专利名称：：一种基于细胞核酸结合蛋白基因沉默的抑制肿瘤细胞生长新方法
技术领域：
：本发明涉及一种新型的抑制肿瘤细胞生长的方法，该方法能够在体外抑制人肿瘤细胞的生长。该方法为肿瘤发生机理的研究提供了一个方便的途径，为抗肿瘤的基因治疗研究提供了潜在的靶点。
背景技术：
：在全球范围内，恶性肿瘤的死亡率高居榜首。在细胞生物学领域，一般认为肿瘤的发生是细胞增殖失控所致。正常细胞的增殖受到一系列调控因子的复杂调控，如果有一个或多个调控因子不能正常工作，就可能会引起细胞增殖的紊乱。通过基因治疗的方法来治疗胂瘤一直是科学家们努力的方向，基因治疗的作用靶点多选择对细胞增殖具有重要调控作用的转录调节因子，通过分子生物学的手段来纠正肿瘤发生相关因子的异常行为达到治疗肿瘤的目的。细胞核酸结合蛋白(cellularnucleicacid-bindingprotein,CNBP)正是一个在细胞增殖中处于枢纽调控位置的基因，与肺瘤发生有着密切关系，是一个潜在的基因治疗靶点。细胞核酸结合蛋白是一个含有7个锌指结构的19kD蛋白，1989年首次克隆到了人CNBP。随后的十几年里研究人员又相继克隆出了小鼠、大鼠、鸡、爪蟾、斑马鱼等脊推动物的CNBP。CNBP在进化过程中具有高度的保守性，脊推动物CNBP的氨基酸序列同源性高达80%以上，高度保守性提示它具有重要的生物学功能。近十几年的研究表明，CNBP可以通过调控c-MYC基因来促进细胞增殖。在常见人肿瘤细胞中，CNBP均有较高表达。CNBP可能是调节细胞增殖的枢纽性调控因子。RM干扰技术可以方便快捷的实现特定基因表达下调，是继基因敲除与反义核酸技术后又一种有效的基因沉默方法。含有千扰序列的重组质粒可在哺乳动物细胞内稳定表达茎环结构的RM,茎环结构的RNA被进一步加工成siRMs,从而干扰目的基因，造成RNA水平上的基因沉默。本发明构建了针对细胞核酸结合蛋白的RM干扰质粒，转染人宫颈癌细胞HeLa细胞系，有效抑制了肿瘤细胞的生长。
发明内容本发明选取细胞核酸结合蛋白为靶基因，利用RNA干扰技术使该基因沉默，创建了一个有效的抑制体外胂瘤细胞生长的方法。本发明在细胞核酸结合蛋白基因的编码区选取翻译起始位点后的第392-410位作为干扰乾位点，合成了可形成茎环结构的寡聚核苷酸序列，通过分子生物学方法获得了含有该茎环结构的真核干扰质粒。将干扰质粒转染入人宫颈癌细胞HeLa细胞系中。半定量RT-PCR和蛋白杂交分析技术显示，干扰细胞抹中CNBP的mRNA水平和蛋白表达水平有了明显下降，即CNBP基因被有效的沉默了。通过测定生长曲线，发现HeLa细胞的生长速度明显低于对照组。利用流失细胞仪分析了细胞周期，结果显示HeLa细胞在CNBP基因沉默后S期细胞减少，G!期细胞增多，表明HeLa细胞的增殖受到抑制。本发明提出的技术路线可以进一步应用于不同组织来源的肿瘤细胞和不同的肿瘤相关基因，可以用来研究肿瘤的发生机制，寻找用于抗肺瘤的基因治疗的理想靶点。下面结合附图对本发明作进一步详细描述。图1:本发明中选择的干扰靶位点。图2:CNBP基因沉默后HeLa细胞的生长速度明显低于对照组。图3:CNBP基因沉默后HeLa细胞中S期细胞减少，G!期细胞增多，表明增殖受到抑制。干扰靶位点的核酸序列GCACCAAAGTGAAGTGCTA具体实施例方式在下面的实施例中进一步说明了本发明，但并不限制本发明的范围。实施例1本发明中使用的引物序列及用途<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2真核干扰质粒的构建将引物RMi-F,RNAi-R分别溶于双蒸水中，调浓度至l吗/pl。在50|al体系中加入每个引物各2nL,双蒸水469(TC放置5min，緩慢降温至37'C,然后37'C退火1h使之形成双链。将双链与经勘/z;HI和A7/7dIII酶切的Ambion/^司pSilencer3.1-H1neo载体连接，转化感受态DH5a细菌，然后涂布于含氨卞青霉素的LB固体培养基上，37度培养12小时。挑选单克隆进行酶切鉴定(引物-没计时阳性克隆的勘/rflI和III酶切位点将辆7皮坏，即勘/ziHI和#//dIII切不开的为阳性克隆)。阳性克隆培养于LB液体培养基，提取质粒，通过测序确定序列。实施例3质粒DM的大量制备(采用北京威格拉斯生物技术公司质粒大量提取纯化试剂盒)1)收集过夜培养菌100ml,4°C6000rpm离心10min，弃去上清。2)加入溶液I5ml，充分震荡菌体沉淀，使其完全分散。将细菌悬液移入50ml离心管中。3)加入溶液II5ml，轻轻颠倒离心管6一8次，室温放置5min,使菌体完全裂解，溶液变透明。4)加入溶液III5ml，立即颠倒离心管6_8次，充分混匀，至白色絮状物产生，水上放置10一15min。5)4'C13000rpm离心15min,用3层无菌纱布过滤上清于另一离心管中。6)加入10ml异丙醇，充分混匀，冰上^C置15min。7)4°C13000rpm离心10min,弃去上清，倒置轻轻沥干残余液体，加入0.5ml溶液I，充分溶解沉淀。移入新的1.5ml离心管，室温放置20min。8)室温12000rpm离心2min,上清移入新的L5ml离心管。9)加入100^1杂质清除液A,轻轻混匀，12000rpm离心2min,上清移入新的1.5ml离心管。10)再次加入100^1杂质清除液A，轻轻混匀，12000rpm离心5min，上清移入新的1.5ml离心管。11)加入70^1杂质清除液B，轻轻混匀，12000rpm离心5min,上清移入新的1.5ml离心管。12)加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min,12000rpm离心10min,弃去上清，用70°/乙醇轻轻洗涂，弃去液体，室温倒置晾干5min。3)加入0.5raTE溶解沉淀。14)加入200nl杂质清除液C,混匀后水上放置30min,12000rpm离心10min,弃去上清，用70%乙醇轻轻洗涤2次，室温倒置晾干5min使乙醇完全挥发。15)加入100—200nlTE溶解沉淀。实施例4脂质体介导的真核细胞转染处于对数生长期的细胞以105细胞/孔接种于24孔细胞培养板中，长到70-80%汇合时，可用于转染。转染前2h换入50(^1新鲜的无双抗的DMEM培养基。转染时，在1.5ml离心管A管中加入50jxl无双抗、无血清的培养基和0.8-1.2叫质粒，在另一B管中加入50nl无双抗、无血清的培养基和2(UInvitrogen公司Lipofectamine2000试剂，将A和B两管轻轻混匀，室温放置30min后，将混合物逐滴緩慢加到培养板中，轻轻混匀，培养12-16h后，换新鲜培养基。细胞转染24-48h后，用含新霉素(600吗/ml)的培养基培养，3天一换液，筛选2-4周。实施例5细胞生长曲线的测定取对数生长期细胞，lxl0"田胞/孔接种于24孔板中，分别于0、2、4、6天计数，3个复孔，作生长曲线。实施例6利用流式细胞仪分析细胞周期取对数生长期细胞，磷酸盐緩沖液PBS洗2次，1000rpm离心lOtnin,弃上清，留0.2ml左右PBS重悬细胞，加入lml70°/。乙醇于4'C固定8h以上，1500rpm离心10min,弃上清，细胞沉淀用PBS洗两次，留O.2mlPBS，加入终浓度为50吗/mlRnaseA,37XM呆温30-45min,水浴1rain,加入终浓度为65吗/ml碘化丙锭，4'C避光染色30min,流式细胞仪分析细胞周期。权利要求1.一种基于细胞核酸结合蛋白基因(CNBP)沉默的抑制肿瘤细胞生长的方法，该方法包括以下步骤(1)将化学合成的含有CNBP干扰靶位点的引物退火获得含有茎环结构的插入序列；(2)将插入序列构建到真核质粒pSilencer3.1-H1中；(3)利用脂质体将干扰质粒转染到人乳腺癌细胞HeLa细胞系，并进行稳定筛选；(4)测定细胞生长曲线和细胞周期来判断细胞生长是否受抑制。2.—种含有权利要求1所述的CNBP干扰靶位点的真核表达载体，是pSilencer3.1-HI-CNBP。3.—种含有权利要求2所述表达栽体的原核重组菌。4.根据权利要求3所述的重组菌，其中所述的重组菌是含有重组质粒的重组大肠杆菌BL21-CNBP。5.—种含有权利要求1所述的CNBP干扰靶位点核酸序列(具体序列见说明书)。6.—种含有权利要求2所述表达栽体的重组HeLa细胞抹。7.根据权利要求6所述的重组HeLa细胞抹，其中所述的重组HeLa细胞抹是含有重组质粒pSilencer3.1-H1-CNBP的重组HeLa细胞林HeLa-CNBP。全文摘要本发明涉及一种新型的抑制肿瘤细胞生长的方法，该方法能够在体外抑制人肿瘤细胞的生长。本发明在细胞核酸结合蛋白基因的编码区选取干扰靶位点，构建了针对该位点的真核干扰质粒，将干扰质粒转染入人宫颈癌细胞HeLa细胞系中，沉默了CNBP基因，明显抑制了HeLa细胞的生长。本发明提出的技术路线可以进一步应用于不同组织来源的肿瘤细胞和不同的肿瘤相关基因，该方法为肿瘤发生机理的研究提供了一个方便的途径，为抗肿瘤的基因治疗研究提供了潜在的靶点。文档编号A61K48/00GK101422619SQ20071016526公开日2009年5月6日申请日期2007年11月2日优先权日2007年11月2日发明者张世馥,锋杨申请人:中国医学科学院基础医学研究所