的生物学反应的病症。胰岛素抵抗一般地伴有2型糖尿病。一种特殊的医学需求由用皮质类固醇治疗的，或内源性皮质类固醇的过度分泌(库欣氏综合征(Cushing’sSyndrome))的某些与肥胖症有关的DM患者、某些与对胰岛素抵抗的遗传易感性有关的DM患者和继发于脂肪代谢障碍的DM患者显示的对胰岛素的显著抵抗而引起。由于肥胖症在发达和发展中世界中的广泛流行(导致“糖胖病(diabesity)”综合征)和由于线粒体DNA中的突变产生的DM的单基因型识别的增加，患有显著的胰岛素抵抗的患者数目正不断增加,其中胰岛素抵抗可能是异乎寻常的严重(vandenOuweland,J.Μ.，Lemkes,H.H.，RuitenbeekjW.，Sandkuijl，L.A.，deVijlderjM.F.，StruyvenbergjP.A.，vandeKamp,J.J.,&Maassen,J.A.(1992)具有母系遗传的II型糖尿病和耳聋的大谱系中线粒体tRNA(Leu)(UUR)基因的突变(Mutat1ninmitochondrialtRNA(Leu)(UUR)geneinalargepedigreewithmaternallytransmittedtypeIIdiabetesmellitusanddeafness).NatureGenet.1,368-71)。这类另外不同子集的患者的治疗典型地需要皮下注射大量的普通胰岛素制剂(U-100浓度；通常0.6mM胰岛素或胰岛素类似物)。这样的大量注射可导致疼痛和胰岛素作用的发生率和持续时间的可变性。虽然野生型胰岛素的U-500制剂(以商品名Humulin?RU-500出售；EliLillyandC0.)可用于临床用途，胰岛素浓度从0.6mM增加至3mM导致发作的延迟和胰岛素作用的延长，以至于Humulin?RU-500(或类似的这样的产品)的PK/H)特性类似含有鱼精蛋白-锌的胰岛素六聚体的微晶混悬液的那些；这种制剂长期以来被命名为中性鱼精蛋白//agadorn(NPH)。因此，皮下注射野生型胰岛素的U-500制剂的膳食用途将预期降低血糖控制的效果和增加低血糖发作的风险。用于连续皮下胰岛素输注装置(CSII;“胰岛素泵”)中的Humulin?RU-500(或类似的这样的产品)的用途将同样被预期干扰患者基于目前或过去的血糖浓度测量控制运算以有效调节胰岛素输注速率的能力，这导致血糖控制欠佳和低血糖事件的风险增加。[0006]胰岛素药理学的已完善确立的原则涉及注射的胰岛素分子的聚集状态与从贮库吸收进入毛细血管并因此进入系统循环的时间过程的关系。一般来说，聚集成高分子量复合物的胰岛素分子越多，吸收的延长就越久和胰岛素的作用就越长。本领域已知削弱其自组装的胰岛素分子中的氨基酸取代与相对于野生型人胰岛素的更快吸收有关；实例由取代ProB28—Asp(门冬胰岛素(insulinaspart),以商品名Novolog?销售的胰岛素产品的活性成分；Novo_Nordisk,Ltd)和由配对的取代ProB28—Lys和LysB29—Pro(赖脯胰岛素(insulinZis/Tro),以商品名Humalog?销售的胰岛素产品的活性成分；EliLillyandC0.)提供。相反地，本领域已知引起其等电点(pi)从约pH5至约pH7的转变的胰岛素分子的氨基酸延伸或化学修饰导致皮下贮库中修饰的胰岛素的等电点沉淀；这样的高分子量复合物提供作为基础胰岛素制剂的延长吸收。实例由以商品名NovoSolBasal?销售的胰岛素产品(一种Novo-Nordisk的中断产品,其中ThrB27被Arg取代和其中ThrB3°的C-末端羧酸酯部分被酰胺化)和甘精胰岛素(insulinglargine)(以商品名Lantus?销售的胰岛素产品的活性成分，一种其中B链经二肽ArgB31-ArgB32延伸的基础制剂；Sanof1-Aventis,Ltd.)提供。(NovoSolBasal?和Lantus?各自包含另外的取代AsnA21—Gly,以使得它们的可溶性制剂在酸性条件(分别为PH3和pH4)下因AsnA21的脱酰胺作用而不被化学降解)。典型的微晶膜岛素混悬液(NPH,半缓慢膜岛素(sem1-lente)、缓慢膜岛素(Iente)和特缓慢胰岛素(ultra-lente))的长效作用显示了反映这些微晶的各自理化特性及其相对溶解速率的中至长效ρκ/ro特性范围。[0007]以上胰岛素产品，包括野生型人胰岛素或动物胰岛素的目前和过去的制剂，使用或被用于胰岛素分子的自组装，其作为一种获得化学稳定性的手段，作为一种避免原纤维形成的手段，作为一种调节ρκ/ro特性的手段，或作为一种获得这些目标的组合的手段。然而胰岛素自组装也可引入不适宜的或不需要的特性。Humulin?RU-500(或类似的这样的产品)的非-最佳的延长的ρκ/ro特性，例如，很可能是在制剂和在皮下贮库中六聚体-六聚体缔合的结果(图2)。实际上，野生型牛胰岛素锌六聚体经激光散射的体外研究已经提供在0.3-3mM的浓度范围内的渐进性六聚体-六聚体相互作用的证据。因此目前和过去对于胰岛素制剂的组成及胰岛素类似物的设计的策略面对和已经面对开发速效超浓缩胰岛素制剂的不可逾越的障碍:虽然自组装是获得化学和物理稳定性所必需的，但其0.6mM以上的渐进性质导致PK/PD的不适宜的延长。不受理论的束缚，发明人因而探寻发明具有类似于U-1OO浓度的野生型人胰岛素的普通制剂(如，HumulinR?U-100；EliLillyandC0.)或比其更快的PK/ro特性的胰岛素类似物，以使这些PK/ro特性不受在0.6禮-3.0mM的浓度范围内的胰岛素类似物的显著影响。[0008]给予胰岛素已被长期确立为治疗糖尿病。胰岛素是在脊椎动物代谢中起重要作用的小球蛋白。胰岛素包含两条链:含有21个残基的A链和含有30个残基的B链。该激素作为Zn2+-稳定的六聚体贮存于胰腺β-细胞中，但在血流中作为无Zn2+的单体发挥功能。胰岛素是一种单链前体胰岛素原的产物，其中连接区(35个残基)将B链的C-末端残基(残基Β30)连接至A链的N-末端残基。成熟的贮存颗粒内的锌胰岛素六聚体的晶体排列已通过电子显微镜(EM)被观察到。患有DM的患者中的胰岛素替代疗法的主要目的是严格控制血糖浓度，以防止其偏离健康人受试者的特征性正常范围之上或之下。偏离正常范围之下与立即肾上腺素能或神经性低血糖症状有关，其在严重发作时导致惊厥、昏迷和死亡。偏离正常范围之上与微血管疾病包括视网膜病、失明和肾衰竭的长期风险增加有关。由于野生型人胰岛素或人胰岛素类似物的吸收的药代动力学一当以大于U-1OO的浓度配制时一相对于膳食后代谢动态平衡的生理需求通常太慢、太长和太易变化，患有与显著的胰岛素抵抗有关的DM的患者通常不能获得最佳的血糖目标，因此直接和长期并发症二者的风险增加。因此，当制备的自组装的胰岛素或胰岛素类似物的浓度高于约0.6mM时，普通和速效胰岛素产品的安全性、效果和实用便利性已受到PK/PD的延长的限制。[0009]存在保护锌-介导的胰岛素六聚体的组装，但减少更高级六聚体-六聚体自组装的程度的需求，作为获得足够的化学稳定性和足够的物理稳定性以满足或超过法规标准的制剂的一种机制。化学降解是指胰岛素分子中原子排列的变化，例如Asn的脱酰胺作用，异-Asp的形成，和二硫桥的断开。胰岛素对化学降解的易感性与其热力学稳定性相关(如通过化学变性实验所探查的)；因为其是对化学降解最易感的物质的单体，所以通过自组装内单体的螯合降低其降解速率。物理降解是指原纤维形成(纤维化)，其是导致在富含β_折叠的构象中含有数以千计(或更多)的胰岛素原聚体的线性结构的自组装的非-天然形式。原纤维形成是在高于室温时制备、贮存和使用胰岛素和胰岛素类似物的一个严重问题。原纤维形成的速度随着较高的温度、较低的pH、搅动，或脲、胍、乙醇共溶剂的存在，或疏水表面而增加。现行的美国药品管理条例要求，如果原纤维形成以1%或更高的水平发生，则丢弃胰岛素。由于原纤维形成在较高的温度下增强，所以患有DM的患者最好是在使用前必须将胰岛素冷冻。使用外部胰岛素泵(其中以规律的时间间隔将少量胰岛素或胰岛素类似物注射到患者体内)的此类患者而言，胰岛素或胰岛素类似物的原纤维形成可能是一个特别的问题。在这样的用法中，胰岛素或胰岛素类似物在泵装置中并未保持冷冻，和胰岛素的原纤维形成可导致用于注射胰岛素或胰岛素类似物进入体内的导管堵塞，有可能导致不可预知的血糖水平波动或甚至危险的高血糖症。至少一份最新报告已经表明，赖脯胰岛素(KP-胰岛素，一种其中残基B28和B29相对于它们在野生型人胰岛素中的位置相互交换的类似物；以商品名Humalog?出售)可能对原纤维形成特别敏感，并导致胰岛素泵导管的堵塞。胰岛素显示在25°C以上的温度时每增加10°C，其降解率增加10-倍或更多；因此，准则要求在<30°C的温度下贮存并优选冷冻。这样的制剂典型地包括天然胰岛素自组装的优势。[0010]蛋白质原纤维形成的现有理论假定，原纤维形成的机制通过部分折叠的中间体状态进行，其进而聚集以形成促淀粉状蛋白生成的核。在这个理论中，稳定天然状态的氨基酸取代可以或者不可以稳定部分折叠的中间体状态，以及可以或者可不增加(或降低)天然状态和中间体状态之间的自由能屏障都是可能的。因此，现有理论表明胰岛素分子中给定的氨基酸取代增加或降低原纤维形成的风险的趋向是极其不可预测的；特别是在可检测到原纤维形成发生之前观察到的滞后时间与天然状态单体的热力学稳定性的测量无关(如通过化学变性实验所探查的)。尽管给定的取代可稳定全部天然状态和促淀粉状蛋白生成的部分折叠二者一并且因此延迟原纤维形成的发生一但另一种取代可稳定天然状态但不稳定促淀粉状蛋白生成的部分折叠，因而对滞后时间仅有很少的影响或者完全没有影响。还有的其它取代可使天然状态不稳定，但稳定促淀粉状蛋白生成的部分折叠，并且因此导致原纤维形成加速，而不管其明显的稳定化特性。[0011]因此，存在对这样的胰岛素类似物的需求，其在胰岛素浓度从0.6mM至3.0mM(典型地对应于范围从U-100至U-500的制剂浓度)的广泛范围下，显示治疗DM的快速PK/PD，同时显示对应的野生型胰岛素的至少部分活性，维持其至少部分化学和/或物理稳定性。[0012]发明概述因此，本发明的一个方面是提供胰岛素类似物，其提供具有足够化学稳定性和物理稳定性的锌-稳定的胰岛素六聚体，以使它们的制剂的蛋白浓度能在一定范围内并呈在皮下注射后赋予快速吸收的形式。本发明解决了先前对超浓缩的胰岛素制剂和胰岛素类似物制剂的限制，即，它们仍不足以快速地发挥作用以使膳食后血糖控制最佳化或能够用于胰岛素泵。本发明的一组三个谷氨酸残基，[G1UA8、G1uB31、G1uB32]，可与本领域已知的B链取代联合使用，以引起胰岛素六聚体的加速分解或与胰岛素类似物在其皮下注射后相对于类似制剂中的野生型胰岛素的更快吸收有关。[0013]更特别地，本发明涉及通过掺入(a)在AS位的谷氨酸(Glu)，(b)B链的2_残基GIub31-GIub32延伸，和(c)任选地，在B24位的非-标准氨基酸而得到修饰的胰岛素类似物。任选的在B24的非-标准氨基酸取代可以是环己烷基丙氨酸或苯丙氨酸(Phe)的芳族环的卤代衍生物。这样的序列可任选地包含在如本领域已知的胰岛素类似物的A或B链中其它位点的标准氨基酸取代，以提高在皮下注射后胰岛素吸收的速度；后者的实例由AspB28(如目前以商品名Novolog?出售的胰岛素产品中存在的)或[LysB28、Pix)B29](如目前以商品名Humalog?出售的胰岛素产品中存在的)提供。[0014]发明人试图绕过胰岛素六聚体经历蛋白浓度大于0.6mM(标准的U-100制剂)的较高级自缔合的趋势。为此，发明人试图将另外的荷负电的侧链置于六聚体-六聚体界面，如在晶格中可见的(图2)。野生型六聚体的静电表面示于图3A和3B(六聚体的顶部和底面)。本发明的类似物包含3个如下的另外的谷氨酸(Glu)残基。(i)Glif3^Glif32a鉴于甘精胰岛素(Lantus?的活性成分)包含另外的B链残基ArgB31和ArgB32(赋予两个额外的正电荷)，本发明的类似物包含酸性残基GIub31和GIub32(赋予两个额外的负电荷)。并非在中性pH下介导等电点沉淀以形成如由Lantus?所见的长效忙库，这种电荷反转(chargereversal)减少胰岛素的等电点离开中性的偏离(pi<5)。B链的这种酸性延伸的预测的静电效应示于图3C和3D。(ii)GIua8。静电排斥的原理通过使A链取代ThrA8—Glu稳定化而得到扩展。与B链酸性延伸一致的GIua8的预测的静电效应示于图3E和3F。预计B31、B32和AS的负电荷引起连续六聚体的平坦上下表面之间的排斥。尽管本发明不依赖于这种理论或受这种理论的束缚，野生型胰岛素六聚体的依序组装(将一个六聚体堆叠在其它六聚体之上，如同在晶格中)和这样的堆叠的静电破坏分别在图4A和4B中以示意性方式举例说明。还应该注意到，酸性B31-B32标记物也减弱对I型IGF受体(IGF-1R)的促有丝分裂交叉-结合，一种也与甘精胰岛素提高的IGF-1R结合特征相反的作用。[0015]G1uB31、G1uB32和GIua8的3个负电荷(与本发明的胰岛素类似物协同使用)可与本领域已知的取代组合以使胰岛素六聚体的二聚体-或三聚体-形成表面不稳定并因此赋予可溶性含锌制剂相对于相同或类似制剂中的野生型胰岛素的更快吸收。这样的取代的实例是Aspb28(见于门冬胰岛素，以商品名Novolog?出售的胰岛素产品的活性成分)、[LysB28，ProB29](见于赖脯胰岛素，以商品名Humalog?出售的胰岛素产品的活性成分)，和[LysA3，GIub29](见于赖谷胰岛素，以商品名Apidra?出售的胰岛素产品的活性成分)。然而，三个谷氨酸(G1uB31、G1uB32和GIua8)组与其它取代或修饰的组合并不限于用于后来的三种产品的B链取代。确实，在过去十年期间，已经描述了对胰岛素分子的特殊化学修饰，即选择性地修饰蛋白质的一种或另一种特殊的性质，以促进感兴趣的应用。虽然在重组DNA时代(1980)开始时，野生型人胰岛素对在不同的治疗环境的使用被构思为最佳的，但胰岛素类似物在过去十年的广泛临床应用提示，一组非-标准的类似物，各自被定制以解决特定的未满足的需求，将提供重要的医学和社会效益。蛋白质中一个特定位置的一个天然氨基酸被另一个天然氨基酸取代是本领域熟知的并在本文中被命名为标准取代。胰岛素中的非-标准取代提供提高的稳定性或加速吸收的前景，而不使随在0.6-3.0mM范围内的胰岛素类似物浓度变化的PK/H)变差。本发明的类似物特别地包括PheB24的非-标准修饰，例如其被环己烷基丙氨酸(Cha)或PheB24的芳族环的卤代衍生物的取代。[0016]要求保护的发明通过在B24位任选掺入非-标准氨基酸取代绕过先前的设计限制，其包括关于PheB24的取代的那些。这通过芳族氨基酸侧链被卤素-修饰的芳族类似物(在大小和形状上类似于苯丙氨酸)取代而实现，在该情况下类似物随后维持相应的胰岛素或含有天然芳族侧链的胰岛素类似物的至少部分生物学活性。非-标准的氨基酸侧链(在B24位的2-F-PheB24、2-Cl-PheB24或2-Br_PheB24，也分别命名为邻-单氟_PheB24、邻-单氯-PheB24、邻-单溴-PheB24)显著地稳定分离的胰岛素单体。胰岛素单体的类似的稳定性由五氟-PheB24赋予，其中5个环氢原子的每一个被氟原子替代。非-标准的氨基酸侧链(在B24位的4-F-PheB24、4-Cl-PheB24或4-Br_PheB24;也分别命名为对-单氟_PheB24、对-单氯-PheB24、对-单溴-PheB24)进一步调节六聚体解体的速率并因此可被包括在内，以提高胰岛素类似物的[GluA8、G1uB31、GIub32]家族的快速起效特征。在B24的非-标准取代还可以是环己烷基丙氨酸，一种允许有天然-样生物学活性，但促进锌胰岛素六聚体解体的非-平面和非-芳族环。[0017]在脊椎动物胰岛素序列中的B24位的芳族氨基酸苯丙氨酸(Phe)是保守的。这是胰岛素中3个苯丙氨酸残基(位置B1、B24和B25)中的一个。一种结构上类似的酪氨酸是在B26位。在胰岛素单体中的PheB24结构环境在条带模型(ribbonmodel)(Fig.5A)和空间填充模型(space-fillingmodel)(Fig.5B)中显示。认为PheB24的芳族环紧贴着疏水核心(但不在其内)装配以稳定B链的超二级结构。认为PheB24位于典型的受体-结合表面，并且认为其涉及关于受体结合的构象改变。还认为PheB24包装在胰岛素的二聚体界面，且因此包装在胰岛素六聚体的3个界面。其在胰岛素单体中的结构环境不同于其在这些界面的结构环境。特别地，单体中PheB24的侧链可用的围绕体积大于二聚体或六聚体中的。[0018]胰岛素中的芳族侧链，如一般在球蛋白中的，可以参与各种各样的疏水性和弱极性相互作用，不仅包括相邻的芳族环，而且还涉及正-或负静电势的其它来源。实例包括肽键中的主-链羰基-和酰胺基团。芳族侧链的疏水包装可发生在蛋白核心内和蛋白质之间的非-极性界面上。在脊椎动物蛋白中，这样的芳族侧链可以是保守的，反映了它们对结构或功能的关键贡献。天然芳族氨基酸的实例是苯丙氨酸。它的芳环系统包含排列为平面六边形的6个碳原子。芳香性是这些6个碳中结合排列的集体性质，产生了该环的平面之上和之下的η电子轨道。这些面显示部分的负静电势，而含有5个C-H部分的该环边缘，呈现出部分的正静电势，这种部分电荷的不对称分布引起四极静电力矩(quadrapoleelectrostaticmoment)并可与蛋白质中其它外形或部分电荷一起参与弱极性相互作用。芳族侧链的另外的特征性特点是其体积。这种体积的决定因素(Determinants)包括在平面环边缘的其5个C-H部分的拓扑轮廓(topographiccontours)。[0019]PheB24的非-标准修饰包括与其被环己烷基丙氨酸(Cha)取代有关的平面性和芳香性的丧失。PheB24的其它非-标准修饰保存芳香性，但导致其静电特性的改变。包含在PheB24环中的一个或多个氢原子被卤原子(氟、氯或溴；F1、Cl或Br)的取代引起与这些卤原子的电负性有关的偶极和四极静电力矩的特征变化。一个C-H部分被C-F、C-C1或C-Br部分的取代，例如，应被期望保持其芳香性，但因卤原子的电负性和随后的环平面之上和之下η电子轨道的扭曲所致而引入重要的偶极矩。尽管C-F部分的大小类似于天然C-H部分的大小(因此可在大体上被不同的蛋白环境所容纳)，但其局部电负性和环-特定的氟-诱导的静电偶极矩可造成与蛋白中的相邻基团的有利或不利的静电相互作用。这样的相邻基团的实例包括，但不限于，CO-NH肽键单位、二硫桥键中的硫原子的孤对电子、侧链甲酰胺官能团(Asn和Gln)、其它芳族环(Phe、Tyr、Trp和His)，和形式上正电荷和负电荷的酸性侧链(Asp和Glu)、碱性侧链(Lys和Arg)、具有用于胰岛素形成范围内的电势pKa的可滴定侧链(titratablesidechain)(His),可滴定的N-和C-末端链末端、结合的金属离子(如Zn2+或Ca2+)，和蛋白-结合的水分子。[0020]此外，取代的[G1uA8，GIub31,GIub32]组减少胰岛素与I型IGF受体(IGF-1R)的交联结合，以至于胰岛素的促有丝分裂特性不增加。本发明的另一方面是，这样一种类似物可以配制成浓度从u-100至u-500(pH7-8)的无锌制剂，其保留类似于或比浓度U-100的野生型人胰岛素的普通制剂更快速和较少延长的ρκ/ro特性。[0021]一般来说，本发明提供包含32-残基B链多肽的胰岛素类似物，其通过两个Glu残基(GIub31和GIub32)与含有GIua8的变体A链结合而延伸。在一个实施例中，也掺入B链多肽[LysB28、ProB29]以赋予增加的快速起效特性；在另一个实施方案中，类似物不仅包含[LysB28、ProB29]，而且还包含在B24位的2Br-PheB24以增加化学和物理稳定性。在另一个实施方案中，胰岛素类似物是哺乳动物胰岛素类似物，例如人胰岛素的类似物。[0022]此外或作为选择，胰岛素类似物可包含在B链29位的非-标准氨基酸取代。在一个具体的实例中，在B29的非-标准氨基酸是正亮氨酸(Nle)。在另一个具体的实例中，在B29的非-标准氨基酸是鸟氨酸(Orn)。[0023]还提供的是编码包含32-残基B链多肽的胰岛素类似物的核酸，所述多肽包含2-残基C-末端延伸(GIub31和GIub32)，或任选地还在位置B24或B29或二者上掺入非-标准的氨基酸的这样一种核酸。在一个实例中，非-标准的氨基酸通过终止密码子编码，例如核酸序列TAG。表达载体可包含这样的核酸，并且宿主细胞可包含这样的表达载体。[0024]本发明还提供一种治疗患者的方法。该方法包括给予患者生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其中胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐包含掺入两个残基延伸(GIub31和GIub32)的B链多肽和如上所述的GIua8变体A链。在一个实施方案中，在给予患者的胰岛素类似物中的2Br-Phe(或其它非-标准的氨基酸)位于B24位。在又一个实施方案中，胰岛素类似物是哺乳动物胰岛素类似物，例如人胰岛素的类似物。[0025]附图简述图1A是包含A链和B链以及具有侧连的二元切割位点(实心圆)和C-肽(空心圆)所示的连接区的人胰岛素原序列(SEQIDNO:1)的图示。[0026]图1B是由胰岛素样部分和无序连接肽(虚线)组成的胰岛素原的结构模型。[0027]图1C是指示残基B24在B链中的位置的人胰岛素序列(SEQIDNO:2和3)的图/Jnο[0028]图2提供胰岛素六聚体在晶格中堆叠的结构模型。(A)锌-稳定的T6锌六聚体(侧视图)包含两个轴向锌离子/六聚体(紫红色球(magentaspheres))。A链以深灰色显示，而B链以浅灰色显示。虽然仅仅示出3个六聚体，但在晶格中连续堆积的连续六聚体产生一个伪无穷体积(pseudo-1nfinitecolumn)。这样的晶格组装提供在溶液中的连续六聚体-六聚体相互作用的模型。(B)界面区域的扩展(小图A中的箱)。(C)基于显示G1uA4、GIub31和GIub32在六聚体-六聚体界面的预测位置的野生型晶体结构的相应模型。[0029]图3提供静电表面的示例说明。(A和B)基于其作为锌六聚体的晶体结构的野生型胰岛素六聚体的静电表面。红色代表负静电势，和蓝色代表正静电势。顶面和底面在小图A和B中显示。(C和D)含有B链延伸GIub32和GIub32(绿色条状)的变体胰岛素六聚体的预测的静电表面。颜色代码(colorcode)另外示于小图A中。顶面和底面在小图C和D中显示。(E和F)含有GIua8(黄色条状)以及B链延伸GIub32和GIub32(绿色条状)的变体胰岛素六聚体的预测的静电表面。颜色代码另外示于小图A中。顶面和底面在小图E和F中显示。[0030]图4提供野生型六聚体-六聚体自缔合及其提出的通过静电工程改造而阻止的图示。(A)连续堆积的锌胰岛素六聚体的图示(也参见图2中的条带模型)。(B)包含B链残基[G1uB31、G1uB32]的酸性延伸的加入(红色标记物；每个六聚体六个，其中之一隐藏在六聚体后面(灰色))，其被设计成通过静电排斥的方式防止六聚体-六聚体自缔合。预测此将导致六聚体甚至在U-500制剂中解体的优势。这种模型得到猪模型中的PD研究的支持。[0031]图5A是显示与3个二硫桥键相关的PheB24的芳族残基的胰岛素单体的条带模型。显示邻接的侧链LeuB15(箭头)和PheB24。A链和B链分别以浅和深灰色另外显示，而半胱氨酸的硫原子作为圆圈表不。[0032]图5B是胰岛素的空间充满模型，显示疏水核心边缘口袋内的PheB24侧链。[0033]图6是显示胰岛素类似物的受体-结合研究结果的一对图。(上面小图)胰岛素受体的B同工型(IR-B)的相对活性通过竞争结合测定确定，其中受体-结合的1251-标记的人胰岛素由增加浓度的KP-胰岛素(■)或其类似物:[GluB31、GIub32]-胰岛素(?)、[G1uA8、G1uB31、G1uB32]_胰岛素(▲)和2-Br-PheB24-[GluA8、GluB31、GluB32]-胰岛素(▼)替代。(下面小图)I型IGF受体(IGF-1R)的相对活性通过竞争结合测定确定，其中受体-结合的1251-标记的IGF-1由增加浓度的KP-胰岛素(■)或其类似物:[GluB31、GluB32]-胰岛素(?)、[GIua8,G1uB31、GIub32]-胰岛素(▲)和2-Br-PheB24-[GluA8、GIub31、GIub32]-胰岛素(▼)替代。[0034]图7是关于在青春期约克郡猪模型(adolescentYorkshirepigmodel)中的野生型胰岛素和胰岛素类似物的药效学(PD)分析的系列图。图7A-7E的每一幅显示在指定猪中的比较性H)研究的结果；对5只猪分别进行了试验。图7A提供LillyHumulinU-500R(■和黑色线)对比LillyHumalogU-100(▲和灰色线)的基线比较。图7B提供标称浓度U-500(3.0mM)的[GluB31、GIub32]-KP-胰岛素(?和灰色线；称为“Hexalog”)与对照产品LillyHumulinU-500R(■和黑色线)和LillyHumalogU-100(▲和灰色线)的对比。右边的阴影的水平箭头指示LillyHumulinU-500R的拖长尾线。图7C表示在第二只猪中标称浓度U-500(3.0mM)的[G1uB31，GIub32]-KP-胰岛素(籲和灰色线；称为“Hexalog”)对比对照产品LillyHumulinU-500R(■和黑色线)的独立试验的结果。图7D是在第三只猪中标称浓度U-500(3.0mM)的[GluB31，GIub32]-KP-胰岛素(?和灰色线；称为“Hexalog”)对比对照产品LillyHumulinU-500R(■和黑色线)的另一次独立试验的结果的图。图7E显示标称浓度U-500(3.0mM)的[G1uA8、G1uB31、G1uB32]-KP-胰岛素(▲和灰色线；称为“Hexalog-Cle”)的4-Cl_PheB24衍生物对比对照产品LillyHumulinU-500R(■和.；黑色线)和LillyHumalogU-100(?和灰色线)的独立试验。[0035]发明详述本发明涉及胰岛素类似物，其能使快速的PK和ro维持在从u-100至u-500的宽范围的胰岛素浓度内。然后类似物维持相应的未修饰的胰岛素或胰岛素类似物的至少部分的生物学活性和维持类似的或提高的热力学稳定性和对原纤维形成的抗性。[0036]本发明涉及在位置A8、B31和B32的一组3个谷氨酸取代，任选地与本领域已知的B链取代组合以提高在胰岛素皮下注射之后其吸收速率，并任选地与PheB24的非-标准修饰组合。在B24的后一修饰包括由Cha或由PheB24的芳族环的卤素衍生物(氟代、氯代或溴代)的取代。这样的修饰意欲改进超浓缩的胰岛素制剂关于在皮下注射后的稳定性或吸收速度的特性。在一个实例中，胰岛素类似物包含至少一个另外的取代。[0037]实例由赖脯胰岛素的衍生物([LysB28，ProB29]-胰岛素；KP_胰岛素)提供。在两个实施方案([GIua8,GIub31、GIub32]-KP-胰岛素和2-Br_PheB24-[G1uA8,GIub31、GIub32]-KP-胰岛素的任一个中，本发明提供这样的胰岛素类似物，其显示对胰岛素受体的亲和力类似于对目前临床使用的野生型胰岛素或胰岛素类似物的亲和力，和对I型IGF受体的亲和力类似于或低于目前临床使用的野生型人胰岛素或胰岛素类似物的亲和力。然而，本发明并不限于KP-胰岛素及其类似物的以上两种衍生物。还设想这些取代也可在从动物胰岛素衍生的六聚体类似物中进行，以非限制性实例为例，有例如猪、牛、马和犬胰岛素。[0038]已经发现[GIua8、GIub31、GIub32]-KP-胰岛素和2-Br_PheB24-[GIua8、GIub31、GluB32]-KP-胰岛素，当在Lilly稀释液(LillyDiluent)中配制并在给通过链脲霉素患有糖尿病的雄性Lewis大鼠皮下注射后，将以类似于或大于在相同的制剂中的野生型人胰岛素的效价导致血糖浓度的降低。还已经发现[G1UA8、G1uB31、G1uB32]-KP-胰岛素和2-Br-PheB24_[GIua8、GluB31、GIub32]-KP-胰岛素，当在含锌缓冲液中用酚型防腐剂配制并在皮下注射给麻醉的约克郡猪(其内源性b-细胞分泌胰岛素受到静脉内给予奥曲肽的抑制)后，将以类似于相同的制剂中的野生型人胰岛素的效价和比类似的蛋白浓度和在类似的制剂缓冲液中的野生型胰岛素更快的药代动力学导致血糖浓度的降低。[0039]本发明的胰岛素类似物也可包含Aspb28或在这个位点的其它取代。此外或作为选择，本发明的胰岛素类似物可包含在B链29位上的标准或非-标准氨基酸取代，在野生型胰岛素中B链29位是赖氨酸(Lys)。在一个具体的实例中，在B29的非-标准氨基酸是正亮氨酸(Nle)。在另一个具体的实例中，在B29的非-标准氨基酸是鸟氨酸(Orn)。[0040]此外，鉴于人和动物胰岛素之间的类似性，和过去在糖尿病病人中使用动物胰岛素，还设想可将其它微小修饰引入胰岛素序列中，特别是那些被认为是“保守的”取代。例如，氨基酸的另外取代可在具有类似侧链的氨基酸组中进行，而不偏离本发明。这些氨基酸包括中性疏水氨基酸:丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(lie或I)、脯氨酸(Pro或P)、色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)和甲硫氨酸(Met或M)。同样，中性极性氨基酸可在其以下氨基酸的组中彼此取代:甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Glu或Q)和天冬酰胺(Asn或N)。认为碱性氨基酸包括赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)。酸性氨基酸为天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)。除非另有说明或从上下文中显而易见，否则本文所述氨基酸应视为L-氨基酸。标准的氨基酸也可由属于相同化学类型的非-标准氨基酸取代。通过非限制性实例的方式，碱性侧链Lys可由较短侧-链长度的碱性氨基酸(鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸)替代。Lys也可由中性脂族等构物正亮氨酸(Nle)替代，其可转而由含有较短脂族侧链的类似物(氨基丁酸或氨基丙酸)替代。[0041]如本说明书和权利要求书所使用，胰岛素或胰岛素类似物中的不同氨基酸可用所述氨基酸残基，接着是氨基酸的位置(任选用上标)表示。所述氨基酸的位置包括取代位于其中的胰岛素的A链或B链。因此，PheB24表示在胰岛素B链第24个氨基酸上的苯丙氨酸。[0042]虽然不希望受到理论的束缚，本发明设想，3个谷氨酸残基组合(G1uA8、GIub31和GIub32)引入具有以下作用的负静电势:(i)减少在蛋白浓度范围0.6-3.0mM的六聚体-六聚体相互作用的程度，(ii)提高胰岛素类似物的热力学稳定性，(iii)延迟在高于室温下轻轻搅动时原纤维形成的发生，和(iv)改变受体-结合表面的功能特征，以至于降低与促有丝分裂I型IGF受体的交叉-结合。不认为3个Glu残基对这些有利作用的每一个同等地作出贡献。然而认为GluAS对获得热力学稳定性提供了主要贡献，例如，认为酸性B链延伸对降低与IGF受体的交叉-结合作出了主要贡献。因此，认为3个Glu残基一起提供有利特性的独特组合。[0043]本发明的类似物可任选地包含PheB24的非-标准修饰。在B24的苯丙氨酸是在功能型胰岛素中不变化的氨基酸并包含芳族侧链。胰岛素中的PheB24的生物学重要性由引起人糖尿病的临床突变(SerB24)指明。虽然不希望受到理论的束缚，认为PheB24包装在典型的受体结合表面的疏水核心的边缘。模型以晶体学原聚体(2-Zn分子I;蛋白质数据库标识符4INS)为基础。位于B链的C-末端β-股(残基Β24-Β28)内，PheB24邻接中心α-螺旋(残基Β9-Β19)。在胰岛素单体中，芳族环的一面和一边位于由LeuB15和CysB19界定的浅口袋中；另一面和另一边则暴露于溶剂。这个口袋部分被主链羰基和酰胺基包围，并由此产生具有不规则和宽松空间边界的复杂和不对称的静电环境。在胰岛素二聚体中，和在胰岛素六聚体的3个二聚体界面的每一个中，PheB24的侧链包装在更紧密地包含在空间环境中作为每个二聚体界面的8个芳族环簇(TyrB16、PheB24、PheB25、TyrB26和它们的二聚体_相关的配偶)的部分。不受理论的束缚，PheB24的芳族环被Cha或Phe衍生物的卤素衍生物的取代保持在二聚体界面内的一般的疏水填充，同时在引入六聚体解体速率的有利提高或在胰岛素单体内的有利的不对称静电相互作用时施以不同影响，以使其热力学稳定性增加。[0044]本发明涉及胰岛素类似物，其可以大于U-100和最高至U-500的浓度配制，以至于不管胰岛素类似物的浓度，制剂在皮下注射后维持类似于普通野生型人胰岛素U-100制剂的吸收速率和药理学活性；后者的实例是Humulin?RU-100(EliLillyandCo)或Novalin?RU-100(Novo-Nordisk)。设想本发明的取代可在许多现有的胰岛素类似物的任何一种中进行。例如，本文提供的3个谷氨酸残基可以在赖脯胰岛素([LysB28、Pix)B29]-胰岛素，本文缩写为KP-胰岛素)、门冬胰岛素(AspB28_胰岛素)、赖谷胰岛素([LySB3、GluB29]-胰岛素)，或其它修饰的胰岛素或胰岛素类似物的情况下制得，或在各种药物制剂内制得，所述制剂例如除了人胰岛素外，还有普通胰岛素、NPH胰岛素、中效胰岛素或特慢胰岛素。门冬胰岛素包含Aspb28取代并以商品名Novalog?出售，而赖脯胰岛素包含LysB28和P1b29取代，并以商品名Humalog?知晓并出售；赖谷胰岛素包含取代LysB28和P1b29并以商品名Apidra?知晓并出售。这些类似物描述于美国专利号5，149，777,5,474，978和7，452，860中。这些类似物各自被称为速效胰岛素。[0045]为了比较的目的，以SEQIDNO:1提供人胰岛素原的氨基酸序列。[0046]SEQIDNO:1(人胰岛素原)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-GIn-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-1Ie-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-1Ie-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn以SEQIDNO:2提供人胰岛素A链的氨基酸序列。[0047]SEQIDNO:2(人Λ链)Gly-1le-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-1le-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn以SEQIDNO:3提供人胰岛素B链的氨基酸序列。[0048]SEQIDNO:3(人B链)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CyS-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr以SEQID.N0.5提供本发明的变体A链的氨基酸序列。[0049]SEQIDNO:5(变体人A链)Gly-1le-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Glu-Ser-1le-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn以SEQIDN0.6提供人胰岛素延伸的B链的氨基酸序列。[0050]SEQIDNO:6(人B链)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CyS-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Glu-Glu以SEQID.N0.7提供KP-胰岛素延伸的B链的氨基酸序列。[0051]SEQIDNO:7(延伸的KPB链)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CyS-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-LyS-Pro-Thr-Glu-Glu以SEQID.N0.8提供门冬胰岛素延伸的B链的氨基酸序列。[0052]SEQIDNO:8(延伸的AspB28B链)Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr-Glu-Glu以SEQID.N0.9提供赖谷胰岛素延伸的B链的氨基酸序列。[0053]SEQIDNO:9(延伸的LysA3，GIub29B链)Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-CyS-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu人胰岛素B链的氨基酸序列可在B24位用非-标准氨基酸取代进行修饰，如在同时待审的国际申请号PCT/US2009/52477、美国申请系列号12/884，943和13/018，011，和美国临时专利申请系列号61/507，324中更全面地描述的，其公开的内容通过引用结合到本文中。这样的序列的实例以SEQ.1DNO10提供。[0054]SEQIDNO:10Phe-Val-Xaa5-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa4-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Try-Thr-Xaa2-Xaa3-Thr-Glu-Glu[Xaa1是Cha、五氟-Phe、2-F-Phe、2-Cl-Phe、2-Br-Phe、4-F-Phe、4-Cl-Phe、4-Br_Phe；Xaa2是Asp、Pro、Lys或Arg；Xaa3是Lys、Pro或Ala；Xaa4是His、Asp或Glu;和Xaa5是Asn或Lys]在B24位的非-标准氨基酸取代可任选地与在B29位的非-标准取代组合，如在SEQ.1D.NO11中提供。[0055]SEQIDNO:11Phe-Val-Asn-Gln-HiS-Leu-CyS-Gly-Ser-Xaa4-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Try-Thr-Xaa2-Xaa3-Thr-Glu-Glu[Xaa1是Cha、五氟-Phe、2-F-Phe、2-Cl-Phe、2-Br-Phe、4-F-Phe、4-Cl-Phe、4-Br_Phe；Xaa2是Asp、Pro、Lys或Arg；Xaa2是Asp、Glu或Pro；Xaa3是鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、正亮氨酸、氨基丁酸或氨基丙酸；和Xaa4是His，Asp或Glu]胰岛素-介导的半合成也使用含有GIub31和GIub32的合成十肽，如在SEQIDNO:12-17中所提供。[0056]SEQIDNO:12Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Glu-Glu.SEQIDNO:13Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr-Glu-Glu.SEQIDNO:14Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr-Glu-Glu.SEQIDNO:15Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr-Glu-Glu.SEQIDNO:16Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Asp-Lys-Thr-Glu-Glu.[Xaa1是Cha、五氟-Phe、2-F-Phe、2-Cl-Phe、2-Br-Phe、4-F-Phe、4-Cl-Phe、4-Br_Phe]SEQIDNO:17Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Xaa2-Pro-Thr-Glu-Glu.[Xaa1是Cha、五氟-Phe、2-F-Phe、2-Cl-Phe、2-Br-Phe、4-F-Phe、4-Cl-Phe、4-Br_Phe；和Xaa2是Leu、Lys或Asp]KP-胰岛素的3个类似物通过胰蛋白酶-催化的半-合成法制备并通过高效液相色谱法来纯化(Mirmira,R.G.JPTager,H.S.,1989.J.B1l.Chem.264:6349-6354)。这个方案应用(i)表示残基(N)-GF*FYI1ETEE的合成十肽(包括修饰残基(F*)、“KP”取代(下划线)和2-残基酸性延伸(黑体字))和(ii)截短的类似物去-八肽[B23-B30]-胰岛素或GIuas-去-八妝[B23-B30]-膜岛素。由于十妝通过ProB28和LysB29(斜体字)互换而不同于野生型B23-B30序列(GF*FYT/%TEE)，在胰蛋白酶处理期间不需要保护赖氨酸ε-氨基。简而言之，将去-八肽(15mg)和八肽(15mg)溶于含有10mM乙酸I丐和ImM乙二胺四乙酸(EDTA)的二甲基乙酰胺/1，4_丁二醇/0.2M三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(pH8)(35:35:30,v/v,0.4mL)的混合物中。用10μLN-甲基吗啉调节最终pH至7.0。使溶液冷却至12°C，加入1.5mgTPCK-胰蛋白酶，于12°C温育2天。24小时后加入另外的1.5mg胰蛋白酶。反应物用0.1%三氟乙酸酸化，并用制备型反相HPLC(C4)纯化。采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALD1-TOF!AppliedB1systems,FosterCity,CA)的质谱法在每种情况下得到预期值(未显示)。固相合成的通用方法如(Merrifield等，1982.B1chemistry21:5020-5031)所述。9-荷-9-基-甲氧基-羰基(F-moc)保护的苯丙氨酸类似物购自Chem-1mpexInternat1nal(WoodDale,IL)。[0057]还采用以上方案制备以下的3个胰岛素类似物:[GluB31、GluB32]-KP-胰岛素、[GIua8,GIub31、GIub32J-KP-胰岛素和2-Br_PheB24-[GluA8、GIub31、GIub32]-KP-胰岛素。胰岛素类似物经历以下测定法的一些或全部。生物学效价在糖尿病大鼠模型中并在麻醉的约克郡猪中通过血糖钳技术进行评价；所显示的受体-结合活性值基于激素-受体解离常数相对于人胰岛素的比率计(因此人胰岛素的活性是1.0，通过活性值的标准误差(另外通常小于25%)限定)；热力学稳定性值(解折叠的自由能；AGu)于25°C基于外推至零的变性剂浓度的二态模型进行评价；对原纤维形成的抗性通过在无锌磷酸盐-缓冲盐水(pH7.4)中，于30°C轻轻搅动时，测量蛋白质原纤维形成开始所需要的滞后时间(以天计)来评价，如在(Yang,Y.,Petkova,A.T.,Huang,Κ.,Xu,B.,Hua,Q.X.,Y,1.J.,Chu,Y.C.,Hu,S.Q.,Phillips,N.B.,Whittaker,J.,Ismail-Beigi,F.,Mackin,R.B.,Katsoyannis,P.G.,Tycko,R.,&Weiss,M.A.(2010)促淀粉状蛋白生成蛋白及其修复的软肋(AnAchilles’Heelinanamyloidogenicproteinanditsrepair).膜岛素原纤维形成和治疗剂设计(Insulinfibrillat1nandtherapeuticdesign.).J.B1l.Chem.285，10806-10821)中所述。[0058]应用Aviv分光偏振计于4°C和/或25°C获得圆二色性(CD)谱(Weiss等，B1chemistry39:15429-15440)。样品在50mM磷酸钾溶液(pH7.4)中含有约25μMDKP-胰岛素或类似物；将样品于25°C稀释至5μM用于胍诱导的变性研究。为了求出解折叠的自由能，通过非线性最小二乘法将变性转换拟合至二态模型，如Sosnick等，MethodsEnzymol.317:393-409中所述。[0059]KP-胰岛素的基线热力学稳定性，如于25°C从变性二态模型推断的，是2.8土0.1千卡/摩尔。三个类似物表现出较大的稳定性，如下:[G1uB31、G1uB32]-KP-胰岛素，3.1±0.1千卡/摩尔；[G1uA8、G1uB31、G1uB32]-KP-胰岛素，3.6土0.1千卡/摩尔；和2-Br-PheB24-[GluA8、GIub31、GIub32]-KP-胰岛素，4.3±0.1千卡/摩尔。[0060]此外，发现类似物的物理稳定性显著大于KP-胰岛素的物理稳定性，如在温育期间对一式三份所评价的；于451:、在轻轻搅动下，制备蛋白300μΜ的磷酸盐-缓冲盐水(PBS)的溶液(pH7.4)。观察样品20天，或者直到观察到玻璃小瓶出现沉淀或起霜迹象。尽管KP-胰岛素的滞后时间在I和2天之间，但类似物各自的滞后时间延长如下:[GluB3\Iub32J-KP-胰岛素，5天;[GIua8、GIub31、GIub32]-KP-胰岛素，12和13天之间；对2-Br-PheB24_[GIua8、GIub31、GIub32]-KP-胰岛素未进行测试。[0061]相对受体-结合活性定义为类似物的激素-受体解离常数对野生型人胰岛素的比率，如通过竞争性置换测定法，使用1251-人胰岛素所测定的。微量滴定条板(NuncMaxisorb)用AU5IgG(100μ?/孔的40mg/ml磷酸盐-缓冲盐水)于4°C温育过夜。结合数据通过二个位点序贯模式分析。对数据进行非特异性结合(在ΙμΜ人胰岛素的存在下相关的残留放射性膜的量)的校正。相应的测定使用I型IGF受体和1251-标记的人IGF-1作为示踪剂进行。在所有测定中，在缺乏竞争性配体时结合的示踪剂的百分率小于15%，以避免配体消耗假象(ligand-deplet1nartifacts)。结果证实3个类似物的亲和力在KP-胰岛素的亲和力的45-75%之间；对IGF受体的交叉-结合类似于或弱于KP-胰岛素的交叉-结合。代表性的结合数据提供于图6中。[0062]为评价胰岛素类似物的降低血糖的效力，通过用链脲霉素处理，致使雄性Lewis大鼠(平均体重?300克)患糖尿病。(这种模型提供效价但不是药代动力学加速程度的探针，因为(i)野生型胰岛素、KP-胰岛素和AspB28-胰岛素呈现血糖浓度影响的类似模式和(ii)这些模式不受制剂中存在或不存在足以确保胰岛素六聚体的组装的化学计量的锌离子的影响)。经皮下注射含有野生型人胰岛素、胰岛素类似物，或单独缓冲液(从EliLillyandC0.获得的无蛋白无菌稀释液；由16mg甘油、1.6mg间甲酹、0.65mg苯酹和3.8mg磷酸钠(pH7.4)组成)的蛋白溶液，并通过使用临床血糖计(HypoguardAdvanceMicro-Drawmeter)系列测量来监测血糖发生的改变。为确保制剂的均勻性，胰岛素类似物各自经反相高效液相色谱法(rp-HPLC)再纯化，干燥成粉末，以相同的最大蛋白浓度(300yg/mL)溶于稀释剂中并通过分析C4rp-HPLC再次定量；使用以上缓冲液制备稀释液。在时间t=O时，对大鼠按照20μg胰岛素/100μ?缓冲液/300g大鼠进行皮下注射。这个剂量相当于约67μg/kg体重，其以国际单位(IU)计相当于2IU/kg体重。KP-胰岛素的剂量-反应研究指示在该剂量下在注射后第一个小时期间实现接近葡萄糖清除的最大速率。从一群30只糖尿病大鼠中随机选择大鼠。有两组在实验开始时显示类似的平均血糖浓度。在时间O和每10分钟至最多90分钟，从尾夹尖(clippedtip)采血；在某些研究中，时间段延长至180分钟或240分钟。胰岛素减少血糖浓度的作用功效使用通过浓度相对于时间的变化(使用最小均方和线性下降的初始区域)除以注射的胰岛素浓度来计算。以每只大鼠20微克剂量(0.6mM蛋白浓度)进行的大鼠测定指示3个类似物是至少与KP-胰岛素同样有效的。事实上，[GIua8,G1uB31、GIub32]-KP-胰岛素和2-Br_PheB24-[GluA8、GIub31、GIub32J-KP-胰岛素似乎比KP-胰岛素更有效。[0063]为评价胰岛素类似物在预测人药理学特性的动物模型中的PK、PD和效价，在青春期约克郡农场猪(体重35-45kg)中进行含有AspB1°-人胰岛素类似物的2F-PheB24衍生物的研究。在研究的第一天，每只动物经历用泰拉瑞诱导的麻醉和用异氟烷诱导的全身麻醉。每只动物经气管内插管来连续监测氧饱和度和呼气末(end-tidalexpired)CO2。尽管动物未患糖尿病，在血糖钳研究(clampstudy)开始前约30分钟和此后每2小时,在OR通过皮下注射乙酸奥曲肽(44mg/kg)抑制胰岛功能。在放置IV导管和用10%葡萄糖输注建立基线正常血糖(euglycemia)后，胰岛素的皮下注射通过导管给予。为了量化外周胰岛素-介导的葡萄糖摄取，给予可变速率的葡萄糖输注以维持约85mg/dl的血糖浓度。这种葡萄糖输注典型地将需要5-6小时，即直至在Humulin?的对照研究中典型地观察到葡萄糖输注速率回到前-胰岛素基线值。使用Hemocue201便携式血糖分析仪每10min(标准误差1.9%)测量葡萄糖浓度。[0064]用于葡萄糖钳的计算机化方案如在(Matthews,D.R.,和Hosker,J.P.(1989)DiabetesCare12,156-159)中描述。简言之，用于胰岛素测定的2_ml血样依据以下安排获得:胰岛素递送后从0-40min:5_分钟间隔；从50-140min:10-分钟间隔，和从160min-直至当GIR回到基线的时间点:20-min间隔。对于PK/PD，将应用20_min移动平均曲线拟合和滤子。PD测定为时间对半最大效应(早期)、时间对半最大效应(晚期)、时间对最大效应和在基线上的曲线下面积(AUC)。对于这些分析的每一种，在随后的分析中使用拟合的曲线，而不是原始数据。使3只猪的每一只经历两种研究:一种用ChlOTolog(4-Cl-PheB24、LysB28、ProB29胰岛素)(和一种以相同的剂量(0.5最大剂量)用U-500比较物Humulin?RU-500(EliLillyandC0.,Indianapolis,IN)和U-100比较物Humalog?和对照Humulin?(LillyLaboratories,Indianapolis,IN)。结果表明3个类似物[611/31、611/32]-1(?-膜岛素、[611/8、GIub31、GIub32]-KP-胰岛素和2-Br_PheB24-[GluA8、GIub31、GIub32]-KP-胰岛素各自表现出至少与Humulin?RU-500同样高的效力并具有比Humulin?RU-500更快的药效学。[0065]还如下评价谷氨酸-稳定的胰岛素类似物相对于由EliLilly&Co生产的对照胰岛素产品的比较药效学特性:浓度U-500的野生型普通胰岛素制剂(LillyHumulinU-500R)和浓度U-100的膳食胰岛素类似物赖脯胰岛素(LillyHumalogU-100R)。由于猪在它们对胰岛素的敏感性和关于它们的皮肤的吸收特性方面是变化的，在同一猪中进行比较；因此使用一批独立的猪。数据示于图7A-7E中，并且求出的H)参数概述于表1A-1E中。如所期望的，对照研究证实LillyHumulinU-500R的F1D曲线相对于LillyHumalogU-100R有显著的延长，如在图7A中所图示的。通过比较，LillyHumulinU-500R的H)特性类似于赖脯胰岛素(当以3.0mM的蛋白浓度，即以对应于LillyHumulinU-500R的浓度和制剂中配制时)的特性(数据未示出)。这样的类似性指明赖脯胰岛素{lispro)修饰不能保护类似物六聚体以避免较高级的自组装，发现与在类似物的晶体结构中的此类六聚体之间的天然-样晶格接触一致(Ciszak,見.等Structure--,615-22(1995))。[0066]表IAAIJCSTmaxIf期WTmax后期,Imux(mills),■my.Wmur).(fuinsiiiiuitxs}WT1:-500ICiW152220520(IUiiidog251173ISO丨214:通过GIub31和GIub32的B链酸性延伸与KP修饰组合(如本领域已知的在B28位和B29位)一起产生一种新的胰岛素类似物(命名为“Hexalog”)，其以极高的蛋白浓度快速起效。图7B-7D和表1B-1D显示，[GIub31,GIub32]-KP-胰岛素在3.0mM的蛋白浓度时的PD特性显著快于LillyHumulinU-500R且无延长的尾部。曲线下面积提示这种制剂的浓度为至少U-500。[0067]表IB++AVCV4T_ax前期.14Tm?后期,Tmax(Iiiiiwl(nig/kf/n?in*)《咖iitsj.|mins|ItexaIegV-5m25￥)41120204IluiiialogI'-100200848120233WT1:-5002189100180342表ICAl]1:ViTniiijoitΛTmnxif期,,Tina*(mins)(mg/kg/ηι?η)(iiiins)HexaJogl；-50§ITO58917(1214WTU-SCM)2293104210330表IDAI；C:?4TnwiT翁期%Tmax后期,Γη_細雇_(ing/fcg/niin)<mias)(m--is)IleialogI1-SOO381230SO204WTl1-500287277180274图7E和表1E提供用于修饰的谷氨酸-稳定的胰岛素类似物的类似数据，其中4-Cl-PheB24修饰(即，PheB24的芳族环对位的氯取代)伴有取代[G1uA8、G1uB31、G1uB32]-KP-胰岛素。虽然不希望以任何具体理论的可专利性为条件，4-Cl-PheB24修饰被认为进一步加速六聚体解体，超出了在B28位和B29位的KP修饰所影响的速度。认为GIua8修饰进一步提高六聚体之间的静电排斥并且还增强单体的化学和物理稳定性，从而延迟降解。[0068]表1E【权利要求】1.一种胰岛素分子，其包含含有2-残基延伸GIub31和GIub32的胰岛素B链多肽，并任选包含含有取代GIua8的胰岛素A链。2.权利要求1的胰岛素类似物，其中B链多肽另外包含在B28位、B29位或两者上的取代。3.权利要求2的胰岛素类似物，其中B链多肽另外包含取代AspB28。4.权利要求2的胰岛素类似物，其中B链多肽另外包含取代LysB28和ProB29。5.权利要求2的胰岛素类似物，其中B链多肽另外包含取代GluB29。6.权利要求1的胰岛素类似物，其中B链多肽另外包含非-标准的B24取代。7.权利要求1-6中任一项的胰岛素类似物，其中B链多肽另外包含在B24位的选自环己烷基丙氨酸、五氟-苯丙氨酸、邻-单氟-苯丙氨酸、邻-单氯-苯丙氨酸和邻-单溴-苯丙氨酸的取代。8.权利要求1或权利要求2的胰岛素类似物，其中B链多肽另外包含在B29位的选自正亮氨酸、氨基丁酸、氨基丙酸、鸟氨酸、二氨基丁酸和二氨基丙酸的非-标准取代。9.权利要求1的胰岛素类似物，其中类似物是哺乳动物胰岛素的类似物。10.权利要求1的胰岛素类似物，其中类似物是人胰岛素的类似物。11.编码权利要求1-10中任一项的胰岛素类似物的核酸。12.编码权利要求6的胰岛素类似物的核酸，其中在24位的非-标准氨基酸由终止密码子编码。13.权利要求21的核酸，其中终止密码子是核酸序列TAG。14.一种表达载体,其包含权利要求11-13中任一项的核酸序列。15.一种用权利要求14的表达载体转化的宿主细胞。16.一种降低患者的血糖水平的方法，所述方法包括给予患者生理学上有效量的胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐，其中胰岛素类似物或其生理学上可接受的盐包含掺入2-残基延伸GIub31-GIub32的B链多肽。17.一种降低患者的血糖水平的方法，所述方法包括给予患者生理学上有效浓度的权利要求1-10中任一项的胰岛素类似物，或其生理学上可接受的盐，其溶于药物制剂中，所述药物制剂含有0.6-3.0mM胰岛素类似物。18.一种降低患者的血糖水平的方法，所述方法包括给予患者生理学上有效浓度的权利要求1-10中任一项的胰岛素类似物，或其生理学上可接受的盐，其溶于含有5-10mM浓度范围内的乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)的药物制剂中。19.一种治疗患者的方法，包括权利要求27的制剂，其中胰岛素溶液通过注射器、笔式装置皮下注射，或通过泵连续地注射。【文档编号】C07K7/00GK104168911SQ201380015458【公开日】2014年11月26日申请日期:2013年1月22日优先权日:2012年1月20日【发明者】M.A.维斯申请人:卡斯西部储备大学