核酸的制作方法

核酸的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种核酸，其包括非特异性启动子和编码多肽的至少一种序列，其中所述多肽中具有至少一种异源性T细胞表位但没有任何调节性T细胞表位。所述多肽可以是异二聚体的一条链，所述异源性T细胞表位导致所述异二聚体链的破坏以致于它不能结合所述异二聚体的另一条链。所述核酸能被用于引发针对至少一种异源性T细胞表位的T细胞应答。
【专利说明】核酸
[0001]本申请是申请日为2008年3月28日，申请号为200880017669.4，发明名称为“核酸”的申请的分案申请。
发明领域
[0002]本发明涉及核酸和它们作为疫苗的用途，所述核酸编码T细胞表位，针对所述表位将会引发一种免疫应答。这种疫苗可被用于治疗肿瘤。
[0003]发明背景
[0004]在癌症疫苗和慢性病毒感染的领域，现在变得清楚的是，除了频率之外的因素，例如肿瘤特异性T细胞的功能性亲和力和启动途径，是将疫苗效力最大化的主要决定因素。若干小组已经证明，高亲和力的⑶8+T细胞展示优秀的抗肿瘤活性(Alexander-MiIler, Immunologic Research, 2005;31:13-24, Hodge 等，J Immunol2005;174:5994-6004,Valmori 等，J Immunol2002;168:4231-40, Zeh 等，JImmunoll999; 162:989-94)。据建议，高亲和力的T细胞在患者肿瘤退化中扮演重要角色。这被一项研究例证，其中在所述研究中，高亲和力的抗原特异性的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在带有显著肿瘤退化的患者中被检测到(Khong&Rosenberg, J Immunol2002; 168:951-6)。还有证据正在出现以证明在体外被激发的自体肿瘤特异性T细胞的过继性转移是成功的，可能是因为在体外的刺激使得选择高亲和力的T细胞成为可能(Vignard等，JTmmunol2005;175:4797-805，Dudley 等，J Immunother2001;24:363-73，Morgan 等，J Tmmunol2003;171:3287-95, Rosenberg&Dudley, Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America2004;101Suppl2:14639-45)。
[0005]到目前为止，若干小组已经尝试使用一种抗体作为该表位的运载体(caiTier)来针对预定的表位引发一种细胞免疫应答。例如，W096/19584(Bona等)公开了在其中T细胞表位被插入抗体的互补决定区域(CDR)的嵌合抗体，并提出`这种嵌合抗体适合于引发细胞毒性T细胞(CTL)应答。然而，此文件教导的是DNA必须编码功能蛋白。因此在摘要中陈述，“所述表位和母体免疫球蛋白的功能能力被保留”。并且，在第21页上陈述，“所期望的表位的插入应该是在编码所述母体免疫球蛋白分子的核酸的区域，其中所述区域对所述母体免疫球蛋白分子的表达或功能不是必要的”。此外，W096/19584中所有实施例显示，完整的免疫球蛋白是在T细胞表位的插入之后被产生的。
[0006]编号为7，067，110的美国专利公开了使用抗体的融合蛋白来引起针对抗原的免疫反应的方法，其中所述融合蛋白缺少通过多肽键融合到抗原的免疫球蛋白可变区域结构域。所述融合蛋白保留结合到Fe的能力。
[0007]EP0759944公开了将T细胞表位并入抗体分子内的方法，其中所述抗体分子作为完整的免疫球蛋白被分泌，并能将CTL表位靶向至肿瘤以使它们成为CTL更好的靶。
[0008]W000/64488公开了 CTL应答可由编码嵌合抗体的核酸引发，其中所述嵌合抗体具有被插入CDR而非其可变区域的异源性T细胞表位，只要所述核酸被导向在B细胞中表达。由于B细胞不能激发原初T细胞应答，W000/64488中所述疫苗将只在提高预先存在的T细胞应答时有用。
[0009]W002/092126公开了 CTL应答可由包括异源性T细胞表位和部分人Fe的多肽引发，其中所述多肽结合到高亲和性CD64受体。然而，本发明人现在已经证明，通过在例如不适当的CDR或甚至抗体的可变区域内插入T细胞表位而破坏抗体序列预防了重链和轻链的缔合，并且没有分泌功能抗体。编码这些错折叠的抗体的DNA意外地产生强烈的T细胞应答。此外，这不是通过⑶64介导的，因为不与小鼠或人⑶64结合的人IgG2同人IgGl —样有效地工作。
[0010]发明概述
[0011]在本发明的一个方面，提供了一种核酸，其包括非特异性启动子和编码多肽的至少一种序列，其中所述多肽中具有至少一种异源性T细胞表位但没有任何调节性T细胞表位。
[0012]此多肽优选地是同源的运载体，例如当被用来提高人体中的T细胞应答时它可以是人蛋白或外来蛋白或将所有T调节性表位鉴定并去除的人/外来嵌合蛋白。
[0013]所述多肽优选地是异二聚体的一条链，所述异源性T细胞表位导致所述异二聚体链的破坏以致于它不能结合或缔合所述异二聚体的另一条链。很多分子是异二聚的，其一条链依赖于另一条而折叠并然后分泌。如果所述二级结构由于异源性T细胞表位的插入而破裂，那么折叠和分泌就被抑制。在某些实施方案中，一条链被分泌并包含异源性CTL表位，而另一条链包含异源性辅助表位，但由于二级折叠的破坏而不被分泌。因此，所述核酸可编码所述异二聚体的两条链，其中一条链包含异源性的细胞毒性T细胞(CTL)表位并在表达时被分泌,而另一条链包含异源性辅助表位并在表达时不被分泌。可选择地，各自的异二聚体链可在分开的核酸分子上被编码。
[0014]所述异二聚体可以是免疫球蛋白分子。所述免疫球蛋白分子的重链可包含异源性的细胞毒性T细胞(CTL)表位并在表达时被分泌，而所述免疫球蛋白分子的轻链可包含异源性辅助表位并在表达时不被分泌。
[0015]本发明第一个方面中所述的核酸编码不含有任何调节性T细胞(T reg)表位的多肽。这些多肽作为T细胞表位的惰性运载体而起作用，并可以是被免疫系统用来激发免疫应答的分子或分子的一部分，因为根据定义这些分子不表达竞争性T reg表位。适合的分子包括HLA分子、T细胞受体、TOL受体、TOL配体、细胞因子、细胞因子受体、趋化因子、趋化因子受体。优选地，所述分子是抗体或其一部分。
[0016]不希望被理论约束，本发明至少部分地基于如下的概念:T细胞应答可针对特异性的T细胞表位(例如CTL表位)通过施用编码包括所述T细胞表位而非调节性T细胞表位的多肽的核酸而被产生。人们相信，核酸或者被抗原呈递细胞(APC)吸收，迁移到淋巴结并被直接呈递，或者被表达以产生被分泌然后被其他APC吸收的多肽。前一个核酸适合于激发辅助T细胞表位，而后一个适合于激发CTL应答。由所述核酸编码的多肽理想地不具有任何天然T细胞表位。在这点上，适合的多肽是免疫分子，例如抗体。不能缔合以使得轻链留在APC中而重链被分泌的抗体重和轻链适合于本发明的实施，虽然本发明不限于使用抗体作为所述T细胞表位的运载体。
[0017]约40年前鉴定了抑制性T细胞的群体，但其发展却因鉴定细胞的特殊技术的缺乏和关于阻遏之存在的科学怀疑而被阻碍。然而，Sakaguchi等在1995年复苏了对抑制性细胞的兴趣，他们证明，将耗尽了 CD4+CD25+T细胞的淋巴细胞转移进无胸腺小鼠导致了受体小鼠身上各种自身免疫疾病的发生，以及CD4+CD25+T细胞的重建避免了这些小鼠中的自身免疫反应(Sakaguchi等J.1mmunoll995; 155:1151-1164)。接着，在小鼠和人身上的许多研究表明，具有调节活性的各种T细胞群体在对自身(控制自身耐受性)(Sakaguchi 等 J.1mmunol 1995; 155:1151-1164)以及外来抗原(Shevach, Immunity2006;25:195-201, Coleman 等,J.Cell Mol.Med.2007;11:1291-1325)的免疫应答(既是先天的又是适应的)的阻遏上扮演重要角色。小鼠癌症模型中Treg细胞的耗尽显示促进内源的免疫介导的肿瘤排斥(Shimizu,等，J.1mmunol.1999; 163:5211-5218, Onizuka 等,Cancer Research 1999; 59:3128-3133)和抗原特异性的抗肿瘤免疫性(Tanaka,等，J.1mmunother.2002; 25:207-217)。此外，Treg 细胞的耗尽加强肿瘤的免疫疗法包括疫苗接种(Tanaka,等,J.1mmunother.2002; 25:207-217，Dannu11 等,J.Clin.1nvest.2005;115:3623-3633)和 CTLA-4 阻断(Sutmuller 等,J.Exp.Med.2001;194:823-832)。此外，Treg细胞的数量在外周血液中增加(Woo等，CancerResearch2001;61:4766-4772, Curiel 等，Nature Medicine2004;10:942-949, Wolf等，Clin.Cancer Research2003;9:606-612, Sasada 等，Cancer2003;98:1089-1099)，并在患有不同癌症的患者的肿瘤微环境和引流淋巴结中增殖(Curiel等，NatureMedicine2004;10:942-949，Sasada 等，Cancer2003;98:1089-1099，Liyanage 等，J.1mmuno1gy2002;169:2756-2761，Matsuura 等，Cancer2006;106:1227-1236，Yang等,Blood2006;107:3639-3646, Alvaro 等,Clin.Cancer Research2005;11:1467-1473)D在患有胃癌(Sasada 等，Cancer2003;98:1089-1099，Ichihara 等，Clinical CancerResearch2003; 9:4404-4408)和卵巢癌(Curiel 等,Nature Medicine2004; 10:942-949)的患者中 ，差的预后和减少的存活率与更高的Treg细胞频率有关。Treg细胞还显示阻遏 / 抑制肿瘤特异性 CD8.(Liyanage 等,J.1mmunology2002; 169:2756-2761，Picciril1 等，J.1mmunology2001;167:1137-1140, Mempel 等,Immunity206;25:129-141, Annacker 等,J.1mmunology2001;166:3008-3018, Woo 等,J.1mmunology2002;168:4272-4276)和 CD4+ (Liyanage 等，J.1mmunology2002;169:2756-2761，Ichihara 等，ClinicalCancer Research2003;9:4404-4408, Nishikawa 等，Blood2005;106:1008-1011)T 细胞的增殖、细胞因子的产生(IFN Y，IL-2)和细胞溶解活性。此外，Treg细胞能阻遏树突细胞(Romagnani 等,Eur.J.1mmunol.2005;35:2452-2458)、NK 细胞(Ralainirina 等,J.Leukoc.Biol.2007; 81:144-153)和 B 细胞(Lim 等，J.1mmunology2005; 175:4180-4183)的功能。合起来看，这些研究表明Treg细胞在肿瘤免疫病理学上的重要作用，并指出Treg细胞频率和肿瘤生长之间的紧密关联。
[0018]Treg细胞被分为天然的⑶4+CD25+T细胞和多种群体的诱导的/适应性的Treg细胞(Shevach, Immunity2006;25:195-201, Bluestone 等，Nat.1mmunol.2005;6:345-352)(表1)。小鼠和人的约5%-10%的OM+T细胞是天然的Treg细胞(Sakaguchi等，Nat.1mmunology2005;6:345-352)。天然的Treg细胞在胸腺中通过与自体肽的强的TCR相互作用产生(Picca 等，Current Opinion in Immunology2005; 17:131-136，Jordan 等，NatureImmunology2001;2(4):301-306，Picca 等，Immunological Reviews2006;212:74-85),而诱导的Treg细胞从外周的非调节性T细胞产生。此胸腺外转换需要特殊的免疫条件例如连续暴露于低剂量的抗原，暴露于全身外周抗原或暴露于TGFP (Shevach, Immunity2006; 25:195-201, Akbar 等,Nat.Rev.1mmunol.2007; 7:231-237)。Treg 细胞可通过下面的机制中的一种或其组合来介导它们的阻遏:i)细胞-细胞接触依赖的机制，ii)通过免疫抑制的细胞因子如IL-10或TGFP的分泌，或iii)直接杀死靶细胞的穿孔素-粒酶途径(vonBoehmer, Nature Immunology2005;6(4):338-344)。
[0019]迄今，人Treg细胞的抗原特异性被知道的很少。Wang等报道了癌症患者中LAGE-1特异性的⑶4+⑶25+GITR+功能性Treg细胞克隆的鉴定(Wang等,Immunity2004; 20:107-118)。Vence等证明了肿瘤抗原特异性的OM+Treg细胞在转移性黑素瘤患者外周血液中的存在(Vence等，PNAS2007; 104(52):20884-20889)。这些Treg细胞识别一大批的肿瘤抗原，其包括TRP1、NY-ESO-U gplOO和存活蛋白。此外，Vence等最先证明了 NY-ES0-1特异性的Treg细胞表位在NY-ES0-1分子内的存在。此外，据显示，用载有合成肽或肿瘤裂解液的树突细胞对黑素瘤患者的疫苗接种诱导了 Treg细胞频率的增加，这与肿瘤特异性的⑶8+T细胞的扩张伴随(Chakraborty等，Hum.1mmunology2004;65:794-802)。这暗示所述疫苗含有未被鉴定的Treg细胞表位以及⑶8+T细胞表位的可能性，这些表位由通过Treg细胞T细胞受体(TCR)的配体特异性激活而导致Treg细胞在体内的扩张。被广泛接受的是，Treg细胞需要通过TCR识别/结合的抗原特异性激活，但介导抗原非特异性的旁观者阻遏(Thorton&Shevach，J.1mmunology2000; 164:183190)。此外，Li等提出了显性的Treg表位在丙型肝炎病毒核心蛋白中的存在，其中所述核心蛋白刺激被感染的患者中HCV特异性的Treg细胞(Li等，Immunol.Cell Biol.2007; 85 (3): 197-204)。总的来说，除了近期关于使用抗内皮DNA构建体C200Fc对HHD转基因小鼠进行免疫的发现，这些研究未能激发显著的Tielw96特异性的抗肿瘤免疫应答，而且在C200Fc DNA免疫之前(Middleton，博士论文。诺丁汉大学，2007年11月)耗尽⑶4+CD25+Treg细胞(通过施用400yg的PC61单克隆抗体)之后来自HHD小鼠脾细胞的分泌Tiej1H96特异性的IFNy的细胞的提高的频率表明，DNA疫苗中的Tie-2^含有未被鉴定的Treg细胞表位以及⑶8+表位。这将解释所述疫苗在打破对自体抗原Tie-2的耐受性以及在HHD小鼠中引出抗肿瘤免疫力的失败原因，这是由于充足的抗原特异性的扩张的Treg细胞，其阻遏细胞介导的抗肿瘤免疫应答。因此，使用惰性免疫运载体表达T效应表位是有优势的，其中所述惰性免疫运载体不能表达T reg表位以将免疫应答导向效应表位并防止占优势的T reg应答的激发。
[0020]有利地，本发明中的核酸包括编码一段序列例如前导序列的序列，其中所述前导序列允许被表达的多核苷酸被分泌。这允许所述多核苷酸被转移到抗原呈递细胞(APC)。所述序列可以是与所述多核苷酸一起天然表达的前导序列，或可以是异源的前导序列，例如被加入的免疫球蛋白前导序列。在所述多核苷酸编码膜结合分子的情况下，所述后者是特别适合的。
[0021]根据本发明的另一个方面，提供了一种核酸，其包括非特异性启动子和编码免疫球蛋白分子的重组重链的至少一种序列，其中所述重链中具有至少一种异源性T细胞表位以致于所述重链在所述核酸被表达时不能采取它的天然构象。
[0022]本发明这个方面的核酸编码免疫球蛋白分子的重组重链。这种重链的结构是本领域技术人员已知的，并通常包括可变的和恒定的区域。所述重链可以来自抗体。所述抗体可以是单克隆的或多克隆的，并可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，虽然IgG是优选的。所述IgG抗体可以是任何IgG亚类，例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4，或小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b或IgG3。所述IgG抗体可以是含有IgG2Fc结合结构域的人IgGl抗体，或含有IgGlFc结合结构域的人IgG2抗体。所述重链可能含有人抗体的恒定区域，以及小鼠单克隆抗体的可变的或超可变的(CDR)区域，其中所述小鼠单克隆抗体被异源性T细胞表位插入。所述可变区域而非所述超可变区域还可衍生自人抗体的可变区域。当应用于抗体(即包括一条重链和一条轻链)时，据说所述抗体是人源化的。制造人源化抗体的方法是本领域中已知的。方法在例如Winter的编号为5，225，539的美国专利中被描述。在小鼠超可变区域外面的重链的可变区域还可衍生自小鼠单克隆抗体。在这种情况下，整个可变区域衍生自鼠单克隆抗体并且当应用于抗体时，所述抗体据说是被嵌合的。制造嵌合抗体的方法是本领域已知的。这种方法包括例如在Boss (Celltech)和Cabilly (Genentech)的美国专利中所描述的那些。还分别参见编号为4，816，397和4，816，567的美国专利。
[0023]在某些实施方案中，本发明所述核酸还包括编码免疫球蛋白分子的轻链的至少一种序列。可选地，可以提供编码免疫球蛋白分子的轻链的分离的核酸。所述轻链中可具有至少一种异源性T细胞表位。所述T细胞表位可以使得当所述核酸被表达时所述轻链不能采取它的天然构象。所述轻链可具有本文关于重链所述的任何特性。因此，本发明还提供编码免疫球蛋白分子的重组轻链的核酸，其中所述轻链中具有至少一种异源性T细胞表位以致于当核酸被表达时所述轻链不能采取它的天然构象。所述核酸可包括一个非特异性启动子。这种核酸编码免疫球蛋白分子，例如抗体。在一些实施方案中，所述核酸可与包括编码免疫球蛋白分子的轻链的至少一种序列的核酸相组合。
[0024]在一些实施方案中，所述至少一种异源性T细胞表位可以是在重链和/或轻链的可变区域中。
[0025]在一些实施方案中，所述至少一种T细胞表位可以是在所述免疫球蛋白的重链和/或轻链的至少一种⑶R中。
[0026]在一些实施方案中，所述⑶R可以是⑶RLl JDRHl和/或⑶RH2。
`[0027]在一些实施方案中，编码所述至少一种异源性T细胞表位的序列可被插入编码所述重链或轻链的序列中。
[0028]在一些实施方案中，编码所述至少一种异源性T细胞表位的序列可被取代进编码所述重链或轻链的序列中。
[0029]在一些实施方案中，所述核酸可编码抗体。
[0030]在一些实施方案中，所述抗体可以是单克隆抗体。
[0031 ] 在一些实施方案中，所述至少一种异源性T细胞表位可以是细胞毒性T细胞表位。
[0032]在一些实施方案中，所述至少一种异源性T细胞表位可以是辅助T细胞表位。
[0033]在一些实施方案中，所述重链和/或轻链可具有至少一种细胞毒性T细胞表位和至少一种辅助T细胞表位。
[0034]因此，根据本发明进一步的一个方面，提供了一种核酸，其包括非特异性启动子和编码重组免疫球蛋白分子的至少一种序列，其中所述免疫球蛋白分子中具有至少一种异源性T细胞表位以致于当核酸被表达时所述免疫球蛋白分子不能采取它的天然构象。优选地，所述重组的免疫球蛋白分子以及上述的重链和轻链不具有任何调节性T细胞表位。[0035]在一些实施方案中，所述核酸可通过以上描述的特征来修饰。
[0036]本发明还提供:
[0037].一种疫苗，其包括本发明的核酸和佐剂；
[0038].一种药物组合物，其包括本发明的核酸和药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂；
[0039]?本发明的核酸在医学上的用途； [0040].本发明的这种核酸在制造药物方面的用途，其中所述药物激发针对至少一种T细胞表位的免疫应答；
[0041].本发明的核酸，其激发针对至少一种T细胞表位的免疫应答；以及
[0042].一种激发针对T细胞表位的免疫应答的方法，其包括向需要这种免疫应答的受治疗者施用治疗有效量的本发明的核酸。
[0043]惊人地，本发明人已经发现，抗体例如单克隆抗体激发强的辅助和抗原特异性T细胞应答，其中所述抗体可以是人或非人的，且具有被克隆在它们的可变区域内的预定的T细胞表位，以破坏抗体的一级结构，抑制折叠和/或限制重链或非常少量的完整抗体的分泌。本发明人还发现，可以使用编码这种抗体的重链的核酸实现这种作用。人们相信，所述T细胞表位被加工但未被免疫蛋白体破坏。在某些实施方案中，本发明提供一种呈现变性的免疫球蛋白中预先定义的T细胞表位的DNA疫苗，其中所述变性的免疫球蛋白提高T细胞应答的频率和亲和力。由本发明的核酸编码的多肽在本文中可被称作“免疫体”。
[0044]据发现，针对T细胞表位的免疫应答可以被编码免疫球蛋白分子的至少重链的核酸激发，其中所述免疫球蛋白分子被T细胞表位插入以致于免疫球蛋白分子不能采取它的天然构象，此发现与本领域的期望背道而驰，其中被教导的是，抗体必须以功能型被表达。例如，如上所讨论，W096/19584教导的是，当核酸编码在其中T细胞表位被插入其CDR的抗体时，所述核酸必须编码功能性抗体。相似地，EP0759944描述将T细胞表位并入抗体分子内的方法，其中所述抗体分子作为完整的免疫球蛋白被分泌。虽然编号为7,067, 110的美国专利公开说可以通过抗体和抗原的融合蛋白引发针对抗原的免疫应答，但是据公开所述抗体缺少免疫球蛋白可变区域。此外，此融合蛋白将具有所述抗原中的调节性T细胞表位。因此，虽然所述蛋白可以激发抗体应答，但是它将不激发高亲和力的T细胞应答，这是由于所述抗原中的调节性T细胞表位。
[0045]如上所讨论，W000/64488公开编码具有被插入⑶R而非其可变区域的异源性T细胞表位的嵌合抗体的核酸，其中所述核酸被导向在B细胞中的表达。本发明所述核酸未被导向在B细胞中的表达，并因此将不会在体外或体内特异性地靶向B细胞。本发明所述核酸可被任何抗原呈递细胞包括树突细胞吸收，并能因此启动原初CTL和辅助T细胞应答，然而W000/64488中所述疫苗将只对增强预先存在的T细胞应答有用。
[0046]根据本发明的核酸所诱导的应答的功能性亲和力分析证明，当与合成肽的免疫比较时可产生高亲和力应答。这还与提高的在体外和体内识别和杀死肿瘤细胞的能力相关。此观察与其他研究中所记载的具有可比性，在所述其他研究中高亲和力的TRP2特异性CTL显示了更好的抗肿瘤活性(Zeh等,J Immunol 1999; 162:989-94，Harada等,Immunology2001;104:67-74)。
[0047]本发明所述核酸具有一个非特异性启动子，即提高核酸表达但对在其中表达被提高的细胞没有特异性的启动子。所述启动子优选地导致树突细胞和/或角质化细胞中核酸的表达。适合的启动子的例子包括CMV启动子、SV40启动子和本领域技术人员已知的其他非特异性启动子。可选地，本发明所述核酸可具有一种或多种启动子，其中所述启动子在树突细胞(例如Cdllb启动子)和角质化细胞(例如MHCII启动子，Chin等，2001J.1mmunol.167，5549-5557)中导致特异性表达。
[0048]本发明某些方面中所述核酸编码免疫球蛋白分子，优选地为包括抗体所有主要特性的抗体，也就是说包含可变和恒定区域的重和轻链。所述抗体可以是单克隆或多克隆的，并可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，虽然IgG是优选的。所述IgG抗体可以是任何IgG亚类，例如人 IgGl、IgG2、IgG3 或 IgG4，或小鼠 IgGl、IgG2a、IgG2b 或 IgG3。所述 IgG 抗体可以是具有IgG2Fc结合结构域的人IgGl抗体。所述抗体可具有人抗体的恒定区域，以及小鼠单克隆抗体的可变或超可变区域，在其中异源性T细胞表位被插入。所述可变区域而非超可变区域还可衍生自人抗体的可变区域。这种抗体据说是人源化的。制造人源化抗体的方法是本领域中已知的。方法在例如Winter的编号为5，225，539的美国专利中被描述。在小鼠超可变区域外面的抗体的可变区域还可衍生自小鼠单克隆抗体。在这种情况下，整个可变区域衍生自鼠单克隆抗体并且所述抗体据说是被嵌合的。制造嵌合抗体的方法是本领域已知的。这种方法包括例如在Boss (Celltech)和Cabilly (Genentech)的美国专利中所描述的那些。还分别参见编号为4，816，397和4，816，567的美国专利。
[0049]本发明某些方面中所述核酸是这样的:从其表达的重链、轻链或免疫球蛋白分子中具有至少一种异源性T细胞表位，以致于所述重链、轻链或免疫球蛋白分子不能采取它的天然构象。所述T细胞表位可破坏被表达的蛋白以致于所述重链或免疫球蛋白分子不能再结合到它的抗原，以致于所述重和轻链(当存在时)不能再缔合，或者以致于所述重链或免疫球蛋白分子不能被适当地分泌，例如。所述破坏可以是在免疫球蛋白分子的三级结构，其可避免双硫键的形成。
[0050]如下面更详细的讨论，其中所述免疫球蛋白分子是抗体，T细胞表位可插入或取代所述抗体的⑶Rl和⑶R2区域。⑶Rl和⑶R2形成所述抗体β片层构象的一部分，并且被部分地淹没在被折叠的分子中。它们的长度的任何变化、氨基酸组成或变化将破坏此结构并防止重和轻链的折叠与缔合。CDRH3被暴露于免疫球蛋白分子的表面并因此更允许改变。在本发明中，优选的是CDRl和/或CDR2被T细胞表位所取代。的确，在某些实施方案中，在⑶RH接合处骨架区域的丧失完全地破坏抗体折叠但在这些区域中表位的插入导致良好的T细胞应答。在⑶RHl (5个氨基酸长度)或⑶RH2 (17个氨基酸长度)中引入任何表位导致充分的破坏以允许重链的分泌，但是只有非常少量的完整抗体被分泌，即使轻链具有它的天然序列。这表明，二级结构对于重和轻链的配对是重要的。在轻链的CDRLl中引入任何表位导致轻链的低水平分泌，即使只将单个表位引入重链的⑶RH3。
[0051]“异源性T细胞表位”旨在表示对抗体是异源性的T细胞表位。例如，异源性T细胞表位可以是之前不存在于抗体中的表位。异源性T细胞表位可作为整体被插入，虽然它可以从被插入的氨基酸序列与第二部分的侧翼氨基酸一起被制作。这是为了保证被插入的表位在异源的核酸中具有与原始抗原相似的加工情况。一种或多种CTL/辅助表位可被插入相同的可变区域中。
[0052]所述T细胞的一个或多个表位可被插入 重链或轻链中的任何地方。优选地，表位或每个表位被插入重链和/或轻链的可变区域，虽然编码具有T细胞表位的重链或抗体的核酸被包括进本发明，其中所述T细胞表位被插入重链和/或轻链的仅仅恒定区域或者恒定区域和可变区域。在本发明的核酸中，编码T细胞表位的一条或多条序列可被插入(即添加至)编码重链和/或轻链的序列，或可被取代进编码重链和/或轻链的序列。
[0053]在可变区域内，所述T细胞的一个或多个表位可插入或取代重链和/或轻链的CDR中任一种或多种，即L1、L2、L3、H1、H2或H3。在这些中，L1、Hl和H2目前是优选的。在某些实施方案中，T细胞表位插入或取代⑶RLl和/或Hl和/或H2。优选地，被弓丨入的T细胞表位与抗体的原始CDR的氨基酸的大小和电荷不相似，以致于所述抗体不采取它的天然构象，例如不正确地折叠和分泌。可选地或另外地，它们可插入或取代环绕⑶R的骨架区域。
[0054]被插入的T细胞表位优选地是细胞毒性T细胞(CTL或⑶8)表位。可选地或另外地，辅助T细胞(CD4)表位可被插入。T细胞表位可使用已知的T细胞算法来预测或作为肽被合成，并使用标准的T细胞测定来筛选。T细胞表位可具有范围从5至50、7至40、8至30 或 9 至 20 个氨基酸的氨基酸长度，例如 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。所述表位可使用编码抗原表位的互补寡核苷酸插入，其中所述抗原表位被退火并克隆进抗体骨架的特定位点，在所述骨架中的CDR (或其他区域)被独特的限制性酶位点所替换。重组抗体激发辅助和细胞毒性T细胞应答的能力可如本文所例证的那样进行筛选。
[0055]各种组合在本发明中是可能的。在某些实施方案中，一种或多种⑶8表位插入和/或取代⑶R Hl和/或H2，或在重链或抗体的非⑶R可变区域中。另外地或可选地，一种或多种CD4表位可插入和/或取代CDR LI，或在轻链或抗体的非CDR可变区域中。当有多个T细胞表位时，所述T细胞表位可以是相同的或不同的。本领域技术人员将了解，许多组合是可能的，其包括:
[0056].⑶R Hl中的一种⑶8表位，和⑶R LI中的一种⑶4表位；
[0057].⑶R H2中的一种⑶8表位，和⑶R LI中的一种⑶4表位；
[0058].CDR Hl和CDR H2中的一种CD8表位，和CDR LI中的一种CD4表位；
[0059].⑶R Hl中的2种⑶8表位，和⑶R LI中的一种⑶4表位；
[0060].CDR H2中的2种CD8表位，和CDR LI中的一种CD4表位；等。
[0061]本发明的核酸可包括来自单个靶抗原的多个T细胞表位，其中所述靶抗原可结合I类和II类MHC分子二者的大多数。这可产生一种能用于广布的人口接种的疫苗。可选地，本发明中有用的核酸可包括来自多个靶抗原的多个T细胞表位，其中所述靶抗原可结合最常见的I类和II类表型。这可产生一种可以预防抗原损失变异体的选择的疫苗。靶抗原可来自单个的病原体或肿瘤类型，或可被选择以针对各种病原体或癌症引发免疫应答。靶向特定的常见HLA表型的本发明中有用的核酸可包括来自多种多样的癌症和/或病原体的许多T细胞表位，其提供单个疫苗以预防疾病。
[0062]可以插入任何T细胞表位，假如它激发辅助和/或细胞毒性T细胞应答。可以使用来自病原体例如HIV、丙型肝炎和需要CTL以清除潜在感染的其他感染的T细胞表位，虽然优选地所述表位是“自体表位”，即相关于与细胞增殖例如癌症相关的状况/病症。优选地，该T细胞表位使得重链或抗体不能正确折叠并分泌。因此，优选地，被插入的表位具有与原始的可变区域不相似的大小和氨基酸组成。所述核酸可具有多个不同T细胞表位以便产生各种各样的T细胞应答。所述核酸可包括来自单个抗原的多个表位，从而保证不同HLA类型的个体的大多数对单个疫苗进行应答。可选地，可以使用来自靶向受限的一系列HLA种类的多个抗原的多个T细胞表位。本发明所述核酸分子可包括来自单个病原体或癌症类型的若干抗原，或者它们可包括靶向各种各样实体瘤或病原体的完全不同的抗原。本发明所述核酸分子甚至可被设计成靶向肿瘤中不同细胞群体，例如肿瘤上皮和内皮抗原。
[0063]意外地，本发明人已经发现，当T细胞表位被插入重链的结构限制的⑶R或非⑶R区域时，它们引发优良的CTL应答。这看上去是由于大量重链的分泌，其中所述重链只能与轻链弱缔合，由于体积大的表位向它们的可变区域的插入。这与定理矛盾，所述定理描述道“只有由抗原呈递细胞内源性合成的蛋白被呈递在I类MHC分子上并被CTL识别” 一W096/19584。外源性抗原的吸收和在I类MHC上的呈递被认为是交叉呈递的过程，并通常需要通过特定的受体进行吸收。这可以是人Fe Y I抗体的⑶64受体。然而，据预测，大量的完整抗体或抗原-抗体复合物将更善于靶向此受体。相比之下，本文所呈递的结果清楚地显示，不应该结合CD64的很低水平的完整抗体和大量的游离重链引出优良的CTL应答。的确，据本文所显示，CTL应答当CTL表位被插入不能结合CD64的抗体时可被激发，其中所述抗体例如IgG2抗体或IgGl分子，其中所述IgGl分子的CD64结合区域被来自IgG2的非⑶64结合区域替换。
[0064]编码重链的核酸优选地包括前导序列以允许它被分泌。本发明人已经发现，如果重链的前导序列被除去以防止分泌并允许更多内源性蛋白被产生，那么这降低CTL应答。这与预期完全相反。虽然不希望受到理论约束，本发明人相信，这意味着核酸在非抗原呈递细胞中表达，其中所述非抗原呈递细胞分泌高水平的重链和然后可被抗原呈递细胞吸收的少量天然蛋白。可选地，核酸可直接转染抗原呈递细胞，其中所述抗原呈递细胞迁移到引流淋巴结并在其中向原始CTL分泌少量天然蛋白和大量重链，其中所述重链被相同或相邻的抗原呈递细胞吸收并被呈递在I类MHC上。因此，对于激发有效的CTL应答的核酸疫苗，其必须优选地在一种蛋白内编码CTL表位，其中所述蛋白以很低水平被分泌和/或同时分泌大量变性蛋白。然而，在没有辅助应答存在下，CTL应答不能成熟为高亲和性记忆应答。因此，优选的是，T辅助表位被插入重链或免疫球蛋白分子，优选地插入抗体轻链的可变区域。再一次，意外地并且与定理相反，轻链只以很低量分泌，其中所述定理描述道“只有被靶细胞外源性吸收的蛋白被II类MHC分子呈递并被辅助T细胞识别”。为了防止轻链分泌而将前导序列移除，对于辅助应答没有作用。因此，本发明所述核酸可以或不可以具有抗体轻链的前导序列。这些结果暗示，核酸被抗原呈递细胞吸收，其中所述抗原呈递细胞可能通过自体吞噬而在来自内源合成的蛋白的II类MHC的情况下呈递T辅助表位。对于协助CTL应答的辅助T细胞，它们识别的T细胞表位二者必须以称作连锁T细胞辅助的过程被呈递在相同的抗原呈递细胞上。这暗示，由所述核酸编码的、合成轻链的抗原呈递细胞必须还合成、分泌和交叉呈递CTL表位本身，或从相邻的APC吸收重链。
[0065]本发明还提供分离的树突细胞，其呈递来自内源产生的轻链的II类MHC上的异源辅助T细胞表位，以及来自交叉呈递的重链的异源CTL表位。这种树突细胞可被用在本文所述疗法中。
[0066]本发明所述核酸能通过编码一种变性抗体而使存在的T细胞表位更具有免疫原性，其中所述变性抗体导致T细胞应答频率和亲和力二者的增加。[0067]本发明所述核酸可以是DNA、cDNA或RNA例如mRNA，其通过克隆获得，或者完全或部分地通过化学合成产生。为了治疗用途，所述核酸优选地是以能够在待治疗的受治疗者体内被表达的形式存在。
[0068]本发明所述核酸可以是重组的或作为分离物以分离的和/或纯化的形式被提供。它可以不含或大致不含在人类基因组的基因两侧的核酸，除了可能地一种或多种表达的调节序列。当根据本发明所述的核酸包含RNA时，本文所示的序列参考应该被认为是RNA相等物的参考，其中U取代T。
[0069]本发明所述核酸可由技术人员容易地制备，例如使用本文所含信息和参考文献以及本领域已知技术(例如，参见 Sambrook、Fritsch 和 Maniatis, "Molecular Cloning", ALaboratory Manual (《分子克隆，实验室手册》),Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989 和 Ausubel 等，Short Protocols in Molecular Biology (《精编分子生物学实验指南》)，John Wiley和Sons, 1992),假如核酸序列和克隆是可得的。这些技术包括
(i)使用聚合酶链式反应(PCR)扩增这种核酸例如来自基因组来源的样品，(ii)化学合成，或(iii)制备cDNA序列。编码所述多肽的DNA可通过本领域技术人员已知的任何适合途径被生成和使用，其包括取出编码DNA，鉴定待表达的部分任一侧的适合的限制性酶识别位点，以及从DNA切除所述部分。所述部分然后可在标准的商业可得的表达系统中被可操作地连接到适合的启动子。另一种重组手段是使用适合的PCR引物来扩增所述DNA的相关部分。可以对所述序列进行修饰，例如使用位点定向诱变，以导致修饰肽的表达或考虑用来表达所述核酸的宿主细胞中的密码子优选。
[0070]为了获得核酸序列的表达，所述序列可被导入载体，其中所述载体具有可操作地连接到所述核酸以控制其表达的一种或多种控制序列。所述载体可包含驱使被插入的核酸的表达的其他序列例如启动子或增强子、致使所述多肽作为融合蛋白被产生的核酸序列和/或编码分泌信号以使宿主细胞中产生的多肽从细胞分泌的核酸。如果希望，然后可以通过如下获得多肽:将所述载体转化进在其中所述载体是功能性的宿主细胞，培养所述宿主细胞以使多肽被产生，以及从宿主细胞或周围培养基中回收所述多肽。原核和真核细胞被用于本领域此目的，包括大肠杆菌菌株、酵母和真核细胞例如昆虫细胞和动物细胞(例如，COS、CHO细胞、Bowes黑素瘤和其他适合的人细胞)。当本发明涉及编码抗体的重链和轻链的核酸时，相应的核酸可存在于被相同或不同的启动子驱使的相同表达载体中，或在分开的表达载体中。
[0071]本发明所述核酸可被用来激发针对患者中至少一种T细胞表位的免疫应答，其中所述患者例如包括人的哺乳动物。辅助和/或细胞毒性T细胞应答可被激发。针对本发明中获得的特定表位的T细胞应答可具有比较高的亲和力，这是与由作为简单肽的相同表位的免疫接种或由在抗原内作为肽或核酸被编码的相同表位的免疫接种获得的相比。本发明所述核酸可作为组合疗法被施用，即编码轻链的核酸与编码重链的核酸。所述核酸可通过静脉内、皮内、肌肉内、口服或其他途径被施用。皮内或肌肉内施用是优选的，因为这些组织含有树突细胞。
[0072] 如本文所用，术语“治疗”包括任何能够使人或非人动物获益的疗法。所述治疗可以是针对遗传的或后天的疾病。优选地，所述治疗是针对与细胞增殖例如癌症或传染性疾病相关的状况/病症。能够使用核酸治疗的癌症类型的例子包括任何实体瘤、结肠直肠癌、肺、乳腺、胃、卵巢、子宫、肝、肾、胰腺、黑素瘤、膀胱、头颈、脑、食道、胰腺和骨肿瘤，以及软组织癌症，以及白血病。能够使用核酸治疗的传染性疾病的例子包括HIV感染、丙型肝炎或需要T细胞免疫力来清除的任何慢性感染。
[0073]核酸可以与药学上可接受的一种或多种运载体联合使用。这种运载体可包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、脂质体、水、甘油、乙醇及其组合。
[0074]佐剂可被用于促使宿主免疫应答的激发，并可包括氢氧化铝、溶血卵磷脂、普流罗尼(pluronic)、多元醇、多聚阴离子、肽、蛋白和油乳胶。
[0075]本发明中有用的核酸可在药物组合物中配制。除了上述物质中的一种，这些组合物可包括药学上可接受的赋形剂、运载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他物质。这种物质应该是无毒的并不应该干扰活性成分的效力。所述运载体或其他物质的确切性质可取决于施用途径，例如皮内、口服、静脉内、皮肤上或皮下、经鼻、肌肉内、腹膜内途径。所述制剂优选地是作为沉淀至极小的金颗粒表面上的稳定干燥粉末的核酸，并适合于通过基因枪注射。所述制剂可以适合于使用电穿孔进行皮内或肌肉内施用。
[0076]包括核酸的或用于核酸的递送的组合物优选地以“治疗有效量”施用于个体，这足以显示对所述个体的益处。所施用的实际量以及施用的速率和时间过程，将取决于被治疗的状况的性质和严重性。治疗的处方，例如剂量的决定等，是在全科医生和其他医学博士的责任范围内，并通常考虑到待治疗的病症、患者个体的状况、递送位点、施用方法和医师已知的其他因素。本发明所述核酸特别地与存在的癌症的治疗以及对初始治疗或手术后癌症复发的预防相关。上面提到的技术和方案的例子可在Remington’s PharmaceuticalSciences (《雷明顿药物科学》)，第16版，Oslo1A.(编辑)，1980中找到。
[0077]优选地，本发明所述核酸激发辅助和/或细胞毒性T细胞，其中所述细胞毒性T细胞当以有效量施用于人时能够显著抑制肿瘤细胞的生长。最佳剂量可由医生基于若干参数来确定，其中所述参数包括，例如，年龄、性别、体重、受治疗状况的严重程度、被施用的活性成分和施用途径。例如，1-1000 μ g的DNA的剂量足以激发辅助和细胞毒性T细胞应答二者。
[0078]本发明所述核酸可与另外的药学上可接受的成分一起施用。这种成分包括，例如，免疫系统刺激剂。
[0079]组合物可被单独施用，或与其他治疗联合施用，或者同时或者连续地，这取决于受治疗的状况。其他癌症治疗包括本领域已知的其他单克隆抗体、其他化疗剂、其他放射疗法技术或其他免疫疗法。本发明所述组合物的一个特殊应用是作为外科手术的助剂，即在肿瘤被除去之后帮助减少癌症复发的危险。
[0080]注射(皮内)可能是本发明所述核酸的治疗性施用的首要途径。
[0081]核酸可以局部地方式被施用于肿瘤部位或其他期望的部位，或可以以靶向肿瘤或其他细胞的方式被递送。
·[0082]核酸的剂量将取决于所使用的试剂的性质,例如它的结合活性和体内血浆半衰期、制剂中多肽的浓度、施用途径、给药部位和速率、所涉及的患者的临床耐受性、折磨患者的病理学状况以及诸如此类，这恰恰是在医生的技术范围内。例如，每位患者每次施用100 μ g的核酸的剂量是优选的，虽然每剂的剂量可在约10μ g至Img范围内变动。在一系列的连续接种中使用不同剂量；医师可施用最初的接种，然后追加相对较小剂量的核酸。[0083]在某些其他实施方案中，本发明涉及将T细胞表位从靶抗原人工引入抗体的可变区域的方法，以及将这种人工的抗体用作疫苗以激发辅助和细胞毒性T细胞应答二者。
[0084]本发明进一步的一个方面提供一种宿主细胞，其含有本文所公开的核酸。本发明所述核酸可被整合入宿主细胞的基因组(例如染色体)。可以通过包含根据标准技术促进与所述基因组重组的序列来促进整合。核酸可以是在细胞内的外染色体载体上，或否则对所述细胞是可鉴定地异源性的或外源性的。
[0085]再一个进一步的方面提供一种方法，其包括将本发明所述核酸引入宿主细胞。所述引入可使用任何可得的技术，其通常可以(特别地对于体外引入)没有限制地被称作“转化”。对于真核细胞，适合的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒例如牛痘或对于昆虫细胞的杆状病毒的转导。
[0086]对于细菌细胞，适合的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用细菌噬菌体的转染。作为备选方案，可以使用核酸的直接注射。
[0087]标志物基因例如抗生素抵抗或敏感性基因可被用来鉴定含有感兴趣的核酸的克隆，这是本领域众所周知的。
[0088]所述引入之后可以是导致或允许所述核酸的表达，例如通过在表达所述基因所需条件下培养宿主细胞(其可包括实际上被转化的细胞，虽然所述细胞将更可能是被转化细胞的后代)，以致于产生被编码的多肽(或肽)。如果所述多肽偶合在适合的信号前导肽上被表达，它可从细胞分泌至培养基中。在表达的产生之后，多肽或肽可看情况从宿主细胞和/或培养基中分离和/或纯化，并且接下来如所期望的被使用，例如在组合物制剂中，其中所述组合物可包含一种或多种另外的成分，例如包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、媒介物或运载体(例如，见下文 )的药物组合物。
[0089]本发明还提供在候选抗原中鉴定T细胞表位的方法，其包括:
[0090]在非人动物中将T调节性细胞耗尽；
[0091]用候选抗原免疫所述非人动物；以及
[0092]筛选以观察T细胞应答的引发是否针对候选抗原上被预测的表位的肽或者候选抗原中所有可能重叠的肽。
[0093]可以在非人动物例如小鼠或大鼠上实施所述方法。可以使用抗⑶25抗体或通过化学疗法例如环磷酰胺将T调节性细胞在非人动物中耗尽，其中所述抗CD25抗体可选地可以与毒素例如Ontak偶合，其中所述环磷酰胺优先地杀死T调节性细胞。一旦T调节性细胞被耗尽，可以使用编码候选抗原的DNA或通过候选抗原本身对非人动物进行免疫。优选地，所述候选抗原作为抗原-Fe融合蛋白被提供。在筛选步骤中，鉴定了在非人动物中激发的任何T细胞应答所针对的肽。这能使用例如ELISP0T的技术在体外完成。如果T细胞应答被引发至候选表位，此表位可被用来免疫非人动物。如果此肽引发T细胞应答，可通过在根据本发明所述的核酸中编码所述表位来提高亲和力和频率。此方法可允许由免疫蛋白体加工的T细胞表位的鉴定。
[0094]本发明每个方面的优选的特征与已作必要的修正的每个其他方面是一样的。本文提到的现有技术资料以法律所允许的最完全范围被并入。
[0095]附图简述
[0096]现在本发明将在下面非限制性实施例中被进一步描述。引用如下附图:[0097]图1:描绘重链载体pOrigHIB的特征的图
[0098]使用与人IgGlFc恒定区域符合读框的Hindlll/Afel来克隆抗体SC100的野生型非免疫性重可变区域。Fe区域包括CH1、CH2、CH3结构域和铰链区域。在哺乳动物细胞中的高水平表达由人类细胞巨化病毒的立即早期启动子驱使。BGH聚腺苷酸化向Orig HIB人IgGl链的下游发信号以保证mRNA的稳定性和有效终止。EM7是细菌启动子，其控制博莱霉素抗性基因的表达并允许大肠杆菌中的抗生素选择，而抗性基因上游的SV40早期启动子允许在哺乳动物细胞中的选择。SV40聚腺苷酸化向抗性基因的下游发信号以指导zee/mRNA的3’端的适当加工。所述载体还在其主链中包含细菌中繁殖的复制的ColEl起点。互补决定的DNA序列被有效地去除并单独地或共同地交换限制性位点RE1、RE2和RE3 (分别地 Fsp1、MscI 和 Srf I)。
[0099]图2:描绘重链载体pOrigLIB的特征的图
[0100]使用与人K恒定区域符合读框的BamHI/BsiWI来克隆抗体SC100的野生型非免疫性轻可变区域。在哺乳动物细胞中的高水平表达由人类细胞巨化病毒的立即早期启动子驱使。BGH聚腺苷酸化向Orig LIB链的下游发信号以保证mRNA的稳定性和有效终止。所述载体还包括复制的ColEl起点和氨苄西林的抗生素抗性基因，其中所述氨苄西林允许细菌的繁殖和选择。互补决定区域被有效地去除并单独地或共同地交换限制性位点RE4、RE5和 RE6 (分别地 EcoRV、SspI 和 Hpa I)。
[0101]图3:野生型免疫体嵌合重链的序列
[0102]展示了全长嵌合igGl重链的核苷酸和翻译中的氨基酸序列。CDR的位置是在由卡巴特(kabat)编号方案所定义的方框中。终止密码子由红色星号所示。Hindlll/Afe I限制性位点被突出显示，其被用在可变重区域的转移中。
[0103]图4:野生型免疫体嵌合K链的序列
[0104]展示了全长嵌合K链的核苷酸和翻译中的`氨基酸序列。⑶R的位置是在由卡巴特编号方案所定义的方框中。终止密码子由星号所示。被用在可变轻链区域的转移中的BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0105]图5:重叠延伸PCR
[0106]通过重叠PCR，⑶R被移除并被独特的限制性位点替换。正向引物H1、H2、H3、L1、L2和L3 (表2)被设计成分别替换重和轻链的可变区域中的CDR1、2和3。含有引物的、位于中间的、所选的每个独特的酶识别序列缺少待除去的(绿色部分)CDR序列，其中所述CDR序列被夹在10-20bp的野生型序列之间。所述正向引物与普通的反向引物即huHeClonR或huLiClonR (表2) —起被用在第一轮PCR中，其中所述huHeClonR或huLiClonR退火至分别在野生型构建体POrigHIB和pOrigLIB中的人类重和轻恒定结构域。生成的片段不含野生型⑶R序列(红色部分)，但有效地交换限制性位点。为了扩增整个可变重和轻区域，需要第二轮PCR，其使用第一轮所产生的PCR产物作为反向引物，以及在单个质粒中退火至CMV启动子的普通CMV正向引物。第二轮PCR产物被亚克隆进pCR2.1(Invitrogen)，而且在序列确认之后，含有H1、H2、H3、L1、L2和L3版本的重/轻(VH和VL)可变区域单独地、组合地和一起被插回单个构建体pOrigHIB和pOrigLIB中，其分别使用Hindlll/Afel和BamHI/BsiffI交换野生型区域。
[0107]图6:免疫体重链可变区域的序列[0108]重可变区域的核苷酸和氨基酸序列，其中⑶R已经被其相应的酶位点H1、H2和H3单独地、组合地和一起替换。独特的限制酶位点被突出显示。⑶Rl、2和3分别被Fsp1、MsCI和Srf I替换。
[0109]图7:免疫体K链可变区域的序列
[0110]重可变区域的核苷酸和氨基酸序列，其中⑶R已经被其相应的酶位点L1、L2和L3单独地、组合地和一起替换。独特的限制酶位点被突出显示。⑶Rl、2和3分别被EcoRV、SspI和Hpa I替换。 [0111]图8:描绘双表达载体pDCOrig的特征的图
[0112]一旦所有表位已经被并入单个载体中的可变重和可变轻位点，它们被转移到双表达载体中，其使用如突出显示的与其相应的人恒定区域符合读框的Hindlll/Afel和BamHI/BsiWI。重链的Fe区域包括CHl、CH2、CH3结构域和铰链区域。重和轻链二者在哺乳动物细胞中的高水平表达由人类细胞巨化病毒的立即早期启动子驱使。BGH聚腺苷酸化向两条链的下游发信号以保证mRNA的稳定性和有效终止。EM7是细菌启动子，其控制博莱霉素抗性基因的表达并允许大肠杆菌中的抗生素选择，而抗性基因上游的SV40早期启动子允许在哺乳动物细胞中的选择。SV40聚腺苷酸化向抗性基因的下游发信号以指导zee/mRNA的3’端的适当加工。所述载体还在其主链中包含细菌中繁殖的复制的ColEl起点。
[0113]图9:含有避免Fe区域合成的终止密码子的免疫体IB15重链的序列
[0114]嵌合重链pDCOrig IB15CH1终止的核苷酸和氨基酸序列。使用位点定向诱变在人igGlFc恒定区域的CHl结构域之后插入终止密码子，如星号所示。粗体的核苷酸和氨基酸代表CHl结构域。在方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(HMDQVPFSV)和H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。Hindlll/Afe I限制性位点被突出显示，其被用在将可变重区域从单个构建体中转移。
[0115]图10:不含前导序列的DCIB15重可变区域的核苷酸和氨基酸序列
[0116]使用正向引物pOr ig重的不含前导序列和反向弓丨物huHeClonR(表2 )通过PCR除去前导序列，其中所述反向引物huHeClonR有效地结合至人IgGlCHl结构域并再扩增重可变(Vh)区域。在序列确认后，减去前导序列的Vh区域被克隆回双表达构建体DCIB15，其使用与人IgGl恒定区域符合读框的Hindlll/Afe I。方框内的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(HMDQVPFSV)和H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。被用在可变重区域的转移中的HindIII/Afe I限制性位点被突出显示。
[0117]图11:不含前导序列的DCIB15K可变区域的核苷酸和氨基酸序列
[0118]使用正向引物pOrig轻的不含前导序列和反向引物huLiClonR (表2)通过PCR除去前导序列，其中所述反向引物huLiClonR再扩增轻可变(VJ区域。在序列确认后，减去前导序列的'区域被克隆回双表达构建体DCIB15，其使用与人K恒定区域符合读框的BamHI/BsiWI。方框内的氨基酸代表LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在可变轻区域的转移中的BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0119]图12:人IgG2恒定区域的序列
[0120]被扩增的重的人IgG2恒定区域的核苷酸和氨基酸序列。AfeI和SapI限制性位点被突出显示，其被用在双表达载体DCIB15中的huigGl恒定区域的转移和替换中。
[0121]图13:人igG3恒定区域的序列[0122]被扩增的重的人igG2恒定区域的核苷酸和氨基酸序列。AfeI和SapI限制性位点被突出显示，其被用在双表达载体DCIB15中的huigGl恒定区域的转移和替换中。
[0123]图14:免疫体双表达载体的人同种型
[0124]A 双表达载体 pDC0rigIB15huigG2 的图。
[0125]B 双表达载体 pDC0rigIB15huigG3 的图。
[0126]被用在可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被关出显不。
[0127]图15:含有G2基序的DCIB66重链的序列
[0128]嵌合重链的核苷酸和氨基酸序列。在与高亲和性Fe Y Rl (⑶64)相互作用的关键的结合基序中的氨基酸E233L234L235被来自人igG2的P233V234A235取代，其在方框中被加粗以突出显示。方框中的其他氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(HMDQVPFSV)和H2中的 TRP2 表位(SVYDFFVWL)。
[0129]被突出显示的Agel/Ahdl位点被用于将含有所述取代的部分转移至pDC0rigIB15huigGl。被用在可变重区域的转移中的Hindlll/Afe I限制性位点被显示为粗体。
[0130]图16:含有Gl结合基序的DCIB67重链的序列
[0131]嵌合重链的核苷酸和氨基酸序列。在人IgG2恒定区域中的氨基酸P233V234A235被关键的结合基序取代以与来自人IgGl的高亲和性Fe YRl (CD64)E233L234L235G236相互作用，其在方框中被加粗以突出显示。方框中的其他氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV)和 H2 中的 TRP2 表位(SVYDFFVWL)。
[0132]被突出显示的Agel/Ahdl位点被用于将含有所述取代的部分转移至pDC0rigIB15huigG2。被用在可变重区域的转移中的Hindlll/Afe I限制性位点被显示为粗体。
[0133]图17:鼠I gG2a免疫体表达载体
[0134](A)单链 pMoOrigHIB 载体，(B)含有 Hl 中的 GP100210M 表位(HMDQVPFSV)、H2 中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和LI中的H印B CD4表位(TPPAYRPPNAPIL)的双表达载体DCIB53，以及(C)含有 Hl 中的 HLA-DR7 限制的 gpl00CD4 表位(GTGRAMLGTHTMEVTVYH)、H2 中的 TRP2表位(SVYDFFVWL)和 H3 中的 HLA-DR4 限制的 gpl00CD4 表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)的双表达载体DCIB63的图。显示了所使用的限制性位点。
[0135]图18:描绘调节性顺应式质粒pVAXDCIB54的构建的示意图
[0136]使用NruI将重的单链载体pVaxIB54HIB (A)直链化。使用NruI和HpaI将轻链表达盒从pOrigLIB (B)切除并克隆进被直链化的质粒以生成双表达载体pVaxDCIB54 (C)。被用在可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显
示ο
[0137]图19:DCIB15 的序列
[0138]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(HMDQVPFSV)、Η2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和LI中的IfepB CD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示
[0139]图20:免疫体构建体产生低水平的完整蛋白。
[0140]A，通过夹心Elisa对来自CHO-S细胞上清液的免疫体重链水平的定量，其中所述CHO-S细胞被含有gpl00/Hl、TRP2/H2和H印B CD4/L1的免疫体(DCIB15)转染。上清液被不掺杂地使用，用培养基按I比3、I比10和I比30稀释，并与人IgG阳性对照比较。
[0141]B，通过夹心Elisa对含有gpl00/Hl、TRP2/H2和H印B help/Ll的纯化的免疫体(DCIB15)的分析与阳性对照的比较。
[0142]C和D，通过夹心Elisa对来自CHO-S转染子上清液的重链和完整免疫体的表达的确定。将抗人Fe特异性抗体涂布在板上。为了检测重链，使用抗人IgG Fe特异性HRP抗体，而且为了检测完整的免疫体，使用抗人K链特异性HRP抗体。
[0143]E，通过夹心Elisa对来自 CHO-S转染子(DCIB15、DCIB31、DCIB32、DCIB36、DCIB48、DCIB49、DCIB52、DCIB54)上清液的重链、轻链和完整免疫体的确定。将抗人Fe特异性抗体或抗人K链抗体涂布在板上。为了检测重链，抗人IgG Fe特异性HRP抗体与抗人Fe特异性涂布抗体共同使用。为了检测完整免疫体，抗人K链特异性HRP抗体与抗人Fe特异性涂布抗体共同使用。为了检测轻链，抗人K链特异性HRP抗体与抗人K链特异性抗体共同使用。
[0144]图21:DCIB24 的序列
[0145]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Η2中的卵白蛋白表位(SIINFEKL)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0146]图22:DCIB25 的序列
[0147]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(HMDQVPFSV)、Η2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和L3中的IfepB CD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显
/Jn ο
[0148]图23:DCIB31 的序列
[0149]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Η3中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被关出显不。
[0150]图24:DCIB32 的序列
[0151]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Η3中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和L3中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0152]图25:DCIB36 的序列
[0153]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表L3中的TRP2表位(SVYDFFVWL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被关出显不。
[0154]图26:DCIB48 的序列
[0155]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Η2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和H3中的HLA-DR4限制的gpl00CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。 [0156]图27:DCIB49 的序列
[0157]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Η3中的H印B CD4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0158]图28:DCIB52 的序列
[0159]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Η2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和H3中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0160]图29:DCIB54 的序列
[0161]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的HLA-DR7限制的gpl00CD4表位(GTGRAMLGTHTMEVTVYH),H2 中的 TRP2 表位(SVYDFFVWL)和 H3 中的 HLA-DR4 限制的 gpl00CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的HindIII/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0162]图30:DCIB18 的序列
[0163]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Η2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0164]图31:引入免疫体骨架的CTL表位被处理和呈递以引起体内的免疫应答。
[0165]A，在第O、7和14天用含有⑶R H2中的TRP2表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位的免疫体构建体(DCIB18)对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对TRP2肽、HepB辅助肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测
量应答。
[0166]B，通过测量对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的应答而测定了来自被免疫小鼠的脾细胞对TRP2表位的亲和力。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0167]C，来自被免疫小鼠的脾细胞被耗尽了⑶8T细胞，并且针对TRP2肽、H印B辅助肽和培养基对照被分析以确定IFNy酶联免疫斑点测定中表位特异性应答的存在。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0168]D，在6天的体外TRP2肽激发之后，来自被免疫小鼠的脾细胞在4小时的51Cr释放测定中针对B16F10、B16F10IFNa和B16F10siKb黑素瘤细胞系的细胞毒性。
[0169]E，在第 0、7 和 14 天用免疫体 DNA(DCIB15、DCIB31、DCIB32、DCIB36、DCIB48、DCIB52和DCIB54)对C57BI/6或HLA-DR4转基因小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对TRP2肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0170]F，通过测量对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的应答而测定了来自被免疫小鼠的脾细胞对TRP2表位的亲和力。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0171]G，在第 0、7 和 14 天用免疫体 DNA (DCIB15、DCIB48、DCIB49、DCIB52 和 DCIB54)对C57BI/6或HLA-DR4转基因小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对 HepB 辅助肽(DCIB15、DCIB49 和 DCIB52)或 gpl00DR4 辅助肽(DCIB48 和 DCIB54)和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0172]图32:免疫体DNA的免疫接种优于肽的免疫接种或全抗原的免疫接种。
[0173]A，将免疫体DNA的免疫接种(DCIB18)与不完全弗氏佐剂中的肽表位的皮下免疫接种或表达TRP2抗原的DNA的免疫接种进行比较。在第O、7和14天对C57BI/6小鼠进行免疫并在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对TRP2肽(.)、Η印B辅助肽?::§)和培养基对照(□)来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0174]B，通过测量对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的应答而测定了来自被免疫体DNA (?)和肽(?)免疫的小鼠的脾细胞对TRP2表位的亲和力。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0175]C，在6天的体外TRP2肽激发之后，来自被免疫小鼠的脾细胞在4小时的51Cr释放测定中针对B16F10 (_)、B16F10IFNa (纖)和B16F10siKb (□)黑素瘤细胞系的细胞毒性。
[0176]D，将免疫体DNA的免疫接种(DCIB18)与TRP2肽脉冲的DC的免疫接种进行比较。在第0、7和14天对C57BI/6小鼠进行免疫并在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对TRP2肽的滴定量来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0177]E，将免疫体DNA的免疫接种(DCIB18)与TRP2肽脉冲的DC的免疫接种进行比较。在第0、7和14天对C57BI/6小鼠进行免疫并在第19天用TRP2肽脉冲的LPS胚细胞在体外刺激脾细胞。刺激之后六天，用铬释放测定来评估CTL系溶解B16F10或B16F10siKb黑
素瘤系的能力。用％细胞毒性来测量应答。
[0178]F，将免疫体DNA的免疫接种(DCIB24)与SIINFEKL肽的免疫接种进行比较。在第0、7和14天对C57BI/6小鼠进行免疫并在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对SIINFEKL肽和对照肽来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0179]G，将免疫体DNA的免疫接种(DCIB15)与gpl00210M肽的免疫接种进行比较。在第0、7和14天对HHDII小鼠进行免疫并在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对gpl00210M肽和对照的滴定量来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0180]H，将免疫体DNA·的免疫接种(DCIB24)与SIINFEKL肽的免疫接种进行比较。在第0、7和14天对C57BI/6小鼠进行免疫并在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对SIINFEKL肽的滴定量来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0181]I，将免疫体DNA的免疫接种(DCIB15)与gpl00210M肽的免疫接种进行比较。在第0、7和14天对HHDII小鼠进行免疫并在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对gpl00210M肽的滴定量来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0182]图33:DCIB21 的序列
[0183]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Η2中的H印B S Ag表位(IPQSLDSffffTSL)和LI中的1-Ad限制的Flu HA⑶4表位(FERFEIFPKE)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0184]图34:可从⑶R H2位点加工多个表位。
[0185]A，在第O、7和14天用含有CDR H2中的SIINFEKL表位和CDR LI中的HepB CD4表位的免疫体构建体(DCIB24)对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对SIINFEKL肽、不相关肽、HepB CD4肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。[0186]B，在第0、7和14天用含有CDR H2中的H印B CD8表位和CDR LI中的Flu HA CD4表位的免疫体构建体(DCIB21)对Balb/c小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对H印B CD8肽、不相关肽、Flu HA CD4肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0187]图35:DCIB17 的序列
[0188]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(HMDQVPFSV)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0189]图36:DCIB26 的序列
[0190]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的Tie-2Z84表位(FLPATLTMV)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0191]图37:可从可变区域加工多个CTL表位。
[0192]A，在第0、7和14天用含有去掉部分骨架的⑶R Hl中的gplOOMDQVPFSV表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位的免疫体构建体(DCIB17)对HHDII小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对gplOOMDQVPFSV肽、HepB⑶4肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0193]B，在第0、7和14天用含有去掉部分骨架的⑶R Hl中的Tie2表位和⑶R LI中的HepB⑶4表位的免疫体构建体(DCIB26)对HHDII小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对Tie2肽、HepB CD4肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。[0194]图38:可从相同免疫体构建体中不同表位生成多种CTL应答。
[0195]HLA-A2限制的gplOO表位MDQVPFSV被人工引入CDR Hl位点并与CDR H2中的TRP2表位SVYDFFVWL并排，而且H印B CD4表位存在于CDR LI位点(DCIB15)。
[0196]A，在第O、7和14天用免疫体DNA对HHDII小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对gplOO肽、TRP2肽、HepB辅助肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0197]B，通过测量对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的应答而测定了来自被免疫的小鼠的脾细胞对gplOO修饰的MDQVPFSV (?)表位、gplOO野生型ITDQVPFSV表位(▲)和TRP2表位的亲和力。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0198]C，来自被免疫小鼠的脾细胞在4小时的51Cr释放测定中针对被gplOOMDQVPFSV肽、TRP2肽或对照所脉冲的T2细胞和B16F10和B16F10HHD黑素瘤细胞系的细胞毒性。
[0199]D，在第0、7和14天用含有i) CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和CDR LI中的H印B CD4表位(DCIB15)或ii)CDR H2中的TRP2表位和CDR LI中的H印B CD4表位(DCIB18)的免疫体DNA对HHDII小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对gplOO肽(_)、TRP2肽(圍)、HepB辅助肽(議)和培养基对照(□)来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0200]E，使用10 μ g DNA的溶液结合电穿孔通过肌肉内对C57BI/6小鼠进行免疫。在胫骨肌中隔周地进行三次免疫接种。单独使用DCIB24或DCIB18，二者结合地在相同位点或二者同时地但在分开的位点对小鼠进行免疫。在第19天分析脾细胞以确定TRP2、SIINFEKL肽特异性免疫应答的存在。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0201]图39:DCIB37 的序列
[0202]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100F7L表位(TITDQVPLSV)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0203]图40:DCIB40 的序列
[0204]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100F7I表位(TITDQVPISV)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0205]图41:DCIB41 的序列
[0206]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100野生型表位(TITDQVPFSV)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0207]图42:DCIB42 的序列
[0208]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100F7Y表位(TITDQVPYSV)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0209]图43:DCIB43 的序列
[0210]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100V5L表位(TITDQLPFSV)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0211]图44:非锚定残基的修饰能提高表位的免疫原性。
[0212]在第0、7和14天用含有⑶R Hl区域中被修饰的gplOO表位的免疫体构建体(DCIB37、DCIB40、DCIB41、DCIB42 和 DCIB43)对 HHDII 小鼠进行免疫。在第 19 天通过 IFNy酶联免疫斑点测定针对gplOO野生型表位肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0213]图45:DCIB35 的序列
[0214]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV), H2 中的 TRP2 表位(SVYDFFVWL)和 LI 中 HLA-DR4 限制的 gP100CD4 表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0215]图46:多个⑶4辅助应答可被处理和呈递以引发体内的免疫应答。
[0216]A，在第0、7和14天用含有⑶R LI区域中1-Ab限制的H印B⑶4表位的免疫体构建体(DCIB15)对HHDII或C57BI/6小鼠进行免疫。
`[0217]B，在第0、7和14天用含有CDR LI区域中1-Ad限制的Flu HA CD4表位(DCIB21)对Balb/c小鼠进行免疫。
[0218]C，在第O、7和14天用含有⑶R LI中HLA-DR4限制的gplOO⑶4表位的免疫体构建体(DCIB35)对HLA-DR4转基因小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对相应的肽、不相关肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0219]D，在第 0、7 和 14 天用含有 CDR LI (DCIB35)中、CDR H3 (DCIB54)中和 CDR L3(DCIB50)中HLA-DR4限制的gplOO⑶4表位的免疫体构建体对HLA-DR4转基因小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对相应的肽、不相关肽和培养基对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0220]图47:DCIB50 的序列
[0221]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(TIMDQVPFSV), H2 中的 TRP2 表位(SVYDFFVWL)和 L3 中 HLA-DR4 限制的 gP100CD4 表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0222]图48:⑶8T细胞应答部分地依赖于分泌的重链但辅助应答不需要分泌的轻链。
[0223]A，在第O、7和14天用含有i) CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位(DCIB15)，ii)在重链上不含前导序列的⑶R Hl中的gplOO表位、⑶R H2中的TRP2表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位，iii)在轻链上不含前导序列的⑶R Hl中的gp 100表位XDR H2中的TRP2表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位的免疫体DNA构建体对HHDII小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对gplOO (正方形)和！fepB CD4(議)肽和培养基对照(□)来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0224]B，通过夹心Elisa对来自CHO-S转染子上清液的重链、轻链和完整免疫体的确定。将抗人Fe特异性抗体或抗人κ链抗体涂布在板上。为了检测重链，抗人IgG Fe特异性HRP抗体与抗人Fe特异性涂布抗体共同使用。为了检测完整免疫体，抗人κ链特异性HRP抗体与抗人Fe特异性涂布抗体共同使用。为了检测轻链，抗人κ链特异性HRP抗体与抗人κ链特异性抗体共同使用。
[0225]C，在第O、7和14天用含有i) CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位(DCIB15)，ii)在重链上不含前导序列的⑶R Hl中的gplOO表位XDR H2中的TRP2表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位的免疫体DNA构建体对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对TRP2肽来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0226]D，在第0、7和14天用含有i) CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位(DCIB15)，ii)在重链上不含前导序列的⑶R Hl中的gplOO表位XDR H2中的TRP2表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位的免疫体DNA构建体对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对H印B辅助肽来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0227]图49:免疫体Fe区域有利于建立有效的免疫应答。
[0228]A，在第O、7和14天用含有i) CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和CDR LI中的H印B CD4表位(DCIB15)，ii)缺少Fe区域的CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和CDR LI中的H印B CD4表位的免疫体DNA构建体对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对TRP2 ( _ )肽、培养基对照(□)、B16F10黑素瘤系(正方形)和B16F10siKb阴性对照细胞系(正方形)来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0229]B，在第0、7和14天用含有i) CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和CDR LI中的H印B CD4表位(DCIB15)，ii)缺少Fe区域的CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和CDR LI中的H印B CD4表位的免疫体DNA构建体对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对TRP2肽来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0230]C，为了 IfepB辅助肽的特异性应答，分析了相同的小鼠。用斑点/百万个脾细胞来
测量应答。
[0231]D，通过测量对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的应答而测定了来自被DCIB15或缺少Fe区域的DCIB15 (DCIB15FcStop)免疫的小鼠的脾细胞对TRP2表位的亲和力。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0232]E，在第0、7和14天用含有i)CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和CDR LI人IgGl中的HepB CD4表位(DCIB15)，ii)带有人IgG2恒定区域的相同构建体(DCIB33), iii)带有人IgG3恒定区域的相同构建体(DCIB65)，iv)带有被人IgG2结合基序替换的人IgGl结合基序的相同构建体(DCIB66)以及V)带有被人IgGl基序替换的结合基序的DCIB33 (DCIB67)的免疫体DNA构建体对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对TRP2肽()、培养基对照(□)和H印B辅助肽(麵)来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0233]F，通过夹心 Elisa 对来自 CH0-S 转染子(DCIB15、DCIB33、DCIB65、DCIB66 和DCIB67)上清液的重链、轻链和完整免疫体的确定。将抗人Fe特异性抗体或抗人κ链抗体涂布在板上。为了检测重链，抗人IgG Fe特异性HRP抗体与抗人Fe特异性涂布抗体共同使用。为了检测完整免疫体，抗人κ链特异性HRP抗体与抗人Fe特异性涂布抗体共同使用。为了检测轻链，抗人κ链特异性HRP抗体与抗人κ链特异性抗体共同使用。
[0234]G，通过夹心Elisa对来自被DCIB53转染的CH0-S的上清液中的重链免疫体的确定。将抗小鼠Fe特异性抗体涂布在板上。为了检测重链，抗小鼠IgG2a特异性HRP抗体被使用。
[0235]图50:免疫体免疫接种提高免疫应答并克服在全抗原中观察到的调节。
[0236]A，在第0、7和14天用免疫体DNA构建体DCIB15或pcDNA3载体中的全gplOO抗原对HLA-A2转基因小鼠(HHDII)进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对gpioo肽或对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0237]B，通过在腹膜内注射400 μ g抗CD25抗体(PC61)使C57BI/6小鼠耗尽CD25阳性细胞。接下来在第4、11和18天用免疫体DNA构建体DCIB15或pOrig载体中的全TRP2抗原对耗尽⑶25的小鼠和未耗尽的动物二者进行免疫。在第23天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对TRP2肽或对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0238]C和D，HHDII小鼠未被处理(C)或被腹膜内400 μ g的PC61mAb处理(d)。4天后，使用Tie2C200HFc DNA构建体对所有小鼠进行免疫。间隔7天重复进行DNA免疫接种一共3次。最后一次免疫接种之后6天，收集脾细胞并通过先体外后体内的IFNy酶联免疫斑点测定使用1 μ g/ml的来自Tie-2的每一个预测的CTL表位重新刺激。柱表示每只单个小鼠的被归一化至背景对照的三个值的平均，而误差棒代表与平均值的标准偏差。
[0239]E和F，HHDII小鼠未被处理(e) (n=3)或被腹膜内400 μ g的PC61抗体处理(f)(n=2)。4天后，在IFA (皮下)中使用按1:1混合的100 μ g Z12肽和IOOyg Z48肽对所有小鼠进行免疫。第一次肽免疫接种之后7天重复施用肽免疫接种。最后一次免疫接种之后14天，收集脾细胞并通过IFN Y酶联免疫斑点测定使用1μ g/ml的Z12肽(黑柱)或单独的培养基(空柱)重新刺激。柱表示三个值的平均，而误差棒代表与平均值的标准偏差。
[0240]G，在IFA (皮下)中使用按1:1混合的100 μ g Z12肽对HHDII小鼠进行免疫。第一次肽免疫接种之后第7和14天重复施用肽免疫接种。最后一次免疫接种之后7天，收集脾细胞并分析以证实对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的表位特异性应答的存在。用斑点/百万个脾细胞来测量来自单个小鼠的应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0241]H，在第0、7和14天通过基因枪使用免疫体DNA构建体DCIB71对HHDII小鼠进行免疫。最后一次免疫接种之后7天，收集脾细胞并分析以证实对IFN Y酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的表位特异性应答的存在。用斑点/百万个脾细胞来测量来自单个小鼠的应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0242]图51:DCIB71 的序列
[0243]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的Tie-2Z12表位(ILINSLPLV)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0244]图52:DCIB72 的序列
[0245]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Η2中的Tie-2Z12表位(ILINSLPLV)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0246]图53:异种Fe在提供T细胞辅助方面的角色以及抗原特异性T细胞辅助的要求。
[0247]A，在第O、7和14天用含有⑶R Hl中的gplOO表位或⑶R H2中的TRP2表位(相应地，IB17和IB18)的重链免疫体DNA构建体对C57BI/6或HHDII小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针 对gplOO肽或TRP2肽和对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0248]B，通过测量对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的应答而测定了来自被含有CDR H2中TRP2表位的免疫体重链免疫的小鼠的脾细胞对TRP2表位的亲和力。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0249]C，在第O、7和14天用含有⑶R Hl中的gplOO表位、⑶R H2中的TRP2表位和⑶RLI人IgGl中的H印B CD4表位(DCIB15)或者CDR Hl中的gplOO表位、CDR H2中的TRP2表位和带有鼠IgG2a恒定区域的⑶R LI中的H印B⑶4表位(DCIB53)的免疫体DNA构建体对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对TRP2肽、HepB辅助肽和对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0250]D，通过测量对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的应答而测定了来自被DCIB15和DCIB53免疫的小鼠的脾细胞对TRP2表位的亲和力。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0251]E，在第0、7和14天用含有CDR Hl中的gpl00DR4表位、CDR H2中的TRP2表位和CDR H3 人 IgGl 中的 gpl00DR7 表位(DCIB54)或者 CDR Hl 中的 gpl00DR4 表位、CDR H2 中的TRP2表位和带有鼠IgG2a恒定区域的CDR H3中的gpl00DR7表位(DCIB64)的免疫体DNA构建体对HLA-DR4转基因小鼠进行免疫。在第19天通过IFN Y酶联免疫斑点测定针对TRP2肽、gpl00DR4辅助肽和对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0252]F，通过测量对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的应答而测定了来自被DCIB54和DCIB64免疫的小鼠的脾细胞对TRP2表位的亲和力。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0253]图54:DCIB53 的序列
[0254]表达载体pDCOrig moigG2a中鼠的重和轻全长链的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl中的GP100210M表位(HMDQVPFSV)、H2中的TRP2表位(SVYDFFVWL)和LI中的H印B⑶4表位(TPPAYRPPNAPIL)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/Hpal限制性位点被突出显示。
[0255]图55:DCIB64 的序列
[0256]表达载体pDCOrig moigG2a中鼠的重和轻全长链的核苷酸和氨基酸序列。终止密码子由星号标明。方框中的氨基酸代表Hl中HLA-DR7限制的gplOO⑶4表位(GTGRAMLGTHTMEVTVYH)、H2 中的 TRP2 表位(SVYDFFVWL)和 H3 中 HLA-DR4 限制的 gpl00CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的HindIII/Afe I和BamHI/Hpal限制性位点被突出显示。
[0257]图56:免疫蛋白酶体的加工对于免疫体构建体中表位的应答的产生是重要的。
[0258]在第0、7和14天用含有CDR Hl中的gpl002°9_217表位(DCIB41)或CDR Hl中修饰版的gpl00210M (DCIB15)对HHDII小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对gpl002°9_217肽或gpl00210M肽和对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0259]图57:不同免疫接种方法对于从免疫体疫苗引发免疫应答是有效的。
[0260]A，在第0、7和14天用免疫体DNA (DCIB15)通过基因枪进行肌肉内+/-电穿孔或皮内+/-电穿孔而对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对TRP2肽或H印B辅助肽和对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0261]B，通过测量对IFNy酶联免疫斑点测定中增加的肽浓度的应答而测定了来自被不同途径免疫的小鼠的脾细胞对TRP2表位的亲和力。用斑点/百万个脾细胞来测量应答，而亲和力被指定为导致50%最大效应功能的浓度。
[0262]图58:免疫体免疫接种诱发类白癜风脱色素作用并保护免受肿瘤的攻击。
[0263]A，被含有⑶R H2中的TRP2表位和⑶R LI中的H印B⑶4表位的免疫体DNA(DCIB18)免疫的C57BI/6小鼠证明在免疫接种位点的毛发生长中的脱色素作用。
[0264]B，在第3次和第4次免疫接种之间通过静脉内注射用2X104个B16F10IFNa细胞攻击被免疫的C57BI/6小鼠。在肿瘤攻击之后49天评估肺中的肿瘤负荷。肿瘤负荷被表示为平均肿瘤面积所占总的肺面积的百分比。在最后一次免疫接种之后7天经过皮下用2X104个B16F10IFNa细胞攻击被免疫的小鼠。以3_4天的间隔测量肿瘤尺寸，而且一旦肿瘤生长超出限制，就将小鼠安乐死。
[0265]C，肿瘤注射后第46天评估的肿瘤尺寸。
[0266]D，存活率。
[0267]图59:免疫体免疫接种显著地推迟肿瘤生长。
[0268]A，使用2X104个B16F10细胞对C57BI6小鼠进行皮下注射。肿瘤注射4天后，使用DCIB52免疫体DNA对小鼠进行免疫。在肿瘤注射后第11和18天重复进行免疫接种。以3-4天的间隔分析肿瘤负荷，而且一旦肿瘤生长超出最大的允许限制，就将小鼠安乐死。绘制肿瘤体积对时间的图表。
[0269]B，使用2X104fB16F10IFNa细胞对C57BI6小鼠进行皮下注射。肿瘤注射14天后，使用DCIB52免疫体DNA对小鼠进行免疫。在肿瘤注射后第21和28天重复进行免疫接种。以3-4天的间隔分析肿瘤负荷，而且一旦肿瘤生长超出最大的允许限制，就将小鼠安乐死。显示在肿瘤植入后第47天的肿瘤体积。
[0270]C，使用2 X IO4·个B16F10细胞在皮下而且在适当情况下使用抗⑶25抗体在腹膜内对C57BI6小鼠进行注射。肿瘤注射4天后，使用DCIB52免疫体DNA或对照免疫体DNA对小鼠进行免疫。在肿瘤注射后第11和18天重复进行免疫接种。在适当情况下，在第11天将免疫接种与抗CTLA-4抗体的腹膜内注射相结合。以3-4天的间隔分析肿瘤负荷，而且一旦肿瘤生长超出最大的允许限制，就将小鼠安乐死。绘制肿瘤体积对时间的图表。
[0271]图60:DCIB68 的序列
[0272]与表达载体pDCOrig中人IgGlFc和κ恒定区域符合读框的被克隆到重和轻可变区域的核苷酸和氨基酸序列。方框中的氨基酸代表Hl和L3中的HLA-DR7限制的gplOO⑶4表位(GTGRAMLGTHTMEVTVYH)、H2 中的 TRP2 表位(SVYDFFVWL)和 H3 和 LI 中的 HLA-DR4 限制的gpl00CD4表位(WNRQLYPEWTEAQRLD)。被用在来自单个构建体可变重和轻区域的转移中的Hindlll/Afe I和BamHI/BsiWI限制性位点被突出显示。
[0273]图61:免疫应答可由不同载体骨架表达的免疫体构建体生成。
[0274]在第O、7和14天用含有CDR Hl中的gpl00DR4表位、CDR H2中的TRP2表位和CDRH3人IgGl中的gpl00DR7表位的免疫体DNA构建体(DCIB54，B1-3)和pVax载体中的等价构建体(VaxDCIB54，Cl-3)对C57BI/6小鼠进行免疫。在第19天通过IFNy酶联免疫斑点测定针对TRP2肽和对照来分析脾细胞。用斑点/百万个脾细胞来测量应答。
[0275]发明详述
实施例
[0276]方法
[0277]DNA载体的牛成
[0278]使用PCR 来扩增 pSVg`ptHuigGl 和 pSVhygHuCk 载体(Biovation Ltd)中的 SC100克隆VHd VKb (W001/88138)的去免疫鼠重和轻可变区域。使用HindIII/Afe I和BamHI/BsiWI位点将V1^P'区域PCR产物与人IgGl和κ恒定区域符合读框地克隆以生成单链构建体pOrigHIB和pOrigLIB (参见图1和2)。通过双脱氧链终止法来确认全长嵌合重和κ 链的序列(Sanger 等，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of Americal977; 74:5463-7)。嵌合重和轻链的DNA和被翻译的蛋白序列分别被显示在图3和4。互补决定区域(⑶R)的位置被指明。
[0279]除了保持六个氨基酸的重CDR2区域以外，重和轻链的CDR被完全除去并交换为独特的限制酶位点。这通过仔细检查序列任一侧的区域以便进行允许限制酶位点生成的切除来实现。这些独特的限制性位点被用来打开DNA以使编码抗原表位的寡核苷酸可被插入。通过引入表位引物而将在限制性位点生成中失去的多数骨架序列替换，从而保证氨基酸在翻译时被保持并且所述序列符合读框地保留。表1列出所有CDR的被选酶位点和表位寡核苷酸序列。
[0280]⑶R区域被除去并用独特的限制性位点通过重叠延伸PCR替换，如图5所示。对于重可变区域，寡核苷酸H1、H2和H3 (参见表2)被设计为替换三个⑶R中的每一个。每个特定的引物含有10_20bp的序列,其被并入酶位点的任一侧。与结合至人IgGl恒定区域的普通反向引物huHeClonR (参见表2)结合使用，第一轮PCR被设置成由1μ I的模板质粒p0rigHIB,2y I的dNTPS(2.5πιΜ)、5μ I的10Χ的Taq聚合酶缓冲液、I μ I的正向和反向引物(25pmol)、用无菌蒸懼水配成的终体积为50μ I的5个单位的Taq聚合酶(New EnglandBiolabs)组成。反应经历了在95°C下5分钟的最初变性，接着是在95°C下30s的35个循环，在55°C (退火)下I分钟，和在72°C (延伸)下I分钟。最后一个循环包含使用TechnePHC-1可编程循环反应器的10分钟的延伸。相似地，对于轻可变区域，寡核苷酸L1、L2和L3被设计为替换三个CDR中的每一个(参见表2)。第一轮PCR按照上述被设置，但含有结合至人κ链的恒定区域以及模板pOrigLIB的反向引物huLiClonR (参见表2)。
[0281 ] 表1.⑶R替换酶和表位寡核苷酸序列的列表
【权利要求】
1.一种核酸，其包括非特异性启动子和编码免疫球蛋白分子的重组重链的至少一种序列，其中所述重链中具有至少一种异源性T细胞表位以致于所述重链在所述核酸被表达时不能采取它的天然构象。
2.根据权利要求1中所述的核酸，其还包括编码免疫球蛋白分子的轻链的至少一种序列。
3.根据权利要求1中所述的核酸，其与包括编码免疫球蛋白分子的轻链的至少一种序列的核酸相组合。
4.根据权利要求2或权利要求3中所述的核酸，其中所述轻链中具有至少一种异源性T细胞表位。
5.根据权利要求4中所述的核酸，其中所述T细胞表位使得当所述核酸被表达时所述轻链不能采取它的天然构象。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸，其中所述至少一种T细胞表位是在重链和/或轻链的可变区域中。
7.根据权利要求6中所述的核酸，其中所述至少一种T细胞表位是在所述抗体的重链和/或轻链的至少一种⑶R中。
8.根据权利要求7中所述的核酸， 其中所述⑶R是⑶RL1、⑶RHl和/或⑶RH2。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸，其中编码所述至少一种T细胞表位的序列被插入编码所述重链或轻链的序列中。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸，其中编码所述至少一种T细胞表位的序列被取代进编码所述重链或轻链的序列中。
11.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其编码抗体。
12.根据权利要求11中所述的核酸，其中所述抗体是单克隆抗体。
13.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述至少一种T细胞表位是细胞毒性T细胞表位。
14.根据前述权利要求中任一项所述的核酸，其中所述至少一种T细胞表位是辅助T细胞表位。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的核酸，其中所述重链和/或轻链具有至少一种细胞毒性T细胞表位和至少一种辅助T细胞表位。
16.一种核酸，其包括非特异性启动子和编码重组免疫球蛋白分子的至少一种序列，其中所述免疫球蛋白分子中具有至少一种异源性T细胞表位以致于当所述核酸被表达时所述免疫球蛋白分子不能采取它的天然构象。
17.根据权利要求16中所述的核酸，其通过权利要求1至15中任一项所述的特征来修饰。
18.一种疫苗，其包括前述权利要求中任一项所述的核酸以及佐剂。
19.一种药物组合物，其包括权利要求1至17中任一项所述的核酸和药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂。
20.根据权利要求1至17中任一项所述的核酸，其用于医学。
21.根据权利要求20中所述的核酸，其用于激发针对至少一种T细胞表位的免疫应答。
22.根据权利要求1至17中任一项所述的核酸在制备用于激发针对至少一种T细胞表位的免疫应答的 药物中的用途。
【文档编号】A61K39/00GK103667304SQ201310487984
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2008年3月28日 优先权日:2007年3月28日
【发明者】林达·吉利恩·达兰特, 瑞切尔·路易斯·麦瑟瑞汉姆, 维多利亚·安妮·普德尼 申请人:斯堪赛尔有限公司