肺炎链球菌的蛋白质和核酸分子的制作方法

专利名称：肺炎链球菌的蛋白质和核酸分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及源自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的蛋白质，编码该蛋白质的核酸分子，该核酸和/或蛋白质作为抗原/免疫原的用途和在检测/诊断中的用途，以及筛选作为潜在抗-微生物靶的蛋白质/核酸序列的方法。
肺炎链球菌常被称为肺炎球菌，它是一种重要的致病微生物。在发展中国家和发达国家，肺炎链球菌感染在人类疾病中始终占有重要地位，有关专家已对此进行过评述(Fiber，G.R.，科学，2651385-1387(1994))。据信在世界范围内，该微生物是急性呼吸道感染最常见的致病菌，估计每年可导致1百万名儿童死亡，其中的大多数为发展中国家的儿童(Stansfield，S.K.，儿科传染病，6622(1987))。在美国，有人提出(Breiman等，Arch.Intern.Med.，1501401(1990))肺炎球菌仍是细菌性肺炎最常见的致病菌，在儿童，老年人和患有易感染疾病，如无脾症，心脏病，肺病和肾病，糖尿病，酒精中毒的患者，或患有免疫抑制疾病，如AIDS的患者中，细菌性肺炎的发病率特别高。这些人群患肺炎球菌败血症和(因此患)脑膜炎的风险较高，因此死于肺炎球菌感染的风险较大。肺炎球菌也是中耳炎和鼻窦炎的致病菌，在发达国家的儿童中这两种病一直是流行感染，并且带来很大的花费。
最近，青霉素-抗性肺炎球菌的出现使得对有效预防肺炎球菌感染之策略的需要日趋迫切。据报道，在美国12个州的13家医院中，6.6％的肺炎球菌分离株对青霉素具有抗性，一些分离株也对其它抗生素，包括第三代环孢菌素具有抗性(Schappert，S.M.，国家疾病防治中心/健康状况统计中心的人口和健康状况统计数据，2141(1992))。在某些医院，青霉素抗性的比例更高(达20％)(Breiman等，美国医学会志，2711831(1994))。由于肺炎球菌的青霉素抗性是在青霉素保持较好疗效几十年之后，近期突然出现的，因此这些发现令人恐慌。
鉴于上述理由，必须致力于改良预防，控制，诊断或治疗肺炎球菌疾病的方法。
已采用多种方法提供预防肺炎球菌感染所用的疫苗。根据微生物周围的多糖荚膜结构可将其分为不同的血清型(至少90种)，由此产生多个难题。针对单个血清型的疫苗对其它血清型无效，这意味着疫苗必须包括所有血清型的多糖抗原才能在大多数情况下有效。有人发现当荚膜多糖(各自决定着血清型，并且是主要的保护性抗原)被纯化并用作疫苗时，不能在两岁以下的儿童体内可靠地诱导保护性抗体应答，而该年龄组恰恰是侵害性肺炎球菌感染和脑膜炎的发病率最高的人群。
使用荚膜抗原方法的改良依靠多糖与蛋白质的缀合，从而特别地通过赋予应答依赖于T-细胞的特征而获得增强的免疫应答。该方法已被用于开发例如抗流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的疫苗。然而，有关多重多糖疫苗和基于缀合物的疫苗的花费仍是争论的焦点。
第三种方法是寻找其它具有成为候选疫苗之潜力的抗原组分。在本发明中，我们提供了一组蛋白质抗原，所述抗原是分泌/输出蛋白质。
因此，第一方面，本发明提供了肺炎链球菌的蛋白质或多肽，其具有选自表2所示的序列。
所提供的本发明的蛋白质或多肽可以是基本上纯的形式。例如，可以是基本上不含其它蛋白质的形式。
在优选的实施方案中，提供了具有表3所示氨基酸序列的蛋白质或多肽。
本发明包括由本文表1所示核酸序列编码的任何蛋白质。
如本文所述，本发明的蛋白质和多肽可用作抗原物质。所述物质可以是“抗原性的”和/或“免疫原性的”。通常，“抗原性的”是指蛋白质或多肽能被用于产生抗体，或者实际上能在受试者体内诱导抗体应答。“免疫原性的”是指蛋白质或多肽能在受试者体内引发保护性免疫应答。因此，在后一种情况下，蛋白质或多肽不仅能产生抗体应答，还能产生不基于抗体的免疫应答。
本领域技术人员应懂得本发明蛋白质或多肽的同系物或衍生物也可用于本发明的上下文，即用作抗原性的/免疫原性的物质。因此，本发明还包括例如具有一个或多个添加，缺失，取代等的蛋白质或多肽。另外，可以用一种氨基酸取代另一种相似“类型”的氨基酸。例如，用一种疏水氨基酸取代另一种疏水氨基酸。可以使用程序(如CLUSTAL程序)比较氨基酸序列。该程序可比较氨基酸序列，并通过适当时在任一序列中插入间隔找到最佳序列对比。可以计算最佳序列对比的氨基酸同一性或相似性(同一性加上氨基酸类型的保守性)。诸如BLASTx的程序会对比最长的一段相似序列并指定符合值。因此，可以得到比较结果，在其中可以发现几个相似性区域，它们各自具有不同的评分值。本发明希望进行这两种类型的分析。
对同系物和衍生物而言，与本文所述蛋白质或多肽的同一性程度较不重要，重要的是同系物或衍生物应该保持肺炎链球菌的抗原性或免疫原性。然而，提供与本文所述蛋白质或多肽具有至少60％相似性的同系物或衍生物(如上文所讨论)较为合适，优选提供具有至少70％相似性的同系物或衍生物，更优选提供具有至少80％相似性的同系物或衍生物，最优选提供具有至少90％或甚至95％相似性的同系物或衍生物。
在另一种方法中，同系物或衍生物可以是融合蛋白，其中掺入的组成成分通过例如有效地标记所需蛋白质或多肽而使纯化变得更容易。必需除去“标记物”，或者，事实上融合蛋白自身应该保留足够的抗原性以使其有用。
在本发明的另一方面，提供了本发明蛋白质或多肽，或其同系物或衍生物的抗原性/免疫原性片段。
就本文所述蛋白质或多肽，或其同系物或衍生物的片段而言，情况略有不同。众所周知，可以筛选抗原性蛋白质或多肽以鉴定表位区域，即负责蛋白质或多肽的抗原性或免疫原性的区域。进行这种筛选的方法是本领域众所周知的，因此，本发明的片段应该包括一个或多个所述表位区域，或者与所述区域足够相似以保留其抗原性/免疫原性。因此，对于本发明的片段而言，同一性程度可能是不相关的，因为它们可以与本文所述的蛋白质或多肽，同系物或衍生物的特定部分100％相同。同样，主要的问题是片段必须保留抗原性/免疫原性。
因此，对于由蛋白质或多肽衍生得到的同系物，衍生物和片段而言，重要的是它们应具有其衍生自的所述蛋白质或多肽的至少部分抗原性/免疫原性。
可使用基因克隆技术提供基本上纯的本发明蛋白质。所述技术公开于例如Sambrook等，分子克隆，第2版，冷泉港实验室出版社(1989)。因此，第四方面，本发明提供了核酸分子，其含有下列序列或由下列序列组成(i)表1所示的任何DNA序列或其RNA等同物；(ii)与(i)中的任一序列互补的序列；(iii)与(i)或(ii)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列；(iv)与(i)，(ii)和(iii)中的任一序列基本上相同的序列；(v)编码表1所限定蛋白质的同系物，衍生物或片段的序列。
第五方面，本发明提供了核酸分子，其含有下列序列或由下列序列组成(i)表4所示的任何DNA序列或其RNA等同物；(ii)与(i)中的任一序列互补的序列；(iii)与(i)或(ii)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列；(iv)与(i)，(ii)和(iii)中的任一序列基本上相同的序列；(v)编码表4所限定蛋白质的同系物，衍生物或片段的序列。
本发明的核酸分子包括多个这种序列和/或片段。本领域技术人员应懂得本发明包括本文所例举的新的特定核酸分子的新变体。本发明包括这种变体。所述变体可以是天然变体，例如由于菌株变异而产生的变体。例如，包括添加，取代和/或缺失。另外，特别是当使用微生物表达系统时，人们希望通过利用表达所用特定生物体中已知的偏好使用的密码子来改造核酸序列。因此，本发明的范围内也包括合成的或非-天然的变体。
上文所用术语“RNA等同物”表示给定的RNA分子具有的序列与给定DNA分子的序列互补(允许在RNA遗传密码中用“U”替代“T”)。
当比较核酸序列以测定同源性或同一性程度时，可以使用例如BESTFIT和GAP(皆得自Wisconsin Genetics Computer Group(GCG)软件包) BESTFIT程序比较两个序列，产生最相似区段的最佳序列对比。GAP能使序列沿着其全长进行对比，并通过适当时在任一序列中插入间隔找到最佳序列对比。在本发明的上下文中，当讨论核酸序列的同一性时，适于通过沿着全长序列进行序列对比来比较序列。
优选基本上相同的序列与所述序列具有至少50％的序列同一性，更优选具有至少75％的序列同一性，更优选具有至少90％或至少95％的序列同一性。在某些情况下，序列同一性可以是99％或以上。
优选地，术语“基本上相同”表示相对于所述序列与现有技术的核酸序列的同一性程度而言，所述序列与本文所述任一序列的同一性程度更高。
然而，应该指出当本发明的核酸序列编码至少部分新基因产物时，本发明范围内包括编码基因产物或其新的部分的所有可能的序列。
核酸分子可以是分离的形式或重组的形式。可以将其掺入载体，载体可被掺入宿主。所述载体和适当的宿主构成本发明的另一方面。
因此，例如，通过使用基于本文所提供的核酸序列的探针，可以鉴定肺炎链球菌的基因。使用限制性酶可以切下这些基因，将其克隆至载体，再将载体导入适当宿主以进行表达。
通过使用与核酸分子的部分序列互补的适当探针，可以从肺炎链球菌中得到本发明的核酸分子。可使用限制性酶或超声处理技术得到适当大小的片段以用作探针。
或者，可使用PCR技术扩增所需的核酸序列。因此，可使用本文提供的序列资料设计两个引物用于PCR，从而使所需序列，包括完整基因或其片段被靶向，随即被高水平地扩增。正常情况下，一个引物对位于DNA分子的一条链上的第一序列具有高水平的特异性，另一个引物对位于DNA序列互补链上的第二序列具有高水平的特异性，所述第二序列与第一序列的互补序列相隔一段距离。
引物一般至少为15至25个核苷酸长。
另一种方法是使用化学合成，该方法可以实行自动化。可以化学合成相对较短的序列，再相互连接形成较长的序列。
另一方面，本发明提供了免疫原性/抗原性的组合物，该组合物含有一种或多种具有选自表2-4所示序列之序列的蛋白质或多肽或其同系物或衍生物，和/或它们中的任一个的片段。在优选的实施方案中，免疫原性/抗原性的组合物是疫苗，或者可用于诊断试验。
就疫苗而言，它可包括适当添加的赋形剂，稀释剂，佐剂等。多个具体实例是本领域众所周知的。
也可以使用表1所示的核酸序列制备所谓的DNA疫苗。因此，本发明也提供了含有一种或多种本文所定义的核酸序列的疫苗组合物。本领域中已有人描述过这种DNA疫苗的用途，例见Donnelly等，免疫学年评，15617-648(1997)。
如上所述，在检测/诊断肺炎链球菌的方法中，可以使用本文所述的蛋白质或多肽，其同系物或衍生物，和/或它们中的任一个的片段。检测受试者体内存在的抗所述蛋白质的抗体，以此为基础建立上述方法。因此，本发明提供了检测/诊断肺炎链球菌的方法，所述方法包括使受试样品与至少一种本文所述的蛋白质或其同系物，衍生物或片段接触的步骤。优选样品为生物样品，如得自待测受试者的组织样品或血样或唾液。
在另一种方法中，可使用本文所述的蛋白质，或其同系物，衍生物和/或片段产生抗体，反过来，所述抗体可用于检测抗原，因而可检测肺炎链球菌。所述抗体构成本发明的另一方面。本发明范围内的抗体可以是单克隆或多克隆抗体。
当将本文所述的蛋白质，或其同系物，衍生物或片段注射至适当动物宿主(如小鼠，大鼠，豚鼠，兔，绵羊，山羊或猴)体内时，通过刺激抗体生成即可使动物产生多克隆抗体。必要时，可同时使用佐剂和蛋白质。众所周知的佐剂包括弗氏佐剂(完全和不完全佐剂)和氢氧化铝。然后，利用抗体与本文所述蛋白质的结合即可纯化抗体。
单克隆抗体可由杂交瘤产生。通过融合骨髓瘤细胞和产生所需抗体的脾细胞以形成无限增殖的细胞系即可形成杂交瘤。因此，可使用众所周知的Kohler & Milstein技术(自然，256(1975))或在此技术的基础上进行改动的技术。
目前，生产与特定多肽/蛋白质结合的单克隆和多克隆抗体的技术已是本领域的成熟技术。有关讨论可参见标准的免疫学课本，例如Roitt等，免疫学，第2版(1989)，Churchill Livingstone，伦敦。
除了完整的抗体外，本发明还包括该抗体的衍生物，所述衍生物能与如本文所述的蛋白质等结合。因此，本发明包括抗体片段和合成构建体。抗体片段和合成构建体的例子可参见Dougall等，Tibtech 12372-379(1994年9月)。
抗体片段包括例如Fab，F(ab’)2和Fv片段。Fab片段(这些片段在Roitt等[文献同上]中讨论)。可修饰Fv片段以产生已知为单链Fv(scFv)分子的合成构建体。该分子包括与Vh和Vl区共价连接的肽接头，它对分子的稳定性有所贡献。可以使用的其它合成构建体包括CDR肽，它们是含有抗原-结合决定簇的合成肽。也可使用模拟肽，这些分子通常是构象受限的有机环，它能模拟CDR环的结构，并包括能与抗原相互作用的侧链。
合成构建体包括嵌合分子。因此，例如，本发明范围内还包括人源化(或灵长动物化)抗体或其衍生物。人源化抗体的例子是具有人构架区和啮齿动物高变区的抗体。产生嵌合抗体的方法可参见例如Morrison等，PNAS，81，6851-6855(1984)和Takeda等，自然，314，452-454(1985)。
合成构建体还包括含有其它组成成分的分子，所述其它成分可为分子提供一些除抗原结合特性之外的所需特性。例如，所述组成成分可以是标记物(例如荧光或放射性标记)。或者，也可以是药物活性剂。
抗体或其衍生物可用于检测/诊断肺炎链球菌。因此，另一方面，本发明提供了检测/诊断肺炎链球菌的方法，所述方法包括使受试样品与抗体接触的步骤，所述抗体能结合一种或多种本文所述的蛋白质，或其同系物，衍生物和/或片段。
另外，可使用所谓的”“亲和体”。这些亲和体是选自α-螺旋细菌受体结构域之组合文库的结合蛋白(Nord等)。因此，可使用组合文库法选择能与不同靶蛋白质特异性结合的小蛋白质结构域。
显然，可使用本文所述的核酸序列检测/诊断肺炎链球菌。因此，另一方面，本发明提供了检测/诊断肺炎链球菌的方法，所述方法包括使受试样品与至少一种本文所述的核酸序列接触。优选样品为生物样品，如得自待测受试者的组织样品或血样或唾液。在用于本发明的方法之前，可对样品进行预处理。因此，例如，可处理样品以提取DNA。然后使用基于本文所述核酸序列(通常为该序列的片段)的DNA探针检测肺炎链球菌的核酸。
在其它方面，本发明提供了(a)免疫接种受试者以防肺炎链球菌的方法，所述方法包括给受试者施用本发明的蛋白质或多肽，或其衍生物，同系物或片段，或本发明的免疫原性组合物的步骤；(b)免疫接种受试者以防肺炎链球菌的方法，所述方法包括给受试者施用本文所定义的核酸分子的步骤；(c)预防或治疗肺炎链球菌感染的方法，所述方法包括给受试者施用本发明的蛋白质或多肽，或其衍生物，同系物或片段，或本发明的免疫原性组合物的步骤；(d)预防或治疗肺炎链球菌感染的方法，所述方法包括给受试者施用本文所定义的核酸分子的步骤；(e)用于检测/诊断肺炎链球菌感染的试剂盒，其包括一种或多种本发明的蛋白质或多肽，或其同系物，衍生物或片段，或本发明的抗原性组合物；和(f)用于检测/诊断肺炎链球菌感染的试剂盒，其包括一种或多种本文所定义的核酸分子。
即使我们已鉴定出一组重要的蛋白质，所述蛋白质是抗微生物疗法的潜在靶标。然而仍必需测定每个蛋白质是否是微生物存活所必需的。因此，本发明也提供了测定本文所述蛋白质或多肽是否为潜在的抗微生物靶标的方法，所述方法包括灭活所述蛋白质，并在体外或体内测定肺炎链球菌是否仍旧存活。
灭活蛋白质的适当方法是实行选定的基因敲除，即阻止蛋白质的表达并测定是否会导致致死性改变。进行所述基因敲除的适当方法描述于Li等，美国国家科学院院报，9413251-13256(1997)。
最后一方面，本发明提供了能拮抗，抑制或要不然干扰本发明蛋白质或多肽的功能或表达的药剂用于制备药物的用途，所述药物可用于治疗或预防肺炎链球菌感染。
以下将参照实施例描述本发明，不应将实施例看成是以任何方式限制本发明。实施例中参照的附图为

图1显示出多种DNA疫苗试验的结果；和图2显示出另一些DNA疫苗试验的结果。
使用FastA和TfastA法，检索本地肺炎球菌数据库中的推定前导序列或锚序列特征。使用相关序列询问(interrogate)比较新的序列。它们是
(i)已描述的肺炎链球菌前导序列(得自蛋白质NanA，NanB，LytA，PapA，pcpA，PsaA和PspA)；(ii)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)分泌型蛋白质Usp45的前导序列；(iii)检索(i)和(ii)所得的新的假拟前导序列；(iv)锚基元LPxTG，它是很多革兰氏阳性细菌表面蛋白质的共同特征，通过参与Sortase复合体蛋白的机理可锚着该基元。
以下将参照源自数据库的序列(见表I)提供该方法的例子。 不同的已知输出蛋白质的蛋白质前导序列被用作检索上述本地肺炎球菌数据库的起点。然后在一般性数据库，如EMBL，Swissprot等中对通过此检索发现的假拟蛋白质进行Blast检索。保留并解释仍然未知的肺炎球菌蛋白质。然后使用TfastA法，使用新的潜在的蛋白质前导序列为探针再次进行检索。
Zhang，D.，Yang，X.，Berry，J.Shen，C.，McClarty，G和Brunham，R.C.(1997)，“用主要外膜蛋白基因进行DNA免疫能诱导针对沙眼衣原体(小鼠肺炎)感染的获得性免疫力”，感染和免疫，176，1035-40。
Kurar，E和Splitter，G.A(1997)，“流产布鲁氏菌核糖体L7/L12基因的核酸免疫引发免疫应答”，疫苗，15，1851-57。
Ander，R.，Gao，X.M.，Papakonstantinopoulou，A.，Roberts，M和Dougan，G(1996)，“用编码破伤风毒素C片段的DNA免疫小鼠之后的免疫应答”，感染和免疫，64，3168-3173。制备DNA疫苗为使用LEEP系统得到的各个所需基因设计寡核苷酸引物。彻底检查各个基因，如果可能的话，应设计引物使其靶向据认为仅编码基因蛋白质的成熟部分的基因部分。我们希望当在哺乳动物细胞中表达时，表达仅编码靶基因蛋白质的成熟部分的那些序列会有利于蛋白质的正确折叠。例如，在大多数情况下，应设计引物以使克隆至pcDNA3.1表达载体的最终扩增产物不含推定的N-末端信号肽序列。信号肽将多肽前体经由蛋白质输出途径导向细胞膜，在此通过信号肽酶I(如果是脂蛋白，即为信号肽酶II)切下信号肽。因此，无论是呈现在细菌表面还是被分泌，信号肽都不构成成熟蛋白质的任一部分。当N-末端前导肽序列不是立即显而易见时，应设计引物以靶向整个基因序列以在pcDNA3.1中克隆并最终进行表达。
然而，已经说过蛋白质的其它特征也能影响可溶性蛋白质的表达和呈递。在设计寡核苷酸的过程中，应在编码所需蛋白质的基因中排除编码这些特征的DNA序列。这些特征包括1.LPXTG细胞壁锚着基元。
2.LXXC脂蛋白结合位点。
3.疏水性的C-末端结构域。
4.当不存在N-末端信号肽或LXXC时，应除去终止密码子。
5.当不存在疏水性C-末端结构域或LPXTG基元时，应除去终止密码子。
为感兴趣的各个基因设计适当的PCR引物，当设计这些引物时，应从基因中除去编码上述特征的任何和所有区域。引物被设计成具有适当的限制性酶位点，其后紧接着保守的Kozak核苷酸序列，(在所有情况下)使用的是GCCACC。Kozak序列有利于真核核糖体识别起始序列和位于所需基因插入物上游的ATG起始密码子。例如，使用BamHI位点的正向引物以GCGGGATCCGCCACCA TG起始，后面接着所需基因5’末端的一小段序列。设计反向引物以与正向引物相容，并在所有情况下与5’末端的NotI限制性位点(该位点是TTGCGGCCGC)相容。PCR引物下列PCR引物被设计用于扩增所需的截短基因。ID210正向引物5′CGGATCCGCCACCATGTCTTCTAATGAATCTGCCGATG3′反向引物5′TTGCGGCCGCCTGTTTAGATTGGATATCTGTAAAGACTT3′4172.5正向引物5′CGCGGATCCGCCACCATGGATTTTCCTTCAAATTTGGAGG 3′反向引物5′TTGCGGCCGCACCGTACTGGCTGCTGACT 3′ID211正向引物5′CGGATCCGCCACCATGAGTGAGATCAAAATTATTAACGC 3′反向引物5′TTGCGGCCGCCGTTCCATGGTTGACTCCT 3′4197.4正向引物5′CGCGGATCCGCCACCATGTGGGACATATTGGTGGAAAC3′反向引物5′TTGCGGCCGCTTCACTTGAGCAAACTGAATCC 3′4122.1正向引物5′CGCGGATCCGCCACCATGTCACAAGAAAAAACAAAAAATGAA 3′反向引物5′TTGCGGCCGCATCGACGTAGTCTCCGCC 3′4126.7正向引物5′CGCGGATCCGCCACCATGCTGGTTGGAACTTTCTACTATCAAT 3′反向引物5′TTGCGGCCGCAACTTTCGTCCCTTTTTGG 3′4188.11正向引物5′CGCGGATCCGCCACCATGGGCAATTCTGGCGGAA 3′反向引物5′TTGCGGCCGCTTGTTTCATAGCTTTTTTGATTGTT 3′ID209正向引物5′CGCGGATCCGCCACCATGCTATTGATACGAAATGCAGGG 3′反向引物5′TTGCGGCCGCAACATAATCTAGTAAATAAGCGTAGCC 3′ID215正向引物5′CGCGGATCCGCCACCATGACGGCGACGAATTTTC 3′反向引物5′TTGCGGCCGCTTAATTCGTTTTTGAACTAGTTGCT 3′4170.4正向引物5′CGCGGATCCGCCACCATGGCTGTTTTTCTTCGCTATCATG 3′反向引物5′TTGCGGCCGCTTTCTTCAACAAACCTTGTTCTTG 3′4193.1正向引物5′CGCGGATCCGCCACCATGGGTAACCGCTCTTCTCGTAAC 3′反向引物5′TTGCGGCCGCGCTTCCATCAAGGATTTTAGC 3′克隆从得自国家典型培养物保藏中心的4型肺炎链球菌菌株11886中分离基因组DNA，以此为模板经PCR扩增插入物以及具有上述特征的侧翼序列。用适当限制性酶切割PCR产物，使用常规分子生物学技术将其克隆至pcDNA3.1的多克隆位点。培养经适当作图的所需基因克隆，使用Plasmid Mega试剂盒(Qiagen)大规模分离质粒(＞1.5mg)。通过对各个构建体的每个大规模制品的5’克隆接头的约700个碱基对进行限制性图谱分析和测序，进一步证实基因的成功克隆和维持。菌株证实在克隆和攻击的方法中使用4型菌株，该菌株的肺炎链球菌基因组已被测序。4型肺炎链球菌菌株11886的均质实验室菌株冻干安瓿得自国家典型菌种保藏中心。打开安瓿，用0.5ml胰胨豆胨肉汤(0.5％葡萄糖，5％血液)重新悬浮培养物。在10ml胰胨豆胨肉汤(0.5％葡萄糖，5％血液)中传代培养悬浮液，于37℃静止保温过夜。在5％血液琼脂平板上划线此培养物以检查污染物并证实存活，在血液琼脂斜面上划线，使用其余培养物制备20％甘油原种。将斜面培养物送至公共卫生实验中心，经证实血清型为4型。
在5％血液琼脂平板上划线NCTC11886的甘油原种，于37℃在CO2气罐中保温过夜。制备新鲜的划线培养物并证实奥普托欣敏感性。肺炎球菌攻击经小鼠传代肺炎球菌培养物1次，从感染动物的血液中收集肺炎球菌，在肉汤中培养至预定的活菌数约为109cfu/ml，然后冷冻，从而制备出4型肺炎链球菌的标准接种冷冻培养物。制备的流程图如下划线肺炎球菌培养物并证实其身份↓在上述平板上培养4-5个菌落的过夜培养物↓用动物传代肺炎球菌培养物(腹膜内注射心取血以收集)↓培养经动物传代的肺炎球菌的过夜培养物↓由经动物传代的过夜培养物培养全天培养物(至预定的光密度)并于-70℃冷冻-这是标准的极限↓融化一等份标准的接种物以进行存活计数↓使用标准接种物以测定有效剂量(称之为毒力检测试验)
↓使用有效剂量的标准接种物进行随后所有的攻击用PBS将一等份标准的接种物稀释500倍，并用于接种小鼠。
使用卤代烷轻度麻醉小鼠，然后将剂量为1.4×105cfu的肺炎球菌施用于每个小鼠的鼻腔，小鼠的正常呼吸将有利于摄入肺炎球菌，让小鼠背朝下躺着等待恢复。肺炎链球菌疫苗试验通过给6周龄的CBA/ca小鼠(Harlan，UK)施用DNA而在小鼠中进行疫苗试验。将待免疫接种的小鼠分成6组，每组用重组pcDNA3.1+质粒DNA进行免疫接种，所述质粒DNA中含有所需的特定靶基因序列。将总共100μg溶于Dulbecco PBS(Sigma)中的DNA肌内注射至两腿的前胫骨肌(每条腿50μl)。4周后使用相同的方法进行加强免疫。为了进行比较，在所有疫苗试验中都包括对照组。这些对照组或者是未经免疫的动物，或者是按与上述相同的时间进程仅施用了非重组pcDNA3.1+DNA(假免疫)的动物。第二次免疫接种3周后，用致死剂量的肺炎链球菌血清型4(菌株NCTC11886)鼻内攻击所有小鼠组。通过在5％血液琼脂平板上平铺接种经连续稀释的接种物来监测所施用细菌的数目。鼻内免疫接种的问题是在一些小鼠中，接种物从鼻孔中象吹泡似地冒出来，在结果表中已注意到这个问题，并且在计算时已将此问题考虑在内。较不明显的问题是每只小鼠可能吞下了一部分接种物。假定对每只小鼠而言，被吞下去的量是相同的，在接种过程中将达到平均。然而，所使用的样品较少，这一问题将对一些实验产生显著影响。在感染后3或4天，杀死攻击后仍存活的所有小鼠。在感染过程中，监测被攻击的小鼠中与肺炎链球菌诱导-疾病的发作相关的症状发展情况。典型的症状依次包括立毛，逐渐增加的隆起体态，眼里流出排泄物，嗜睡和不愿动。后期的症状通常与濒死状态的产生一致，剔除濒死状态的小鼠以使它们不再遭受痛苦。据认为这些小鼠濒临死亡，使用剔除时间确定存活时间以进行统计学分析。当发现小鼠死亡时，存活时间被当成是经监测认为小鼠仍旧活着的最后的时间点。结果的解释如果被克隆并用于上述攻击实验的任何DNA序列能产生对抗攻击的保护作用，即为阳性结果。保护作用被看成是DNA序列能产生统计学上显著的保护作用(置信水平为95％(p＜0.05))，和使用Mann-Whitney发现的勉强或接近显著的保护作用，或显示出一些保护性特征，例如有一只或多只无关的小鼠或因为首次出现死亡的时间延长。当我们认为一些结果被使用鼻内感染的相关问题弄得模糊不清时，接近显著或非显著的结果被认为是潜在的阳性结果是可以接受的。疫苗试验2，7和8的结果(见图1)
*-当按此剂量免疫时，有一小部分象吹泡似地被冒出，因此可能未接受全部接种物。T-在实验结束时终止，没有感染症状。括号内的数字-不考虑所采用的不完全剂量的存活时间。P值1指的是与未经免疫的对照相比的显著性试验。统计学分析试验2-与未经免疫接种的对照相比，ID210免疫组具有较长的平均存活时间，但该结果在统计学上不是很显著。
试验7-与未经免疫接种的对照相比，4172.5免疫组显示出更长的存活时间，但是该差异不具有统计学显著性。
试验8-与未经免疫接种的对照相比，ID211免疫组的存活时间显著更长。4197.4，4122.1和4126.7免疫组显示出比未经免疫组更长的平均存活时间，但该结果在统计学上不显著。4197.4和4126.7组首次出现死亡的时间推迟，4122.1组显示出1个无关的结果。肺炎球菌攻击DNA免疫试验9-11的结果(见图2)
*-当按此剂量免疫时，有一小部分象吹泡似地被冒出，因此可能未接受全部接种物。T-在实验结束时终止，没有感染症状。括号内的数字-不考虑所采用的不完全剂量的存活时间。P值1指的是与未经免疫的对照相比的显著性试验。P值2指的是与经pcDNA3.1+免疫的对照相比的显著性试验。统计学分析试验9-尽管在统计学上没有意义，但与未经免疫的对照组相比，4188.11和ID209免疫组确实具有可察觉的较高的平均存活时间。
试验10-与pcDNA3.1+免疫组相比，未经免疫的对照组存活时间显著更长。与假免疫组相比，ID215和4170.4免疫组显示出具有统计学意义的更长的存活时间(p＝0.0168和0.0316)，但不能和未经免疫组相比。
试验11-4193.1免疫组是最令人满意的，其存活时间比pcDNA3.1+免疫组平均长6.5小时，比未经免疫组长6小时，但该结果统计学上不显著。表14101.1ATGGAAGAGTTAGTGACCTTAGATTGTTTGTTTATTGACAGAACTAAGATTGAAGCCAATGCCAACAAGTATAGTTTTGTGTGGAAGAAAACGACAGAGAAATTCTCCGCCAAACTTCAAGAACAGATACAGGTCTATTTTCAAGAAGAAATCACTCCCCTTCTGATTAAATATGCCATGTTTGATAAGAAACAAAAGAGAGGGTATAAAGAGTCAGCTAAAAACTTAGCGAATTGGCACTATAATGACAAGGAGGATAGCTACACACATCCTGATGGCTGGTATTATCGTTTTCACCATACCAAATATCAGAAAACACAGACAGACTTTCAACAAGAAATCAAGGTTTACTACGCCGACGAACCTGAATCAGCCCCTCAAAAGGGACTGTATATGAACGAACGCTATCAAAACTTGAAAGCTAAAGAATGTCAGGCGCTTTTATCTCCCCAAGGTAGACAGATTTTCGCTCAACGCAAGATTGATGTGGAACCTGTCTTTGGGCAGATAAAGGCTTCTTTGGGTTACAAGAGATGTAATCTGAGAGGGAAGCGTCAAGTGAGAATTGACATGGGATTGGTACTTATGGCCAATAACCTCCTAAAATATAGTAAAATGAAATAA4101.3ATGGGGAAAGGCCATTGGAATCGGAAAAGAGTTTATAGCATTCGTAAGTTTGCTGTGGGAGCTTGCTCAGTAATGATTGGGACTTGTGCAGTTTTATTAGGAGGAAATATAGCTGGAGAATCTGTAGTTTATGCGGATGAAACACTTATTACTCATACTGCTGAGAAACCTAAAGAGGAAAAAATGATAGTAGAAGAAAAGGCTGATAAAGCTTTGGAAACTAAAAATATAGTTGAAAGGACAGAACAAAGTGAACCTAGTTCAACTGAGGCTATTGCATCTGAGAAGAAAGAAGATGAAGCCGTAACTCCAAAAGAGGAAAAAGTGTCTGCTAAACCGGAAGAAAAAGCTCCAAGGATAGAATCACAAGCTTCAAATCAAGAAAAACCGCTCAAGGAAGATGCTAAAGCTGTAACAAATGAAGAAGTGAATCAAATGATTGAAGACAGGAAAGTGGATTTTAATCAAAATTGGTACTTTAAACTCAATGCAAATTCTAAGGAAGCCATTAAACCTGATGCAGACGTATCTACGTGGAAAAAATTAGATTTACCGTATGACTGGAGTATCTTTAACGATTTCGATCATGAATCTCCTGCACAAAATGAAGGTGGACAGCTCAACGGTGGGGAAGCTTGGTATCGCAAGACTTTCAAACTAGATGAAAAAGACCTCAAGAAAAATGTTCGCCTTACTTTTGATGGCGTCTACATGGATTCTCAAGTTTATGTCAATGGTCAGTTAGTGGGGCATTATCCAAATGGTTATAACCAGTTCTCATATGATATCACCAAATACCTTCAAAAAGATGGTCGTGAGAATGTGATTGCTGTCCATGCAGTCAACAAACAGCCAAGTAGCCGTTGGTATTCAGGAAGTGGTATCTATCGTGATGTGACTTTACAAGTGACAGATAAGGTGCATGTTGAGAAAAATGGGACAACTATTTTAACACCAAAACTTGAAGAACAACAACATGGCAAGGTTGAAACTCATGTGACCAGCAAAATCGTCAATACGGACGACAAAGACCATGAACTTGTAGCCGAATATCAAATCGTTGAACGAGGTGGTCATGCTGTAACAGGCTTAGTTCGTACAGCGAGTCGTACCTTAAAAGCACATGAATCAACAAGCCTAGATGCGATTTTAGAAGTTGAAAGACCAAAACTCTGGACTGTTTTAAATGACAAACCTGCCTTGTACGAATTGATTACGCGTGTTTACCGTGACGGTCAATTGGTTGATGCTAAGAAGGATTTGTTTGGTTACCGTTACTATCACTGGACTCCAAATGAAGGTTTCTCTTTGAATGGTGAACGTATTAAATTCCATGGAGTATCCTTGCACCACGACCATGGGGCGCTTGGAGCAGAAGAAAACTATAAAGCAGAATATCGCCGTCTCAAACAAATGAAGGAGATGGGAGTTAACTCCATCCGTACAACCCACAACCCTGCTAGTGAGCAAACCTTGCAAATCGCAGCAGAACTAGGTTTACTCGTTCAGGAAGAGGCCTTTGATACGTGGTATGGTGGCAAGAAACCTTATGACTATGGACGTTTCTTTGAAAAAGATGCCACTCACCCAGAAGCTCGAAAAGGTGAAAAATGGTCTGATTTTGACCTACGTACCATGGTCGAAAGAGGCAAAAACAACCCTGCTATCTTCATGTGGTCAATTGGTAATGAAATAGGTGAAGCTAATGGTGATGCCCACTCTTTAGCAACTGTTAAACGTTTGGTTAAGGTTATCAAGGATGTTGATAAGACTCGCTATGTTACCATGGGAGCAGATAAATTCCGTTTCGGTAATGGTAGCGGAGGGCATGAGAAAATTGCTGATGAACTCGATGCTGTTGGATTTAACTATTCTGAAGATAATTACAAAGCCCTTAGAGCTAAGCATCCAAAATGGTTGATTTATGGATCAGAAACATCTTCAGCTACCCGTACACGTGGAAGTTACTATCGCCCTGAACGTGAATTGAAACATAGCAATGGACCTGAGCGTAATTATGAACAGTCAGATTATGGAAATGATCGTGTGGGTTGGGGGAAAACAGCAACCGCTTCATGGACTTTTGACCGTGACAACGCTGGCTATGCTGGACAGTTTATCTGGACAGGTACGGACTATATTGGTGAACCTACACCATGGCACAACCAAAATCAAACTCCTGTTAAGAGCTCTTACTTTGGTATCGTAGATACAGCCGGCATTCCAAAACATGACTTCTATCTCTACCAAAGCCAATGGGTTTCTGTTAAGAAGAAACCGATGGTACACCTTCTTCCTCACTGGAACTGGGAAAACAAAGAATTAGCATCCAAAGTAGCTGACTCAGAAGGTAAGATTCCAGTTCGTGCTTATTCGAATGCTTCTAGTGTAGAATTGTTCTTGAATGGAAAATCTCTTGGTCTTAAGACTTTCAATAAAAAACAAACCAGCGATGGGCGGACTTACCAAGAAGGTGCAAATGCTAATGAACCTTTATCTTGAATGGAAAGTTGCCTATCAACCAGGTACCTTGGAAGCAATTGCTCGTGATGAATCTGGCAAGGAAATTGCTCGAGATAAGATTACGACTGCTGGTAAGCCAGCGGCAGTTCGTCTTATTAAGGAAGACCATGCGATTGCAGCAGATGGAAAAGACTTGACTTACATCTACTATGAAATTGTTGACAGCCAGGGGAATGTGGTTCCAACTGCTAATAATCTGGTTCGCTTCCAATTGCATGGCCAAGGTCAACTGGTCGGTGTAGATAACGGAGAACAAGCCAGCCGTGAACGCTATAAGGCGCAAGCAGATGGTTCTTGGATTCGTAAAGCATTTAATGGTAAAGGTGTTGCCATTGTCAAATCAACTGAACAAGCAGGGAAATTCACCCTGACTGCCCACTCTGATCTCTTGAAATCGAACCAAGTCACTGTCTTTACTGGTAAGAAAGAAGGACAAGAGAAGACTGTTTTGGGGACAGAAGTGCCAAAAGTACAGACCATTATTGGAGAGGCACCTGAAATGCCTACCACTGTTCCGTTTGTATACAGTGATGGTAGCCGTGCAGAACGTCCTGTAACCTGGTCTTCAGTAGATGTGAGCAAGCCTGGTATTGTAACGGTGAAAGGTATGGCTGACGGACGAGAAGTAGAAGCTCGTGTAGAAGTGATTGCTCTTAAATCAGAGCTACCAGTTGTGAAACGTATTGCTCCAAATACTGACTTGAATTCTGTAGACAAATCTGTTTCCTATGTTTTGATTGATGGAAGTGTTGAAGAGTATGAAGTGGACAAGTGGGAGATTGCCGAAGAAGATAAAGCTAAGTTAGCAATTCCAGGTTCTCGTATTCAAGCGACCGGTTATTTAGAAGGTCAACCAATTCATGCAACCCTTGTGGTAGAAGAAGGCAATCCTGCGGCACCTGCAGTACCAACTGTAACGGTTGGTGGTGAGGCAGTAACAGGTCTTACTAGTCAAAAACCAATGCAATACCGCACTCTTGCTTATGGAGCTAAGTTGCCAGAAGTCACAGCAAGTGCTAAAAATGCAGCTGTTACAGTTCTTCAAGCAAGCGCAGCAAACGGCATGCGTGCGAGCATCTTTATTCAGCCTAAAGATGGTGGCCCTCTTCAAACCTATGCAATTCAATTCCTTGAAGAAGCGCCAAAAATTGCTCACTTGAGCTTGCAAGTGGAAAAAGCTGACAGTCTCAAAGAAGACCAAACTGTCAAATTGTCGGTTCGAGCTCACTATCAAGATGGAACGCAAGCTGTATTACCAGCTGATAAAGTAACCTTCTCTACAAGTGGTGAAGGGGAAGTCGCAATTCGTAAAGGAATGCTTGAGTTGCATAAGCCAGGAGCAGTCACTCTGAACGCTGAATATGAGGGAGCTAAAGACCAAGTTGAACTCACTATCCAAGCCAATACTGAGAAGAAGATTGCGCAATCCATCCGTCCTGTAAATGTAGTGACAGATTTGCATCAGGAACCAAGTCTTCCAGCAACAGTAACAGTTGAGTATGACAAAGGTTTCCCTAAAACTCATAAAGTCACTTGGCAAGCTATTCCGAAAGAAAAACTAGACTCCTATCAAACATTTGAAGTACTAGGTAAAGTTGAAGGAATTGACCTTGAAGCGCGTGCAAAAGTCTCTGTAGAAGGTATCGTTTCAGTTGAAGAAGTCAGTGTGACAACTCCAATCGCAGAAGCACCACAATTACCAGAAAGTGTTCGGACATATGATTCAAATGGTCACGTTTCATCAGCTAAGGTTGCATGGGATGCGAT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权利要求
1.肺炎链球菌蛋白质或多肽，其具有选自表2所示序列的序列。
2.肺炎链球菌蛋白质或多肽，其具有选自表4所示序列的序列。
3.权利要求1或2的蛋白质或多肽，它以基本上纯的形式被提供。
4.与权利要求1至3中任一项所定义的基本上相同的蛋白质或多肽。
5.权利要求1至4中任一项所定义的蛋白质或多肽的同系物或衍生物。
6.一种表2-4中所定义的蛋白质或多肽的抗原性和/或免疫原性片段。
7.一种核酸分子，其含有下列序列或由下列序列组成(i)表1所示的任一DNA序列或其RNA等同物；(ii)与(i)中的任一序列互补的序列；(iii)与(i)或(ii)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列；(iv)与(i)，、(ii)和(iii)中的任一序列基本上相同的序列；(v)编码表1所定义蛋白质的同系物、衍生物或片段的序列。
8.核酸分子，其含有下列序列或由下列序列组成(i)表4所示的任一DNA序列或其RNA等同物；(ii)与(i)中的任一序列互补的序列；(iii)与(i)或(ii)中的序列编码相同蛋白质或多肽的序列；(iv)与(i)，、(ii)和(iii)中的任一序列基本上相同的序列；(v)编码表4所定义蛋白质的同系物、衍生物或片段的序列。
9.具有选自表2-4所示序列之序列的蛋白质或多肽，或其同系物，衍生物和/或片段用作免疫原和/或抗原的用途。
10.一种免疫原性和/或抗原性的组合物，该组合物含有一种或多种具有选自表2-4所示序列之序列的蛋白质或多肽或其同系物或衍生物，和/或它们中的任一个的片段。
11.权利要求10所述的免疫原性和/或抗原性组合物，该组合物是疫苗，或者可用于诊断试验。
12.权利要求11所述的疫苗，其含有一种或多种选自赋形剂、稀释剂、佐剂等的其它组分。
13.一种疫苗组合物，其含有一种或多种如表1、3或4中所定义的核酸序列。
14.一种检测/诊断肺炎链球菌的方法，所述方法包括使受试样品与至少一种如表2-4中所定义的蛋白质或多肽或其同系物、衍生物或片段接触的步骤。
15.一种抗体，所述抗体能与如表2-4中所定义的蛋白质或多肽或其同系物、衍生物或片段结合。
16.权利要求15所定义的抗体，所述抗体是单克隆抗体。
17.一种检测/诊断肺炎链球菌的方法，所述方法包括使受试样品与至少一种如权利要求15或16所定义的抗体接触的步骤。
18.一种检测/诊断肺炎链球菌的方法，所述方法包括使受试样品与至少一种如权利要求7或8所定义的核酸序列接触的步骤。
19.一种测定如表2-4中所定义的蛋白质或多肽是否是潜在的抗微生物靶标的方法，所述方法包括灭活所述蛋白质或多肽，并在体外或体内测定肺炎链球菌是否仍然存活。
20.能拮抗、抑制或要不然干扰如表2-4中所定义的蛋白质或多肽的功能或表达的药剂用于制备药物的用途，所述药物可用于治疗或预防肺炎链球菌感染。
全文摘要
本发明描述了新的肺炎链球菌蛋白质以及编码它们的核酸序列。还描述了它们在疫苗和筛选方法中的用途。
文档编号G01N33/50GK1367833SQ9981101
公开日2002年9月4日 申请日期1999年7月27日 优先权日1998年7月27日
发明者C·F·G·吉尔伯特, P·M·汉斯布罗 申请人:微生物技术有限公司