将核酸和/或蛋白质导入呼吸系统的方法与制剂的制作方法

专利名称：将核酸和/或蛋白质导入呼吸系统的方法与制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及细菌学、免疫学及基因治疗领域。总的来说，本发明涉及应用修饰的正常微生物群将疫苗、变应原以及治疗性药物递送至呼吸道黏膜表面。特别是本发明为诱导M-细胞介导的对病原体的免疫反应提供了新的药物与方法，尤其是疫苗制备、递送以及黏膜免疫法，该方法应用乳酸菌、酵母菌以及与大肠杆菌融合的乳酸菌使源于病原微生物的抗原决定簇呈现于细胞表面或者分泌表达，或者分泌一种治疗性蛋白质。
参考文献 本申请参考了圆括号内所标示的各种出版物或专利，以阐明本发明相关领域当前的发展水平。我们通过参考每篇出版物或专利文献而使之成为一体，所引用的全部科学出版文献均列于文中或说明之末。
背景技术：
人体至少存在两个免疫系统“外周”或“全身”免疫系统与“黏膜”免疫系统(Ogra等，1994)，这两系统既可独立又可同时发挥作用，且可通过特定的淋巴细胞调节器而相互作用，产生有效的免疫反应。哪一免疫系统首先发生反应取决于机体获得病理性抗原和由某种淋巴组织处理的方式。
有效免疫反应的发生依赖于淋巴细胞相关细胞在血液、组织与淋巴间的持续运动(Anderson与Shaw，1996)。淋巴细胞通过迁移到脾与淋巴结的二级淋巴器官以及Peyer’s小结的特异性黏膜组织来接触经由血液、淋巴或黏膜入侵的外界抗原。抗原在什么地方以及被哪些细胞提呈给这些淋巴细胞极大地影响着免疫反应的结果，这些结果包括T细胞激活，B细胞产生特异性抗体以及将来记忆淋巴细胞和效应淋巴细胞的优先回巢。
淋巴流经淋巴结内固定的抗原提呈细胞时，淋巴内的抗原被滤过、捕获、处理与提呈。由淋巴结进行的抗原提呈主要产生“外周”免疫，适宜的B细胞产生特异性IgG或IgM抗体。血液中的抗原在脾内特定的血液/组织界面处被提呈，这主要激发“外周”免疫。然而由于脾脏相容抗原提呈细胞和来自其它各组织的活化T-细胞与B-细胞，这样两系统间的对话就有可能诱发外周免疫或黏膜免疫或者同时产生两种免疫反应。抗原在含腔器官(如呼吸道与胃肠道)的腔内被特殊上皮细胞“M”细胞非破坏性吞饮，并转运至Peyer’s小结内的淋巴细胞。这里发生的抗原提呈反应主要激发“黏膜”免疫反应，释放特异性IgA抗体到黏膜分泌物中。
鼻腔、喉咙、肺以及肠腔中的空腔与外界相通，将这些组织暴露于环境中有毒或致病的危险因素。呼吸道、胃肠道以及泌尿生殖道的黏膜表面由一层覆盖有黏液的上皮细胞组成，细胞间通过垫圈样的结构紧密连接一起，起到保护作用。黏膜表面提供了一道富含微生物的细胞屏障，这是病原体与宿主之间的第一个接触面，因而在预防感染性疾病方面至关重要。
口腔、咽与食道的上皮层由复层鳞状上皮组成，而上呼吸道的黏膜表面主要由单层简单的上皮细胞排列而成。下呼吸道中的肺上皮细胞对富含病原体的外部环境的抵抗能力较强。这一广阔的细胞屏障由活跃地吸收空气的精细的单层细胞组成，通常情况下能够排斥潜在的有害物质与抗原物质。
在呼吸道黏膜上皮层中，有少量的淋巴组织构成了有机的黏膜淋巴滤泡-相关上皮(FAE)组织。尽管大分子物质和微生物不能通过呼吸道的上皮组织侵入，但是在位于上呼吸道的Peyer’s斑这样的黏膜诱导位点中，淋巴FAE含有微褶皱或M细胞，微褶皱或M细胞可以转运抗原及微生物以进行抗原取样。简单上皮内的M细胞仅仅发生于有组织的淋巴滤泡。因而在富含M细胞的FAE位点内，存在特定上皮细胞与抗原提呈细胞及淋巴细胞之间高度发达的协作。通过活跃的跨上皮细胞的小泡转运，M细胞把来自内腔的大分子物质、颗粒以及微生物经由细胞质直接转运到上皮内的黏膜淋巴滤泡和黏膜淋巴组织，以处理抗原，并激发黏膜免疫反应，导致分泌免疫。这一反应使得肺脏黏膜表面浸浴在保护性抗体之中。
所以M细胞在上皮屏障中提供了局部的功能性通道以进行小泡转运。M细胞局限于淋巴滤泡(FAE)上，通过及时将外源性物质和微生物暴露于吞噬细胞和抗原提呈细胞，减少了这些物质经由上皮屏障转运的固有危险。M细胞朝向内腔的顶部表面不同于周围的其它细胞它们缺乏典型的刷状缘，而具有变化不定的微绒毛，或具有庞大微绒毛间内吞区域的微褶皱。M细胞的基部内陷形成上皮内的“口袋”或间隙，构成其自身特征。这既缩短了跨细胞囊泡从细胞顶部到基侧部所必须通过的距离，同时又为B细胞和CD4T细胞之类的淋巴细胞、巨噬细胞以及树枝状细胞的聚集提供了停靠位点。M细胞基部还延伸到底部淋巴组织内，与淋巴细胞或/和抗原提呈细胞直接接触，可能对M细胞转运后的抗原提呈发挥作用。
M细胞以几种不同的跨细胞方式参与如下过程将外源性物质转运到位于M细胞顶部胞浆中的内体管、囊泡以及大的多囊泡体中去，然后通过胞吐作用将这些物质释放到囊中。粘附性病毒与大分子物质经由网格蛋白小窝与囊泡，通过吸附性胞吞作用被摄取；而非黏附性物质则经由网格蛋白包被或未包被的囊泡，通过液相胞吞作用被摄取。大的黏附性颗粒与细菌能触发吞噬作用，这一过程涉及细胞的延展以及膜下肌动蛋白网的重组。
M细胞引导完整的大分子物质由屏障一侧向另一侧转运的功能涉及膜小泡的定向运动。尽管M细胞中这种转运的分子机制尚未明确，但是我们可以有把握地设想M细胞介导的膜转运的完成依赖于极化上皮细胞所具有的特征，即极化的结构和信号传导网络。M细胞的跨上皮小泡转运是物质胞吞作用的主要途径，这使M细胞在上皮细胞中独具特色。研究表明在M细胞顶部表面形成的胞内小泡首先将其运载物运送到顶部细胞浆中的内体，内体含有蛋白酶，并能酸化其内含物。
B细胞是M细胞口袋中的主要成分之一，口袋中的B细胞表达IgM而不表达IgG或IgA，提示在这里存在记忆B细胞和/或最初的B细胞分化发生在此。B细胞记忆表型的存在提示口袋内的细胞已为再次暴露于入侵抗原做好了准备。研究表明转移到M细胞口袋中的B淋巴母细胞可以反复暴露于抗原，扩展免疫反应并且使之多样化。但在FAE的正下方，也存在大量足以启动免疫反应的其它B淋巴母细胞、辅助T细胞以及抗原提呈细胞。
M细胞跨细胞转运的腔内抗原被直接转运到抗原加工细胞与抗原提呈细胞，这些细胞随后迁移到其下定位于鼻腔相关淋巴组织(NALT)的淋巴滤泡内的抗原特异性淋巴细胞，进一步诱导抗原特异性淋巴细胞的增殖。因此，抗原与微生物通过M细胞的过程是黏膜免疫反应发生的关键步骤。该过程引起产生IgA的B细胞增殖分化，其中部分细胞进入脉管系统，随后返回黏膜表面，有效地激发特异性黏膜免疫。
诱导黏膜免疫反应的第一步是将抗原转运通过上皮屏障。抗原在诱导位点加工、提呈后，产生IgA的抗原特异性B淋巴母细胞在局部增殖，并通过血流迁移到局部和远处的黏膜及分泌组织，在这里它们主要分化为产生IgA多聚体的浆细胞，浆细胞是NALT的重要组分，它们经过受体介导的胞吞转运作用，通过上皮细胞进入腺体与黏膜分泌物中。
所以，黏膜免疫反应构成了机体防御黏膜传播病原体(如流行性感冒病毒)的第一道防线，并对长期保护起到非常重要的作用。机体对抗病原体的黏膜防御既包括象黏液、上皮组织以及先天性免疫机制之类的先天性屏障，又包括适应性宿主免疫，后者在黏膜表面主要由CD4+T细胞、分泌性免疫球蛋白A(S-IgA)以及抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)组成。在健康状态下，M细胞介导的转运以及由此引起的抗菌性S-IgA的分泌，限制了黏膜疾病的强度与持续时间，并能防止再感染。
参与黏膜免疫反应的主要抗体是分泌性免疫球蛋白A(S-IgA)，它的产生是黏膜免疫系统的特点，构成了防止病原体入侵深部组织的第一道重要防线(Underdown和Mestecky，1994)。黏膜免疫系统产生的抗体在眼结膜、鼻咽、口咽、胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道，以及外分泌腺导管或腺泡等湿润上皮组织的腔表面发挥体外作用。因而这类抗体需要两类细胞协作才能发挥最佳活性一种细胞产生IgA，另一种细胞则将IgA转运到其发挥作用的呼吸系统腔内。
S-IgA通过pIgR(受体)介导的胞吞转运作用产生。分泌型IgA由固有层B浆细胞产生，通过遍布肠道的隐窝上皮细胞转运至腔内。抗体-形成浆细胞释放出翻译后与J链偶联的IgA二聚体。J链将两个IgA多聚体分子联系在一起，并促进其结合上皮细胞离腔侧的多聚免疫球蛋白受体(pIgR)。这一复合体在内体中被转运到上皮细胞腔侧，并释放到分泌物中。多聚免疫球蛋白受体与分泌型IgA结合的部分被称作分泌成分。通过切断受体，S-IgA从pIgR释放出来，导致pIgR与pIgR的分泌成分共价结合。IgA一旦被分泌到腔中，就不再黏附于肠细胞顶部表面，而是选择性地与M细胞顶膜黏附。
抗原暴露于黏膜部位后，进一步激活黏膜B淋巴细胞与T淋巴细胞，使其从诱导位点迁出，并归巢至各种黏膜效应部位。通常黏膜免疫系统涉及抗原特异性淋巴细胞归巢到各种黏膜效应部位，而不是归巢到最初的抗原暴露部位。该路径几乎是B细胞介导的黏膜表面S-IgA抗体反应所专有的，但T细胞也会出现类似情况。
在M细胞口袋中发现的另一重要成分是T细胞，T细胞表达辅助T细胞1(Th1)细胞因子或者表达辅助T细胞2(Th2)细胞因子。辅助T细胞在激发全身及黏膜免疫系统，发生抗原特异性的体液免疫与细胞免疫过程中都起重要作用。细胞因子促使辅助T细胞0(Th0)分化成辅助T细胞1(Th1)或者辅助T细胞2(Th2)。Th0细胞向Th1或者Th2的分化分别受细胞因子如白细胞介素12(IL-12)，、干扰素g(IFN-g)与IL-4的驱动。例如病毒与细胞内细菌等细胞内病原体促使活化的巨噬细胞产生IL-12，后者诱导自然杀伤细胞(NK)产生IFN-g，驱使Th0细胞向Th1表型分化，诱导产生细胞介导的免疫反应。
Th1型反应与细胞介导的免疫反应有关，如迟发型过敏反应与IgG2a抗体反应。当Th1反应占优势时(比如在皮肤引流淋巴结中)，辅助T细胞分泌IL-2，IL-12与IF-γ，导致选择性表达IgG、细胞毒性T细胞被激活、单核噬菌细胞具备噬菌能力等过程。(Weinstein等，1991；Kang等，1996；Ariizumi等，1995)。
Th2反应占优势时(比如在黏膜部位)，辅助T细胞分泌IL-4、5、6、10等，导致选择性表达包括IgA在内的不同免疫球蛋白(Hiroi等，1995；Lebman与Coffinan，1994)。在黏膜部位，大量TGFβ-1控制Th0细胞分化成Th2细胞(Lebman与Coffman，1994；Young等，1994)，Th2细胞分泌的细胞因子促使表达IgA的B细胞增殖、分化。TGFβ-1还通过促进免疫球蛋白重链基因向IgA转型，并抑制其它类型免疫球蛋白的表达，促进IgA的选择性表达。(Lebman与Coffinan，1994；Stavnezer，1995)。TGFβ-1并非广泛分布于选择性表达IgG抗体与Th1细胞反应的外周淋巴结中。当遇到外源性抗原时，Th0细胞分化成Th2，促使CD4+T细胞产生IL-4；IL-4诱导Th2细胞产生、分泌更多IL-4，促进Th2增殖，同时诱导更多的Th0细胞向Th2细胞转化。IL-4还促进IgG、IgE以及IgA的产生。
虽然S-IgA是保护黏膜表面的主要效应分子，但是外周细胞免疫系统也发挥重要作用。细胞介导的免疫反应相对于抗体介导的免疫反应具有如下优势T细胞能够识别来源于病原体(如流行性感冒病毒)核心蛋白的肽类。感染过程中核心蛋白的表达与提呈通常远远早于诱导产生中和抗体的蛋白质的表达与提呈。所以，尽管在免疫反应的后期也形成针对核心蛋白的抗体，但是细胞介导的免疫反应(CMI)发生在抗体产生之前，构成机体的早期防线。CD4+辅助T细胞除支持体液免疫外，还产生介导迟发型变态反应并支持CTL的细胞因子，从而支持CMI。例如，Th1细胞支持主要组织相溶性复合体(MHC)-限制的CTL反应。
细胞内病原体引起的黏膜感染最终诱导产生细胞介导的免疫反应，如CD4+Th1以及CD8+毒性T淋巴细胞介导的免疫反应。参加外周与黏膜细胞介导免疫反应的T淋巴细胞又分成功能性亚群(Punt和Singer，1996)。辅助T淋巴细胞(CD-4)与细胞毒性T淋巴细胞(CD-8)均在免疫反应中发挥免疫调节作用；它们也可以分化成控制免疫反应不同方式及功能的各种效应细胞(Salgame，1991；Anderson与Shaw，1996；Ebnet等)。T细胞分泌的细胞因子控制着免疫反应性细胞在外周或黏膜免疫中所发挥的作用。
CTL通过识别病原特异性抗原/MHC复合体，在清除被各种细胞内病原体所感染细胞的过程中发挥重要作用。抗原特异性CTL抑制病原体进一步扩散，有助于感染的消除。已有报道表明抗原特异性的CTL反应是区域化的，局限于最初的感染灶。例如，肺部或肠内感染之后CTL首先聚集在黏膜相关的淋巴网状组织。CTL在黏膜的区域性存在可能有助于控制由细胞内病原体所引起的黏膜表面感染并使其得以痊愈。因为不同的病原体在宿主体内具有截然不同的感染途径或不同的定位区域，所以具有保护性及抗原特异性的CTL的聚集区域可能会因特异性病原体的不同而变化。但一般而言，黏膜感染主要在黏膜局部及黏膜相关的淋巴器官区域诱发抗原特异性CTL，CTL在病原体入口处即黏膜表面对黏膜感染进行控制。正常情况下，这些反应在分泌性免疫球蛋白A(S-IgA)抗体合成后不久发生。
帮助机体抗击感染性疾病的通常程序涉及免疫作用。通常免疫作用促使免疫系统在引发疾病的特异性病原体能够繁殖到足以引起症状之前就将其迅速清除。经典的免疫方法是接种完整病毒或细菌疫苗，疫苗中病毒或细菌已被杀死或者活力很弱，不能大量扩增。当监测到疫苗中存在外源性有机体时，机体的免疫系统就会象遭到入侵物有力攻击时一样发挥作用。免疫系统针对特异性抗原(被视为外来物的蛋白质)，动用各种力量来驱除、消灭明显的入侵物。
肠道外免疫是接种疫苗最普通的方式。它通常引起外周急性免疫反应，产生保护性IgM/IgG抗体与细胞介导的外周免疫反应。急性反应很快就减轻消退，但留下被称为“记忆”细胞的岗哨，它们保持警惕状态，随时准备全力对抗返回机体的病原体。尽管如此有效，但注射的疫苗最初避开了黏膜，通常不能刺激黏膜淋巴组织产生保护性抗体IgA，因此不能激发黏膜免疫反应。
这就出现了一个问题，因为许多通过全身循环扩散的有害物质，最初是通过黏膜感染经过鼻、口及其它入口进入体内。因此，这些有害物质所遇到的第一道防线是气道、消化道以及生殖道内的黏膜，这些黏膜构成了机体内最大的阻止病原体入侵的表面。要想建立抗击这些有害物质的保护反应，就需要不仅能诱导外周免疫反应而且可以诱导黏膜免疫反应的疫苗。如上所述，黏膜免疫反应被发动后，它所产生的IgA抗体就快速进入那些通道腔内，中和它们所能发现的任何病原体。有效反应也可以激活全身反应，其中循环的免疫细胞有助于破坏远处入侵物。
“肠胃外”接种疫苗的另一个并发症是经典疫苗有复活的危险，引起它们本欲阻止的疾病。
因为有这种并发症，人们正在寻求其它途径来进行免疫，以替代传统疫苗接种方式。其中一种方法为应用DNA疫苗。该方法是给予一种带有病原体DNA片段的质粒，诱导机体产生抗击各种病原体的保护反应。这些病原微生物包括B型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、腮腺炎病毒、疟疾与流感病毒。
目前正在研发的DNA疫苗也存在一些问题。首先疫苗的递送过程十分复杂，需要将基因或cDNA与适当的表达载体连接，转入适当的蛋白合成生物体(例如，大肠杆菌、酿酒酵母、毕氏酵母或者其它细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞)内，产生多拷贝目的基因。而且要分离DNA，转入另一表达体系，进入宿主体内，在内源性或外源性启动子控制下正确进行基因转录和翻译。使用多价表达载体(包括但不局限于噬菌体、粘粒、病毒以及质粒载体)是十分昂贵的，难于制备且很难导入。另外，为有效地将疫苗导入宿主体内，需要同时导入病毒元件，这就有形成有活力的重组逆转录病毒的危险。
诱导免疫防护反应的另一种途径是给予疫苗亚单位制剂，该制剂主要是由从病原体基因获得的具有抗原性的蛋白质组成。这些蛋白质本身无法引起感染，但是可以诱导产生全身性的、而不是黏膜局部的抗体与CTL。这些疫苗的生产、纯化与保存均十分昂贵。
与传统的疫苗接种方式有关的另一个问题是在人类宿主体内疫苗的生理学变化可能有助于新疾病的发生。新出现的病原体可能对抗体具有抗性，或通过基因重组而使其对抗宿主防御反应的能力更加强大。就如已经充分证实的流感病毒那样，重组事件或者缺乏与病原体的接触，均会引起人群免疫性的丧失。新出现的病原体的重组事件提高了感染率，就流感病毒而言，有时会引发大流行。
因此，尽管在疾病预防与免疫接种方面取得了很大的进展，但是新的以及复燃的感染性疾病正在扰乱平衡状态而利于寄生菌的生存。全身性免疫固然很重要，但仍需要继续开发黏膜疫苗以有效抗击这些新的疾病威胁。为此，目前正在研发口服疫苗，它们能够同时较好地激发“黏膜”和“外周”免疫，比普遍使用的肠外接种疫苗更为经济、方便。目前正在开发的口服疫苗倾向于开发、利用修饰的致病微生物，如沙门氏菌属，对其抗原进行修饰，用于口服免疫(Stocker，美国专利号4,837,151，沙门氏菌几个菌株的营养缺陷型变种；Clements等，美国专利号5,079,165，沙门氏菌无毒力菌株；Charles等，美国专利号5,547,664，活的减毒沙门氏菌)。尽管这些病原体已经被减毒，但仍有可能恢复其致病性而对宿主动物造成危害。
发明家们目前正在研究应用乳酸菌(LAB)作为生产与传递治疗性分子(如抗原)的活媒介的可能性。乳酸菌(LAB)属于革兰氏阳性细菌家族，该家族因其在工业性食品发酵中的应用及其益生菌的特性而为人们熟知。总的来说，LAB、乳酸球菌与嗜热链球菌具有的某些特性使其成为口服疫苗最具吸引力的候选者，这些特性包括辅佐活性、黏膜吸附特性及低的固有免疫原活性。
考虑到胃肠外接种疫苗、尤其是涉及DNA或亚单位疫苗时的固有问题，当今的发明家们研发了应用非致病性乳酸球菌和链球菌将抗原和治疗剂同时递送至上呼吸道的方法，以进行疫苗接种和/或基因治疗。
特别值得关注的菌种是乳酸乳球菌。它们是GC含量低的杆状细菌，在酪乳、酸奶、干酪、泡菜、啤酒、葡萄酒、面包及其它发酵食物的制备过程中发挥重要作用。L.lactis基因组包含6个原噬菌体(携带着近300个基因或约占总编码容量的14％)与43个插入元件。序列分析结果表明该菌二元信号换能元件的数量少，并且很少有δ-换能元件。基因组分析也证实该菌缺乏参与柠檬酸循环的基因和酶，但仍能维持有氧呼吸所必需的功能。嗜热性链球菌是另一值得关注的细菌，被应用于食品级的发酵过程中，如用于干酪的制作。
就普通乳酸菌而言，已经有几个程序用以产生LAB转化子。Leer等人(WO095/35389)介绍了一种将核酸注入微生物的方法，包括乳酸杆菌与双歧杆菌之类的微生物。Leer等人的方法是建立在转化过程开始之前细菌进行有限自分解基础之上的。已经公开发表的PCT申请PCT/NL96/00409揭示了筛选非致病性细菌，特别是筛选乳酸杆菌与双歧杆菌黏附于特异性黏膜受体能力的方法，同时也揭示了一种表达载体，它由表达启动子序列，核酸序列和允许核糖体识别与翻译的序列组成。这一文献表明多种乳酸杆菌能被转化，以表达包括致病性细菌蛋白在内的异基因产物。此外，已经应用口服重组L.lactis诱发了针对所表达抗原的局部IgA和/或血清IgG抗体反应。Wells等，Mol.Microbiol.81155-1162，1993。另外，Casas等人(美国专利号6,100,388)的研究表明可以用外源DNA转化L.reuteri，在细胞表面表达外源性蛋白质或将之分泌。而EP 1084709 A1揭示L.plantarum同样可以被转化，在细胞内或细胞表面表达抗原片段。相关文献参见U.S.Pat.Nos.5,149,532及6,100,388。
所有这些参考文献均表明在接种疫苗时可以使用某些种属细菌。但是他们所介绍的方法都很费时、昂贵、效率低，并且上面所提及的参考文献主要针对胃肠道，而忽略了呼吸道的各种黏膜表面。
另外，就目前所使用的方法而言，对于用来传递抗原的每一特异种属可能需要不同的表达系统。通常需要研发适当的启动子、增强子及选择性标志，可能需要进行几种不同的转化来确定可行系统，以保证体内和体外适当的表达水平。所有这些程序均需很多时间与经费。现在所需要的就是在经济可行的、安全的乳酸菌内，用一个人们已知的、经济可行的表达系统来表达外源蛋白，将抗原和/或治疗剂导入呼吸道。凭借目前发明家的工作，我们在此提出了这一系统。
发明概要 由于胃肠外接种免疫本身伴有一些并发症，特别是不能激发黏膜免疫反应，对于最初通过黏膜感染的致病原缺乏对机体的保护作用，且减毒的活疫苗微生物具有突变为致病形式的危险，我们研究了另一种预防疾病的方法，该方法对接种疫苗与基因治疗都有效。
成功开发以DNA或蛋白为基础的药物，以及治疗恶性肿瘤的最大障碍是药物的递送方法。以呼吸系统为目标时，递送过程特别复杂且低效。目前正在研究的方法涉及裸DNA/脂质结合的转化方法，其转化速率低；或者涉及疾病特异性表达载体，该载体具有宿主特异性，且很难产生、保存及用药。另外通常研究的递送机制涉及病毒元件的应用，这就有形成有活力的重组逆转录病毒的危险。
如上所述，我们正在研究能够同时诱导黏膜与全身免疫反应的很有希望的理论，该理论涉及通过细菌、酵母等活微生物将黏膜疫苗导入呼吸道。有证据表明呼吸道存在着M细胞介导的免疫途径，它通过上呼吸道的鼻相关淋巴组织(NALT)，既可诱导黏膜免疫反应，也可以诱导全身(细胞介导)免疫反应。普通的CTL细胞在发挥活性之前需要从远处位点迁移到全身各区域；与之不同，在与NALT相关的黏膜表面发生的抗原特异性CTL反应是受局部CTL诱导所支配的。
因此M细胞口袋内的抗原特异性CTL在任何黏膜位点均可以发生快速的保护性反应——这主要意味着疫苗的开发将得到进一步发展。因为抗原特异性的黏膜记忆CTL反应主要在黏膜免疫后才能观测到。最近新发现抗原特异性黏膜CTL反应可以诱导产生全身性CTL，并且产生全身性免疫作用，所以抗击病原体的最佳保护作用需要使用黏膜疫苗。以微生物递送黏膜疫苗时，疫苗应该与呼吸道黏膜接触，同时激发黏膜与全身免疫作用。
正在研究的应用微生物进行疫苗接种的其它机制主要目标是将疫苗递送至肠道。现在需要研究的是一种机制，即如何将疫苗递送至黏膜免疫诱导细胞，非侵入性、安全有效地递送至呼吸道。
我们已开发出利用修饰的酵母菌与LAB(微生物)将抗原性片段和治疗剂同时递送至呼吸道的新型制剂和方法。
本发明的宗旨对所适用的微生物没有限制，包括乳酸杆菌、乳酸球菌、链球菌以及酵母等。此外，本发明中所用微生物具备M细胞结合元件，以将细菌导向至呼吸道黏膜表面。
本发明包含在细胞表面表达抗原或分泌抗原的微生物。在这种情况下，待递送抗原的编码序列需配带有适宜的、被改造的分泌信号及锚定信号。应用于治疗时，多肽需要被完全加工并且大量分泌(跨越细胞膜分泌)，可能需要完全编码的分泌信号。
总之，本发明已研发出新型制剂和方法，以把抗原性片段和/或基因元件递送至呼吸道黏膜细胞，诱导黏膜免疫反应，和/或递送治疗性元件进行基因治疗。本发明特别适合于生产新型的、经过改造的微生物，该微生物可被用作外源核酸的递送工具。
本发明的一个实施例在于微生物是通过两个不同的细菌菌株融合而得，特别是经过改造的大肠杆菌与乳酸菌(如非致病性链球菌)的融合。更为独特的是，本发明利用能够在宿主体内(如大肠杆菌或者LAB与大肠杆菌的融合体)驱动外源核酸进行表达的表达载体转化大肠杆菌而将其改造。此外，所使用的LAB是嗜热链球菌或者乳酸球菌。
本发明的另一个实施例是应用源于酵母菌的微生物。
本发明的再一个实施例为疫苗由微生物细菌如LAB组成。
异质核酸可以编码能够在微生物细胞表面表达或者被分泌进入呼吸系统细胞外环境中去的抗原，抗原成分可以是肿瘤、细菌或者病毒抗原。可被编码的细菌性抗原包括但不局限于下列抗原分枝杆菌属麻风抗原，分枝杆菌属肺结核抗原，伤寒杆菌抗原，衣原体抗原，柯克斯体抗原，疟疾子孢子与裂殖子蛋白(例如，来自伯格氏鼠疟原虫子孢子的环孢子蛋白)，白喉类毒素，破伤风类毒素，难辨梭状芽孢抗原，利什曼虫抗原，沙门氏菌属抗原，大肠杆菌抗原，李斯特抗原，包柔疏螺旋体菌抗原(包括OspA和OspB抗原)，Franciscella抗原，耶尔森氏菌属抗原，非洲分枝杆菌抗原，分枝杆菌胞内抗原，分枝杆菌avium抗原，志贺氏菌抗原，奈瑟菌抗原，葡萄球菌、螺旋杆菌、假单胞菌、密螺旋体抗原，血吸虫抗原，丝虫抗原，百日咳抗原，炭疽毒素、百日咳毒素、梭菌属、嗜血杆菌抗原，链球菌抗原(包括金黄色酿脓葡萄球菌的M蛋白及肺炎球菌抗原如肺炎链球菌抗原)。
可被编码的病毒性抗原包括但不局限于下列抗原腮腺炎病毒抗原，肝炎病毒a、b、c、d、e HBV抗原，狂犬病抗原，脊髓灰质炎病毒抗原，裂谷热病毒抗原，登革热病毒抗原，麻疹病毒抗原，轮状病毒抗原，人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原(包括gag、pol与env蛋白以及HIV env的gp120和gp160)，呼吸道合胞体病毒(RSV)抗原，疱疹病毒抗原，副流感病毒抗原，麻疹病毒抗原，蛇毒抗原，人类肿瘤抗原，霍乱弧菌抗原，以及来自HCV、HAV、HPV、TB、风疹、流行性感冒、腮腺炎、疟原虫表面糖蛋白、细小病毒、爱泼斯坦barr病毒、痘病毒、狂犬病病毒等的抗原，象CEA之类的癌抗原和其它相似的抗原性片段。
此外，本发明还有一个独特之处在于异质核酸编码的治疗性蛋白质可以被表达在微生物表面或者被分泌到细胞外环境，并被进一步地送至呼吸系统的黏膜细胞。治疗元件可以是编码下列蛋白的目的基因胰岛素、生长激素、Epogen、干扰素、细胞因子、白细胞介素、人类白蛋白、活化酶、维生素、抗癌剂taxol、因子VIII、因子IX、癌抗原、完整抗体、抗体片段、抗生素、激素、信息素以及象降钙素之类的其它小分子物质。
本发明还包括生产修饰微生物与含有这些生物体制剂的方法。而且，本发明包含应用修饰微生物进行治疗、缓解和预防疾病的相关方法，这些疾病包括与各种蛋白质缺乏、紊乱相关的疾病(例如，糖尿病、血友病、生长激素缺乏等)以及病毒和细菌感染(例如，AIDS、肝炎、疟疾、瘟疫、天花、疱疹、人类乳头瘤病毒与轮状病毒)。此外，本发明还可以被用来进行疫苗接种和免疫治疗，以治疗、缓解和预防结肠癌、肺癌、前列腺癌等癌症。
本发明的实施例之一是将外源核酸插入到一个已经存在的和/或市售的大肠杆菌表达系统，随后将大肠杆菌与LAB融合。融合体再与适宜的生物载体结合，将LAB递送到呼吸系统，诱导产生适宜的抗原性或治疗性反应。在专门的一实施例中，有融合菌株是为鼻腔内给药而设计的配方，以诱发M细胞介导的免疫反应(如黏膜接种疫苗)和/或治疗由于正常的蛋白质合成缺陷所引起的疾病。
本发明的另一实施例是所用微生物含有编码M细胞定向因子的结构。该结构可包含在含有目的核酸的质粒中，它可以位于单独的质粒上，或在外膜重建时插入LAB-大肠杆菌融合体的外膜中。由于表达了M细胞定向因子，修饰微生物就优先与M细胞结合而不与其它形式上皮细胞结合。通常有三类蛋白可作为M细胞定向因子(Chen等，美国专利号为6,060,082)(Ginkel等，CDC.6(2)，2000)。第一类为植物血凝素，它可以被整合入细胞表面。第二类是来自呼肠孤病毒的δ-蛋白，它定向M细胞因子，被表达为融合蛋白。(Wu，Y.，等，“M细胞靶DNA疫苗接种”Proc.Natl Acad.Sci.USA 98(16)9318-23，2001)。编码δ-蛋白的多聚核苷酸序列可放在编码目的核酸的质粒上，或者位于单独的质粒上。核苷酸序列被转录后，δ-蛋白随同抗原性或治疗性蛋白质一起被表达在递送宿主细胞表面。第三种方法是开发、使用靶特异性、主要针对M-细胞的单克隆抗体片段。靶向M-细胞的另一种机制是通过突变和筛选来开发适宜的宿主菌株，这种菌株在体外优先结合上皮细胞(如HeLa细胞)。
附图简要说明

图1显示根据本发明的原理对酵母菌进行转化后表达在酵母菌细胞表面的绿色荧光蛋白(GFP)，。
图2说明接受了应用GPD质粒表达的流感病毒口服疫苗的老鼠与对照组的血清学结果。
图3说明接受了应用GPD质粒表达的流感病毒皮下接种疫苗的老鼠与对照组的血清学结果。
图4表明接受了应用GPD质粒表达的轮状病毒VP7口服疫苗的老鼠与对照组的血清学结果。
图5表明接受了应用GPD质粒表达的轮状病毒VP7皮下接种疫苗的老鼠与对照组的血清学结果。
图6表明接受了应用pYD质粒表达的流感病毒口服疫苗的老鼠与对照组的血清学结果。
图7说明接受了应用pYD质粒表达的流感病毒皮下接种疫苗的老鼠与对照组的血清学结果。
图8表明接受了应用pYD质粒表达的轮状病毒VP7口服疫苗的老鼠与对照组的血清学结果。
图9表明接受了应用pYD质粒表达的轮状病毒VP7皮下接种疫苗的老鼠与对照组的血清学结果。
图10表明接受了应用pYD质粒表达的流感病毒鼻腔内接种疫苗的老鼠与对照组的血清学结果。
发明详述引言 本发明的一个实施例提供了为经鼻腔内递送而设计的、能够表达和/或分泌外源性蛋白质的正常微生物群，包括与哺乳动物机体相容的酵母菌或细菌。本发明的另一个实施例是把正常微生物与第二类细菌相融合，后者拥有能够表达目的抗原或治疗性蛋白质的表达系统。
定义 与本发明中生物分子相关的各种术语贯穿于说明与权利声明中。在叙述本发明之前，首先阐明下文中将要用到的术语的定义，对理解全文是很有帮助的。
“抗原”或“抗原性片段”，“免疫保护性抗原决定簇”或“抗原决定簇是指能够在受者(如动物或哺乳动物)体内引起细胞或体液免疫的蛋白质或肽类的全部或其中部分成份，它们与由该蛋白引起免疫的动物所产生的抗体发生反应。而且，在这里所用于说明本发明的术语“抗原”、“抗原性片段”或“抗原决定簇”包括任何与抗体发生特异性相互作用的决定簇。抗原性或抗原决定簇通常是由具有化学活性的表面分子簇(如，氨基酸或糖侧链)组成，并且具有特异的三维结构以及特异的电荷特征。可用于本发明的抗原或抗原决定簇的实施例包括，但不局限于病毒抗原、细菌抗原、原生动物抗原、微生物抗原及肿瘤抗原。
“抗原性或治疗性成分”可以包括，例如抗原性或治疗性DNA、cDNA、RNA以及反义多聚核酸序列。
“编码序列”或“编码区域”是指具有在序列表达时产生基因产物所必需的序列信息的核酸分子。
与哺乳动物体“相容”是指与哺乳动物体协调共存能力，即可以被用于输血或器官移植而不发生免疫反应。
术语“接触”用于细胞时，是指通过微生物递送媒介把抗原或治疗性基因、蛋白或反义序列、和/或附属元件递送至靶细胞的过程，或者使它们直接接近靶细胞的过程。
“治疗剂的递送”可以通过许多不同的方式进行。比如使用口服方式，是指给予药丸或者允许口服给药而设计的制剂。这种方法为精通给药技术的人们所熟知。优选的制剂包含抗原性或治疗性基因、蛋白质或可以与微生物递送媒介(如乳酸菌、酵母菌等)联合递送的反义多聚核苷酸序列。该制剂的基因可以是DNA片段、质粒、粘粒或能够在细胞(尤其是LAB-大肠杆菌融合体细胞)中表达目的蛋白质的重组载体等形式。这些制剂可设计配方散布于药理学上能接受的酸乳中，以便体内给药。
“表达盒”是指至少包含一个编码序列的核苷酸序列，该序列必须同时伴有指导转录启始和终止的序列元件。一个表达盒可能含有附加序列，包括但不局限于如下元件启动子、增强子以及参与转录后或翻译后加工的序列。
核酸结构的“异质”区域是指在一个大分子内的核酸分子中，可确认的一个(或多个)核酸片段，它在自然界与该大分子无关联。因而当异质区域编码哺乳动物的基因时，该基因两侧的DNA序列与其源生物基因组的两侧序列不同。在另一例子中，异质区域是指在自然界中不存在其编码序列的结构(比如cDNA，其中的基因组编码序列含有内含子或含有不同于自然基因密码子的合成序列)。根据这种定义，等位基因变异或自然发生的基因突变事件并不产生DNA的异质区。就蛋白质而言，“异质”可以被理解为一种蛋白质，其中至少部分成分在既定的宿主细胞染色体DNA中不被正常编码。异质蛋白质的实施例包括由细菌与真核微生物产生的杂交蛋白或融合蛋白，由原核宿主产生的真核蛋白等。
“异质核酸”是一种从不同于其产生种属的其它属种获得的DNA、cDNA或任何形式的RNA多聚核苷酸序列或其杂交形式，由此产生不同于其产生种属的其它属种的多肽、肽片段或蛋白质。异质核酸序列也可以包括源于同一种属的用于替代或增加内源性核酸序列的核酸序列，这在包含基因替代在内的基因治疗方面尤为有价值。
这里所使用的“免疫原性制剂或者免疫原性组合物(immunogeniccomposition)”术语是本发明的一个实施例，它提供了一种促进动物免疫反应诱导的抗原。免疫反应可以是体液免疫和/或细胞免疫，涉及免疫原或其一个片段或亚单位。典型的抗原包括但不局限于肿瘤抗原、病毒抗原、寄生虫抗原、真菌抗原和细菌抗原。例如可被编码的细菌性抗原包括但不局限于下列抗原分枝杆菌属麻风抗原，分枝杆菌属肺结核抗原，立克次体抗原，衣原体抗原，伤寒杆菌抗原，柯克斯体抗原，疟疾子孢子与裂殖子蛋白(例如，来自伯格氏鼠疟原虫子孢子的环孢子蛋白)，白喉类毒素，破伤风类毒素，难辨梭状芽孢抗原，利什曼虫抗原，沙门氏菌属抗原，大肠杆菌抗原，李斯特抗原，包柔疏螺旋体菌抗原(包括OspA和OspB抗原)，Franciscella抗原，耶尔森氏菌属抗原，非洲分枝杆菌抗原，分枝杆菌胞内抗原，分枝杆菌avium抗原，志贺氏菌抗原，奈瑟菌抗原，葡萄球菌、螺旋杆菌、假单胞菌、密螺旋体抗原，血吸虫抗原，丝虫抗原，百日咳抗原，炭疽毒素、百日咳毒素、梭菌属、嗜血杆菌抗原，链球菌抗原(包括金黄色酿脓葡萄球菌的M蛋白及肺炎球菌抗原如肺炎链球菌抗原)。
编码的病毒性抗原包括但不局限于下列抗原腮腺炎病毒抗原，肝炎病毒a、b、c、d、e HBV抗原，狂犬病抗原，脊髓灰质炎病毒抗原，裂谷热病毒抗原，登革热病毒抗原，麻疹病毒抗原，轮状病毒抗原，人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原(包括gag、pol与env蛋白以及HIV env的gp120和gp160)，呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，疱疹病毒抗原，副流感病毒抗原，麻疹病毒抗原，蛇毒抗原，人类肿瘤抗原，霍乱弧菌抗原，以及来自HCV、HAV、HPV、TB、风疹、流行性感冒、腮腺炎、疟原虫表面糖蛋白、细小病毒、EB病毒、痘病毒、狂犬病病毒等的抗原，癌抗原如CEA和其它相似的抗原性片段。
“乳酸菌”或“LAB”通常是指发酵碳水化合物、以乳酸作为终末产物的革兰氏阳性细菌家族。乳酸菌生活在口腔与消化道，被用于生产发酵食品如朝鲜泡菜、酸奶等。众所周知，它们能够产生各种抗菌化合物如有机酸、过氧化氢、二乙酰与细菌素，它们利用碳水化合物作为能源物质产生乳酸和抑制有害细菌生长的抗菌物质，因而对维持肠内健康状态发挥重要作用。乳酸菌包括链球菌、肠球菌、乳酸球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌等菌属。典型的产乳酸细菌包括嗜热链球菌、粪肠球菌、durans肠球菌、乳酸球菌、乳酸杆菌、乳酸乳杆菌、bulgaricus乳酸杆菌、嗜热乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌及植物乳酸杆菌。
“乳酸杆菌”是指具有下列细菌学特征的乳酸菌种革兰氏阳性，棒状，不运动，过氧化氢酶阴性，兼性厌氧，最适生长温度为30-40℃，15℃时不生长，产生DL-乳酸。
这里所使用的“微生物”包括细菌、酵母菌、细菌-细菌融合体及细菌-酵母融合体。
“修饰”术语通常是指通过基本变化使既定生物体或系统呈现新的倾向性、新的结构或新的终末形式。“修饰的微生物体”实施例之一是应用编码抗原性或治疗性多肽的表达载体转化微生物，因而“修饰微生物”在其表面表达或/和分泌抗原性或治疗性多肽。
“核酸结构”或“DNA结构”有时指编码序列或者与适宜调节序列可操作地相偶联的序列，该序列被插入载体以转化细胞。这一术语可以同术语“转化DNA”交换使用。这样的核酸结构可以包含一个目的基因产物的编码序列，一个选择性标志基因和/或一个报告基因。“DNA结构”也用来指异质区域，尤其是在被构建用于转化细胞时。
“可操作地偶联”或“可操作地插入”是指将表达编码序列所必需的调节序列置于核酸分子中相对于编码序列的适当位置，以促进使编码序列的表达。同一定义有时也被用于在表达载体中安置其它转录控制元件(如增强子)。
“质粒”或“质粒载体”是一种环状DNA分子，能够通过转化、转导或转染进入细菌或酵母细胞中，可以在细胞内自我复制。质粒载体通常包含一个被RNA聚合酶(为宿主自身固有的或非宿主固有的)所识别的、控制目的基因表达的启动子序列，一个与启动子序列可操作地相偶联的异质核酸以及一个用于提高拷贝数(通过外源因子诱导)的复制起点。质粒复制起点很重要，它们决定质粒拷贝数进而影响质粒产量。能够以高拷贝数量进行复制的质粒可以提高固定容量培养基中扩增的质粒产量(Suzuki等，Genetic Analysis，p.404，(1989)。质粒载体中的启动子序列控制目的基因表达，该序列可以是能够在宿主中驱动基因表达的任何启动子序列，即被特定RNA聚合酶识别的序列，例如可以使用被来自T7，T3，SP6及LacZ等的RNA聚合酶所识别的启动子序列。用于此目的的启动子包括但不局限于下列序列lac、tip、tac、gal、ara以及P.sub.L启动子等。当使用大肠杆菌时，只要达到上述目的即可使用上述任一启动子(Fitzwater等.，Embo J.73289-3297(1988)；Uhlin等，Mol.Gen.Genet.165167-179(1979))。此外，质粒载体可以含有抗药基因作为选择性标记。
“多聚核苷酸”通常是指任何多聚核糖核酸或多聚脱氧核糖核酸，可以是未加修饰的RNA或DNA或者是修饰的RNA或DNA。“多聚核苷酸”包括单链与双链DNA或RNA，DNA或RNA单链区域和双链区域的混合物以及由上述混合物形成的杂交分子。多聚核苷酸术语也包括含有一个或更多修饰碱基的DNA或RNA以及为了稳定或其它原因而将主链骨架修饰的DNA或RNA。“修饰碱基”包括，例如三苯甲基化碱基与稀有碱基(如次黄嘌呤核苷)。DNA与RNA具有许多修饰，因而“多聚核苷酸”包含经过化学、酶学或代谢修饰过的自然界典型的多聚核苷酸形式，以及具有病毒和细胞特征的DNA和RNA的化学形式。“多聚核苷酸”也包含相对短的多聚核苷酸，通常指寡核苷酸。
“多肽”是指由两个或更多氨基酸通过肽键或经过修饰的肽键相互连接而成的肽或蛋白质。“多肽”包括短链和长链，短链通常指肽、寡肽或寡聚体，而长链常指蛋白质。多肽除了包含基因编码的氨基酸，还可包含非基因编码的氨基酸。“多肽”包括经过修饰了的氨基酸序列，这种修饰是由自然过程(如翻译后加工过程)或者经过化学修饰技术来完成的，后者在工业工艺中为人们所熟知。在基础课本与更为详细的专论，以及大量的研究专著中均对这些修饰做了详细阐述。
修饰可以发生在多肽的任何位置，包括肽链骨架、氨基酸侧链与氨基或羧基末端。在多肽中，同一类型的修饰可以不同程度发生在同一位点或几个位点，也可以含有多种类型的修饰。多肽可因为泛醌化而产生分枝，它们可以是有分枝或无分枝的循环。循环的、分枝化的以及分枝循环的多肽可以由于翻译后自然加工所致，也可以由合成方式产生。
“启动子”、“启动子区域”或“启动子序列”通常指基因的转录调节区域，它们可以位于编码区的5’旁，3’旁，编码区内，或内含子中。典型的启动子是能够与细胞内RNA聚合酶结合并且启动下游(3’方向)编码序列进行转录的DNA调节区域。典型的5’启动子序列3’端限制在转录起始位点，并且向上游方向(5’端)延伸，包含起始转录(在本底可以探测到的水平)所必需的最低数量的碱基或元件。启动子序列内部含转录起始位点(该位点用核酸酶S1可以便利地进行基因定位)以及与RNA聚合酶结合的蛋白质结合区域(一致序列)。
“报告基因”是指编码可以通过标准方法直接或间接检测产物的基因。
“酵母”通常是指酿酒酵母、面包酵母菌种的一个酵母菌株，是一种以单倍体或双倍体形式存在的单细胞微生物，通过子细胞芽生的方式进行繁殖。酿酒酵母基因组易进行基因操作，这使其在了解真核细胞基本生物学现象的研究中具有极高的研究价值。酵母基因组已被全部测序，拥有大量关于这一生物体的生物学、遗传学与分子生物学的可获得信息，还拥有在酵母中组成性或诱导性表达异质蛋白质的人们所熟知的、独特的工具，这使酵母成为表达和纯化宿主治疗性重组蛋白质的有用工具。此外，酵母被广泛应用于人们日常消费的焙烤食品、维生素以及酒精饮料发酵的制造业中，这就是酵母被食品与药品管理部门冠以“通常被认为是安全的”(GRAS)称号的原因。
除了广泛应用于食品和饮料制造业外，酵母还是定居在人体内的正常菌群的一部分。已从健康个体口腔与直肠黏膜表面分离出了酿酒酵母常驻菌株(SeeXu，J.，C.M.Boyd，E.Livingston，W.Meyer，J.F.Madden，and T.G.Mitchell.1999.移居在妇女体内的致病性酵母的种属与基因型的差异及相似性。J Clin.Microbiol.373835-3843.)。
与机会性酵母菌种(例如可以使免疫功能低下患者发生致命性感染的白色念珠菌)不同，酿酒酵母常驻菌极少与破坏健康的效应有关。另外，已经证明把活酿酒酵母给予健康个体与动物模型不引起酵母移居和致病(SeeMaejima，K.，K.Shimoda，C.Morita，T.Fujiwara和T.Kitamura.1980.给小鼠和猕猴口服及静脉注射酿酒酵母MC16后细菌的移居与致病性，Jpn.J Med.Sci.Biol.33271-276。参见Pecquet，S.，D.Guillaumin，C.Tancrede，and A.Andremont.1991.酿酒酵母在人类志愿者肠道中的排除动力学及其在无菌小鼠体内对微生物移植的抵抗效应，Appl.Environ.Microbiol.573049-3051)。依据本发明的原则，适于应用的酵母菌属的非限制性的例子包括下组细菌酿酒酵母、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus以及S.kluyveri。“选择性标志基因”指编码一种在表达时赋予被转化细胞一种可被选择的显型产物的基因，如抗生素抗性。
“有效治疗量”指多聚核苷酸、反义多聚核苷酸或蛋白质及其片段同细菌融合体载体一起给予生物体时，能够在生物体内产生有效预期效应(如提高或降低M-细胞介导的免疫反应)的剂量。
“转录与翻译”控制序列指DNA调节序列，例如启动子、加强子、多聚腺苷化信号、终止子等，用以在宿主细胞内表达编码序列。
将包括DNA表达构件在内的治疗剂转入细胞(如大肠杆菌细胞)的许多方法已为熟练掌握该技术的人们所熟知。当把外源性或异质DNA或基因引入细胞时，该细胞即被这样的DNA“转化”、“转染”或“转导”。转化的DNA可以整合或不整合入(共价连接)细胞基因组中。例如，在原核生物、细菌和酵母细胞中，转化的DNA可以位于游离元件(如质粒)上，也可以在特异限制位点连入宿主DNA。这里“转导”是指病毒(如腺病毒、AAV、逆转录病毒)介导的转导系统，或质粒递送的基因转移方法，将DNA递送至细胞的过程。“转染”是指使用非病毒介导的方式将基因元件导入细胞的过程。这些方法包括磷酸钙-或硫酸右旋糖苷-介导的转染、电穿孔、玻璃珠打靶法等，这些方法已为本领域的人们所熟知。本次公开的资料清晰地阐明了精确的制剂与实施方法。
“载体”是质粒、噬菌体或者粘粒之类的复制子，可以将另一核酸片段插入其中，使该片段得以复制或表达。
修饰的正常菌群 用质粒转化大肠杆菌细胞为业内人士所熟知。将多聚核苷酸导入大肠杆菌细胞可以通过许多标准实验室操作手册(如Davis等，分子生物学的基本方法(1986)以及Sambrook等，分子克隆法实验室手册，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))中介绍的方法来完成，例如磷酸钙转染法、DEAF-右旋糖苷介导的转染法、显微注射法、阳离子脂质体介导的转染法、电穿孔法、转导、擦拭装载法、微球导入或感染。
转化LAB可以根据Leer等人(WO095/35389)所介绍的有限自溶法来完成，也可以根据下面参考文献所介绍的方法和技术对各种目的LAB进行转化，在此考虑其整体性而使之归为一体。已经公开发表的PCT申请PCT/NL96/00409揭示了对非致病性细菌特别是乳酸杆菌属和双歧杆菌属LAB进行筛选的方法，筛选其与特异性黏膜受体结合的能力。该申请同时也阐明了一种表达载体，由一个表达启动子序列、一个核酸序列以及允许核糖体识别和翻译的序列组成。该文献提示各种乳酸杆菌都可以被转化，以表达包括致病性细菌蛋白质在内的异质基因产物。PCT/NL95/00135阐明了一种用于乳酸杆菌的多拷贝表达载体，其5’-非翻译核酸序列至少含有核糖体识别和RNA稳定所需要的最小序列，其后是翻译起始密码子。应用口服L.lactis重组体可以诱导出针对表达抗原的局部IgA和/或血清IgG抗体反应(Wells等，Antonie van Leeuwenhoek 1996 70317-330)。此外，Casas等人在U.S.Patent No.6,100,388中揭示L.reuteri可被异质DNA转化并在细胞表面表达或分泌外源性蛋白质，而EP 1084709 A1则阐明乳酸杆菌plantarum也可被转化，在细胞内或细胞表面表达抗原片段。
酵母的转化方法也为业内人士所熟知。例如2002年10月25日递交的临时的美国专利申请系列号10/280,769介绍了有关细节。并参见Christine Guthrie和Gerald Fink编著的《酵母的遗传学、分子与细胞生物学指南》(2002)。这是两本关于酶学方法的丛书，第350和351卷，由Academic Press出版，在此考虑其整体性将之融为一体。
本发明的一个实施例是一种与哺乳动物机体相容、通常被认为安全(GRAS)的微生物与第二种细菌相融合而被修饰，后者具有能够表达LAB蛋白的表达系统。本发明中与宿主机体相容的乳酸菌(LAB)来自于链球菌或乳酸乳球菌种。细菌来自嗜热链球菌种或乳酸球菌，但也可以是下述乳酸杆菌种中的一员嗜酸、brevis、干酪、delbrueckii、ermentum或plantarum乳杆菌。更为独特的是，优先选择的菌种是那些经过突变和/或选择而加以修饰的菌种，它们在呼吸道中更易存活并能够优先黏附于上呼吸道黏膜表面。
可以将具有适当表达系统的几种不同的细菌与非致病性链球菌或乳酸球菌融合而产生预期修饰的LAB菌株。本发明的独特实施例是链球菌或乳酸球菌与大肠杆菌融合。通常用于分子克隆技术的几种不同的E.coli菌种是HB101、C600、DH1、DH10B、DH5α与β10。优先选择上述菌种，是因为可以很容易得到它们生产和表达外源核酸所需要的表达系统，这些表达系统较完善，可以在市场上买到。
本发明包括一种细菌与不同种的细菌相融合。已报道的具有表达系统的两个独特菌种是乳酸乳球菌和枯草杆菌。Cocconcelli，PS.等，.“单链DNA质粒、载体构建和嗜热硬脂杆菌α-淀粉酶在乳酸杆菌内的克隆”微生物学研究142(6)643-52(1991)和Kleerebezem，M.等“乳酸菌的控制基因表达系统乳酸球菌、Leuconostoc以及spp.乳酸杆菌可转移的乳链菌肽诱导表达盒”应用与环境微生物学63(11)4581-84(1997)。
本发明的表达系统含有一个DNA构件，它至少包含一个编码目的抗原的核酸序列或可操作地偶联于启动子的治疗性基因，该启动子可以指导细菌宿主体内异质序列的表达。编码抗原性或治疗性片段的多聚核苷酸可能只包含编码成熟多肽或其一个片段的编码序列，或者是包含阅读框内编码成熟多肽或其一个片段的编码序列及其它编码序列，如编码复制起始点、锚定序列、先导或分泌序列、前蛋白或其它融合多肽序列、便于选择融合多肽的标志序列。多聚核苷酸也可以包含5’与3’非编码序列，如转录的非翻译序列、剪接与多聚腺苷化信号、核糖体结合位点以及稳定mRNA的序列。
本发明的一个实施例是LAB(如嗜热或嗜酸菌种)与大肠杆菌融合，该融合方法可以使嗜热或嗜酸细菌表达大肠杆菌相关DNA编码的抗原性或治疗性蛋白质或多肽。抗原性多肽可以被表达在LAB-大肠杆菌融合体表面，而治疗性蛋白质则可以被分泌表达。在体内生产这些抗原性或治疗性蛋白质过程中，编码氨基酸序列的核苷酸序列含有锚定序列、分泌或先导序列、或有助于产物稳定的附加序列。这样所产生蛋白质要么表达在LAB-大肠杆菌融合体细胞表面，要么被分泌并由此引起免疫或治疗反应。
多肽片段中最好包括那些编码能够被机体的各种免疫始动细胞特别是M细胞、IgA和IgG细胞所识别的抗原决定簇，它们在动物体内尤其在人类体内具有抗原性或免疫原性。特定序列和片段的不同变异体也构成了本发明的一部分。首选的变异体是那些不同于参考文献的保守性氨基酸替换，其它优选的片段包括具有生物学活性的治疗性片段，它们具有相似的或加强的活性，或减弱不利的活性。这些多肽片段保留了抗原或治疗剂的生物学活性，包括抗原性活性。
本发明的一个实施例包含表达一个或多个抗原性或治疗性多聚核苷酸的大肠杆菌来源的载体以及宿主嗜热链球菌或乳酸乳球菌细胞。宿主嗜热链球菌或乳酸乳球菌细胞通过与大肠杆菌载体融合的基因工程过程，生产与表达抗原性或治疗性多肽。具备适宜表达系统的合适的大肠杆菌可以通过多种商业渠道购得，或者由基因工程手段获得，以构建本发明中抗原性或治疗性多聚核苷酸的表达系统或表达系统的一部分。
用以与大肠杆菌.细胞融合并在体内生产抗原性和治疗性蛋白质和/或多肽的适宜LAB的代表株包括嗜热链球菌或嗜酸乳球菌以及乳酸杆菌细胞如acidophilus、brevis、casei、delbrueckii、fermentum或plantarum。
更为独特的是本发明所使用的重组大肠杆菌载体被正向或反向插入了由DNA，cDNA或RNA序列组成的抗原性或/和治疗性构件。该构件包含调节序列，比如与基因序列可操作地偶联的启动子。大量适宜的质粒和启动子为业内人士所知或者如下所述，多数可以在市场上购得。
因此本发明的一个实施例，DNA结构是一质粒，它至少编码一个适宜宿主的复制原点、一个选择性标志基因和/或一个报告基因、一个启动子，该启动子与融合到表面结合启动子或锚定区域的编码抗原或治疗性元件的异质核苷酸序列可操作地偶联。该结构也可以包含其它适宜元件，例如转录起始序列、分泌信号序列和转录终止序列。
质粒的选择或构建是以它们在宿主细菌体内的复制能力为基础的。当表达系统来自大肠杆菌时，用于克隆启动子与核苷酸序列的质粒载体包括pUC18、pUC19、pBR322及pBluescript。适合LAB的质粒包括，例如乳酸球菌质粒pAK80或者由此衍生的pTV32、pLTVI、pFXL03、pIC19H、pVA838及pVA891。pER35是一个源自非致病性链球菌的质粒，来自乳酸球菌的质粒可以由DSMZ、Braunschweig、Germany获得，其它的质粒已经在文献中说明。此外适合乳酸乳球菌的质粒载体在Geoffrey M.等人的文章“应用绿色荧光蛋白作为正在开发的活疫苗载体乳酸菌珠的标签”(应用与环境微生物学66(1)383(2000))有说明。PiardJ.等人在“生脓链球菌M6蛋白在各种乳酸菌细胞壁上的锚定”细菌学杂志179(9)3068-72(1997)中对适于乳酸乳球菌、fermentum乳酸杆菌与sake乳酸杆菌的质粒载体进行了说明。有些质粒载体适合于广谱的乳酸杆菌菌种，如Cocconcelli P.等人的文章“单链DNA质粒、载体结构和嗜热硬脂杆菌α-淀粉酶在乳酸杆菌内的克隆”微生物学研究142(6)643-52(1991)中说明的pPSC20和pPSC22。也可应用穿梭载体，它们能够在融合体的亲代细菌中表达。在这种情况下，适宜的穿梭载体需含有来自两个融合菌种的复制起点。适用于LAB的穿梭载体包括pFXL03、pWV01、pGKV210、pVA838和pNZ123。此外，大肠杆菌和LAB的穿梭载体在Maassen C.等人.，Vaccine，ibid.和Bringel等人的“来自乳酸杆菌plantarum CCM1904的pLP1质粒在乳酸杆菌中的特性、克隆、制备与分布及其在穿梭载体构建中的应用”质粒，22(3)193-202(1989)中得以说明。
质粒可以包含选择性标志基因或报告基因，以助于确定含有预期质粒DNA的细菌。选择性标志基因可以是抗生素抗性标志，如kanr、tetr、ampr等。β-半乳糖苷酶基因和编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因是报告基因的例子。另外，如果质粒不包含选择性标志或报告基因，质粒DNA可用其它许多方法检测，如使用质粒DNA作为探针的斑点印迹法。
需要根据宿主细菌及要表达的抗原来选择启动子。可以用于大肠杆菌表达系统的启动子包括λ-PR、PL与Trp以及T3、T7、Gpt、SP6和lacZ启动子或乳糖操纵子。文献中已说明了乳酸球菌的启动子。例如，较好地适用于plantarum乳酸杆菌和乳酸乳球菌，且有助于其它LAB表达的一种启动子是来自乳酸乳球菌的尼生素可诱导的nisA启动子。参见deRuyter P.等人的“食物-级尼生素诱导乳酸乳球菌的控制表达系统”应用与环境微生物学.623662-67(1996)；KleerebezemM.，“乳酸菌的控制基因表达系统乳酸球菌，Leuconostoc和Lactobacillus spp的可转移的尼生素诱导表达盒”应用与环境微生物学63(11)4581-84(1997)；Geoffroy M.等人的“应用绿色荧光蛋白作为正在开发的活疫苗载体乳酸菌珠的标签”(应用与环境微生物学66(1)383--91(2000)。其它的启动子包括乳酸乳杆菌的MG1614和MG1363启动子，以及pH可诱导的、生长期依赖的P170启动子及其变异体在Madsen.S.M.等人的“乳酸乳球菌的pH-可诱导的、生长期依赖的P170启动子的分子特性”分子微生物学32(1)75-87(1999)中得以说明。而且，乳酸球菌的启动子P59已被用于各种乳酸乳球菌和乳酸杆菌的表达载体中(Piard J.等，“酿脓链球菌M6蛋白在各种乳酸菌细胞壁上的锚定”细菌学杂志179(9)3068-72(1997))。Geoffroy等人说明了一种嗜热链球菌适用的启动子-P25启动子。此外，质粒可以包括多种启动子序列，它们均与编码抗原的序列可操纵地偶联。这种载体中的每一个启动子都与融合体的亲代细菌中的至少一个细菌相容。质粒可以包括多个复制起点，如来自每一亲代细菌的复制起点。
可以用多种方法来制备编码抗原的核酸序列或治疗性元件及表面结合启动子区域。这些序列可从自然资源中获得，或者用已知的DNA合成技术制备。随后这些序列被整合入质粒中，用该质粒转化所选细菌宿主。最近，由于蛋白质重组产物的分子生物学进展，人们可以利用细胞表面展示技术在微生物外表面表达外源蛋白质。表面结合启动子区域的序列被融合至抗原序列，这样修饰的乳酸杆菌就能在自身表面表达抗原。这种表面结合启动子区域的实施例在PCT/NL96/0013以及Dieye Y.等人的“乳酸菌蛋白定向系统的设计”细菌学杂志183(14)；4157-66(2001)中有所阐明。
首批被研究的表面表达系统之一由George P.Smith在20世纪80年代中期开发出，它能表达与丝状噬菌体pIII融合的肽或小分子蛋白质(见Smith G.P.，科学，2281315-1317，1985)。从那时起，人们研究了微生物体内表达和分泌异质蛋白质的各种系统，以开发新的、更好的细胞表面展示与分泌系统，将目的蛋白质表达在微生物表面或将其分泌。目前，发明家们正在利用内源性表面蛋白作为表面锚定基序，研究应用细菌和酵母菌在细胞表面稳定表达蛋白质或多肽的方法。
细菌，特别是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，具有独特而复杂的细胞膜结构，它可能由内层细胞膜、间周质与外层细胞膜组成。因此，要想把外源蛋白质有效转运至细胞膜表面，需要表面锚定基序。所以，为了表达外源肽或蛋白质，适宜的细菌表面蛋白质必需与外源目的蛋白在基因水平融合，并且所表达的融合蛋白必须通过细胞内膜和细胞外膜到达细菌表面，并被锚定在细菌表面。
考虑到这些因素，一个表面锚定基序需要具有几个关键性特征首先，被用作锚定基序的表面蛋白需具有一个分泌信号序列，允许外源蛋白质转运通过细胞内膜；第二，需要一个把外源蛋白质锚定到细胞表面的的定向信号；此外，整个融合基序不仅能容纳各种大小的外源蛋白质或肽类基因，而且能大量表达。
已开发的细胞表面展示系统基本有三组C-末端融合、N-末端融合与夹心融合。首先，如果天然的表面蛋白在其N-末端内具有一个独立的定位信号，则可以使用一个C-末端融合基序把外源性肽融合到功能性部分的C-末端。例如，在大肠杆菌中开发的Lpp-OmpA基序就是利用C-末端融合系统(见Georgiou G.等人，Protein Eng.，9239-247，1996)。其次，已经开发了一个N-末端融合基序，它含有一个C-末端分选信号，将外源蛋白质定向至细胞壁。已经开发出N-末端融合基序的细菌实施例包括金黄色葡萄球菌蛋白A(见Gunneriusson E.等，J.Bacteriol.，1781341-1346，1996)、金黄色葡萄球菌纤连结合蛋白B(见Strauss A.等，Mol.Microbiol.，21491-500，1996)以及酿脓链球菌丝状M蛋白(见Pozzi G.等，Infect.Immun.，601902-1907，1992.)。但是，如果表面蛋白不含有这样的锚定区域，则需要装配整个结构，为此开发了夹心融合系统，目的外源蛋白被插入到表面蛋白基序中。应用这一系统的几个例子包括大肠杆菌PhoE(见Agterberg M.等，基因，8837-45，1990)，FimH(见Pallesen L.等，微生物学，‘1412839-2848，1995)，与PapA(见Steidler L.等，J.Bacteriol.，1757639-7643，1993)。利用这些机制，掌握该领域普通技术的人们就能够修饰给定细菌(如，链球菌和乳酸球菌)的特定表达系统而实现本发明的目的，即表达、分泌和/或细胞表面显示各种抗原性和/或治疗性元件。
为了把翻译的蛋白质分泌到细胞外环境中去，可以将适当的分泌信号整合到预期多肽中，这些信号可以是多肽内源性的，也可以是外源信号。因此可以使用分泌信号来促进蛋白质的输送。分泌信号肽的编码序列与蛋白质编码序列的5’末端可操纵地偶联，这一杂合核酸分子被插入所选的质粒中，该质粒适于在所选宿主细胞内表达蛋白质。为表达和分泌外源性蛋白质而设计的质粒可从许多商业途径获得。例如，若欲应用大肠杆菌表达系统表达和分泌蛋白质，通常使用的质粒包括pTrcPPA(Pharmacia)、pPROK-C和pKK233-2(Clontech)以及pNH8a、pNH16a、pcDNAII和pAX(Stratagene)等。其它的分泌信号系统有，例如Dieye Y.等人在“乳酸菌蛋白定向系统的设计”细菌学杂志183(14)；4157-66(2001)中说明的来自链球菌致热原的M6前蛋白，及Ravn P.等人在“TnINuc的研究进展及其在分离乳酸乳球菌新型分泌信号中的应用”基因242347-356(2000)中提出的那些系统，如被信号肽酶I或信号肽酶II识别的SP13、SP10、SP307与SP310。
因而，本发明的一个实施例介绍了在宿主体内生产异质蛋白质的方法，该蛋白通过宿主的分泌途径被加工。分泌表达通过含有一个DNA构件的质粒转化宿主生物体(如大肠杆菌)而实现，该DNA构件包含与编码分泌信号肽的DNA序列可操作地偶联的转录启动子。分泌信号肽的例子有，如BAR1 C-末端区域部分，或者金黄色葡萄球菌蛋白A，它们能指导异质蛋白质或多肽的输出。
用于大肠杆菌的其它分泌系统的例子包括美国专利号4,336,336(1979年1月12日递交)，欧洲专利申请发表号184,169(1986年6月11日发表)、177,343(1986年4月9日发表)以及121,352(1984年10月10日发表)，Oka T.等(1985)、Gray G.L.等(1985)、Ghrayeb J.等(1984)与Silhavy T.等(1983)。这些系统大多运用下述发现某些通常能被细胞输出到非细胞质区域的细菌蛋白质的N末端存在一种短(15-30氨基酸)氨基酸序列，该序列可用于以相似方法将异质蛋白质转运到非细胞质区域。这些短的氨基酸序列通常被称为“信号序列”，因其能发出信号将蛋白质从细胞质转运到非细胞质区域。在革兰氏阴性细菌中，这样的非细胞质区域包括细胞内膜、间周质、细胞壁和细胞外膜。在蛋白质刚刚转运出细胞质之前或者转运过程中，信号序列通常通过肽切割被去除，这就在预期的非细胞质部位遗留成熟的蛋白质。如果要将正确的蛋白质转运到预期的非细胞质区域，信号序列的点特异性去除(亦称为信号序列的正确加工)是非常重要的。
因此，本发明涉及通过与大肠杆菌融合而被修饰的嗜热链球菌或乳酸乳球菌，所使用的大肠杆菌包含一个编码异质核酸的质粒，该异质核酸与能够在修饰的宿主菌体内驱动基因表达的启动子可操纵地偶联。依据本发明的一个独特实施例，异质核酸是编码抗原的多聚核苷酸序列，该抗原可以被分泌或者展示在细菌的细胞表面。无论哪种情况，编码异质核酸的质粒都需包含适宜的分泌或锚定序列信息，该信息是分泌或向细胞表面转运与表达所必需的。因此，在融合体内产生的蛋白质或肽片段包含抗原成分，它在与机体的免疫相关细胞接触时能诱发免疫反应。
在蛋白质被分泌时，预期的相关免疫细胞是分泌IgA抗体的细胞，但分泌的抗原片段也有可能被Peyer’s斑内的M细胞吞噬，在这种情况下抗原性蛋白或片段可与M细胞口袋内的各种成分接触，包括CTL、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞，因而诱导黏膜免疫反应。当蛋白质或抗原性片段被锚定并展示于融合细胞表面时，抗原片段可直接与M细胞表面接触，因而直接与M细胞口袋内的各种成分相互作用，诱发黏膜免疫反应。
根据本发明的另一个独特实施例，异质核酸是编码治疗性蛋白质或肽片段的多聚核苷酸序列，这些蛋白质或肽片段或者分泌，或者显示在细菌细胞表面。无论哪种情况，编码异质基因元件的质粒都包含分泌或向细胞表面转运与表达所需的适宜分泌或锚定序列信息。根据这一实施例，融合体产生的蛋白质或肽片段包含着治疗剂，所以在融合体内异质核酸得以表达时就产生了减轻和/或纠正疾病状态所需的蛋白质或蛋白片段。尤其是异质核酸可以编码一种能够被分泌到呼吸道中的蛋白质如胰岛素，这样当蛋白质被分泌时它能被吸收并缓解疾病状况，如糖尿病。
M细胞靶向 本发明的一个实施例是修饰的微生物机体要被定向至M细胞，例如与呼吸系统内鼻相关淋巴组织(NALT)中的Peyer’s斑相关的M细胞。M细胞靶向可以用多种方法完成，包括使用结合到M细胞表面多种成分的复合物。这种复合物包括多肽(如M细胞受体或表面抗原)，碳水化合物以及glycoconjugates。M细胞靶向可能涉及特异性结合M细胞的复合物，及特异性结合M细胞相关组织细胞的复合物，如上呼吸道的上皮细胞。
结合M细胞的一种复合物是来自细菌与病毒的靶向于M细胞的黏附素，例如耶尔森氏菌与伤寒沙门氏菌(Clark M.A.等，“M-细胞表面β1整合素的表达与侵袭素介导的假结核病耶尔森氏菌定向于鼠Peyer’s斑内M细胞”Infect Immun.661237-43(1998)；Baumler A.等，“The lpf fimbrial操纵子介导的typhirium沙门氏菌向鼠Peyer’s斑的粘附作用”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93279-83(1996))。细菌与病毒种的黏附素是介导M结合的蛋白质。此外，呼肠孤病毒的σ1蛋白也被用来靶向M细胞(Wu，Y.等，“M细胞靶向的DNA疫苗接种”Proc.Natl Acad.Sci.USA 98(16)9318-23(2001))。因而，本发明的一个独特方面是，包含异质核酸和分泌或锚定信号的质粒也包含编码呼肠孤病毒σ1蛋白的多聚核苷酸序列，该序列被融合于编码异质核酸的序列。另外编码呼肠孤病毒σ1蛋白的多聚核苷酸序列可位于一独立质粒中。
特异结合M细胞的另一种复合物是植物血凝素。应用各类植物血凝素携带脂质体到M细胞的靶向作用在U.S.Patent No.6,060,082中有所阐明。本发明的一个实施例是，在融合过程的重建阶段向其中添加植物血凝素当细胞外膜在融合体周围重新形成时，植物血凝素被掺入细胞膜表面，从而靶向M细胞。如果将衍生为脂质的植物血凝素(Avanti极性脂质)添加到培养基中，它也可以在细菌生长与繁殖过程中被掺入细胞壁中。
特异结合M细胞表面蛋白质如受体或表面抗原的抗体，也可用于靶向M细胞。可以应用多种已经为业内人士所熟知的方法生产针对表面蛋白的抗体，该蛋白可以是完整的目的蛋白(蛋白前体或加工后的蛋白质)或蛋白质的一部分。
通过把上述M细胞靶向复合物添加到正在重建细胞壁的修饰乳酸杆菌的原生质体中，可实现将该复合物合成入修饰微生物的细胞壁中。优选的一个方法是将M细胞靶向复合物衍生为脂质，作为细胞膜的锚定点。这种功能化脂质可从Avanti Polar Lipids，Inc.(Alabaster，AL)购得。
另外，修饰微生物中的质粒可编码一种M细胞靶向多肽。一种方法是使包含抗原序列的质粒也含有M细胞靶向多肽的序列，此时M细胞靶向的多肽序列可被附于抗原序列上。另外，可将M细胞靶向多肽序列附加到表面结合启动子区域并与启动子区域可操作地偶联，这样在质粒表达时就产生两种异质蛋白质。
另一种方法是将M细胞靶向的多肽序列置于第二个质粒上，该序列附加于表面结合启动区域并与启动子可操作地偶联，这样亲代细菌就拥有两种不同的重组质粒。
另外，含有异质核酸的质粒也可以包含编码合成肽的多聚核苷酸序列，该合成肽含有融合于异质核酸编码序列的整合素-结合基序(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸，RGD)，以加强蛋白质的转运。已经证实能够结合RGD基序的整合素蛋白质位于人类极化的支气管上皮细胞顶部表面(Scott E.S.等，“应用整合素-靶向的脂质复合物加强向人类气道上皮细胞进行的基因递送”The Journal Of Gene Medicine 3125-134(2001))。受体-配体间的相互作用表现在含有RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)基序的肽与细胞表面受体整合素家族中数个成员间，这种相互作用已被充分阐明。因此，该途径是通过受体介导的胞吞作用获得进入上皮靶细胞的入口(Scott E.S.等，“应用整合素-靶向的脂质复合物加强向人类气道上皮细胞进行的基因递送”The Journal Of Gene Medicine 3125-134(2001)；还有Hart，S.等，整合素-结合肽介导的基因递送与表达”Gene Ther.2552-554(1995).)。
修饰的微生物经首选鼻腔内给药后，至少能够在部分呼吸道停留和/或定居，例如在口腔、咽喉、喉和/或肺，或者在其中几个部位。本发明的一个实施例是修饰的微生物主要停留于上呼吸道，但本发明并不局限在那里。这时修饰的微生物展示或分泌其编码的抗原性或治疗性物质，允许这些物质与肠道黏膜细胞接触。所表达的抗原和/或宿主传递的治疗性物质能够与消化道黏膜层和/或消化道壁接触，并更特异地与消化道壁内、能够诱导针对抗原免疫反应的M细胞接触，这样抗原就被提呈给M细胞口袋内的巨噬细胞、树突状细胞、B-淋巴细胞和/或CTL。如上所述，由消化道壁内细胞引起的免疫学反应是重要的免疫反应，它在经过疫苗接种的人类或动物体内消化道能引发进一步的全身免疫反应，放大了免疫反应，并加强了机体的后续保护机制。
如下内容也属于本发明的研究范畴经鼻腔给药后，修饰的微生物倾向于在被免疫个体的呼吸系统内表现持续存在状态，通常超过3-9天，更好的是超过15天甚至20天，尽管这并不是必需的。根据菌株的表型，特别是根据其在给定细胞内长时间生存和/或吸附于给定细胞(例如上呼吸道的M细胞)的能力来选择宿主菌株，是掌握生物学普通技术的人们力所能及的。
业内人士可根据本发明的原则来选择适当的微生物进行修饰，所选微生物具有下列一种或几种特征在所选细菌或酵母内编码抗原或治疗剂的结构的稳定性，抗原或治疗剂在微生物体的表达水平，异质蛋白质的表达调节、抗原或治疗剂表达位点的调节，所产生抗原的稳定性以及所用菌株的生物化学特性，其生化特性包括但不局限于糖酵解形式、形状、细胞壁成分、LTA结构、肽聚糖结构、16S RNA序列、抗酸性、胆汁酸抵抗性、凝集性、辅助性、免疫调节性、体外粘着特性、甘露糖特异粘着性、有无蛋白黏附因子、有无mapA样黏附因子、有无具有重复氨基酸序列结构的大蛋白黏附因子，以及微生物机体(例如，根据本发明，作为疫苗的一部分)与被接种个体细胞间的相互作用包括但不限于它的持续存在性(如上所述)，生存能力、抗原或治疗剂的体内表达和/或组织特异性的持续存在。
上述内容是对本发明的具体实施例加以说明，并不以任何方式限定本发明。尽管对特异性的修饰作了说明，但本发明的详细资料不能解释为对本发明的限制。很显然，如果不离开本发明的宗旨和范围，也可采用各种各样其他的等价物、变化和修饰，这种等效实施例也包含在本发明中。
实施例 下面的描述阐明了操练本发明所涉及的一般程序。提到特异性材料仅仅是为了举例，而不是为了限定本发明。除非特别指出，我们一般使用的是通用的克隆程序，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，supra or Ausubel et al.(eds)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons(2000)(hereinafter“Ausubel et al.”)提出的那些程序。因此，下述例子说明了业内精通人士如何利用本发明生产来自嗜热链球菌和/或乳酸乳球菌的修饰生物体，使之表达异质抗原。而且，这些例子说明了如何使用修饰生物体激发哺乳动物体内的免疫反应。本次发布中没有明确阐明的分子生物学方法、细胞生物学方法以及免疫组织化学方法都已在科学文献中有详细报道。
实施例1修饰的乳酸球菌的生产细菌的选择和质粒DNA的克隆 修饰的乳酸球菌通过乳酸球菌与包含一个重组质粒的第二细菌发生融合而形成。本例中，乳酸乳球菌(ATCC #7962)与大肠杆菌HB101(ATCC # 33694)相融合。
大肠杆菌HB101含有一个编码GFPuv的重组质粒pSYG3，GFPuv是为细菌表达而优化设计的的GFP变异体(Crameri A.等.“Improved green fluorescentprotein by molecular evolution using DNA shuffling”Nat.Biotechnol.14315-19(1996))。GFPuv被优化设计，受到UV光(360-400nm)激发时产生最大量的荧光，可利用下列引物从pBAD-GFPuv(Clontech，Palo Alto，CA)扩增得到CAT GCATGC CAT GGC TAG CAA AGG AGA AGA AC和CCG GGT ACC GAG CTC GAATTC(SEQ.ID.NO.1)(Geoffroy M.等人，“应用绿色荧光蛋白作为正在开发的活疫苗载体乳酸菌种的标签”(应用与环境微生物学66(1)383--91(2000))。
PSYG3是从pUC19构建而成，含有来自pBR322的复制起点、一个卡那霉素抗性基因、一个T7启动子序列，该启动子序列与融合于表面结合启动子区域的编码GFPuv的核苷酸序列可操纵地偶联。表面结合启动子区域可以来自乳酸球菌Usp45前蛋白的信号肽编码序列，以及编码酿脓链球菌M6前蛋白的细胞壁锚定区域的序列，后者带有必需的转录终止子。信号肽序列位于GFPuv序列上游，而细胞壁锚定区域序列则是位于GFPuv序列下游。详细资料参见Deite Y.等人的“乳酸菌蛋白靶向系统的设计”细菌学杂志183(14)4157-66(2001)；也参见插图1的pSYG3图谱。质粒的克隆、转化大肠杆菌、以及筛选含有质粒的克隆等都可以根据掌握本领域普通技术的人员所熟知的程序来完成，如下列文献提出的程序Sambrook等，《分子克隆实验指南》，第三版(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York)(2001)以及Ausubel等人的，《现代分子生物学实验技术》(Wiley，New York)(2001)。
质粒也可包含其它的DNA序列，例如呼肠孤病毒的σ1蛋白的编码序列，正如上述，它除了与表面结合启动子区域可操纵地偶联，也与T7启动子可操纵地偶联。这类蛋白的表达可实现目的蛋白对M细胞的靶向作用。
大肠杆菌与乳酸球菌原生质体的形成 两菌种的原生质体都可利用下列方法形成。乳酸乳球菌在MRS培养基(Difco)中，26C生长直至对数生长期；带有pSYG3的大肠杆菌HB 101在LB培养基中，37C培养直至到对数生长期，然后将氯霉素添加到大肠杆菌培养基中，选择性扩增pSYG3 16小时。将培养物在2000×g离心30分钟，产生的细胞沉淀经洗涤后，悬浮于含有溶菌酶(20ug/ml)的高渗溶液(0.01M Tris盐酸[pH7.5]，0.3-0.5M甘露醇)，室温孵育5-15分钟。把所产生的部分原生质体轻轻涂布在含有适宜再生培养基(MRS或LB)的平皿上，观测菌落形成以确保原生质体能够再生细胞壁。原生质体必须保存在高渗溶液中(它可以含蔗糖，而不含甘露醇)，直到它们再生了细胞壁以防止渗透压引起的细菌溶解。
大肠杆菌与乳酸乳球菌的融合 为了融合原生质体，需把保存在上述高渗溶液中的大肠杆菌原生质体1×109-10×1010添加到0.5-1ml保存在同一高渗溶液中的乳酸乳球菌原生质体1×109-10×109中。向混合物中加入0.5ml-1.5ml的20％-70％PVA或PEG，轻轻摇动溶液使之充分混匀。混合物在室温条件下孵育1-30分钟，用相差显微镜监测原生质体的聚集与融合。当细胞生长达对数生长期时，将原生质体冲洗3次，并且用3-7ml上述高渗溶液稀释。把少量上述溶液(0.5-2ml)涂布在含有卡那霉素的MRS琼脂上，26C孵育。
可应用MRS琼脂在基本培养基上筛选乳酸乳球菌和修饰乳酸乳球菌的复制品，和/或应用针对LAB的抗血清进行ELISA试验。LAB菌株的鉴定也可在番茄琼脂平皿上进行。用卡那霉素筛选含有pSYG3的细菌。乳酸乳球菌融合体带有pSYG3，这样产生的克隆就被修饰了。另外，由于GFP也是一种报告基因，可根据紫外线照射下的绿色荧光来选择含有pSYG3的克隆。
实施例2修饰的乳酸球菌的表型特性 需要进行各种试验来证实已经产生了预期的修饰乳酸杆菌株。单克隆将被1)挑自上述选择性培养平皿；2)在MRS肉汤中培养；3)再次涂布至含有卡那霉素的MRS琼脂上。步骤1-3需重复5次，以获得纯化克隆。
确定修饰乳酸杆菌株生理特性的试验，要根据API ZYM和API 20A生化试验系统中的操作规范来进行。亲代细菌的特性已经由Holt等人在Bergey’s Manualof Determinative Bacteriology 9thed.(Williams & Wilkins，Baltimore，MD)(1994)中阐明，它是对上述说明和培养的细菌进行鉴定的综合性指南。
根据上述选择压力，修饰的乳酸球菌生物体应该具备与乳酸球菌种相应的表现型。因而细胞应该是球形、革兰氏染色阳性，液体培养基中细胞成对或以短链的形式出现，需要复杂培养基才能生长，代谢应是发酵产生乳酸(+)，而不产生气体。此外细菌应是过氧化氢酶阴性、氧化酶阴性的。
修饰的乳酸球菌株不应该具有与大肠杆菌相应的表现型。上面对乳酸杆菌进行的某些试验也表明修饰的乳酸杆菌生物体不是大肠杆菌，因为大肠杆菌细胞还原硝酸盐、革兰氏染色阴性、过氧化氢酶阳性。
实施例3修饰乳酸球菌基因型特征 应用Southern印迹法来确定修饰的乳酸球菌生物体是否具有预期的基因型。根据标准程序提取染色体DNA，见Saito与Miura。根据Sambrook《分子克隆实验指南》中说明的程序制备质粒DNA、进行Southern杂交。
源自亲代细菌的染色体DNA和质粒DNA被用作探针。如果以大肠杆菌染色体DNA为探针探测乳酸乳球菌的染色体DNA或者以乳酸乳球菌染色体DNA为探针探测大肠杆菌染色体DNA，则会看到很低的同源性。而乳酸乳球菌和大肠杆菌的染色体DNA探针与修饰乳酸球菌染色体DNA共享50％或更大的同源性，因为融合体应当含有来自亲代细菌的染色体DNA。本领域的专家也会理解下述情况如果亲代细菌更为密切相关，因而染色体DNA高度同源，正如在本发明的某些实施例中可能发生的那样；发生在亲代细菌染色体DNA间的杂交程度与发生在亲代同融合体染色体DNA间的杂交程度，二者之间的差异变化就比本实施例中所述的变化小许多。在这种情况下，我们更要依靠Southern杂交来进行质粒DNA鉴定，以确定融合体基因型的特征。
实施例4确定抗原在修饰乳酸球菌表达的Ex Vivo实验分析GFP荧光的检测 根据已知的程序，可用几种不同的方法来检测GFP荧光在修饰乳酸球菌生物体内的表达。如上所述，在UV照射下对修饰乳酸球菌生物体的培养平皿进行照相，可以鉴别表达GFP的克隆。此外，可利用表面荧光显微镜来观察悬浮于PBS中的修饰乳酸球菌细胞内的GFP产物，使用适宜的胶片获取照片。最后，可通过制备修饰乳酸球菌细胞的溶解产物、应用荧光计分析其荧光性，从而检测GFP的表达。
对总蛋白抽提物和细胞成分进行Western斑点印迹以定位GFP的表达 将总蛋白抽提物和各种细胞成分进行Western斑点印迹分析，来检测GFPuv的表达，证明GFP被定向至细胞膜。总蛋白抽提物的制备是根据人们早已熟知的程序进行的，这些程序在多种文献中提出，例如Ausubel等人的《新编分子生物学操作手册》。细胞成分的制备要根据Piard，J.-C.等人在.“酿脓链球菌M6蛋白在各种乳酸菌中对细胞壁的锚定作用”细菌学杂志179(9)3068-72(1997)”中提出的方法进行。简而言之，就是将2ml对数期培养物在4C、4,300g条件下微量离心5分钟。所产生的细胞沉淀与上清液被分离、浓缩。用三氯乙酸(TCA)把上清液中的蛋白质沉淀下来。将细胞沉淀重新悬浮于TES中，用溶菌酶处理，把所产生的原生质体低速离心沉淀，上清液中就包含着从细胞壁释放的蛋白质，通过TCA沉淀蛋白质。根据Dieye Y.等人在“乳酸菌靶向蛋白系统的设计”细菌学杂志183(14)4157-66中提出的方法，把从原生质体沉淀中的蛋白质抽提出来。
这样就可以应用Western斑点印迹方法来分析总蛋白和细胞成分样品用兔GFP抗血清(Invitrogen)作为第一抗体，以偶联辣根过氧化物酶的抗兔抗血清(Sigma)作第二抗体，进行检测。以已知量的GFPuv(Clontech)作为对照标准，可以通过扫描比较来自标准泳道与实验泳道的信号来评估Western印迹上的GFPuv含量。Sambrook等人在《分子克隆实验室手册》中详细说明了Western印迹技术。
实施例5确定GFPuv的表达及其引起的免疫反应的体内实验分析 鼠可以经鼻腔免疫，可应用各种方法以产生最佳结果。例如，利用上述修饰乳酸杆菌生物体或者应用乳酸球菌-大肠杆菌融合体(该融合体除了不含质粒外其它一切特性均与上述融合体完全相同)在第1或1-3天，然后在第28天对6组BALB/c小鼠进行免疫。另一种可选免疫程序是7天间隔免疫分别在第0、7、14与28天进行免疫。
GFP在体内表达的检测分析 可以用几种不同的方法检测GFP在体内的表达及其被M细胞相关组织摄取的情况。在鼻腔给药8-12小时后将小鼠处死，通过对每只小鼠进行支气管肺泡灌洗，收集细胞，将细胞离心，用PBS洗涤两次，重悬于PBS中。可用嗜酸探针将悬浮物染色，例如LysoTracker Red(分子探针，Eugene，Oregon)，它与细胞器结合并在590nm波长处发出荧光，这样就可以在表面荧光显微镜下观察荧光来检测GFPuv的表达，参见Geoffrey，1VI.等人，Applied and Environmental Biology 66(1)383。
另一种可选方法是，鼻腔给药8-12小时后将鼠处死，收集鼻相关淋巴组织(NALT)及其边缘组织，浸入福尔马林中，用石蜡包埋，制成薄片在荧光显微镜下检测GFP。也可以通过下述方法检测GFP将组织薄片与兔抗GFP抗血清以及上述偶联过氧化氢酶的抗兔抗血清孵育，然后加入二氨基联苯胺来检测GFP。可以用FITC-标记的Ulex europaeus凝集素1(Vector Laboratories)来观测M细胞。对GFP免疫反应的检测分析 为检测对GFP的免疫反应，需要在第一次接种前与第一次接种后的2、4、8周采集血液标本，应用酶联免疫吸附试验(ELISA)评估免疫反应。简而言之，就是用每孔100ng的GFPuv(Clontech，Palo Alto，CA)PBS溶液过夜包被微滴定量平板，然后向平板中加入血清标本，室温孵育2小时。应用辣根过氧化物酶偶联的抗鼠抗血清来进行检测。
此外，需要检测机体暴露于GFPuv后淋巴细胞的增殖反应。免疫接种后10天分离淋巴细胞，在含有单纯培养基或含有GFPuv的培养基的微孔板中孵育72小时，在孵育期的最后18小时向培养基内加入3H-胸腺嘧啶脱氧核苷，用液晶闪烁计数器来检测其摄取情况。
实施例6输送HBsAg抗原与IL-2基因 HBV表面抗原基因Pre-S2和S可以从质粒pEco63(ATCC31518)经PCR扩增获得，鼠IL-2基因片段可以通过PCR技术从质粒pMUT-1(ATCC37553)获取。将两种基因以融合形式置于Lac-Z启动子下或独立置于pUC18的T7启动子下，也可以克隆于穿梭载体中。仅含有pre-S2/S基因的质粒被称作pPS2S，同时含有pre-S2/S和IL-2两种基因的质粒称为pPS2S/IL2(Chow et al.J Vir.Jan 1997169-178)。这两种基因也可以融合形式或独立克隆于另一穿梭载体。将DNA转化大肠杆菌DH5和/或HB 101，质粒DNA就在大肠杆菌培养基内扩增。根据上述方法将对数生长期的大肠杆菌制成原生质体，与乳酸乳球菌融合。将融合体选择性培养于LAB MRS平皿和番茄汁平皿和/或合成培养基平皿中(Broach等，基因，8(1979)121-133.)。通过卡那霉素以及下述转基因产物分析法来筛选质粒的表达情况。
用AUSZYME(Abbott Lab)单克隆抗体试剂盒来分析融合体培养基肉汤或细胞沉淀中的HBsAg蛋白。应用Ten-Brock ground bead匀浆器释放细胞内蛋白质；用Triton X-100处理膜以释放膜结合蛋白质。抗原产物应当占细胞总蛋白的3％。应用增殖试验(Chow等)和使用抗-IL-2抗体的ELISA(Pharmigen)分析法来测定IL-2的活性。
用1-10×109cfu的LAB(最多可三次给药)对BALB/c和C57b1/6小鼠进行免疫。从第二天开始通过断尾取血法采集血清。使用本领域已知的血清学分析法和/或本说明中详细介绍的方法来检测HbsAg抗体。
实施例7构建以pYD1为基础的质粒 pYD1是从Invitrogen购得的半乳糖可诱导的表达载体，它指导酵母细胞壁上的蛋白表达。目的抗原VP7、HA和NA是利用表1所列出的引物通过PCR扩增而得。所得的PCR产物被克隆到pYD1的BamHI/EcoRI(VP7)位点或BamHI/XbaI(NA and HA)位点。
实施例8pGPD-DSPLY及其衍生物的构建 pGPD-DSPLY的功能是作为细胞壁上许多蛋白组成性表达的靶载体。构建pGPD-DSPLY及其衍生物所使用的PCR引物的名称与序列被列于表1中。
pGPD-DSPLY包含编码酵母-配对因子的先导序列以及编码编码酿酒酵母α-凝集素的细胞壁锚定区域(C-末端350个氨基酸)的序列。首先，编码α-先导肽(其后伴随两个氨基酸Gly和Ala间隔)的序列是利用BamLALPHAfwd和EcoLALPHArev作为引物经PCR从酵母染色体(strain S288C)扩增并克隆入p426GPD的BamHI和EcoRI位点(Mumberg等人，1995，不同遗传背景中控制表达异质蛋白质的酵母载体，Gene 156119-122)，进而构建pSecY。然后，编码α-凝集素细胞壁锚定区域的序列是利用寡聚核苷酸Agglfwd和Agglrev作为引物经过PCR技术从酵母染色体DNA(strain S288C)扩增得到，并被克隆入p426GPD的ClaI/XhoI位点，获得pGPDAnch。pGPD-DSPLY是通过将含有α-凝集素序列的EcoRI/XhoI片段亚克隆至pSecY同一位点构建而成的。
表面展示抗原NA、VP7(pNADSPLY，pVP7DSPLY)的载体是经过下述过程制备的NA和VP7编码序列是分别利用引物对NAnewfwd/Nanewrev和VP7newfwd/VP7newrev从这些基因的克隆拷贝中经PCR扩增得到，克隆到pGPDAnch的α-凝集素序列的上游EcoRI/HindIII位点，得到pNAAnch和pVP7Anch。随后，把源自pNAAnch和pVP7Anch的EcoRI/XhoI片段亚克隆至pSecY的同一位点，分别得到pNADSPLY和pVP7DSPLY。为了证实抗原在细胞壁上的正确定位，pGFPDSPLY基本是根据上述方法构建的；GFP的编码序列是使用sgGFPfwd和sgGFPrev作为引物从质粒pQB125-fPA(Qbiogene)经过PCR扩增而得。
构建HA表面展示载体pHADSPLY是通过将PCR-扩增的HA序列克隆到pGPDDSPLY的EcoRI/HindIII位点来完成的。由于在HA编码序列中存在EcoRI位点，我们使用了粘性末端PCR技术(Zheng G.，粘性末端PCR亚克隆的新方法.1998，Biotechniques，25206-208)来使克隆更容易进行。首先，使用引物对HAfwd1/Hanewrev和HAfwd2/Hanewrev来进行两个独立的HA扩增反应。经过DpnI(去除背景质粒)和HindIII消化处理之后，把等摩尔量的两种PCR产物混合，加热变性，并冷却至室温，然后克隆到pGPDDSPLY的EcoRI/HindIII位点。
为了便于抗原的免疫学检测，将编码各种表位标签(His6 and HA)的序列被克隆至pNADSPLY和pVP7DSPLY载体的EcoRI位点，标签位于抗原编码序列和细胞壁锚定序列之间。用于这些结构的寡聚核苷酸都列在表1中。
实施例9制备乳酸杆菌表面显示载体 表达目的抗原的基因被克隆至表面展示载体pSC111AE的SfiI/AscI位点。这种构建过程的结果是VP7、HA、NA与GFP的N-末端被融合至淀粉酶基因的分泌信号，C-末端被融合到prtp蛋白酶的细胞壁锚定区域。融合蛋白质的表达受具有组成性活性的Xyl启动子驱动。表1列出了用于各种抗原的PCR扩增过程的寡聚核苷酸序列。
表1.用于构建表面显示表达载体的寡聚核苷酸的SEQ ID NO

实施例10酵母细胞表面的蛋白质表达 将用pYD1或pYD1-based表达载体进行转化的pYD1-based表达-EBY 100酵母在含有2％葡萄糖的YNB-CAA培养基中，于30℃环境中过夜培养。离心收集细胞，重悬于含有2％半乳糖的YNB-CAA培养基中，使OD600达0.5～1。在20～25℃培养细胞，以一定的时间间隔收集样品，通过免疫荧光染色法来检测细胞表面蛋白质的表达。
用pGDP-DSPLY或其衍生物转化的pGPD-DSPLY-based表达-W303-1A细胞在不含尿嘧啶的合成培养基中，于30℃养至对数中期，收集细胞，并根据下述方法分析蛋白质的表达。
实施例11酵母细胞表面抗原的检测 通过免疫荧光法标记完整细胞，然后在共焦显微镜下检测酵母细胞表面抗原的表达。
向培养至对数生长期的酵母菌中加入1/10th体积的甲醛，继续摇动培养物孵育1小时。用PBS把固定的细胞洗涤3次，在室温下用抗-GFP单克隆抗体孵育1.5小时。用PBS洗涤后，加入与若丹明偶联的第二抗体室温孵育1小时。用PBS洗涤细胞，，并将其置于显微镜载玻片上，在共焦显微镜下观察细胞。如插图1所示，GFP-相关荧光的细胞分布方式提示GFP被表达在酵母细胞表面。此外，应用免疫荧光检验法分析酵母细胞表达表面展示的GFP，也检测到了相似的GFP分布方式。
实施例12使用重组酵母菌进行动物免疫的规程 用细胞表面表达VP7、HA或NA的酵母菌经口服、鼻内或皮下途径对6周龄的雌性Balb/c鼠进行接种；加强接种是每2周进行一次。用表达表面展示抗原的酵母菌，或用鼠进行接种。使用了三种不同的接种方法口服、鼻内或皮下接种。用于每一实验的老鼠的数量列在表2中。第一次接种之前与此后的每2周采集一次血液标本。8周后将鼠处死，收集气管、肺及肠道的灌洗液。用ELISA法检测血液及组织样本中的抗原特异性的IgG和IgA抗体。
A.疫苗制备 半乳糖可诱导的表达(pYD1)是把表达病毒抗原VP7、HA或NA的酵母细胞或包含空载体的酵母细胞在YNB-CAA培养基上培养，以2％半乳糖诱导表达。组成性表达(pGPD-DSPLY)是把酵母细胞在不含尿嘧啶的合成培养基上培养至对数中期，收集细胞，以PBS洗涤并悬浮细胞，使其浓度达5×109/ml。
B.疫苗接种口服 0.1ml(5×108)/鼠鼻腔内0.02ml(1×108)/鼠皮下 0.1ml(5×108)+0.1ml佐剂/鼠(第一次皮下接种使用完全福氏佐剂，加强接种使用不完全福氏佐剂)。第一次接种在0周，加强接种分别在2、4、6周进行，每次都使用相同数量的细胞。
实施例13抗体反应的测定 从眼眶采集血液标本(～0.1ml)，离心分离血清，-20℃保存。将肺和肠道从死亡动物身上分离，用PBS冲洗。把组织冲洗液收集到Eppendorf试管中并离心，将上清液保存在-20℃。
用ELISA法检测标本，测定抗原特异性的抗体存在与否。把病毒抗原VP7、HA或NA包被在96孔平板上。封闭非特异性结合位点后，将PBS稀释的血清、肺或肠道冲洗液标本加入每孔。使用辣根过氧化物酶标记的第二抗体(抗-IgG或抗-IgA)检测抗原-抗体复合物。
下面的表3、4、5与表6是来自每一接种规程的原始数据。表3显示应用pGPD酵母菌流感疫苗的鼠血清抗体滴度。表4显示应用pGPD酵母菌轮状病毒疫苗的鼠血清抗体滴度。表5显示应用pYD1酵母菌流感疫苗的鼠血清抗体滴度。表6显示应用pYD1酵母菌轮状病毒疫苗的鼠血清抗体滴度。
图2-10是以图解的形式说明表3-6所表示的数据。如图所示，与质粒对照组相比，本发明中的每一免疫原性制剂都成功地在实验动物体内引起了免疫反应。2A和2B，皮下注射重组体酵母菌，诱导的体液抗体反应(IgG产生)。此外，鼻腔内接种重组体酵母菌引起体液免疫(IgG产生，图2C)与黏膜免疫(IgA产生，图2D)两种免疫反应。
表2.每一实验组的动物数量

注ApYD1系统；BpGPD-DSPLY系统表3.使用pGPD酵母流感疫苗的鼠血清抗体滴度

SQ皮下表4.使用pGPD酵母菌轮状病毒疫苗的鼠血清抗体滴度

N/A指酵母菌流感疫苗未能得到的血清抗体滴度表5. 使用pYD1的酵母菌流感疫苗的鼠血清抗体滴度

SQ皮下表6.使用pYD1的酵母菌轮状病毒疫苗的鼠血清抗体滴度


给药方法 对于鼻内接种，其制剂可以是适于鼻内给药的气雾剂形式，或者是适于支气管内接种的喷洒剂形式等。这类制剂的制备方法为精于药学的人士熟知，例如，见Guillaume C.等人的“阳离子脂质-DNA复合物的气雾化脂质复合物的特性及气雾剂给药条件的最优化”生物化学与生物物理学研究通讯286464-471(2001)。例如，超声波喷雾化可以用来将含有修饰微生物的制剂成气雾剂，通过带有剂量仪表的吸入器(MDI)进行鼻内用药。MDIs是小型、易携带装置，以便于吸入的气雾形式给药。在这种情况下，药物，即含有修饰微生物的制剂，被溶解或悬浮于小筒内的液体中。小筒被制成带有喷嘴的塑料装置，它释放固定剂量的药物或者剂量仪控制的剂量。
理想状态下，喷雾器产生的颗粒很小，形成由小立方单位组成的串状物。对抗原/治疗剂以气雾途径给药依赖于两方面要求该途径能把规定浓度的抗原或治疗剂输送至肺通道内，同时减少全身性副作用的发生。因而疗效依赖于微生物制剂在肺内的有效渗透，这一渗透作用依赖于由所用复合物的物理特性决定的气雾剂动力学参数、所用的气雾化装置以及吸入状态。因此，肺内沉积作用依赖于雾化颗粒的平均颗粒空气动力学直径(MMAD)。参见Pascal S.等人的“Antibiotherapie En Aerosols”Revue Maladies Respiratoires 9145-153(1992)。目前递送带有抗原或治疗剂的LAB携带者的方法涉及转导裸DNA或者与靶输送蛋白共价连接的DNA和/或装入脂质内的DNA。这种方法的一个优势是通过输送存在于LAB融合体载体内的异质核酸，大力避免了质粒DNA被剪切压力降解这一不良作用，例如超声波喷雾器中的那些剪切压力。
根据本发明的一个实施例，修饰微生物可被制成干粉形式的脂类复合物。脂质制剂可以被超声波降解，与修饰微生物混合，使用前需要在室温用或者不使用50mM NaCl的盐溶液孵育30分钟到1小时。使用等于或超过50mM浓度的氯化钠(NaCI)可以引起培养细胞的高水平转染。可使用DP10超声波喷雾器(AirMedica，France)产生气雾剂，理想状态下的溶液是总体积为4ml，含有400μg的修饰微生物及不同量的脂质。为使由于泼溅而造成的药品损失减至最小，应将通过喷雾器的气流限制到一个合适水平。使用PALAS PCS2000光学计数器可以显示由DP10超声波喷雾器所产生的各种溶液的颗粒大小频谱，0.8(w∶w)的脂质/pDNA比率是最佳的。
雾化作用的一个基本参数是雾化颗粒的大小分布；所产生颗粒的最终大小和数量依赖于被雾化的产物以及所使用的喷雾器类型。理想状态下，超声波喷雾器所产生的颗粒直径应该在1μm和2μm之间，形成多分散的气溶胶；它们应该在适于到达深部气道的大小范围内，使脂类复合物具有更为显著的治疗功效。超声喷雾化的操作过程应当让我们能够(i)制备可被快速雾化的高浓度、稳定的复合物，同时避免絮凝；(ii)保持所产生复合物的完整性与活性；(iii)获得合适大小的雾化颗粒，使其能够被吸入，沉积于肺内。
因此，可以干粉形式制备疫苗，如冰冻干粉，使用前需要重新配制，例如用合适的液体；或者是以固体或液体的形式制备疫苗，给药前与固体、半固体或液体食物混合。应用精通药学的技术人员所能认识到的因素，可研究最佳给药剂量及给药方法以取得最佳疗效。
给予特定病人抗原性或治疗性制剂的有效剂量依赖于多种因素，其中某些因素会因病人的不同而不同。一位胜任的临床医生应该能够确定给予患者的抗原性或治疗性制剂的有效剂量，以产生适宜免疫或治疗反应。制剂的剂量依赖于治疗类型、给药途径、抗原或治疗剂的性质、治疗剂被计算出的吸收率等。利用LD50动物数据以及其它经由呼吸系统摄取和/或吸收的信息，临床医生可以根据给药途径来确定对个体的最大安全剂量。应用常规技术，胜任的临床医生能够在常规的临床实践中把特殊治疗性制剂的用量最优化。
关于有效剂量，所使用修饰微生物的剂量并不是特别关键的，只要这一剂量能够引起酵母和/或细菌停留并定居于上呼吸道，尤其是定居于Peyer’s斑内和/或引起明显的免疫反应。适宜的剂量至少为105cfu，，每剂1010-1012cfu更佳，这将允许足够数量的细菌通过内脏进入肠道。
一旦根据本发明的规则正确地合成，本发明的微生物制剂将就可用来诱发免疫反应，并向较广范围的动物肠黏膜提供异质核酸，这些动物包括但不局限于灵长类、山羊、牛、马、鸟、鱼、猪、小鼠、大鼠、猫及狗。
除非特别指明，凡在细则与声明中表示成分剂量或特性的数据如分子量、反应条件等都应理解为术语“大约”变更的数据。因此，除非另有说明，在下列细则及附加的声明中提出的数字参数都是近似值，这些数值可以根据本发明所寻求的预期特性而变化。最后，每一数字参数都至少应该依据所报道的有意义数字的数值，运用普通的舍入技术进行分析，这并非试图限制将同等意义的规程应用于本声明的范围。尽管用以阐明本发明主要范围的数字范围和参数是近似值，但我们尽可能精确报道在明确实例中提出的数值。然而，由于检测过程存在标准偏差，任何数值都不可避免地含有某些错误。
在说明本发明的上下文中(特别是在下列声明中)所使用的术语“a”、“an”、“the”以及相似的指代物应理解为单数和复数，除非在这里另有说明或与文章明显矛盾。在这里复述数值范围，仅仅是为了在个别提及该范围内每一独立数值时提供一种速记方法。除非在这里另有说明，每一单独的数值都与本说明呈为一体。这里所说的所有方法可以用任何适宜的顺序施行，除非在这里另有说明或与文章明显矛盾。这里应用的任何实施例及所有实施例，或者举例性语言(例如，“suchas”)仅仅是为了更好地阐明本发明，而不是对发明的适用范围加以限制。本说明中的任何语言都不应理解为对应用本发明极为重要的没有声明的要素。
这里所公开的可选择的要素或者发明的实施例，都不应被理解为限制。每组成员可能被单独提及、声明，或者同组内其它成员或这里的其它要素一起被提及、声明。可以预见到，组内的一个或多个成员可能被包括在声明内，或者因为便利和/或专利等因素而被剔除。当存在这样的包含或剔除时，此时的说明包含着修正后的组别，以完成对附加声明中使用的所有Markush组别的文字说明。
这里说明了本发明的优选实施例，包括发明家所知道的执行本发明的最好模式。当然，对那些只掌握该领域普通技术、仅靠阅读前述说明的人来说，这些优选实施例就会出现明显的偏离。发明家希望有经验的技术人员正确利用这样的偏离，并且希望以其它不同的方式实施而不仅仅使用这里特定说明的方法。因此，本发明包括主题内容的所有修饰和等价者，这在附加声明中作了复述，是根据适用法律的许可进行的。而且，本发明包含在所有可能的变异范围内对上述因素作任何的联合，除非在这里另有说明或与文章明显矛盾。
另外，对专利文献与公开发表的文献的大量参考贯穿于本说明中。对上述引用的每一参考文献与公开发表的文献，我们都通过参考整体性而使之成为一体。作为结束语，应该理解这里所公开的发明实施例是用来例证本发明的原理，可以运用的其他修饰方法也在本发明的范围内。因而，根据本发明的原则，可通过举例方式，而不是限制方式，应用本发明其他可供选择的方法。因此，本发明不限于上面所显示与说明的内容。
序列表<110>圣必健公司<120>将核酸和/或蛋白质导入呼吸系统的方法与制剂<130>21823.12<160>32<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>寡核苷酸<400>26aaggcgcgcc atcgatgttg tacagttcat c 31
<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>27taggcccagc cggccgccca gaactatgga cttaatatac 40<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>28aaggcgcgcc atttatccca tcaacgac 28<210>29<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>29taggcccagc cggccgccga cacaatatgt ataggctac 39<210>30<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>30aaggcgcgcc gatgcatatt ctgcactgc 29<210>31<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>31taggcccagc cggccgccca ttcaattcaa actggaagtc 40<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>32aaggcgcgcc cttgtcaatg gtgaatgg 28
权利要求
1.一种在动物体内诱导免疫反应的方法，包括向实验动物提供按鼻内给药途径设计的免疫原性制剂，其中所述的免疫原性制剂包括带有表达载体的微生物，该表达载体含有编码抗原的异质核酸。
2.根据权利要求1在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的微生物体是酵母菌或细菌。
3.根据权利要求1在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的抗原可选自肿瘤、细菌、病毒、寄生虫与真菌。
4.根据权利要求3在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的病毒选自流行性感冒、肝炎、HIV和轮状病毒。
5.根据权利要求2在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的酵母菌选自酿酒酵母、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis.、S.servazzii、S.unisporus与S.kluyveri。
6.根据权利要求2在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的细菌包括双歧杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、durans肠球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热乳杆菌、干酪乳杆菌及植物乳杆菌。
7.根据权利要求1在动物体内诱导免疫反应的方法，鼻内给药制剂包括粉剂、冰冻干粉、液体制剂、半固体酸乳与干酪。
8.一种在动物体内诱导免疫反应的方法包括提供一种鼻内给药的转化的酵母菌制剂，其中所述的的酵母含有编码抗原的异源核酸，而抗原被表达在酵母表面上。
9.根据权利要求8在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的酵母是指酿酒酵母。
10.根据权利要求8在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的抗原源自病毒。
11.一种在动物体内诱导免疫反应的方法包括提供一种鼻内给药的转化酿酒酵母制剂，其中所述的转化酿酒酵母含有编码流感病毒A的免疫保护性抗原决定簇的异源核酸。
12.根据权利要求11在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的免疫保护性抗原决定簇是流感病毒HA或NA。
13.一种免疫原性制剂，包括由按鼻内给药途径设计的带有表达载体的微生物体，其中所述的表达载体含有编码抗原的异源核酸。
14.根据权利要求13的免疫原性制剂，其中所述的微生物体是酵母或细菌。
15.根据权利要求13的免疫原性制剂，其中所述的抗原选自肿瘤、细菌、病毒、寄生虫和真菌。
16.根据权利要求15的免疫原性制剂，其中所述的病毒选自流感病毒、肝炎病毒、HIV和轮状病毒。
17.根据权利要求14的免疫原性制剂，其中所述的酵母菌选自酿酒酵母、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus与S.kluyveri。
18.根据权利要求14的免疫原性制剂，其中所述的细菌选自双歧细菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、durans肠球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热乳杆菌、干酪乳杆菌及植物乳杆菌。
19.根据权利要求13的免疫原性制剂，其中鼻内的给药制剂配方形式选自气雾剂、滴剂、吸剂、栓剂与乳剂。
20.一种免疫原性制剂，包括由鼻内给药的转化酵母制剂配方，其中所述的酵母含有编码抗原的异源核酸，而该抗原被表达在酵母表面上。
21.根据权利要求20免疫原性制剂，其中所述的酵母是酿酒酵母。
22.根据权利要求20免疫原性制剂，其中所述的抗原源自病毒。
23.一种免疫原性制剂，包括由鼻内给药的转化酵母制剂配方，其中所述的转化酿酒酵母含有编码来自甲型流感病毒的免疫保护性抗原决定簇的异质核酸。
24.根据权利要求23的免疫原性制剂，其中所述的免疫保护性抗原决定簇是流感病毒HA或NA。
25.根据权利要求18的免疫原性制剂，其中所述的细菌与大肠杆菌融合。
26.根据权利要求25的免疫原性制剂，其中所述的大肠杆菌选自HB101、C600、DH1、DH5α及P10。
27.根据权利要求25的免疫原性制剂，其中所述的大肠杆菌含有质粒。
28.根据权利要求27的免疫原性制剂，其中所述的质粒含有异质核酸，该核酸与启动子可操作地偶联，而启动子能够驱动异源核酸在宿主生物体内表达。
29.根据权利要求28的免疫原性制剂，其中所述的异质核酸编码抗原。
30.根据权利要求29的免疫原性制剂，其中所述的抗原被表达在细菌细胞表面。
31.根据权利要求29免疫原性制剂，其中所述的抗原被分泌表达。
32.根据权利要求13或29的免疫原性制剂，其中所述的抗原选自分枝杆菌属麻风抗原、分枝杆菌属肺结核抗原、斑疹伤寒抗原、衣原体抗原、科克氏体抗原、疟疾子孢子与裂殖子蛋白(例如，来自伯格氏鼠疟原虫子孢子的环孢子蛋白)，白喉类毒素，破伤风类毒素，梭状芽孢菌抗原，利什曼虫抗原，沙门氏菌抗原，大肠杆菌抗原，李斯特菌抗原，包柔疏螺旋体菌抗原(包括OspA和OspB抗原)，Franciscella抗原，耶尔森氏菌抗原，非洲分枝杆菌抗原，分枝杆菌胞内抗原，分枝杆菌avium抗原，密螺旋体抗原，血吸虫抗原，丝虫抗原，百日咳抗原，炭疽毒素、百日咳毒素，葡萄球菌抗原，嗜血杆菌抗原，链球菌抗原，金黄葡萄球菌的M蛋白，肺炎球菌抗原，志贺氏菌抗原，奈瑟氏菌抗原，炭疽毒素，梭菌、葡萄球菌、螺旋杆菌、假单胞菌、耶尔森氏鼠疫杆菌、狂犬病毒、沙门氏菌和肺炎球菌。
33.根据权利要求13或29免疫原性制剂，其中所述的抗原选自腮腺炎病毒抗原，A、B、C、D、E型肝炎病毒，HBV抗原，疱疹病毒抗原，副流感病毒抗原，狂犬病毒抗原，脊髓灰质炎病毒抗原，裂谷热病毒抗原，登革热病毒抗原，麻疹病毒抗原，轮状病毒抗原，人类免疫缺陷病毒(HIV)gag、pol和env蛋白抗原，HIV env的gp 120和gp 160，呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，蛇毒抗原，人类肿瘤抗原，霍乱弧菌抗原，HCV、HAV、HPV、TB、疱疹、风疹、流行性感冒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、疟原虫表面糖蛋白、Epstein barr病毒、痘病毒、狂犬病病毒、CEA及癌症抗原。
全文摘要
本申请提供了与细菌学、免疫学及基因治疗领域相关的方法和制剂。总的来说，提供了用以把疫苗、过敏原和治疗剂导入呼吸道黏膜表面的修饰微生物。尤其是这些制剂和方法旨在诱导M－细胞介导的针对病原性疾病的免疫反应。特别是公开了疫苗制备、递送以及黏膜免疫法，该方法应用乳酸菌、酵母菌以及与大肠杆菌融合的乳酸菌使源于病原微生物的抗原决定簇展示于细胞表面或者分泌表达，或者分泌一种治疗性蛋白质。
文档编号A61K39/145GK1646020SQ03807533
公开日2005年7月27日 申请日期2003年1月27日 优先权日2002年1月31日
发明者陈巍, 傅晓丽, 雪莉·诺莱尼, 张智清 申请人:圣必健公司