将核酸和/或蛋白质转导至肠黏膜的方法及其制剂的制作方法

专利名称：将核酸和/或蛋白质转导至肠黏膜的方法及其制剂的制作方法
技术领域：
本研究与细菌学、免疫学以及基因治疗领域相关；总的来说，本发明是通过基因修饰的正常微生物群将异源核酸转导至生物体内。特别是本发明涉及将异源核酸转导至肠黏膜的制剂和有关方法，是利用基因修饰的微生物直接输送转化异源核酸，或是输送至少表达一种异源核酸的基因修饰的微生物。本发明所用微生物包括细菌、细菌融合体及酵母菌。所用异源核酸可以编码免疫保护性抗原决定簇(抗原)或其它基因治疗成分。
参考文献 参考了本申请内以圆括号所标示的各种出版物或专利文献，以说明本发明所属领域的目前发展状况。我们通过参考这些出版物或专利文献的每一部分而使之成为一体，所引用的全部科学出版文献均列于文中或本说明之末。
背景技术：
疾病通常是由有缺陷的或者受损伤的基因或者暴露于传染性病原而引起。由缺陷基因引起的疾病例子包括各种不同形式的癌症，例如结肠和肺癌、血友病或低密度脂蛋白(LDL)受体缺乏症。感染性疾病通常是由致病微生物引起，致病微生物包括细菌、真菌、寄生虫、病毒以及某些情况下的感染性缺陷蛋白质即prions。
现代基因治疗技术具有很大的潜力，无论是对这些由缺陷基因引起的疾病还是由传染性病原引起的疾病都能提供强有效的治疗和/或预防方法。基因治疗或基因替代治疗包括提供一种含有异源核酸的宿主，该异源核酸用来替代缺陷基因或者是编码产生源自传染性病原或肿瘤的免疫保护性抗原决定簇。在以后的应用实例中，编码免疫保护性抗原决定簇的异源核酸可以被用来转化宿主细胞，或者在基因转输媒介(载体)表面表达和/或从基因传输媒介分泌出去。
导入异源核酸的载体包括病毒性和非病毒性载体。尽管病毒转导系统被认为是把基因转至细胞的最有效的媒介，但是由于它具有激发炎症反应或对这些转导载体的免疫反应的危险，其应用还是受到限制。Forbes，S.J.，综述文献胃肠疾病和肝脏疾病中的基因治疗，Aliment Pharmacol.Ther.11823-826(1997).病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、腺病毒载体以及腺病毒相关病毒载体。与其它病毒载体相比，腺病毒载体有以下优点它们能够感染较宽范围的细胞，而不象逆转录病毒载体那样局限于正在复制的细胞。但是腺病毒载体可以激活机体的免疫系统，因此如果机体生命未受到威胁，初始剂量或重复强化诱导很少起作用。见Forbes，S.J.，supra。
也可以使用同各种转染剂配制在一起的质粒来完成异源核酸的转导。最基本的转染剂是盐溶液，将盐溶液中的质粒DNA注射进入肌肉，并且已经证实它被转导进入肌肉细胞。其它的例子包括脂质体、PEG与各种聚合体。但是，目前通用的体内基因转导模式和免疫接种技术在很大程度上依赖于肌肉、皮肤、静脉、腹膜以及其它身体部位的注射。
免疫治疗剂和预防疫苗是最有希望的疾病预防领域之一。免疫治疗剂通常被认为是有助于抑制和杀死病原体或肿瘤的合成制剂，并且是在疾病发生之后给予机体。预防疫苗是用来防止肿瘤感染的，并且在疾病发生之前给予机体。然而，免疫治疗剂和预防疫苗二者都必须被制成能够激发机体产生特异性免疫反应的制剂，才能发挥作用。
人体至少存在两个免疫系统“外周”或“全身”免疫系统与“黏膜”免疫系统(Ogra等.，1994)；这两系统独立但同时发挥作用，且可能通过特定的淋巴细胞调节器而相互作用，产生有效的免疫反应。决定哪一免疫系统首先发生反应的因素就是个体后天获得和通过各种淋巴组织处理病理性抗原的方式。
依靠淋巴细胞相关细胞通过血液、组织与淋巴腺持续运动才能产生有效的免疫反应(Anderson与Shaw，1996)。淋巴细胞转移到脾与淋巴结等二级淋巴器官以及所谓Peyer’s斑的特异化黏膜组织来抗击分别通过血液、淋巴腺以及黏膜而入侵的周围环境中的抗原。抗原在什么地方以及被哪些细胞提呈给这些中继(中间)淋巴腺细胞极大地影响免疫反应的结果—激活T细胞或B细胞转化成特异性抗体形成细胞及其后的记忆反应与效应淋巴细胞。
淋巴腺内的抗原被滤过、捕获、处理与提呈，此时淋巴腺不注意淋巴结内固有的抗原提呈细胞；由淋巴结进行的这种抗原提呈主要产生“外周”免疫、适当的B细胞转化成特异性的IgG或IgM抗体。血液中的抗原在脾内特定的血液/组织界面处被提呈，这也主要激发“外周”免疫；然而，由于脾脏同时含有抗原提呈细胞与来自其它各种组织的活化T-细胞与B-细胞，这样两系统间的对话就有可能诱发外周免疫或黏膜免疫或者同时产生两种免疫反应。肠腔器官(如呼吸道与胃肠道)内腔中的抗原被称作“M”细胞的特异性内皮细胞完整吞噬(非破坏性吞噬)，并且跨细胞转移到Peyer’s斑内的淋巴细胞，在这里发生的抗原提呈反应主要激发“黏膜”免疫反应，并且释放特异性IgA抗体到黏膜分泌物中去。
鼻腔、喉咙、肺以及肠腔中的腔隙是与外界相连通的，这样就将这些组织暴露在环境中有毒或致病的危险因素之下。呼吸道、胃肠道以及泌尿生殖道的黏膜表面是由一层覆盖有黏液的上皮细胞组成，通过垫圈样的细胞间紧密连接将细胞与细胞连接在一起，这样就起到了保护作用。面对富含微生物的环境，黏膜表面提供了一个细胞屏障，这是病原体与宿主之间的第一个接触界面，因而它们在预防感染性疾病方面是至关重要的。
虽然作用相似，但是体内不同黏膜表面的上皮衬层具有很大的不同。复层鳞状上皮衬在口腔、咽、食道、尿道与阴道黏膜表面，而胃肠道的黏膜表面是由单层简单的上皮细胞排列而就。这些黏膜表面总面积超过了400m2。在肠道内，小肠和大肠的上皮细胞装备良好，足以面对这样一个富含病原体的外部环境。尽管这一广大的细胞屏障由纤细的单层细胞组成，这些细胞活跃地从事食物消化以及营养成分吸收工作，但是它通常能够排除潜在性的有害与抗原性物质。
在肠道黏膜上皮衬层中，有少量的淋巴组织构成系统的黏膜淋巴滤泡-相关上皮(FAE)组织。尽管大分子物质和微生物不能通过衬于肠道的上皮组织入侵，但是在象位于肠道的Peyer’s斑这样的黏膜诱导点中，淋巴FAE包含微褶皱或M细胞，微褶皱或M细胞可以转运抗原及微生物以进行抗原摄取；M细胞存在于简单上皮内的情形仅仅见于有组织的淋巴滤泡。因而在富含M细胞的FAE位点内，存在特化上皮与抗原提呈细胞及淋巴细胞之间高度进化了的协同作用。通过活跃的跨上皮细胞小泡转运，M细胞把来自内腔的大分子物质、颗粒以及微生物经由其细胞质直接转运到上皮内的黏膜淋巴滤泡和机体有组织的黏膜淋巴组织，该淋巴组织能够处理抗原并且激发能够引起分泌免疫的黏膜免疫反应，分泌性免疫反应使得肠道和肺黏膜表面浸浴在保护性抗体之中。
所以M细胞提供了用以进行小泡转运的局部、功能性通道。M细胞位于淋巴滤泡(FAE)的上方，通过及时将外源性物质和微生物暴露于吞噬细胞和抗原提呈细胞，从而减少了经由上皮屏障转运这些物质的固有危险。M细胞朝向内腔的顶部表面不同于周围的其它细胞它们缺乏典型的刷状缘，而有不定的微绒毛或具有庞大微绒毛内吞区域的微褶皱。M细胞的基部内陷形成了自身独一无二的特征，这是上皮内的“口袋”或空间，它们既缩短了跨细胞囊泡从细胞顶部到基侧部所必须通过的距离，同时又为B细胞和CD4T细胞之类的淋巴细胞、巨噬细胞以及树枝状细胞的聚集提供了入坞位点。M细胞也有延伸到潜在淋巴组织的基本的推移活动，它们在这里与淋巴细胞或/和抗原提呈细胞直接接触，这好象是对M细胞转运后的细胞提呈发挥作用。
胃肠外免疫是疫苗接种的最常用途径。它通常引起外周急性免疫反应，产生保护性IgM/IgG抗体与细胞介导的外周免疫反应。急性反应很快就会减轻消退，但是它留下了被称为“记忆”细胞的岗哨，这类岗哨细胞时刻保持警觉，一旦真正的病原体返回入侵机体，它们就会释放作为防护者的全部力量。尽管它们很有效，但是经过注射接种的疫苗最初绕过了黏膜，通常不能刺激黏膜淋巴组织产生保护性IgA抗体，因而不能激发黏膜免疫反应。
这样就出现了一个问题，因为许多经由全身循环传播扩散的危险物质，最初是通过鼻、口及其它开口器官进入身体，越过黏膜感染机体。因此，它们所遇到的第一道防卫结构就是那些衬于气道、消化道与生殖道内的黏膜，这些黏膜组成了体内最大的病原体-屏障。抗击这些致病物的保护作用需要一种这样的疫苗，它不仅诱导外周免疫反应，而且能诱导黏膜免疫反应。如上所述，当黏膜免疫反应发动时，它就产生迅速进入这些通道腔内的IgA抗体，抑制它们发现的任何病原体；有效的黏膜免疫反应也激活全身性反应，此时循环的免疫系统细胞帮助消灭远处的入侵者。
“标准预”疫苗接种的另一个并发症是传统的疫苗有这样一个危险疫苗微生物不知何故会反跳获得生命力，引发它们本欲预防的疾病。
因为有这种并发症，人们正在寻求用以替代传统疫苗接种方式的其它途径来进行免疫。其中一种方法就是应用DNA疫苗，此时给予一种携带着来自病原生物体的一个DNA片段的质粒，诱导机体产生抗击各种病原体的保护反应，这些病原微生物包括B型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、HIV、疟疾与流感病毒。
目前正在研究开发的DNA疫苗也带来一些问题。首先疫苗的转导十分复杂，需要将基因或cDNA与适当的表达载体融合成一体，然后转入适当的蛋白合成生物体(例如，大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或者其它细菌、酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞)中去，生产获得感兴趣基因的多重拷贝。然后分离DNA并使之进入另一表达系统、转导到宿主体内，此时在内源性或外源性启动子的控制下恰当地进行基因转录和翻译；使用多重表达载体(包括，但不局限于噬菌体、粘粒、病毒以及质粒载体)是十分昂贵的，难于制备且很难接种给药。而且，为有效地将疫苗导入宿主体内，需要共同注入病毒元件，这就带来了输进有活力的重组逆转录病毒群系的危险。
诱导免疫防护反应的另一种途径是接种亚单位疫苗制剂，该制剂主要是由从病原体基因分离的具有抗原性的蛋白质组成。这些蛋白质自身无法引起感染，但是可以诱导产生全身性的而不是黏膜局部的抗体与CTL，而且生产、纯化和保存这些疫苗均十分昂贵。
与传统的疫苗接种方式有关的另一个问题是疫苗在人类宿主体内的生理学变化可能会引发新的疾病。新出现的病原体可能对抗体具有抗性，或(通过基因重组而使其)对抗宿主防御反应的能力更加强大。就如已经充分证实的流感病毒那样，重组事件或者缺乏与病原体的接触均会引起人群相应免疫性的缺乏；就流感病毒而言，重组事件提高了感染速度，新出现的病原体有时会引发全国流行。
因此，尽管在疾病预防与免疫接种方面取得了很大的进展，但是新的及重新出现的感染性疾病正在打乱这一平衡状态而利于寄生物的生存；全身性免疫固然很重要，但是仍需要继续开发黏膜疫苗以有效的抗击这些新的疾病威胁。为此，目前正在发展口服疫苗；它们能够较好地同时激发“黏膜”和“外周”免疫，比普遍使用的胃肠外转导系统具有更高的效价比、且更为方便。目前正在开发的口服疫苗有倾向集中在发展和使用改良的致病生物体，如沙门氏菌属，作为口服免疫的抗原载体(Stocker，美国专利号4,837,151，沙门氏菌几个菌株的营养缺陷型变种；Clements等，美国专利号5,079,165，沙门氏菌的无毒力菌株；Charles等，美国专利号5,547,664，活的减毒沙门氏菌)。即使这些病原体已经被减毒，但它们仍然具有可能恢复其致病性而对宿主动物造成危害的危险。
考虑到胃肠外接种疫苗、尤其是涉及DNA或亚单位疫苗时的固有问题，本发明人正在研究开发新颖的制剂，以及应用非致病性乳酸菌(LAB)作为生产和转导治疗性分子(如，抗原)的活载体的方法。总体来说，LAB尤其是乳酸杆菌种所具有的某些特性使得它们成为用于口服免疫接种的最具有吸引力的侯选者。这些特性包括佐剂活性、黏膜黏附特性、低的自身免疫原性，且被认为是安全的(GRAS)。它们已经出现在肠道内生菌群中，且在商业上被用来生产酸奶酪、营养乳和其它食品及其益生的应用。人们应用食用LAB已经有很长时间了，且通常认为它们是安全的，这代表着它们用作治疗性载体的潜在重要优势。本发明人目前正在研究，LAB用作活疫苗载体的一个特别重组体是乳酸杆菌。乳酸杆菌种在哺乳动物胃肠道内普遍存在，并且能够定向地黏附于黏膜受体，这使得它们成为用作疫苗载体的非常有用的生物体，这样接种的宿主可以对抗宽范围的病原体。
就普通意义上的乳酸菌而言，已经有几个程序用以产生LAB转化子。Leer等人(WO095/35389)介绍了一种将核酸注入微生物的方法，包括象乳酸杆菌与Bifidobacterium之类的微生物；Leer等人的方法是以在转化过程开始之前进行有限自分解为基础。已经公开发表的PCT申请PCT/NL96/00409揭示了筛选非致病性细菌黏附于特异性黏膜受体的能力的方法，特别是筛选乳酸杆菌与Bifidobacterium属LAB；同时也揭示了一种表达载体，它由一个表达启动子序列，一种核酸序列和容许核糖体识别与翻译性能的序列组成。这一参考文献表明乳酸杆菌的不同种系可以被转化，以表达包括致病性细菌蛋白在内的的异源基因产物。
此外，已经应用口服重组L.lactis诱发了对所表达抗原的局部IgA和/或血清IgG抗体反应。Wells等，Mol.Microbiol.81155-1162，1993。另外，Casas等人(美国专利号6,100,388)研究表明可以用异源DNA转化L.reuteri，在细胞表面表达外源性蛋白质或将之分泌；而EP 1084709A1揭示L.plantarum同样可以被转化，在细胞内或细胞表面表达抗原片段。相关文献参见U.S.Pat.Nos.5,149,532及6,100,388。
所有这些参考文献均表明在接种疫苗时可以使用某些种属的细菌。但是他们所介绍的方法都很费时、昂贵、效率低。另外，就目前所使用的方法而言，对于用来转导抗原的每一特异性种属可能需要不同的表达系统。通常需要研制开发适当的启动子、增强子以及可选择性标志等；可能需要进行几种不同的转化来确定可行系统，以保证体内和体外适当的表达水平；所有这些程序均需增加很多时间与经费。现在所需要的就是在经济可行的、安全可靠的食物级微生物中，用一个人们已知的、经济可行的表达系统来表达异源蛋白质成分，从而达到疾病预防和治疗的目的。
发明概要 本发明一般适用于应用遗传改良的微生物进行体内异源核酸的转导。特别是，本发明包括进行异源核酸转导的制剂及相关方法，应用遗传改良微生物直接转导转化异源核酸，或者是遗传改良微生物表达至少一种异源核酸。本发明中的遗传改良微生物包括细菌、细菌融合体与酵母菌。异源核酸可以编码适于基因治疗应用的免疫保护性抗原决定簇(抗原)或其它蛋白质，基因治疗包括基因替代和/或基因增加。
本发明的一个实施方案中，提供了一种免疫原性制剂(或免疫原性组合物)(immunogenic composition)，它是由至少表达一种异源核酸的遗传改良微生物组成。这种遗传改良微生物包括，但不局限于细菌、细菌融合体、酵母菌以及酵母-细菌融合体。异源核酸可以编码免疫保护性抗原决定簇(抗原)，后者是疾病预防性或治疗性或者兼具这两种功能。
本发明的又一个实施方案中，抗原被表达在遗传改良微生物表面。
本发明的再一个实施方案中，抗原同时被分泌与表达在遗传改良微生物表面。当表达本发明的遗传改良微生物的抗原与肠黏膜中免疫细胞接触时，就激发针对抗原的免疫反应。
本发明再一个实施方案是，本发明提供了把DNA转导至哺乳动物细胞的制剂和相关方法，这是利用来自自然界生物体或者来自人体“微生物”群体的细菌和酵母菌进行转导的。本发明还证实了，可以通过口服摄取把携带着DNA载体，如具有哺乳动物表达系统的质粒，的改良微生物细菌培养物引入至肠道。
当把本发明的制剂经过口服给予机体时，其靶细胞就是肠道细胞，例如，M-细胞、K-细胞以及其它任何衬于机体肠道的细胞或者是上皮细胞层下面的细胞，但是并不仅限于肠细胞。本发明的一个实施方案，遗传改良微生物携带有一个与可诱导启动子联合发挥作用的自溶解基因，该可诱导启动子可以被如下因素诱导，例如pH降低、乳糖、温度、厌氧性环境或其它任何合适的诱导物或诱导条件。当自溶解蛋白对细菌细胞发挥作用时，细菌细胞可能在胃肠道内破裂并且释放质粒，这最好发生在肠腔内。质粒最好是一种高拷贝的质粒，例如，基于pUC18的质粒或“逃亡”质粒。
本发明又一个实施方案为，可以以原生质体的形式供应本发明的遗传改良微生物机体，例如没有细胞壁的细菌细胞。在原生质体沿胃肠道向下运行时，周围的低渗环境会在细菌细胞内产生较大的渗透压，致使细胞突然破裂并且释放质粒。
本发明还有一个实施方案，本发明的遗传改良微生物可以在摄取之前用裂解病毒进行处理，这些裂解病毒包括但不局限于噬菌体，例如φadh、φLC3、mv4、M13、T4、φ29、Cp-1、Cp-7和Cp-9噬菌体。在微生物细胞沿着胃肠道向下运行时，噬菌体可以开始它们的细胞溶解周期，溶解微生物细胞释放质粒。
由于细菌体积小、所释放的DNA量很大，体内的肠道细胞就将DNA摄入细胞内并且表达蛋白质。肠道细胞之所以能够摄入DNA，是因为有质粒的联合作用，例如与细胞膜碎片联合，后者就象脂质体在脂质体转染中起到DNA载体的作用一样而发挥载体的作用。肠道细胞也可以通过细胞内吞或胞饮作用摄取裸露的DNA。
而且，因为肠道细胞中的M-细胞通常参与大分子物质的小泡转运，所以细菌所释放的DNA可以被M-摄取。因为M-细胞定位于淋巴滤泡相关上皮组织(FAE)中，后者含有大量的免疫细胞例如B细胞与T细胞，所以能够产生所预期的针对质粒所表达蛋白质的黏膜和/或外周免疫反应。就转导治疗性基因而言，如转导胰岛素、干扰素、生长激素、因子VIII和因子IX以及其它任何治疗性目的蛋白，M-细胞口袋可以发挥作为治疗性分泌蛋白质进入血流的通路作用。再一方面，DNA的蛋白质编码区域可以通过基因工程进行设计，并且可以拼接到容许蛋白质分泌的信号序列肽的下游，从而使该蛋白质能被细胞分泌。
本发明的遗传改良微生物有机体可以被制备为多种形式，例如干粉的形式，摄取之前需要重新配制或者被装在胶囊中，或者被混入食物如牛奶、酸奶酪、冰淇淋。
附图简要说明

图1显示的是表达在酵母菌细胞表面的绿色(未成熟)荧光蛋白(GFP)，已经根据本发明的规则对酵母菌进行了转化。
图2是以图解的形式说明用流感病毒疫苗口服接种的老鼠与对照组的血清学结果，该流感病毒疫苗使用了GPD质粒。
图3也是以图解的形式说明用GPD质粒的流感病毒疫苗皮下接种老鼠与对照组的血清学结果。
图4图示的是用GPD质粒的轮状病毒VP7疫苗口服接种老鼠与对照组的血清学结果。
图5表明用GPD质粒的轮状病毒VP7疫苗皮下接种老鼠与对照组的血清学结果。
图6是以图解的形式说明用pYD质粒的流感病毒疫苗口服接种老鼠与对照组的血清学结果。
图7也是以图解的形式说明用pYD质粒的流感病毒疫苗皮下接种老鼠与对照组的血清学结果。
图8表明用pYD质粒的轮状病毒VP7疫苗口服接种老鼠与对照组的血清学结果。
图9表明用pYD质粒的轮状病毒VP7疫苗皮下接种老鼠与对照组的血清学结果。
图10则是用图解的形式来说明用pYD质粒的流感病毒疫苗经鼻腔内接种老鼠与对照组的血清学结果。
定义 与本发明中生物学分子相关的各种术语均有详细的技术说明与要求；在提出本发明之前，首先阐明下文中将要用到的术语的定义，对理解全文是很有帮助的。
“抗原”或“抗原性片段”，“免疫保护性抗原决定簇”或“抗原决定簇”是指能够在受试对象(如，动物或哺乳动物)体内引起细胞或体液免疫的完整蛋白质或肽类或者是其中部分成份，他们也必须与由相应蛋白免疫的动物所产生的抗体发生反应。而且，在这里所用于说明本发明的术语“抗原”、“抗原性片段”或“抗原决定簇”包括对与抗体发生特异性交互反应起决定性作用的任何分子。抗原性或抗原决定簇的决定因素通常是由具有化学活性的表面分子(如，氨基酸或糖侧链)集团组成，并且具有特异性的三维空间结构特征以及特异性的电荷特征。可用于本发明的抗原或抗原决定簇的范例包括，但不局限于病毒、细菌、原生动物、微生物性以及肿瘤抗原。
“抗原性或治疗性元件”可以包括，例如抗原性或治疗性DNA、cDNA、RNA以及反义多聚核酸序列。
“编码序列”或“编码区域”是指具有在序列表达产生基因产物时所必需的序列信息的核酸分子。
与哺乳动物体“兼容”是指协调的、共同生存的能力，例如还可以被用于没有免疫学反应的输血和器官移植。
术语“接触”用于细胞时，是说明通过微生物转导媒介把抗原或治疗性基因、蛋白或反义序列、和/或附属元件转导至靶细胞的过程，或者直接把它们放置于靶细胞附近的过程。
“治疗剂的转导”可以通过许多不同的方式进行说明解释。比如使用口服转导方式，是说给予药丸配方，或者给予按着允许口服或类似途径给药而设计的制剂。这样的方法为那些精通发药技术的人们所熟知，但是更为可取的制剂包括如下药学配方，由抗原性或治疗性基因、蛋白质或可以与微生物转导媒介(如，乳酸杆菌、酵母菌等)联合转导的反义多聚核苷酸序列等组成。这样的制剂中，基因可以以如下形式存在DNA片段、质粒、粘粒或能够在细胞(尤其是LAB-大肠杆菌融合体细胞)中表达目的蛋白质的重组载体等形式。可以根据药理学上能够接受的酸乳等级，将这些制剂设计为体内给药方式。
“表达盒”术语是指至少包含一个编码序列的核苷酸序列，该编码序列必须同时伴有指导转录起始和终止的序列元件。一个表达盒可能含有附加序列，包括但不局限于如下元件启动子、加强子以及参与转录后或翻译后加工处理过程的序列。
核酸结构的“异源”区域是在一个大分子中的核酸分子的可以明确确认的一个(或多个)核酸分子片段，在自然界中尚未发现它与此大分子有关联。因而当异源区域编码哺乳动物的基因时，该基因通常被DNA侧面包绕，此DNA在源生物基因组中不会包围该哺乳动物基因组的DNA。另一个例子中，异源区域就是在自然界中没有发现的包含编码序列的一个结构(比如cDNA，其中基因组编码序列包含内含子或具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。根据这里的定义，等位基因的变异或自然发生的基因突变事件并不产生DNA的异源区。就蛋白质而言，“异源”可以被理解为这样一种蛋白质，其中至少有一部分在给定宿主细胞染色体DNA中不被正常编码。异源蛋白质的范例包括由细菌与真核微生物产生的杂交或融合蛋白、由原核宿主产生的真核蛋白以及类似蛋白质。
“异源核酸”是一种从不同于其产生种属的其它属种所获得的DNA、cDNA或任何形式的RNA多聚核苷酸序列或其杂交形式，以及构成多肽、肽片段的氨基酸序列，或蛋白质。异源核酸序列也可以包括源于同一种属的意欲被取代或增加的核酸序列以及内生性核酸序列。这在包括基因替代在内的基因治疗应用方面特别有用。
这里所使用的“免疫原性制剂”(immunogenic composition)术语是本发明的一个实施方案，它提供了一种以便于诱导产生免疫反应的方式接触动物的抗原。免疫反应可以是体液免疫或细胞免疫或者同时发生，免疫原或其一个片段或亚单位。典型的抗原包括但不局限于肿瘤抗原、病毒抗原、寄生虫抗原、真菌抗原和细菌抗原。例如可被编码的细菌性抗原包括但不能因此而局限于下列抗原分枝杆菌属麻风抗原，分枝杆菌属肺结核抗原，斑疹伤寒杆菌抗原，衣原体抗原，Coxiella抗原，疟疾孢子体与裂殖子蛋白(例如，来自疟原虫berghei孢子体的周孢子体蛋白)，白喉类毒素，破伤风类毒素，梭菌抗原，利什曼虫抗原，沙门氏菌属抗原，大肠杆菌抗原，李斯特菌抗原，包柔氏螺旋体菌抗原(包括OspA和OspB抗原)，Franciscella抗原，耶尔森氏菌属抗原，分枝杆菌属africanum抗原，分枝杆菌属细胞内抗原，分枝杆菌属avium抗原，志贺氏菌抗原，淋球菌抗原，葡萄球菌、Helicobacter、peudomona、密螺旋体抗原，血吸虫(裂体虫)抗原，丝虫属抗原，百日咳抗原，葡萄球菌抗原，炭疽毒素、百日咳毒素、梭菌属，血友病菌抗原，沙门氏菌属，链球菌抗原(包括生脓原S.的M蛋白及肺炎球菌抗原，如链球菌肺炎抗原)。
可被编码的病毒性抗原可以包括但不能因此而局限于下列抗原腮腺炎病毒抗原，甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒、HBV抗原，狂犬病抗原，脑灰质炎病毒抗原，裂谷热病毒抗原，登革热病毒抗原，麻疹病毒抗原，轮状病毒抗原，人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原(包括gag、pol与env蛋白以及HIV env的gp120和gp160)，呼吸合胞体病毒(RSV)抗原，疱疹病毒抗原，副流感病毒抗原，风疹病毒抗原，蛇毒抗原，人类肿瘤抗原，Vibrio霍乱抗原，以及来自HCV、HAV、HPV、TB、疱疹、风疹、流行性感冒、腮腺炎、小儿麻痹症(急性脊髓灰白质炎)、轮状病毒、疟原虫表面糖蛋白、细小病毒、EB病毒、痘病毒、狂犬病病毒、肺炎等的抗原，象CEA之类的癌抗原和其它相似的抗原性片段。
“乳酸菌”或“LAB”通常是指发酵碳水化合物产生乳酸作为终末产物的一个革兰氏阳性细菌家族。乳酸菌生长在口腔与消化道，被用来制造发酵食品如朝鲜泡菜、酸奶酪等。众所周知，它们能够产生各种抗菌化合物如有机酸、过氧化氢、联乙醯与细菌素，它们利用碳水化合物作为能源物质产生乳酸和抑制有害细菌生长的抗菌物质，因而对维持肠内健康状态发挥重要的作用。乳酸菌包括链球菌、肠球菌、乳酸球菌、乳酸杆菌和Bifidobacterium等菌属。这些乳酸-产生细菌的典型范例包括嗜热链球菌、乳酸肠球菌、durans肠球菌、乳酸球菌、乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜热乳酸杆菌、酪蛋白乳酸杆菌以及plantarum乳酸杆菌。
“乳酸杆菌”是指乳酸杆菌种的具有下列细菌学特征的乳酸细菌革兰氏阳性、杆棒状、无活动力、过氧化氢酶阴性、兼性厌氧、最适生长温度为30°--40°C、15℃ 时不生长以及形成DL-乳酸。
这里所使用的“微生物”包括，细菌、酵母菌、细菌-细菌融合体与细菌-酵母菌融合体。
术语“改良”通常是指通过基本或基础的变化而使给定的生物体或系统呈现出新的倾向性、新的结构或新的终末形式的过程。一个方面，“改良的微生物体”是指已经用编码抗原性或治疗性多肽的表达载体转换过的微生物体，因而“改良微生物”在其表面表达或/和分泌抗原性或治疗性多肽。
术语“核酸结构”或“DNA结构”有时被用来指代编码序列或者是与适当的调节序列联合发挥作用并且被插入到载体进行细胞转化的序列。这一术语可以同术语“转化DNA”交替使用。这样的核酸结构可以包括一个兴趣基因产物的编码序列，连同一个选择性标志基因和/或一个报告基因。“DNA结构”也用来代指异源区域，特别是指为进行细胞转化组建而成的区域。
“运作上相联系”或“运作插入”意思是表达编码序列所必需的调节序列被安置在核酸分子中相对于编码序列的适当位置，以使编码序列能够表达。这一定义有时也被用指在表达载体中排列其它转录控制元件(如，增强子)。
“质粒”或“质粒载体”是一种能够通过转化而被引进或转染到细菌或酵母菌细胞中去的环状DNA分子，质粒就可以在细胞内自动复制。质粒载体通常包含一个为宿主自身固有的或非宿主自有的RNA聚合酶所识别的启动子序列、一个运作上与启动子序列相联系的异源核酸以及一个通过与外因子感应而提高拷贝数量的复制原点组成，其中启动子控制着目的基因的表达。质粒复制原点是很重要的，因为它们决定质粒拷贝数量进而影响质粒产量。能够以高拷贝数量进行复制的质粒可以大大提高固定容量培养基上的质粒产量(Suzuki等，Genetic Analysis，p.404，(1989)。包含在质粒载体中的启动子序列，控制着目的基因的表达，可以是能够在特定宿主中驱动基因表达的任何启动子序列，例如，可以使用能够被来自T7，T3，SP6以及其它类似的LacZ等的RNA聚合酶所识别的启动子序列。可用于此目的的启动子包括但不局限于下列序列lac、tip、tac、gal、ara以及P.sub.L启动子等，当使用埃希氏菌属大肠杆菌时，只要达到上述目的即可使用(Fitzwater等.，Embo J.73289-3297(1988)；Uhlin等，Mol.Gen.Genet.165167-179(1979))。此外，质粒载体可以含有抗药基因用作选择性标志。
“多聚核苷酸”通常是指任何多聚核糖核酸或多聚脱氧核糖核酸，可以是未加修饰的RNA或DNA，也可以是修饰的RNA或DNA。“多聚核苷酸”，对单链与双链DNA或RNA没有限制，包括DNA或RNA，它们是单链区域和双链区域的混合物以及由上述混合物形成的杂交分子。多聚核苷酸也包括含有一个或更多修饰碱基的多种DNA或RNA以及为了稳定性或其它原因而将主链骨架修饰的多种DNA或RNA。“修饰碱基”包括，例如，tritylated碱基与稀有碱基(如，次黄嘌呤核苷)。DNA与RNA都经过了许许多多的修饰，因而“多聚核苷酸”拥有象在自然界中发现的那样典型的经过化学修饰、酶学修饰或代谢修饰过的多聚核苷酸形式，以及具有病毒和细胞特征的DNA和RNA化学形式。“多聚核苷酸”也拥有相对短的多聚核苷酸，通常是指寡核苷酸。
“多肽”是指任何由两个或更多氨基酸通过肽键或经过修饰的肽键(如，肽等排体)相互连接而成的肽或蛋白质。“多肽”既指短链又指长链，短链通常是指肽、寡肽或寡聚物，而长链常指蛋白质。多肽可以包括氨基酸而不是基因编码的氨基酸。“多肽”包括经过修饰了的氨基酸序列，这种修饰是由自然过程(如，翻译后加工处理过程)或者经过化学修饰技术来完成的，后者在工业工艺中为人们所熟知。在基本课本与更为详细的专论，以及大部头的研究专著中均对这些修饰做了详细解释。
修饰可以发生在多肽的任何位置，包括肽链骨架、氨基酸侧链与氨基末端或羧基末端。在给定多肽中，如果同一类型的修饰可生在几个位点或相同或不同水平，则会更为人们所赏识。一种给定的多肽也可以含有多种类型的修饰；多肽可因为泛醌化而产生分枝，它们可以是有分枝或无分枝的循环。循环的、分枝化的以及分枝循环的多肽可以是由于翻译后自然加工处理过程所致，也可以是由合成方式所引起。
术语“启动子”、“启动子区域”或“启动子序列”通常是指基因的转录调节区域，它们可以在编码区的5’或3’旁、或者在编码区内或者在内含子中。典型的启动子是一个能够与细胞内RNA聚合酶结合并且发动下游(3’方向)编码序列进行转录的DNA调节区域。典型的5’启动子序列3’末端紧邻转录启始位点，并且其5’端向上游方向延伸，包含起始可以探测到的、高于本底水平的转录所需要的最小数量的碱基或元件。启动子序列内部是一个转录启始位点(用核酸酶S1可以地定位)以及与RNA聚合酶结合的蛋白结合区域(一致序列)。
术语“报告基因”是指编码可以通过标准方法直接或间接地探测得到其产物的基因。
“酵母”通常是指酿酒酵母、贝克酵母菌种的一个酵母菌株，是一种可以以单倍体或双倍体形式生存的单细胞微生物，通过子细胞发芽的方式来进行繁殖。由于酿酒基因组的遗传操纵简便，这就使得它在以了解真核细胞基本生物学现象为目的的研究中具有极高的应用价值。酵母基因组已经被全部测序，并且拥有大量关于这一生物体的生物学、遗传学与分子生物学的可获得信息。此外，它是在酵母菌中表达可构建和可诱导的异源蛋白质的经济可行并为人们所熟知的、独具特色的工具，这就使得酵母菌成为表达和纯化宿主的治疗性重组蛋白质的有用工具。此外，酵母菌被广泛地应用于人们日常消费的烘焙食品、维生素以及酒精饮料发酵的制造业中，这就是被食品与药品管理局(FDA)冠以“通常被认为是人们消费安全的”(GRAS)称号的慈善酵母菌的原因。
除了广泛地应用于食品和饮料制造业，酵母菌还是寄居在人类体内的自然微生物中的一部分。已经从健康个体口腔与直肠黏膜表面分离出了酿酒酵母菌株(见Xu，J.，C.M.Boyd，Livingston，W.Meyer，J.F.Madden，and T.G.Mitchell.1999.定居于妇女体内的致病性酵母菌种类与基因型的差别及相似性.JClin.Microbiol.373835-3843.)。
与条件致病性微生物酵母菌种不同，例如白色假丝酵母菌可以引起免疫功能受损患者发生致命性感染，酿酒酵母寄居菌极少与这种破坏健康的效应有关联。另外，已经证明如果把活的酵母菌给予健康个体与动物模型并不能引起酵母菌定居与致病性(见Maejima，K.，K.Shimoda，C.Morita，T.Fujiwara和T.Kitamura.1980.给小鼠和猕猴口服及静脉注射酿酒酵母菌MC16后细菌的定居与致病性，Jpn.J Med.Sci.Biol.33271-276。参见Pecquet，S.，D.Guillaumin，C.Tancrede，and A.Andremont.1991.酿酒酵母菌在人类志愿者肠道中的排除动力学及其在无菌小鼠体内对微生物移植的抵抗效应，Appl.Environ.Microbiol.573049-3051)。依据本发明的原则，适于应用的无限制性酵母菌属的例子包括下组酵母菌酿酒酵母菌、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus以及S.kluyveri。
“选择性标志基因”这一术语是指编码一种产物的基因，该产物在得到表达时则赋予被转化细胞一种可被选择的表现型，如抗生素抗性。
关于“有效治疗量”，“有效治疗量”是指多聚核苷酸、反义多聚核苷酸或蛋白质或者它们的片段的计量，当将该计量的上述物质同细菌融合体载体一起给予生物体时，它们能够在生物体内有效产生预期效应(如，提高或降低M-细胞介导的免疫反应)。
“转录与翻译”控制序列是DNA调节序列，例如启动子、增强子、多聚腺苷化信号、终止子以及宿主细胞内为表达编码序列而提供的类似元件。
将包括DNA表达结构在内的治疗性配方转导至细胞(如，大肠杆菌细胞)的许多方法已经为该领域技术人员所熟知。当把外源性或异源DNA或基因引导入细胞时，该细胞即被这样的DNA“转化”或“转染”或“转化”。转化DNA可以整合入细胞基因组，也可以不整合。例如，在原核生物、细菌和酵母菌细胞中，转化DNA可以维持在游离元件(如，质粒)上也可以被结合在宿主DNA特异性的限制位点。在这里所使用的“转化”是用来说明用病毒介导的转导系统，如腺病毒、AAV、逆转录病毒或质粒转导基因转换方法，将DNA转导至细胞的过程。这里所使用的“转染”是用来说明使用非病毒介导的方式，这些方法包括磷酸钙-或-葡聚糖介导的转染、电击孔法、玻璃发射打靶法及其它类似的方法将基因元件传输和导入细胞的过程。这些方法为本领域的技术人员所熟知，根据本次公开的资料，精确的制剂与实施操作方法就更为明显了。
“载体”就是象质粒、噬菌体或者粘粒这样的复制子，另外一个核酸片段可以被插入进去并使该片段得以复制或表达。
发明详述 身体不同部位的微生物浓度变化很大。例如，口腔黏膜与牙齿表面具有很高浓度的细菌，它们同唾液及咀嚼的食物一起由此进入食道、然后到达胃中，食物在胃中与胃液混合呈流质状。胃液的酸性能够有效地破坏与其接触的大部分细菌。食物在胃内停留大约4小时左右，就被逐渐释放进入小肠；小肠的近端部分也因为从胃内进入的酸而呈酸性；此外，分泌进入小肠近端部分的胆汁酸也破坏细菌，这样就使得此处的细菌水平相对的低。由于酸性下降、胆汁酸被冲淡稀释，小肠末端部分的细菌水平就升高了。数米长的小肠内布满了密度很高的微绒毛，这些微绒毛极大地提高了黏膜的固有表面积，结果是如果我们把小肠铺开来的话，它就会覆盖一个网球场的面积。巨大的表面积使得食物分解以及其后的营养成分吸收能够有效进行，营养成分是通过黏膜被吸收进入血流的。大部分的系统免疫组织与小肠有关系，且可以在黏膜上皮细胞之下直接发现它们。
乳酸菌(“LAB”)与酵母菌具有的某些特性使得它们成为把DNA转导至肠道细胞的最具有吸引力的侯选者。它们已经出现在肠道内生微生物群中，并且在商业上被用来生产酸奶酪、营养乳和其它食品及其前生命期的应用，它们通常被认为是安全(GRAS)的。它们也具有黏膜黏附特性，且自身免疫原性低。LAB和酵母菌在哺乳动物胃肠道内普遍存在，并且能够定向地黏附于黏膜受体，这使得它们成为把DNA和抗原转导至肠细胞内的非常有用的载体生物。
也可以在胃内和小肠的近端部分发现LAB，是因为LAB的耐算性相对较好；这使得它们成为把DNA和抗原通过胃转导进入肠的一个理想载体。有5个主要的乳酸杆菌属，包括链球菌、肠球菌、乳酸球菌、乳酸杆菌和Bifidobacterium。这些乳酸-产生细菌的典型例子包括嗜热链球菌、faecalis肠球菌、durans肠球菌、lactis乳酸球菌、lactis乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、bulgaricus乳酸杆菌、嗜热乳酸杆菌、casei乳酸杆菌、plantarum乳酸杆菌、L.gasseri、L.jenseni、L.crispatus、L.paracasei、L.rhamnosus、L.agilis、L.salivarius、L.pseudoplantarum、L.buchneri以及L.reuteri。例如，rhamnosus乳酸杆菌GG(ATCC 53103)或者更为简单地称为乳酸杆菌GG或LGG是从健康人类的肠道菌群中分离出来的前生命期株。乳酸杆菌对健康人类的益生效应已经被广泛地研究，并且在科学期刊中有文献证明。依据本发明的一个方面，所有这些种和属的细菌都可被用作DNA转导载体。
大肠杆菌是自然生长在哺乳动物肠道内的又一菌种。例如，coli K-细胞生产制造机体血液凝固所需要的维生素K。由于大肠杆菌细菌已经被广泛地研究，是现代基因工程中广为应用的菌种，所以改良和操纵大肠杆菌的方法与技术已为业内人士所周知。正因如此，依据本发明的一个方面，改良的大肠杆菌也可以被用作将DNA转导至肠细胞的载体。
酵母菌是通常发现于食物中的真核细胞的真菌，因此经常定居在人类的部分肠道。象Saccharomyces种这样的酵母菌通常被认为是安全的，因此根据本发明的规范，它们是可用的理想侯选者。Saccharomyces菌种包括如下种类S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus、S.cerevisiae与S.kluyveri。酿酒酵母菌株为现代面包师所用的酵母，且已经在传统的酵母粉中发现S.kluyveri，因此按照本发明的规范，这些菌种理想地适合于修饰改良。
为了这次公开的目的，所有在哺乳动物体内发现的自然发生的细菌或酵母菌都被称为“微生物”。
依据本发明的一个方面，包括细菌(如，LAB、coli)和酵母菌的微生物都可以用、包含哺乳动物表达系统、能表达兴趣蛋白质的质粒DNA进行转化。在本发明的一个实施方案中，所用细菌是嗜酸乳酸杆菌；而在另一个实施方案中，所用微生物是酵母菌。这样就可以将改良微生物的培养物通过口服摄取给予动物或人类。在微生物沿着胃肠道运行过程中，微生物细胞被触发而引起细胞溶解，并且在肠道内释放质粒。通过给予加大量的微生物，同时使用高拷贝的质粒，这样质粒DNA就可以被肠道细胞摄取并被在细胞内表达。
应用质粒转化大肠杆菌已为本领域内所熟知，在这里不需要进一步的解释。可以应用Leer等人描述的方法，以有限的自分解方式对LAB进行转化，我们通过参考该文献(WO095/35389)全文而使之呈为一体。根据下列文献中所公开的方法和技术，也可以对各种兴趣LAB进行转化，这些文献在这里被呈为一体，就象在这里全面提出一样。已经公开发表的PCT申请PCT/NL96/00409揭示了筛选非致病性细菌黏附于特异性黏膜受体的能力的方法，特别是筛选乳酸杆菌与Bifidobacterium属LAB；同时也揭示了一种载体，它由一个表达启动子序列(一种核酸序列)和容许核糖体识别与翻译性能的序列组成。这一参考文献表明乳酸杆菌的不同种系可以被转化，以致表达包括致病性细菌蛋白的异源基因产物。PCT/NL95/00135说明了一种用于乳酸杆菌的多拷贝载体，它所包含的5’非翻译核酸序列至少组成了核糖体识别与RNA稳定所需要的最小序列，紧随该序列之后的是翻译起始密码子。而且，已经应用口服重组体L.lactis来诱导针对表达抗原反应的局部IgA和/或血清IgG抗体(Wells等人，Antonie van Leeuwenhoek 199670317-330)。此外，Casas等人在U.S.Patent No.6,100,388中说明可以应用异源DNA转化L.reuteri，并且可以在细胞表面表达外源性蛋白质或者将其分泌；而EP1084709 A1揭示plantarum乳酸杆菌也可以被转化，在细胞内或在细胞表面表达抗原片段。
酵母菌的转化方法也已为本领域所熟知。例如，2002年10月25日归档的悬而未决的美国专利申请系列号10/280,769中附加了详细的资料。再见ChristineGuthrie和Gerald Fink编著的《酵母菌遗传学、分子与细胞生物学的指导》(2002)。这是酶学系列丛书中关于方法学的两本。350卷和351卷，Academic Press出版，通过参考其全部而在这里呈为一体。
除了上述参考文献所揭示的载体以外，适合于LAB的其它质粒包括，例如pFXL03、pWV01、pGKV210及pVA838。来自乳酸杆菌和乳酸球菌的某些质粒也可以从DSMZ、Braunschweig和Germany获得。其它的都在专著中进行了说明。例如，适合于酪蛋白乳酸杆菌的质粒载体在许多文献中都又说明，包括Maassen C.等人的“口服疾病预防策略的手段表达破伤风毒素片段C的酪蛋白乳酸杆菌重组体疫苗接种或多发性硬化症中口服耐量感应的髓磷脂蛋白”Vaccine 17(17)2117-28(1999)。此外，适合于Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis的质粒载体在Geoffrey M.等人“应用绿色荧光蛋白标记乳酸菌以开发活疫苗载体”(Applied and Environmental Microbiology 66(1)383(2000))有说明解释；Piard J.等人在“各种乳酸菌锚定链球菌生脓原M6蛋白的细胞壁”Journal ofBacteriology179(9)3068-72(1997)中对适于lactis乳酸球菌、酵素乳酸杆菌与sake乳酸杆菌的质粒载体进行了说明。有些质粒载体适合于宽范围的乳酸杆菌种，如pPSC20和pPSC22，在Cocconcelli P.等人的文章“单链DNA质粒、载体结构和嗜热硬脂杆菌α-淀粉酶在乳酸杆菌内的克隆”Res Microbiol 142(6)643-52(1991)中都得到了说明。也可以应用穿梭载体，它们是能够在乳酸杆菌和大肠杆菌两种细菌内表达的质粒；大肠杆菌/LAB穿梭载体在Maassen C.等人.，Vaccine，同上，中得到说明。因为操纵大肠杆菌的方法和技术很具特色，穿梭载体具有方便大肠杆菌基因改良及其后乳酸杆菌转化工作的优势。大肠杆菌E的载体和质粒已经为人们所熟知，并且具有丰富的可得资源，包括商业性资源。
质粒可以包含选择性标志基因或者包含报告基因，它们使确定哪些细菌含有预期质粒DNA的工作更为容易。可能的选择性标志基因是抗生素抗性基因，如卡拉霉素抗性基因，、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因或者是酶突变或酶缺陷，这种酶突变或缺陷能够影响细菌代谢或合成某些营养成分的能力。β-半乳糖基因和编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因属于报告基因的例子。相反，如果质粒没有包含选择性标志基因或报告基因，则质粒DNA需要用多种方法如使用质粒DNA作探针的斑点印迹技术，才能被探测得到。
如果想应用的话，也可以使用在LAB和大肠杆菌细菌中进行原核表达的启动子，这些启动子在专著中均有说明解释。例如，已为人们研究透彻的plantarum乳酸杆菌和lactis乳酸球菌两种细菌的、并且已被证明对其它LAB中的表达也很有用的一种启动子就是来自lactis乳酸球菌的尼生素可诱导的nisA启动子(deRuyter P.等，“食品级尼生素诱导lactis乳酸杆菌的控制表达系统”Applied andEnvironmental Microbiology.623662-67(1996))。Kleerebezem M.，“乳酸菌的控制基因表达系统乳酸球菌，Leuconostoc和Lactobacillus spp可转化的尼生素诱导表达盒”Applied and Environmental Microbiology 63(11)4581-84(1997)。L.plantarum ldhL启动子也被成功地应用于L.plantarum。L.casei表达系统的启动子包括来自L.casei的组成性乳酸脱氢酶启动子与来自L.amylovorus的可调控淀粉酶启动子(Maassen，等，Vaccine 17(17)2117-28(1999))。乳酸球菌启动子P59已经被应用在各种lactis乳酸球菌和乳酸杆菌细菌中(Piard J.等，“各种乳酸菌锚定链球菌生脓原M6蛋白的细胞壁”Journal of Bacteriology 179(9)3068-72(1997))。此外，质粒可以含有均与编码抗原序列联合运作的多重启动子。
本发明的一个实施方案中，DNA结构可以是一个质粒，它至少编码一个适当的预期细菌宿主的复制原点、一个可选择性标志基因和/或一个报告基因、一个启动子，该启动子与编码抗原或治疗性元件的异源核苷酸序列联合发挥作用，而被编码的抗原或治疗性元件融合到表面结合或分泌信号序列。该结构也可以包含其它适当的元件，例如转录起始序列、锚定或分泌信号序列和转录终止序列。
用于LAB的质粒可以包括上述文献中所揭示的已经存在的LAB质粒的修饰改良。特别是通过重组体DNA技术，对质粒载体进行修饰使其包含一个真核表达增强子和启动子，例如CMV启动子、RSV启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子或其它能够在哺乳动物细胞内表达蛋白质的任何合适的启动子。这种修饰也可以包括引入启动子的5’非翻译区域，例如用以加强哺乳动物细胞内表达的CMV启动子的内含子A。而且，组成多聚腺苷酸(poly A)尾和多聚腺苷化信号的3’非翻译区也可被包括在质粒中，目的是正确地加工处理质粒所表达的mRNA分子。在不需要在LAB中表达蛋白质的某些情况下，可以把除了复制原点序列和选择性标志之外的原核表达系统剔除。
这样就可以应用真核表达的改良质粒来表达任何兴趣蛋白质；这些蛋白质的例子包括报告蛋白质(例如，绿色荧光蛋白质(GFP)、荧光素酶、碱性磷酸酯酶、CAT等)、治疗性蛋白质(例如，胰岛素、生长激素、干扰素、促红细胞生成素、filgastrim、细胞因子、白细胞介素、人类白蛋白、activase、维生素合成或乳糖消化酶(乳糖分解酶)、VIII因子和IX因子、完整抗体、抗体片段、抗生素、激素、信息素以及象降钙素之类的其它小分子)。为提高机体对免疫原性蛋白质的免疫原反应，抗原可以与白细胞介素-2共表达，二者在分离的载体内或者在同一个载体不同表达盒内，或者通过双顺反子表达的IRES序列。例如见，Chow Y.H.等，(1997)“应用乙型肝炎表面抗原和白细胞介素-2共表达质粒改进乙型肝炎病毒DNA疫苗”，J.Virology，Vol.71，No.1，169-178。
为把所翻译的蛋白质分泌到细胞外环境中去，可以将适当的分泌信号合并到目的多肽中去。这些信号可以是多肽内生性的，或者是异源信号。因而，可以应用分泌信号来使终末蛋白质的传输更容易进行。分泌肽的编码序列与蛋白质编码序列的5’末端联合发挥作用，这一杂交核酸分子被嵌入到选定质粒中去，该质粒是为将来在所选宿主细胞内进行蛋白表达而设计的。被特异性设计为表达和分泌外源性蛋白质的质粒可以从许多商业途径购买得到，例如可以从Invitrogen公司买到pSecTag2载体。因为肠道细胞是有极性的，所以也可以应用适当的顶部靶向或基侧部靶向的信号序列。
此外，也可以应用重组DNA技术对质粒载体进行改良修饰，以包含一个病毒复制原点，如源自Epstein-Barr病毒的oriP/EBNA-1蛋白。Huertas D.等，“源自游离基因oriP-EBNAI-YACs的人类CFTR基因在鼠细胞内的表达”HumanMolecular Genetics，2000，Vol.9，No.4，617-629。具备了病毒复制原点，质粒就可以在哺乳动物细胞内以稳定的游离基因形式存在，这是因为它与内源性DNA一起复制并且通过粘着于宿主染色体而分离。这样就使得质粒能够生存较长的时间，从而使特定的蛋白质长时间表达。
本发明的一个实施方案，就如上面所述，可以通过用溶菌酶处理细菌而制备原生质体而得到改良微生物，就象在下面要讨论的范例I中例证的那样。原生质体培养物就可以通过口服摄取；在原生质体通过胃并进入肠道内的过程中，渗透压和/或胆汁盐触发原生质体突然破裂并释放质粒DNA。为提高原生质体经受住胃内的胃酸作用的机会，必须应用各种载体与缓冲物对原生质体进行配方设计，保护它在胃内免受胃酸的侵蚀。例如，经常用在抗酸剂中的NaHCO3可以被用作设计原生质体的缓冲剂，此时原生质体被设计为可用于口服的等渗溶液中。其它的例子包括将原生质体配制在凝胶体中，如琼脂糖凝胶、白明胶等。
又一个实施方案，细菌溶解是通过细菌培养物与噬菌体一起感染而发生的。噬菌体的例子包括，但不局限于φadh、φLC3、mv4、M13、T4、φ29、Cp-1、Cp-7与Cp-9。在摄取细菌培养物之前，细菌细胞必须为足够数量的噬菌体感染。由于在细菌感染与细菌溶解之间有一个时间滞后差，这就有了足够的时间让细菌细胞在溶解发生之前向下运行进入肠道。可选择的另一种方法是，噬菌体在首次感染数小时或数天之后才被引入。在这后一种实施方案中，细菌培养物的首次感染是允许细菌移植于肠道，并且大量增殖；然后在给予第一培养物数小时或数天之后给予被噬菌体感染的第二种细菌培养物；当噬菌体在肠道内溶解细胞时，噬菌体颗粒可以进一步感染肠黏膜中的细菌细胞，这就极大地提高了肠道内的质粒DNA。
本发明的再一个实施方案，可以通过基因工程设计改变LAB，使它能够在可诱导的启动子控制下表达自体溶解基因。通过使用可诱导的启动子，自体溶解基因就可以在适当的时间、在胃肠道内适当的位置被触发、表达，进一步溶解细菌细胞。自体溶解基因的例子包括，但不局限于AcmA(Buist G.等，(1997)“通过诱导自身的主要自溶素AcmA过度形成而引起的lactis乳酸球菌自身溶解”Appl.Environ.Microbiol，632722-2728)、holin与细胞溶解酶(Henrich B.等，(1995)“乳酸球菌gasseri噬菌体φadh自溶基因的一级结构和泛函分析”J.Bacteriology，Vol.177，No.3，723-732)，通过参考文献而使它们在这里呈为一体。
在机体肠道内发生细菌自溶解更为可取，这样就会使得肠道细胞可以摄取质粒。用于自溶解基因的可诱导启动子的例子包括，但不局限于pH可诱导启动子，这在颁布给Kullen等人的U.S.Patent No.6,242,194中有详细说明，也在这里通过参考文献而使之呈为一体，就象在这里完全提出的一样；乳糖可诱导启动子，例如，用于大肠杆菌质粒的启动子(如，源自Stratagene的pBluescript)或乳酸杆菌的内生性乳糖启动子；厌氧生长期诱导的启动子，例如醇脱氢酶启动子(adhE)，这在AristarkhovA等人的“埃希氏大肠杆菌体内产生醇脱氢酶的adhE转录抄本的翻译需要核糖核酸酶III的分裂”J.Bacteriology，Vol.178，No.14，4327-4332。就乳糖而言，诱导自溶解基因需要在摄取细菌培养物之后摄入乳糖，如给予牛奶或酸奶酪；可以在摄取细菌培养物数小时甚至数天之后再给予乳糖，以使LAB重组体于肠道内进一步在数量上增殖。在adhE启动子存在的情况下，该启动子在肠道内被诱导是由于肠道内的厌氧条件所致。
自溶解基因和可诱导启动子，二者一起被称为表达盒，可能是在用于细菌转化的质粒的一部分。另一方面，自溶解基因表达盒可能更适合于整合进入所使用的LAB染色体DNA中。可以通过自溶解基因表达盒两侧的侧翼DNA序列来完成进入染色体的整合，表达盒两侧的侧翼DNA序列与染色体内靶序列是同源的。由侧翼DNA序列和自溶解基因组成的整个结构就可以被用来转化微生物。通过同源重组，自溶解基因就可以整合进入LAB的基因组(染色体组)。通过同源重组修饰改良细菌种属的上述方法，已经被广泛地应用于大肠杆菌细胞，并且同样可以被应用于LAB。
编码抗原或治疗性元件以及表面结合启动子区域的核苷酸序列，可以用多种方法进行准备。可以从任何自然资源中分离获得这些序列，或者利用已经为人们所熟知的DNA合成技术通过人工合成而获得这些序列。这些序列就可以被整合进入质粒，然后利用此质粒转化所选定的细菌宿主。最近，分子生物学在重组体蛋白质生产方面的进展使得在微生物体外表面表达蛋白质成为可能，这是利用一种被称为“细胞表面展示”的技术来完成的。编码表面结合启动子区域的序列需要与抗原序列融合，这样就使得改良的乳酸杆菌生物体能够在自身表面表达抗原。这种表面结合启动子区域的例子是那些用在PCT/NL96/00135所说明的结构中的区域，以及Dieye Y.等在“乳酸菌蛋白靶向系统的设计”中所说明的那些区域，Journal of Bacteriology，183(14)；4157-66(2001)。
被研究的首批表面表达系统之一是George P.Smith在20世纪80年代中期开发的，他能够表达与丝状噬菌体pIII融合的肽或小分子蛋白质(见Smith G.P.，Science，2281315-1317，1985)。从那时开始，人们已经研究了微生物体内表达和分泌异源蛋白质的各种系统，以开发新的、比较好的细胞表面展示与分泌系统，可以通过该系统将兴趣蛋白质表达在微生物机体表面或将其分泌。目前，发明人正在利用内生性表面蛋白作为表面锚定主体，研究细菌和酵母菌在细胞表面稳定表达蛋白质和多肽方面的应用。
细菌，特别是象大肠杆菌这样的革兰氏阴性细菌，具有独特且复杂的细胞包膜结构，它可能是由内层细胞膜、外周细胞质与外层细胞膜组成；因此，要想把外源性蛋白质有效地转运到细胞膜表面，需要一个表面锚定主体。所以为了表达外源性肽或蛋白质，适当的细菌表面蛋白质必需与外源性兴趣蛋白质在基因水平上融合，并且所表达的融合蛋白必须通过内层细胞膜和外层细胞膜到达细菌表面，并被锚定在细菌表面。
考虑到这些因素，一个表面锚定主体需要具有几个关键性特征。首先，要被用作锚定主体的表面蛋白需要具有一个足够的分泌信号序列基序来支持外源性蛋白质通过细胞内层细胞膜的转运；第二，也需要一个将外源性蛋白质锚定到细胞表面的靶信号；此外，完整的融合主体不仅需要具有调节提供各种大小的外源性蛋白质或肽类的能力，而且要具有能够大量地表达这些物质的能力。
已经被研究开发的细胞表面展示系统基本上有三组C-末端融合、N-末端融合与夹心融合(三明治融合)。首先，如果天然的表面蛋白在其N-末端内具有一个不连续的定位信号，则可以使用一个C-末端融合基序把外源性肽融合到那一功能性部分的C-末端；例如，在大肠杆菌中开发的Lpp-OmpA基序就是利用C-末端融合系统(见Georgiou G.等人，Protein Eng.，9239-247，1996)。第二，已经开发了一个N-末端融合基序，它含有一个C-末端分类信号将外源性蛋白质导航到细胞壁；已经开发N-末端融合基序的细菌范例包括金黄色葡萄球菌蛋白A(见Gunneriusson等，J.Bacteriol.，1781341-1346，1996)、金黄色葡萄球菌fibronectin结合蛋白B(见Strauss A.等，Mol.Microbiol.，21491-500，1996)以及链球菌生脓原丝状M蛋白(见Pozzi G.等，Infect.Immun.，601902-1907，1992.)。但是，如果表面蛋白不含有这样的锚定区域，则需要装配整个结构；为此开发了夹心-融合系统，外源性兴趣蛋白质被插入到表面蛋白主体；使用这一系统的几个例子包括大肠杆菌PhoE(见Agterberg M.等，Gene，8837-45，1990)、FimH(见Pallesen L.等，Microbiology，‘1412839-2848，1995)以及PapA(见Steidler L.等，J.Bacteriol.，1757639-7643，1993)。利用这些机制，掌握该领域普通技术的人们就能够修饰改良给定细菌(如，链球菌和乳酸球菌)的特定表达系统从而达到本发明的目的，也就是表达、分泌和/或细胞表面展示各种抗原性和/或治疗性元件。
为了把所翻译的蛋白质分泌到细胞外环境中去，可以将适当的分泌信号整合到目的多肽中；这些信号可以是多肽内生性的，也可以是异源信号。因此可以使用分泌信号而使终末蛋白质的传递更为容易。分泌肽的编码序列与蛋白质编码序列的5’末端联合运作，这一杂交的核酸分子被插入到所选择的适合于在所选宿主细胞内表达蛋白质的质粒中。可以从许多商业途径得到质粒，特别是为表达和分泌外源性蛋白质而设计的质粒。例如，如果想应用大肠杆菌的表达系统来表达和分泌蛋白质，通常使用的质粒包括pTrcPPA(Pharmacia)、pPROK-C和pKK233-2(Clontech)以及pNH8a、pNH16a、pcDNAII和pAX(Stratagene)或其它质粒。其它的分泌信号系统是Dieye Y.等人在“乳酸菌蛋白靶系统的设计”Journal ofBacteriology183(14)；4157-66(2001)中解释说明的那些系统，例如，来自链球菌致热原的M6前蛋白；以及Ravn P.等人在“TnINuc的研究进展及其在分离Lactis乳酸球菌的新颖分泌信号中的应用”Gene242347-356(2000)中提出的那些系统，如被信号肽酶I或信号肽酶II所识别的SP13、SP10、SP307与SP310。
因而，本发明在一个方面实施方案了在宿主生物体内生产异源蛋白质的方法，通过宿主的分泌途径加工处理蛋白质。分泌是通过用包含一个DNA结构的质粒对宿主生物体(如，大肠杆菌)进行转化而实现的，该DNA结构含有与编码分泌信号肽的DNA序列联合运作的转录启动子，比如BAR1 C-末端区域的那一部分，或者能够导航异源蛋白质或多肽输出的金黄色葡萄球菌蛋白A。
已经说明的、应用在大肠杆菌中的其它各种分泌系统的例子包括美国专利号4,336,336(1979年1月12日归档)，欧洲专利申请发表号184,169(1986年6月11日发表)、177,343(1986年4月9日发表)以及121,352(1984年10月10日发表)，Oka T.等(1985)、Gray G.L.等(1985)、Ghrayeb J.等(1984)与Silhavy T.等(1983)。这些系统大部分是应用如下发现某些细菌蛋白质在正常情况下被细胞输出到非细胞质区域，而一个出现在这些细菌蛋白氨基NH2-末端上的短(15-30)的氨基酸序列，对以相似的方法将异源蛋白质转运到非细胞质区域是非常有用的。这些短的氨基酸序列通常被称为“信号序列”，因为它们发出信号将蛋白质从细胞质中转运到非细胞质区域。在革兰氏阴性细菌中，这样的非细胞质区域包括内层细胞膜、周质间隙、细胞壁和外层细胞膜。在刚刚早于或者在蛋白质转运出细胞质的过程中，信号序列去除的典型方式是通过某点上肽切割，这样就将成熟的蛋白质留在了预期的非细胞质区域。信号序列点特异性的去除，在这里也指信号序列精确的加工处理过程，如果希望正确的蛋白质被转运到预期的非细胞质区域，这是一首选的事情。
因此，本发明在这方面同通过与大肠杆菌细菌融合而被改良的嗜热链球菌或lactis乳酸球菌生物体有关，所使用的大肠杆菌包含一个编码异源核酸的质粒，该异源核酸与能够在改良的宿主细菌体内驱动基因元件表达的启动子联合发挥作用。依据本发明的一个独特实施方案，异源核酸是编码抗原的多聚核苷酸序列，该抗原可以被分泌或者出现在细菌的细胞表面；无论是哪种情况，编码异源核酸的质粒都将包含适当的分泌或锚定序列信息，而这些信息是分泌或向细胞表面转运与表达所必需的。据此，在融合体内所产生的蛋白质或肽片段构成了能够在与机体的免疫相关细胞接触时诱发免疫反应的抗原。
在蛋白质被分泌时，预期的相关免疫细胞是分泌IgA抗体的细胞，但是也很有可能出现下面的情况分泌的抗原性片段被Peyer’s斑内的M细胞吞噬，抗原性蛋白质或片段在这种情况下可能与M细胞口袋内的各种成分接触，包括CTL、B细胞、巨噬细胞和树枝状细胞，因此诱导黏膜免疫反应。当蛋白质或抗原性片段被锚定并呈现在融合体细胞表面时，抗原性片段可以直接与M细胞表面细胞膜接触，因而直接与M细胞的各种成分相互作用，直接诱发黏膜免疫反应。
根据本发明的另一个独特实施方案，异源核酸是编码治疗性蛋白质或肽片段的多聚核苷酸序列，这些蛋白质或肽片段或者被分泌或者被展示在细菌细胞表面。无论是哪种情况，编码异源基因元件的质粒都将包含适当的分泌或锚定序列信息，而这些序列信息是分泌或向细胞表面转运与表达所需要的。根据这一实施方案，融合体内所产生的蛋白质或肽片段组成了治疗剂，这样在异源核酸得以表达时它就产生减轻和/或纠正疾病状态所必需的蛋白质或蛋白片段。特别是，异源核酸编码一种能够被分泌到呼吸道内腔中去的蛋白质例如胰岛素，这就是为什么当蛋白质被分泌时它能够被吸收并且减轻、纠正疾病状态，如糖尿病。
根据上面的简要论述，依据本发明的规范，也可以应用由细菌-细菌组成的融合体。可以将具有适当表达系统的几种不同的细菌与非致病性链球菌或乳酸球菌细菌融合而产生预期的改良LAB生物体。本发明中可取的一方面，链球菌或乳酸球菌细菌与大肠埃希氏菌(coli)融合；通常用于分子克隆技术的几种不同的coli菌种是HB101、C600、DH1、DH10B、DH5、α5与β10。优先选择上述菌种，是因为可以很容易地得到它们生产和表达异源核酸所需要的表达系统，这些表达系统都已经被详细地说明并且可以通过商业渠道获得。
本发明中，一个菌种的细菌与不同菌种的细菌相融合。具有已经报道的表达系统的两个独特菌种是嗜酸乳酸球菌和枯草杆菌。Cocconcelli PS.等，“单链DNA质粒、载体结构和嗜热硬脂杆菌α-淀粉酶在乳酸杆菌内的克隆”Research inMicrobiolog；y 142(6)643-52(1991)和Kleerebezem M.等“乳酸菌的控制基因表达系统乳酸球菌、Leuconostoc以及spp.乳酸杆菌可转化的尼生素诱导表达盒”Applied and Environmental Microbiology63(11)4581-84(1997)。
一个方面，本发明的表达系统含有一个DNA结构，至少由一个编码目的抗原或治疗性基因的核酸序列组成，它发挥作用时与可以指导细菌宿主体内异源序列表达的启动子相关联。编码抗原性或治疗性片段的多聚核苷酸可能包含编码成熟多肽或其一个片段的编码序列，该序列独自发挥作用，或者是在阅读框内编码成熟多肽或其一个片段的编码序列与其它编码序列共同作用，如编码复制原点、锚定点、引导或分泌序列、前蛋白(或副蛋白)或其它融合肽片段的序列。比如，可以编码标志序列，后者使得我们更容易选择融合多肽。多聚核苷酸也可以包含非编码5’与3’序列，如转录的非翻译序列、拼接与多聚腺苷化信号、核糖体结合位点以及稳定mRNA的序列。
另一方面，LAB(如嗜热或lactis菌种)与大肠杆菌融合，该融合方法可以使嗜热或lactis细菌表达由大肠杆菌相关DNA编码的抗原性或治疗性蛋白质或多肽。更有价值的是，抗原性多肽可以被表达在LAB-大肠杆菌融合体表面，而治疗性蛋白质则可以被分泌。因而，含有编码锚定、分泌、引导氨基酸序列的附加多聚核苷酸序列或增加体内产物稳定性的附加序列通常是很有利的，。这样所产生的由多肽片段构成的蛋白质要么被表达在LAB-大肠杆菌融合体细胞表面、要么被分泌，并由此引起免疫或者治疗反应。
典型的多肽片段包括，例如编码能够被机体的各种免疫起动细胞特别是M细胞、IgA和IgG细胞所识别的抗原决定簇的那些片段，它们在动物体内尤其在人类体内具有抗原性或免疫原性。特定序列或片段的不同变异体也构成了本发明的一部分；首选的变异体是那些将其保守氨基酸替换者；其它可选择的片段包括具有生物学活性的治疗性片段，它们调节生物学活性，包括相似的或者加强的活性、降低不需要的活性。这些多肽片段保留抗原或治疗剂的生物学活性，包括抗原性活性。
本发明独特的一方面是，它与包含一种或多种抗原性或治疗性多聚核苷酸的大肠杆菌起源的载体以及宿主嗜热链球菌或lactis乳酸球菌细胞有关，宿主嗜热链球菌或lactis乳酸球菌细胞是通过与大肠杆菌细胞载体融合由遗传工程设计生产的，本发明还与由宿主LAB-大肠杆菌融合体细胞编码的抗原性或治疗性多肽的生产与表达有关。具有适当表达系统的合适的大肠杆菌细胞可以通过多种商业渠道购买得到或者由遗传工程设计生产而得，并且与本发明的抗原性或治疗性多聚核苷酸的表达系统或表达系统的一部分合成一体。
将多聚核苷酸引进大肠杆菌细胞可以通过许多标准实验室操作手册(如Davis等，分子生物学的基本方法(1986)以及Sambrook等，分子克隆法实验室手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))中所介绍的方法来完成，例如磷酸钙转染法、DEAF-葡聚糖介导的转染法、显微注射法、脂质阳离子介导的转染法、电穿孔法、转换、擦痕装载法、弹道导入或感染。用以与大肠杆菌细胞融合并且在体内生产抗原性和治疗性蛋白质和/或多肽的合适的LAB宿主代表性范例包括嗜热链球菌或lactis乳酸球菌以及乳酸杆菌细胞如acidophilus、brevis、casei、delbrueckii、fermentum或plantarum。
更为独特的是本发明所使用的重组大肠杆菌载体，已经被以正向或反向插入了由DNA、cDNA或RNA序列组成的抗原性或/和治疗性结构。所插入的结构进一步组成调节序列，比如包括与遗传序列关联运作的启动子，这一方面更有实用价值。很大数量的合适的质粒和启动子为业内人士所熟知，和/或如下所述，并且可以从商业渠道获得。
因此本发明还体现一个方面，DNA结构可以是一个质粒，它至少编码一个适当的预期细菌宿主的复制原点、一个可选择性标志基因和/或一个报告基因、一个启动子，该启动子与编码抗原或治疗性元件的异源核苷酸序列关联运作，而被编码的抗原或治疗性元件融合到表面结合启动子或锚定点区域。该结构也可以包含其它适当的元件，例如转录起始序列、分泌信号序列和转录终止序列。根据它们在宿主细菌体内复制的能力而生产或制造质粒。当表达系统来自大肠杆菌时，启动子与核苷酸序列可以被克隆进入其中的质粒载体包括，例如pUC18、pUC19、pBR322及pBluescript。适合于LAB的适当质粒包括，例如pFXL03，pWV01，pGKV210和pVA838。来自乳酸杆菌和乳酸球菌的某些质粒可以从DSMZ，Braunschweig，Germany处购的。其它的质粒在专著中都有说明。例如，适合于酪蛋白乳酸杆菌的质粒载体在许多文献中都又说明，包括Maassen C.等人的“口服疾病预防策略的手段表达破伤风毒素片段C的酪蛋白乳酸杆菌重组体疫苗接种或多发性硬化症中口服耐量感应的髓磷脂蛋白”Vaccine 17(17)2117-28(1999)。此外，适合于Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis的质粒载体在Geoffrey M.等人“识别正在开发的活疫苗载体乳酸菌种的绿色荧光蛋白的应用”(Applied andEnvironmental Microbiology 66(1)383(2000))有说明解释；Piard J.等人在“各种乳酸菌锚定链球菌生脓原M6蛋白的细胞壁”Journal of Bacteriology179(9)3068-72(1997)中对适于lactis乳酸球菌、酵素乳酸杆菌与sake乳酸杆菌的质粒载体进行了说明。有些质粒载体适合于宽范围的乳酸杆菌种，如pPSC20和pPSC22，在Cocconcelli P.等人的文章“单链DNA质粒、载体结构和嗜热硬脂杆菌α-淀粉酶在乳酸杆菌内的克隆”Research in Microbiolog；y142(6)643-52(1991)中都得到了说明。也可以应用穿梭载体，它们是能够在用以产生融合体的双亲细菌中表达的质粒；这种情况下，适当的穿梭载体要含有来自两个融合菌种的复制原点；适用于LAB的适当穿梭载体包括pFXL03、pWV01、pGKV210、pVA838和pNZ123。此外，大肠杆菌/LAB穿梭载体在Maassen C.等人.，Vaccine，同上和Bringel等人的“来自乳酸杆菌plantarum CCM 1904的pLP1质粒在乳酸杆菌中的特性、克隆、加工与分布及其在穿梭载体构建中的应用”Plasmid，22(3)193-202(1989)中得到说明。
质粒可以包含选择性标志基因或报告基因，它们使我们更容易确定那些细菌包含有预期质粒DNA。可能的选择性标志基因是抗生素抗性标志，如卡拉霉素抗性基因，、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因；β-半乳糖苷酶基因和编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因就是报告基因的例子。相反，如果质粒没有包含选择性标志或报告基因，则质粒DNA只能以不同的方法检测，如使用质粒DNA作为探针的斑点印迹法。
需要根据宿主细菌及要表达的抗原来选择启动子。可以使用于大肠杆菌表达系统的启动子包括λ-PR、PL与Trp以及T3、T7、gpt、SP6和lacZ启动子或乳糖操纵子。文献中已经说明了各种乳酸杆菌和乳酸球菌细菌的启动子。例如，已为人们研究透彻的plantarum乳酸杆菌和lactis乳酸球菌两种细菌的、并且已被证明对其它LAB中的表达也有用的一种启动子就是来自lactis乳酸球菌的尼生素可诱导的nisA启动子(参见deRuyter P.等人的.，“食品级尼生素诱导嗜酸乳酸杆菌的控制表达系统”Applied and Environmental Microbiology.623662-67(1996)；Kleerebezem M.，“乳酸菌的控制基因表达系统乳酸球菌，Leuconostoc和Lactobacillus spp可转化的尼生素诱导表达盒”Applied and EnvironmentalMicrobiology63(11)4581-84(1997))。L.plantarum ldhL启动子也被成功地应用于L.plantarum。L.casei表达系统的启动子包括来自L.casei的结构性乳酸脱氢酶启动子与来自L.amylovorus的可调控淀粉酶启动子(Maassen，等，Vaccine17(17)2117-28(1999))。乳酸球菌启动子P59已经被应用在各种lactis乳酸球菌和乳酸杆菌细菌中(Piard J.等，“各种乳酸菌锚定链球菌生脓原M6蛋白的细胞壁”Journalof Bacteriology 179(9)3068-72(1997))。此外，质粒可以含有均与编码抗原序列联合运作的多重启动子序列。这样载体中的每一个启动子都与用来制造该融合体的双亲细菌中的至少一个相兼容，并且如上所述，质粒可以包括多重复制原点，如来自每一双亲细菌种的复制原点。
在抗原性多肽要被表达时，通常情况下，如果能使多肽产生并被展示于细胞表面，这种情况是首选的。最近，分子生物学在重组体蛋白质产物方面的进展使得在微生物体外表面表达蛋白质成为可能，这是利用一种被称为“细胞表面展示”的技术来完成的。编码表面结合启动子区域的序列需要与抗原序列融合，这样就使得改良的乳酸杆菌生物体能够在自身表面表达抗原。这种表面结合启动子区域的例子是那些用在PCT/NL96/00135所说明的结构中的区域，以及Dieye Y.等在“乳酸菌蛋白靶向系统的设计”中所说明的那些区域，Journal of Bacteriology，183(14)；4157-66(2001)。
酿酒酵母菌是一种被认为与人类表达系统兼容的酵母，因为它具有与人类表达系统如此的相似性，如细胞周期、染色体结构和RNA拼接。本发明人已经选定方向来研究一种利用该酵母的表达系统，由于该酵母菌具有进行翻译后修饰的能力，例如，对所产生的蛋白质进行乙酰化作用、磷酸化作用以及糖基化作用修饰，它们的作用方式与哺乳动物细胞的作用方式相当相似。因此，人们希望利用酿酒酵母菌作为在动物体内表达外源性蛋白质的宿主，产生与其自然形式更为接近的基因产物，就象动物细胞产生的蛋白质一样。因为就其培养方式而言，酿酒酵母菌与其它的酵母和细菌具有很多相似之处，关于其它微生物的应用知识以及用来操纵它们的微生物学方法和DNA重组技术，都可以很容易地被用来在使用酿酒酵母菌的表达系统内生产外源性蛋白质。
已经在酿酒酵母在内的酵母内生产出了各种蛋白质，尤其是被用作药物的那些蛋白质，其安全性已经被广泛认识(Marten & Seo，第7章，生产rDNA的表达系统和程序，Hatch等编著，ACS Symp.Ser.，477(1991))。来自酵母菌的生产和分泌预期蛋白质的表达和分泌载体质粒包含有一个转录启动序列(启动子)、编码分泌信号肽的DNA、编码目的蛋白质的结构基因和转录终止子，如果有必要的话，还可以含有一个报告基因。如果想要使蛋白质或肽片段被展示在酵母融合体的细胞表面，蛋白质或肽片段的编码序列就必须分别在5′和3′末端同分泌信号序列和合适的锚定序列融合。
这类载体的转录启动序列(启动子)，已被应用者有GAPDH、MF.α-1启动子或PGK(Loison等，Korean Patent Laid-open Publication Nos.88-7727 and88-700234；Bio/Technol.，6，72(1988))、GAPDH、杂交因子-α.(MF.α.-1)、PH05(Meyhack等，Korean Patent Laid-open Publication Nos.86-381 and 87-6185；工业微生物的遗传学和分子生物学，Hershberger等人编著，American Society ofMicrobiology出版，pp.311-312(1989))以及GAL启动子序列(Johnston，Microbiol.Rev.，51，458-476(1987))，例如，在培养介质中由半乳糖诱导而成的GAL1。
关于分泌信号，目前用于异源性蛋白质分泌的来自酵母菌的分泌信号肽包括转化酶信号肽(U.S.Pat.No.5,010,003)、酸性磷酸酯酶信号肽(U.S.Pat.No.5,013,652)、杂交因子-α.的prepro引导肽(ppL)(U.S.Pat.No.4,588,684)。在这些各种各样的分泌信号肽中，ppL的应用最为广泛。就细胞壁锚定序列而言，可以被融合(与酵母菌分泌信号相关联)到抗原上以实现在细胞壁上的细胞表面展示的各种序列包括Gas1p的羧基末端部分(编码最后252个氨基酸的序列)或Yap3p的羧基末端部分(编码最后35个氨基酸的序列)。详细资料请参阅de Sampaio G.等，“酿酒酵母菌中GPI锚定点的组成必作用细胞壁靶向”MolecularMicrobiology34(2)247-56(1999)；也可参见Van Der Vaart等“发挥异源蛋白质细胞表面表达锚定点作用的酿酒酵母菌细胞壁蛋白的比较”Applied andEnvironmental Microbiology63(2)615-620(1997)。
因此，本发明的一个独特实施方案是，它同通过与大肠杆菌细菌融合而被改良的酵母菌生物体有关，所使用的大肠杆菌包含一个编码异源基因元件的质粒，该异源基因元件与能够在改良的宿主酵母菌体内驱动基因元件表达的启动子联合发挥作用。可以使用能够被RNA聚合酶II所利用的各种启动子，这些启动子是可以诱导的例如GAL、GAL10、PH05及相似者，或者它们是组成性的例如ADH1、TPI、PGK及类似者。而且，可以被使用的各种载体包括，但不局限于PBM150、PYEP51、PLGSD5、YEP62、PAAH5及类似物；此外，编码异源基因元件的质粒也可以包含选择性标记，例如URA3、LEU2、HIS3、TRPI及其类似物。
根据这一独特实施方案，异源基因元件是编码抗原的多聚核苷酸序列，所产生的抗原或者被分泌，或者被展示在细菌的细胞表面。无论是哪种情况，编码异源基因元件的质粒都将包含分泌或向细胞表面转运与表达所需要的适当的分泌或锚定序列信息。据此，在融合体内所产生的蛋白质或肽片段构成了能够在与机体的免疫相关细胞接触时诱发免疫反应的抗原。
根据本发明的另一个独特实施方案，异源基因元件是编码治疗性蛋白质或肽片段的多聚核苷酸序列，这些蛋白质或肽片段或者被分泌或者被显示在细菌细胞表面。无论是哪种情况，编码异源基因元件的质粒都将包含分泌或向细胞表面转运与表达所需要的适当的分泌或锚定序列信息。根据这一实施方案，融合体内所产生的蛋白质或肽片段组成了治疗剂，这样在异源核酸得以表达时它就产生减轻和/或纠正疾病状态所必需的蛋白质或蛋白片段。特别是，异源基因元件编码一种能够被分泌到肠道黏膜内腔中去的蛋白质例如胰岛素，这就是为什么当蛋白质被分泌时它能够被吸收并且减轻、纠正疾病状态，如糖尿病。
本发明的一个实施方案，重组LAB、融合体及酵母菌可以被导航至M-细胞，例如与肠黏膜内Peyer’s有关的那些M-细胞。在黏膜上皮衬层中，有少量的淋巴组织构成系统的黏膜淋巴滤泡-相关上皮(FAE)组织。尽管大分子物质和微生物不能通过衬于肠道黏膜的上皮组织入侵，但是在象位于肠道内的Peyer’s斑这样的黏膜诱导点中，淋巴FAE包含微褶皱或M细胞，微褶皱或M细胞可以转运抗原及微生物以进行抗原摄取；简单上皮内的M细胞仅仅发生于机体系统的淋巴滤泡。因而在富含M细胞的FAE位点内，存在着专化上皮与抗原提呈细胞及淋巴细胞之间的高度进化(强化)了的协作(协同作用)。通过活跃的跨上皮细胞的小泡转运，M细胞把来自内腔的大分子物质、颗粒以及微生物经由其细胞质直接转运到上皮内的黏膜淋巴滤泡和机体的系统黏膜淋巴组织，该淋巴组织能够处理抗原并且激发能够引起分泌免疫的黏膜免疫反应，分泌性免疫反应使得肠道黏膜和肺脏黏膜表面浸浴在保护性抗体之中。所以，这些淋巴组织也是抗原、细胞、抗体以及存在于淋巴系统内、最后出现在血液中的其它任何蛋白质进入机体循环的通路。
所以M细胞提供了上皮屏障内用以进行小泡转运的局部、功能性通道(口穴)。M细胞直接局限于淋巴滤泡(FAE)位点，通过及时将这些物质暴露于吞噬细胞和抗原提呈细胞，从而减少了通过上皮屏障转运外源性物质和微生物的固有危险。M细胞朝向内腔的顶部表面不同于周围的其它细胞它们缺乏典型的刷状缘，而有不定的微绒毛，或拥有有庞大微绒毛内吞区域的微褶皱。M细胞的基部内陷形成了自身特征，这是上皮内的“口袋”或空间，它们既缩短了跨细胞囊泡从细胞顶部到基侧部所必须通过的距离，同时又为B细胞和CD4T细胞之类的淋巴细胞、巨噬细胞以及树枝状细胞的聚集提供了入坞位点。M细胞也有延伸到潜在淋巴组织的基本的推移活动，它们在这里与淋巴细胞或/和抗原提呈细胞直接接触，这好象是对M细胞转运后的抗原提呈起到一定的作用。
M细胞以几种不同的跨细胞方式参与如下过程外源性物质转运到细胞浆管、囊泡以及位于M细胞顶部胞浆中的大的多囊泡体中去，及其后通过细胞外分泌作用将这些物质释放到口袋中去的过程。粘附性病毒与高分子物质是通过粘附性细胞内吞作用而被摄取的，这种细胞内吞作用是由笼合包被的凹陷与囊泡进行的；而非黏附性物质的摄取是经过液相细胞内吞作用完成的，液相细胞内吞作用的囊泡是以包被或非包被的形式存在。大的黏附性颗粒与细菌触发吞噬作用，这包括细胞处理过程的延伸以及膜下肌动蛋白网的重组。
M细胞引导完整的大分子物质由屏障一边向另一边转运的能力包括膜性小泡的定向运动。尽管这种转运在M细胞中的分子机制尚未明确，但是我们可以有把握地推测M细胞介导的膜性转运依赖于极化上皮细胞所具有的特征即极化的组织结构和信号传导网络来完成的。跨上皮小泡转运是内吞物质的主要途径，这使得M细胞在上皮细胞中独具特色。研究表明在M细胞顶部表面形成的内吞小泡首先将其内容物转移到顶部细胞浆中的内涵体，内涵体酸化其内含物且包含有蛋白酶。
B细胞是M细胞口袋中的主要成分之一，口袋中的B细胞表达IgM而不表达IgG或IgA，提示存在记忆B细胞或/和原始B细胞在此发生分化。记忆表现型的存在提示口袋中的细胞自身就已经为重新暴露于入侵抗原做好了准备；研究表明转移到M细胞口袋中去的B淋巴母细胞可以反复暴露于抗原，延伸扩展免疫反应并且使之多样化。但是紧邻在FAE下面中，也会存在大量的其它B淋巴母细胞、辅助T细胞以及抗原提呈细胞，这就足以触发免疫反应的发生。
穿越M细胞的腔内抗原被直接转运到抗原处理细胞与抗原提呈细胞，紧接着迁移到定位于黏膜相关淋巴组织(MALT)中的潜在淋巴滤泡中抗原特异性淋巴细胞，MALT诱导细胞进一步增殖分化；因而，抗原与微生物通过M细胞的过程是黏膜免疫反应发生过程中至关重要的一步。该过程引起产生IgA的B细胞增殖分化，其中部分IgA-形成B细胞运动到脉管系统然后返回到黏膜表面，有效地激发了特异性的黏膜免疫反应。
黏膜免疫系统是由功能专一化的局部诱导位点(系统的黏膜相关淋巴组织，或O-MALT)和分布广泛的效应位点(弥漫性黏膜相关淋巴组织，或D-MALT)组成的，上皮屏障隔把它们均同黏膜表面抗原隔开。诱导黏膜免疫反应的第一步就是将抗原转运通过上皮屏障。在诱导位点中处理和提呈抗原之后，定向IgA的抗原特异性B淋巴母细胞局部增殖分化并通过血流迁移到局部和远处的黏膜及分泌腺组织；它们在这里主要分化成产生IgA聚合体的浆细胞，浆细胞是D-MALT的重要组分，并且通过受体介导的跨细胞作用转运通过上皮细胞进入腺体与黏膜分泌物中去 所以，黏膜免疫反应构成了机体防御经黏膜转运的病原体(如流行性感冒病毒)的第一道防线，并且对长期保护作用也是非常重要的。机体对抗病原体的黏膜防御包括两类先天屏障，即黏液、上皮组织以及先天性免疫机制之类的先天性屏障，以及适应性宿主免疫反应，后者在黏膜表面主要是由CD4+T细胞、分泌性免疫球蛋白A(S-IgA)以及抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)组成。在健康的环境中，M细胞转运以及由此引起的抗菌性S-IgA的分泌，都限制了黏膜疾病的强度与持续时间，并能防止再感染。
通过将改良微生物导航至肠道衬层，就使得来自真核质粒的抗原性蛋白质表达并被提呈给M-口袋内的免疫细胞。任何治疗性蛋白质，如胰岛素、生长激素、干扰素等，都可以以相似的方式被表达并通过M-口袋分泌进入淋巴组织，进而进入血液循环。尽管M-细胞是首选的靶向细胞，但是质粒DNA也可以被转导至肠道内的其它细胞，例如K-细胞和其它的快速分裂细胞。事实上，人们已经证实因子VIII和因子IX的表达，例如在快速分离的上皮细胞内首先在基侧部方向(例如，远离内腔并朝向底层的毛细血管和淋巴腺)分泌因子VIII和因子IX。因此人们可以预测，在M-细胞、K-细胞和其它肠道细胞内的分泌性治疗蛋白质的表达会引起这些蛋白质出现在血流和循环中。见Lozier JN，“作为血友病基因治疗靶子的肠道上皮细胞”Hum Gene Ther(1997)Aug 10；8(12)1481-90。为了进一步提高蛋白质向基侧部分泌的靶向作用，可以使用靶向信号序列，例如，来自疱疹性口炎病毒糖类蛋白G的基侧部特异性11氨基酸信号序列。Thomas与Roth，“来自疱疹性口炎病毒的糖类蛋白G细胞质区域内的基侧部靶向信号一级结构序列与细胞内多种靶向主体相似，但有不同的靶向活性”J.Biol.Chem.，Vol.269，No.22，15732-15739(1994). 另一方面，某些蛋白质(例如，尼生素)被优先分泌到管腔内，这在自然情况下仅仅发生在乳酸杆菌表达的细菌素；这种情况下可以应用顶部表面特异性的信号序列。例如，来自Thy-1的glycosylphosphatidylinositol(GPI)附加序列可以与兴趣蛋白质融合，以将特定的蛋白质导航至肠道黏膜细胞顶层。例如，已经证实GPI附加序列可以在培养物中引起极化肠道Caca-2细胞内所表达的蛋白质向顶部方向的转运高于基侧部方向转运2.5倍。见Soole K.等，“极化的肾脏MDCK细胞和肠道Caco-2细胞内所表达的glycosylphosphatidylinositol锚定细菌蛋白的上皮分类”Journal of Cell Science，108，369-377(1995)，通过参考文献而使之在此呈为一体。
M-细胞的靶向作用可以用多种方法来完成，包括使用与M-细胞表面复合物结合的复合物。这样的复合物包括多肽(例如，M-细胞受体或表面抗原)、碳水化合物和glycoconjugates。M-细胞靶向作用可能包含与M-细胞特异结合的复合物，以及特异地结合到与M-细胞相关的组织细胞的复合物，例如肠道黏膜的上皮细胞。
与M-细胞结合的复合物的一个实例是由打靶M-细胞的细菌和病毒所产生的黏附素，例如耶尔森氏菌种和沙门氏菌typhi种。(Clark M.A.等，“M-细胞表面β1 integrin的表达及侵袭素介导的耶尔森氏菌假结核向鼠Peyer’s斑内M-细胞的靶向作用”Infect Immun.661237-43(1998)；Baumler A.等，“lpf fimbrial操纵子介导的Samonella typhirium与鼠Peyer’s斑的黏附作用”Proc.Natl.Acad.Sci.USA93279-83(1996).这样的细菌性与病毒性黏附素是介导M-细胞结合的蛋白质。呼肠孤病毒的δ-1蛋白也已经被用来打靶M-细胞。Wu Y.等，“M-细胞靶向的DNA疫苗”Proc.Natl Acad.Sci.USA 98(16)9318-23(2001)。
特异性地结合到M细胞的另一种复合物是植物血凝素。携带脂质体到M细胞的植物血凝素的M细胞靶向作用，可以使用各种类型的植物血凝素，在U.S.Patent No.6,060,082中均作了说明，在这里通过参考文献而使之呈为一体。
特异性结合到M细胞表面蛋白质如受体或表面抗原的抗体，也可以被用来打靶M细胞。可以用多种已经为业内人士所熟知的方法生产针对这样的表面蛋白的抗体，使用完整的兴趣蛋白质(蛋白前体或加工后的蛋白质)或蛋白质的一部分。此外，也可以应用靶向M-细胞的呼肠孤病毒δ蛋白。Wu Y.等，“M-细胞靶向的DNA疫苗”Proc.Natl Acad.Sci.USA98(16)9318-23(2001)。
上面所说的M细胞靶向复合物可以被整合进入改良微生物的细胞壁中；这可以通过把M细胞靶向复合物添加到正在重建细胞壁的原生质体来实现。首先是，将M细胞靶向复合物与被设计作为细胞膜锚定点的脂质结合。这样的功能化脂质可以从Avanti Polar Lipids，Inc.(Alabaster，AL)购买得到。
另一种方法，质粒可以编码一种M细胞靶向多肽。一个实施方案是，包含要表达的抗原或治疗性蛋白质编码序列的质粒也含有M细胞靶向多肽的序列；此时，M细胞靶向多肽序列可以被附加到抗原序列上去。也可选择的方法是，M细胞靶向多肽序列可以由DNA片段来编码，此DNA片段是经过同源重组产生并且被整合到微生物的基因组中，这与上面所述的把自溶解基因整合到染色组中的方法相似。
下面的实例是说明根据本发明开展工作所要用到的方法和制剂。这些实例仅仅是为了说明问题，而不要认为是限制本发明的适用范畴。虽然这些实例可能是用最为首选的嗜酸乳酸杆菌种来说明的，但是根据本发明的规范，其它的乳酸杆菌种、LAB与大肠杆菌也是适用的。
在这次公开的资料中提到但没进行详细说明的有关微生物学、分子生物学以及细胞培养基的方法，均已经在科学文献中有了详细的报道。这些方法是本领域技术人员力所能及的。
实施例一 嗜酸乳酸杆菌原生质体的形成 乳酸杆菌细胞在MRS肉汤(Difco)、37℃环境中培养3小时至过夜。然后将细胞在2000xg条件下离心30分钟，用含有溶菌酶(20μg/ml)的高渗溶液(0.01MTris氢氯化物[pH 7.5]，0.3-0.5M甘露醇)冲洗细胞并使之重新悬浮，室温环境中孵育5-15分钟。在适当的再生介质或者是与合适的载体(如，酸奶酪)混合，或者是配有蔗糖与适当缓冲剂的高渗溶液中，所形成的原生质体逐渐覆盖于平皿上。必须将原生质体维持在含有蔗糖而不含甘露醇的高渗溶液中，直至再生出细胞壁，以防止渗透压所引起的自溶解。
实施例二 具有可诱导自溶基因的乳酸杆菌种的产生 含有自溶解基因的表达盒可能与乳糖启动子关联运作；自溶解基因的例子就象上面所公开的那样，包括AcmA、holin或细胞溶解酶；乳糖启动子的例子有细菌Plac启动子或pH依赖启动子。关于Plac启动子，例如，它可以通过在源自Stratagene克隆系统的pBluescript内克隆自溶解基因而获得。
来自乳酸杆菌染色体DNA的靶DNA序列，例如，可以通过产生源自乳酸杆菌生物体的基因文库而获得。可以通过适当的限制酶并且插入一定数量的源自乳酸杆菌文库的基因克隆，使携带有自溶解基因表达盒的pBluescript线性化。最好选择所要使用的克隆包含有参与某些营养物质或氨基酸(如，色氨酸、酪氨酸等)代谢途径的一些生化酶，并且pBluescript的插入破坏特定代谢途径中的特定的生化酶。
这样就可以利用上面所讨论的转化规程中的任一方案，使所产生的改良染色体DNA克隆返过来转化进入乳酸杆菌。当这一改良染色体DNA克隆存在于细胞时，它可以与内源性染色体DNA发生同源重组，结果使自溶解基因整合进入乳酸杆菌基因组。可以通过pBluescript质粒所赋予的抗生素抗性，或者伴有在某些营养成分中细胞生长能力的缺失来选择突变种，细胞生长能力的缺失是由于这些营养成分的代谢途径已经被打乱而中断。我们应该注意到，突变乳酸杆菌具有能够驱动自溶解基因表达的Plac启动子，应该在无乳糖的培养基中培养与繁殖这种突变异体。这种突变乳酸杆菌可以被很容易地培养在含有葡萄糖的介质中。
除了自溶解基因之外，可以将任何数量的基因引进并且整合到乳酸杆菌基因组，以产生特定目的的突变体。
实施例三 携带GFP表达盒细菌的M-细胞靶向作用体外模型 最初为了检测重组体LAB打靶M-细胞转导质粒DNA的能力，可以使用拥有不同分化M-细胞的肠道细胞体外模型，正如Kerneis S.等人说明的那样“人类肠道Peyer’s斑淋巴细胞向转输细菌的M-细胞的转化”Science，277(5328)949(1997)，在此通过参考文献而使其呈为一体。简要的说，通过Peyer’s斑淋巴细胞与不同分化的人类肠道细胞系Caco-2.3x 105 Caco-2细胞共同培养而建立的滤泡相关上皮(FAE)和M-细胞，最初可以在6.5mm过滤器(3 micrometer pore Transwellfilters，COSTAR，Cambridge，MA)的较低面过夜培养。然后将过滤器转移至Transwell装置，使上皮细胞朝向孔板的较低室。上皮细胞就可以被培养至其完全分化(14天)。可以从PPs of BALB/c小鼠分离淋巴细胞，通过FACS对淋巴细胞进行分离与分类，所使用的抗体是针对鼠B220(CD45)的单克隆抗体和针对鼠CD3T细胞的单克隆抗体。分离之后，将淋巴细胞(106)加至朝向Caco-2细胞基侧部一边的上层室。培养两天以后，淋巴细胞最有可能已经积聚在上皮内口袋内，该上皮内口袋与在体内观察到的M-细胞口袋相似；Caco-2细胞最有可能已经被转化成具有M-细胞表现型的细胞。因此，可以应用这一体外模型进行实验，评价将重组体LAB导航至M-细胞的条件。
应用这一体外模型，把按照范例I所准备的原生质体培养物，或者是把如上所述的具有靶向复合物的重组体LAB与M-细胞一起在体外孵育。原生质体或重组体LAB就可以携带具备CMV启动子的质粒，该启动子与GFP联合运作。可以使用荧光显微镜监测M-细胞内GFP的表达。
还可选用的另一种方法就是利用分泌性碱性磷酸酯酶作为报告基因，例如，可以从市场购买得到的Clontech Laboratories(Palo Alto，CA)生产的pSEAP2-Basic载体。可以利用制造商提供的方法规程，从培养基中化验分析分泌性碱性磷酸酯酶。而且，可以通过修饰pSEAP2载体，使得靶信号肽序列既可用于碱性磷酸酯酶的顶部靶向，也可用于碱性磷酸酯酶的基侧部靶向。这样就可以依据靶分泌是顶部方向还是10基侧部方向，在Transwell的上层室或下层室中分析碱性磷酸酯酶的活性。
可以理解的是，特定的实验并未被限制于应用报告基因，也可以使用其它任何兴趣蛋白质的ELISA方法或免疫组织化学的方法来确定DNA是否引入M-细胞。
然而在另一个例子中，提高数量的具有GFP基因的质粒DNA也可以与体外M-细胞模型共同孵育，分析M-细胞对裸露质粒DNA的摄取情况。此外，重组体LAB或原生质体的溶解产物也可以与体外模型共同孵育，分析使用GFP的质粒DNA的摄取情况。
实施例四 分泌性碱性磷酸酯酶的体外分析 根据关于M-细胞摄取DNA所需要的细菌、原生质体或DNA的浓度数据，就可以象所说明的那样精确地计算出所需原生质体或重组体LAB的适当浓度，然后将它们通过口服摄取的方式给予动物或人类。如果要使用分泌性碱性磷酸酯酶，则需要采集动物或人类的血清，应用Clontech’s Great EscAPETM SEAPChemiluminescence Detection试剂盒(Cat.#K2041-1)及其操作规程分析动物或人类血清的SEAP活性，通过参考文献将该试剂盒的资料在这里呈为一体。Clontech’spSEAP-2载体所表达的SEAP酶是热稳定的。这样，要确定与内源性碱性磷酸酯酶活性相反的SEAP活性水平，就要求在加入化学发光酶底物之前通过将标本在65℃加热30分钟而灭活内源性碱性磷酸酯酶。
可使用的另一种方法是，如果预期蛋白质是胰岛素，则可以将具有适当胰岛素表达盒的重组体LAB给予适当的糖尿病动物模型或给予糖尿病患者。这样就可以依据动物或人类血流中的葡萄糖与胰岛素水平来监测治疗效果，而检测血流中葡萄糖和胰岛素水平的方法已为业内人士所熟知。
如果预期的蛋白质是一种抗原，则可以采集动物或人类的血清样本，分析与被引入的抗原发生结合反应的抗体。
实施例五 高拷贝质粒 为了提高质粒DNA实际上进入上皮衬层中细胞的机会，首选的方法应该是使用高拷贝的质粒来转化细菌。高拷贝质粒的例子包括具有突变复制原点的质粒，例如pUC 18载体，其阻遏物与复制原点的结合更松弛。可以在LAB质粒载体的复制原点上制造相似的突变异，以提高质粒的拷贝数量。可以应用已为人们所熟知的PCR反应技术产生的随机突变来引起这种突变异。可以设计侧翼包围复制原点的引物，然后使用象Taq聚合酶这样的非校对性聚合酶，最好在含锰缓冲液中进行反应，而不用镁缓冲液。这样，变异的PCR片段就可以取代原来的复制原点，并且被转化进入细菌。然后可以应用高选择性压力(例如，培养介质中的高抗生素)来选择高拷贝的LAB质粒。
可以选择的另一种方法是使用“逃跑”质粒，提高高拷贝质粒的数量。“逃跑”质粒是在大肠杆菌中发现与开发生产的一类最通用质粒中的一部分。它们是以IncFII质粒RI为基础，其中有一个反义RNA(CopA RNA)序列消极地控制着速率限制复制的蛋白质的形成。质粒的拷贝数量是由CopA RNA形成速率与RepAmRNA形成速率之间的平衡来决定的；后者形成速率略有提高就会极大地消减CopA RNA的形成速率，这是由于会聚性转录所致，会聚性转录引起(逃跑复制)拷贝数量控制的全部丧失，结果引起大量的DNA扩增，质粒的拷贝数量可以达到每个基因组中存在1000拷贝。因为这一扩增发生在蛋白质合成时，所以由所克隆基因编码的蛋白质也能够被扩增，并且可占总蛋白量的10-50％。见Nordstrom K与Uhlin BE的“逃跑复制质粒细菌体内产生大量克隆基因所编码蛋白质的工具”Biotechnology(NY)1992 Jun；10(6)661-6。
目前可以获得的“逃跑”质粒，可以被修饰以载有适合于哺乳动物表达的表达盒。根据上面所介绍的方法，就可以利用非致病性大肠杆菌细胞、并将细胞溶解，把改良的“逃跑”质粒传输到胃肠道中来。也可以为DNA转导中所使用的乳酸杆菌和乳酸球菌设计开发“逃跑”质粒。
实施例六 改良乳酸球菌生物体的生产细菌的选择和质粒DNA的克隆 可以通过乳酸球菌与包含重组体质粒的第二细菌融合，形成改良的乳酸球菌生物体。在本实例中，lactis乳酸球菌(ATCC#7962)与大肠杆菌HB101(ATCC#33694)发生融合。
大肠杆菌HB101含有一个编码GFPuv的重组体质粒pSYG3，GFPuv是为细菌表达而经过最优化设计的一种GFP突变异体(Crameri A.等，“经DNAshuffling(洗牌)法分子演变改良绿色荧光蛋白”Nat.Biotechnol.14315-19(1996))。GFPuv已经被最优化设计，它在受到UV光线(360-400nm)激发时产生最大的荧光性；并且可以利用如下引物从pBAD-GFPuv(Clontech，Palo Alto，CA)对其进行扩增CAT GCA TGC CAT GGC TAG CAA AGG AGA AGA AC以及CCG GGT ACCGAG CTC GAA TTC(SEQ.ID.NO 1)(Geoffroy M.等人，“识别正在开发的活疫苗载体乳酸菌种的绿色荧光蛋白的应用”(应用与环境微生物学66(1)383-91(2000)). 由pUC19构建PSYG3，PSYG3含有源自pBR322的复制原点、卡那霉素抗性基因和一个同编码GFPuv核酸序列联合运作的T7启动子序列，其中GFPuv与表面结合启动子区域融合。表面结合启动子区域可以是来自乳酸球菌Usp45蛋白前体的信号肽的编码序列，与源自链球菌生脓原的M6蛋白前体的细胞壁锚定点区域的序列，同时还有必需的转录终止子，其中细胞壁锚定点区域。信号肽序列是从GFPuv序列起始向上游方向延伸，而细胞壁锚定点区域是从GFPuv序列开始向下游方向延伸。详细资料请参阅Deite Y.等人，“乳酸菌蛋白靶向系统的设计”Journal of Bacteriology183(14)4157-66(2001)。质粒的克隆、用质粒对大肠杆菌细胞进行转化、以及选择包含质粒的克隆等都可以用掌握本领域普通技术的人员所熟知的程序来完成，具体程序参见以下文献Sambrook等，《分子克隆实验室手册》，第三版(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York)(2001)以及Ausubel等人的，《分子生物学通用规程》(Wiley，New York)(2001)。
质粒也可以包含其它的DNA序列，例如与表面结合启动子区域及T7启动子联合发生作用的呼肠孤病毒的σ1蛋白的编码序列，正如以上所说明的那样。这类蛋白的表达可以完成M-靶向作用。
埃希氏大肠杆菌与乳酸球菌原生质体的形成 两细菌种的原生质体都可以通过下列方法形成。lactis乳酸球菌要在MRS培养基(Difco)、26℃环境中生长到指数生长期，而拥有pSYG3的大肠杆菌HB 101要在LB培养基、37℃环境中培养到指数生长期之后。然后将氯霉素加到大肠杆菌培养物中，选择性地增殖pSYG3 16小时。将培养物在2000xg离心30分钟，用含有溶菌酶(20ug/ml)的高渗溶液(0.01 M Tris氢氯化物[pH 7.5]，0.3-0.5M甘露醇)冲洗所产生的细胞颗粒，并且用该溶液使之重新悬浮起来，在室温条件下孵育5-15分钟。把所产生的部分原生质体用适当的再生培养基(MRS或LB)轻轻地覆盖在平皿上，观测到菌落形成确保原生质体能够再生形成细胞壁。原生质体必须保持在含有蔗糖而不含甘露醇的高渗溶液中，直到它们再生了细胞壁以防止渗透压引起的细菌细胞溶解。
大肠杆菌与lactis乳酸球菌原生质体的融合 要融合原生质体，把保持在上述高渗溶液中的大肠杆菌原生质体1×109-10×1010添加到0.5-1ml保养在同一高渗溶液的L.lactis原生质体1×109-10×109中。向混合物中加入0.5ml-1.5ml的20％-70％PVA或PEG，轻轻摇动溶液使之充分混匀。混合物在室温条件下孵育1-30分钟，用相差显微镜监测原生质体的聚集与融合。当细胞生长到达指数生长期时，用上述高渗溶液将原生质体冲洗3次，并且用3-7ml此溶液稀释。取少量所形成的溶液(0.5-2ml)覆盖在含有卡那霉素的MRS琼脂上，26C孵育。
MRS琼脂适用于L.lactis和改良L.lactis在基本培养基上复制，和/或用对抗LAB的抗血清进行ELISA试验。LAB的种鉴定也可在西红柿琼脂平皿上进行，用卡那霉素选择包含pSYG3的细菌。这样所产生的微生物菌落就是拥有pSYG3的改良嗜酸乳酸菌的融合体。还可选用的方法是，由于GFP也是一种报告基因，可以根据紫外线照射下的绿色荧光来选择含有pSYG3菌落。
实施例七 改良乳酸球菌生物体的表现型特征鉴定 需要进行各种试验才能证实是否已经产生了预期的改良乳酸杆菌生物体。单个的菌落必须是1)取自上述选择性培养平皿；2)在MRS肉汤中培养；3)移植于含有卡那霉素的MRS琼脂上。步骤1-3要重复5次，以获得纯化的群体。
确定改良乳酸杆菌生物体生理特性的试验，要根据API ZYM和API 20A生化试验系统中的操作程序来进行。双亲细菌的特性已经由Holt等人在《Bergey’s细菌鉴定手册》第九版(Williams & Wilkins，Baltimore，MD)(1994)中提出，它是对所要说明和培养的细菌进行鉴定的综合性指导手册。
根据上述选择性要求，改良的乳酸球菌生物体应该具备与乳酸球菌种相应的表现型。因而改良细菌细胞应该是球形、革兰氏染色阳性，在液体培养基中细胞成对或以短链的形式出现，需要合成培养基才能生长，代谢应是发酵性、且产生L(+)-乳酸、而不产生气体，而且细菌应是过氧化氢酶阴性、氧化酶阴性的。
改良的乳酸球菌生物体不应该具有与埃希氏菌种相应的表现型。上面对乳酸杆菌进行的某些试验也说明改良的乳酸杆菌生物体不是埃希氏菌，因为埃希氏菌细胞还原硝酸盐、革兰氏染色阴性、过氧化氢酶阳性。
实施例八 改良乳酸球菌生物体的基因型特征鉴定 应用斑点印迹技术来确定改良的乳酸球菌生物体是否具有预期的基因型。根据标准程序提取染色体DNA，见Saito与Miura。按照Sambrook《分子克隆实验室手册》中说明的方法准备质粒DNA、进行Southern杂交。
将源自双亲细菌的染色体DNA和质粒DNA用作探针。如果用大肠杆菌染色体DNA来探测lactis乳酸球菌的染色体DNA或者以L.lactis染色体DNA为探针探测大肠杆菌染色体DNA，则会看到很低的同源性。相反，L.lactis和大肠杆菌的染色体DNA探针与改良乳酸球菌染色体DNA共享50％或更大的同源性，因为融合体应该含有来自双亲细菌的染色体DNA。本领域的技术人员也应该意识到这种情况的重要性如果双亲细菌更为紧密的相关，因此它们具有高度同源的染色体DNA，正如本发明的某些实施方案中可能发生的情况那样；发生在双亲细菌染色体DNA间的杂交程度与发生在亲代与融合体染色体DNA间的杂交程度之间的差异就比本范例中所述的变化小许多。在这种情况下，我们更可以依靠Southern杂交鉴定质粒DNA，从而来说明融合体基因型的特征。
实施例九 确定抗原在改良乳酸球菌生物体Ex Vivo表达的实验分析GFP荧光的探测 根据已知的程序，可以用几种不同的方法来检测GFP荧光在改良乳酸球菌生物体内的表达。如上文所述，可以在UV照射下给改良乳酸球菌生物体的培养平皿进行照相，从而鉴别表达GFP的菌落。此外，可以利用表面荧光显微镜来观察悬浮于PBS中的改良乳酸球菌细胞内的GFP产物，可以使用合适的胶片拍摄观察结果。最后，还可以通过制备改良乳酸球菌细胞的溶解产物、并使用荧光计分析其荧光性，来检测GFP的表达。
对总蛋白抽提物和细胞碎片进行Western斑点印迹分析定位GFP的表达 对总蛋白抽提物和细胞的各种碎片进行Western斑点印迹分析，来检测GFPuv的表达，表明GFP正被导航至细胞膜。根据人们早已熟知的程序准备总蛋白抽提物，这些程序在多种文献中提出，如Ausubel等人的《通用分子生物学规程》。细胞碎片的准备要根据Piard，J.-C.等人在.“各种乳酸菌锚定链球菌生脓原M6蛋白的细胞壁”中提出的方法进行。简要地说就是，将2nil指数期培养物在4C、4,300g条件下微量离心5分钟。所产生的细胞颗粒与上层清液被分离开来且被浓缩。用三氯乙酸(TCA)把上清液中的蛋白质沉淀下来。将细胞颗粒重新悬浮在TES中，用溶菌酶处理，把所产生的原生质体低速离心沉淀。上清液中就包含着由细胞壁释放的、并且可以被TCA沉淀的蛋白质。那么，我们就可以应用Dieye Y.等人在“乳酸菌靶向蛋白系统的设计”Journal of Bacteriology 183(14)4157-66中提出的方法，把蛋白质从原生质体颗粒中抽提出来。
这样就可以使用Western斑点印迹方法来分析总蛋白或细胞碎片样本用兔抗GFP抗血清(Invitrogen)作为第一抗体，辣根过氧化物酶共价连接的抗兔抗血清(Sigma)作第二抗体，进行检测。以已知量的重组体GFPuv(Clontech)作为对照标准，可以通过扫描标准品泳道与实验组泳道的信号来评估Western印迹上的GFPuv含量。Sambrook等人在《分子克隆实验室手册》中详细说明了Western印迹技术。
实施例十 HBsAg抗原与IL-2基因的转导 HBV表面抗原基因Pre-S2和S可以通过PCR技术从质粒pEco63(ATCC31518)扩增获得；鼠IL-2基因片段可以通过PCR技术从质粒pMUT-1(ATCC37553)获取。把这两种基因安置在融合一体的Lac-Z启动子之下或者安置在位于pUC18中独立的T7启动子之下。这些基因也可以在穿梭载体中克隆。仅包含pre-S2/S基因的质粒被称作pPS2S，同时包含pre-S2/S和IL-2两种基因的质粒称为pPS2S/IL2(Chow et al.J Vir.Jan 1997169-178)。这两种基因也可以被克隆至另一个穿梭载体，形成融合基因或受独立启动子调控。DNA就被转化进入大肠杆菌DH5和/或HB 101，质粒DNA就在大肠杆菌培养物内增殖。按照上述方法将指数生长期的大肠杆菌制成原生质体并且与lactis乳酸球菌融合。融合体将选择性地生长在LAB MRC培养平皿和西红柿汁平皿和/或合成培养基平皿中(Broach等，Gene，8(1979)121-133.)。通过卡那霉素以及下述的转基因产物分析来选择表达质粒。
用AUSZYME(Abbott Lab)单克隆抗体试剂盒来分析融合体肉汤培养基或细胞沉淀中的HBsAg蛋白。细胞内蛋白质被Ten-Brock ground bead高速匀浆器所释放；用Triton X-100处理、释放膜结合蛋白质。抗原产物应该占细胞总蛋白的3％。应用增殖扩散分析(Chow等)和使用抗-IL-2抗体的ELISA(Pharmigen)分析法来测定IL-2的活性。
用1-10×109cfu的LAB，最多可使用三剂对BALB/c和C57b1/6鼠进行免疫。从第二天开始通过断尾取血法采集血清。使用本领域内已知的血清学分析法和/或本说明中介绍的方法来检测HbsAg抗体。
实施例十一 以pYD1为基础的质粒的构建 pYD1是从Invitrogen购买的半乳糖可诱导的表达载体，它指导蛋白质表达在酵母细胞壁上。兴趣抗原VP7、HA和NA是利用表1所列出的引物通过PCR扩增而得。所得到的PCR产物被克隆到pYD1的BamHI/EcoRI(VP7)或BamHI/XbaI(NA and HA)位点。
实施例十二 pGPD-DSPLY及其衍生物的构建 pGPD-DSPLY是许多蛋白质在细胞壁上组成性表达的靶向载体。表1列出了构建pGPD-DSPLY及其衍生物所使用的PCR引物的名称与序列。pGPD-DSPLY包含一些序列，这些序列编码酵母-配对因子的引导序列以及酿酒酵母菌α-凝集素的细胞壁锚定区域(C-末端350个氨基酸)。首先，编码由两个氨基酸(Gly and Ala)间隔紧随其后的α-引导肽的序列是利用BamLALPHAfwd和EcoLALPHArev作为引物经PCR从酵母菌染色体(strain S288C)扩增，并且被克隆进入p426GPD的BamHI和EcoRI位点(Mumberg等人，1995，不同遗传背景下异源蛋白质控制表达的酵母载体，Gene 156119-122)，进而构建pSecY。然后，编码α-凝集素细胞壁锚定区域的序列是利用寡聚核苷酸Agglfwd和Agglrev作为引物经过PCR技术从酵母染色体DNA(strain S288C)扩增，并且被克隆进入p426GPD的ClaI/XhoI位点，这样获得了pGPDAnch。pGPD-DSPLY是通过将含有α-凝集素序列的EcoRI/XhoI片段亚克隆至pSecY同一位点构建而成。
抗原NA、VP7(pNADSPLY，pVP7DSPLY)表面展示的载体是经过下面的程序而制备的NA和VP7编码序列是分别利用引物对NAnewfwd/Nanewrev和VP7newfwd/VP7newrev经过PCR技术从这些基因的克隆拷贝扩增而得，并且将α-凝集素的上游序列克隆到pGPDAnch的EcoRI/HindIII位点，得到pNAAnch和pVP7Anch。然后，把源自pNAAnch和pVP7Anch的EcoRI/XhoI片段亚克隆进入到pSecY的同一位点分别得到pNADSPLY和pVP7DSPLY。为了证实抗原是否正确定位到细胞壁上了，pGFPDSPLY是基本按照上面所述的方法构建的；GFP编码序列是使用sgGFPfwd和sgGFPrev作为引物从质粒pQB125-fPA(Qbiogene)经过PCR扩增而得。
构建HA表面展示载体pHADSPLY，是通过将PCR-扩增的HA序列克隆到pGPDDSPLY的EcoRI/HindIII位点来完成的。由于在HA编码序列中存在EcoRI位点，使用了一个粘性末端PCR策略(Zheng G.，粘性末端PCR亚克隆的新方法.1998，Biotechniques，25206-208)来使克隆更容易进行。首先，使用引物对HAfwd1/Hanewrev和HAfwd2/Hanewrev来进行两个独立的HA扩增反应。经过DpnI(去除背景质粒)和HindIII消化处理之后，把相同摩尔的两种PCR产物混合、加热变性，并冷却至室温，然后克隆到pGPDDSPLY的EcoRI/HindIII位点。
为了便于抗原的免疫学检测，将编码各种抗原决定基片段(His6和HA)的序列克隆至pNADSPLY的EcoRI位点和pVP7DSPLY载体，该载体把抗原决定基片段定位于抗原编码序列和细胞壁锚定序列之间。用于这些构建工作的寡聚核苷酸都列在表1中。
实施例十三 乳酸杆菌表面展示载体的准备 表达目的抗原的基因被克隆至表面展示载体pSC111AE的SfiI/AscI位点。这种构建过程的结果就是，VP7、HA、NA与GFP被从N-末端融合至淀粉酶基因的分泌信号，以及由C-末端融合到prtp蛋白酶的细胞壁锚定区域。融合蛋白质的表达是由具有基本活性的Xyl启动子驱动的。表1列出了用于各种抗原PCR扩增的寡聚核苷酸序列。
表1.构建表面展示表达载体所需要寡聚核苷酸的SEQ ID NO编号

实施例十四 酵母细胞表面蛋白质的表达 基于pYD1的表达 用pYD1或基于pYD1的表达载体进行转化的EBY 100酵母在含有2％葡萄糖的YNB-CAA培养基中，于30℃环境中过夜培养。通过离心、并将细胞重新悬浮于含有2％半乳糖到OD600值为0.5～1的YNB-CAA培养基中。将细胞培养在20～25℃的环境中，按照适当的时间间隔收集标本，通过免疫荧光染色法来检测细胞表面蛋白质的表达。
基于pGPD-DSPLY的表达用pGDP-DSPLY或其衍生物进行转化的W303-1A细胞在不含尿嘧啶的合成培养基中，于30℃环境中培养至对数中期。收集细胞，并根据下述方法分析蛋白质的表达。
实施例十五 检测展示于酵母细胞表面的抗原 通过免疫荧光染色法标记完整的细胞，然后在共聚焦显微镜下检测酵母细胞表面抗原的表达。酵母菌的培养至指数生长期后，加入1/10培养基体积的甲醛以固定培养物，摇动培养物继续孵育1小时。用PBS把固定的细胞冲洗3次，并且在室温(RT)环境中同抗-GFP单克隆抗体一起孵育1.5小时；用PBS冲洗后，使用与罗丹明共价连接的第二抗体把细胞在RT环境中孵育1小时；用PBS冲洗细胞，，并将标本滴于显微镜载玻片上，在共焦显微镜下观察细胞。就如图1所示的那样，GFP被表达在酵母细胞表面，以GFP-相关荧光性的细胞分布方式来显示。此外，应用免疫荧光检验法分析表达表面展示-GFP的酵母细胞，也探测到了相似的GFP分布方式。
实施例十六 用重组体酵母菌进行动物免疫的程序 用在自身细胞表面表达VP7、HA或NA的酵母菌经口服、鼻内或皮下途径对6周龄的雌性Balb/c鼠进行接种；强化接种是每2周进行一次。用表达表面展示抗原的酵母菌，或用包含空载体的酵母菌对鼠进行接种。使用了三种不同的接种方法口服、鼻内或皮下接种。每一实验所使用的老鼠的数量列在表2中。第一次接种之前与此后的每2周采集一次血液标本。8周后将鼠处死，收集气管、肺及肠道的冲洗液。使用ELISA法检测血液及组织样本中的抗原特异性的IgG和IgA抗体。
A.准备疫苗 半乳糖可诱导的表达(pYD1)，把表达病毒抗原VP7、HA或NA的酵母细胞以及包含空载体的酵母细胞培养在YNB-CAA培养基上，用2％半乳糖诱导表达。组成性表达(pGPD-DSPLY)，酵母细胞在不含尿嘧啶的合成培养基上培养至对数中期；在对数中期收集细胞，用PBS冲洗细胞、并用PBS将细胞悬浮达到5×109/ml的浓度。
B.疫苗接种口服0.1ml(5×108)/只鼠鼻腔内 0.02ml(1×108)/只鼠皮下0.1ml(5×108)+0.1ml佐剂/只鼠(第一次皮下接种使用完全福氏佐剂，强化接种使用不完全福氏佐剂)。第一次接种在0周，强化接种分别在2、4、6周进行，每次都使用相同数量的细胞。
实施例十七 抗体反应的测定 从眼眶采集血液标本(～0.1ml)，通过离心分离血清，-20℃保存。将肺和肠道从死动物尸体上剥离，用PBS冲洗。把组织冲洗液收集到Eppendorf试管中，进行离心，将上清液保存在-20℃。
用ELISA法检测标本，检测抗原特异性的抗体存在与否。把病毒抗原VP7、HA或NA包被在96孔板上。封闭非特异性结合位点之后，用PBS稀释血清、肺或肠道的冲洗液标本并加入每一反应孔。使用辣根过氧化物酶标记的第二抗体(抗-IgG或抗-IgA)检测抗原-抗体复合物。
下面的表3、4、5及表6表示的是来自每一免疫接种方案的原始数据。表3表明应用pGPD的酵母菌流感疫苗接种鼠的血清抗体滴度(浓度)。表4表明应用pGPD的酵母菌轮状病毒疫苗接种鼠的血清抗体滴度。表5表示的是应用pYD1的酵母菌流感疫苗接种鼠的血清抗体滴度(浓度)。表6表示的是应用pYD1的酵母菌轮状病毒疫苗接种鼠的血清抗体滴度(浓度)。
图2-10是以图解的形式说明表3-6所表示的数据。就如我们所见到的那样，与质粒对照组比较时，本发明中的每一免疫原性制剂都成功地诱发了实验动物体内的免疫反应。
表2.每一实验组中的动物数量

注ApYD1系统；BpGPD-DSPLY系统表3.使用pGPD的酵母流感疫苗接种鼠的血清抗体滴度


SQ皮下表4.使用pGPD的酵母菌轮状病毒疫苗接种鼠的血清抗体滴度

N/A意思是未能得到酵母菌流感疫苗的血清抗体滴度表5.使用pYD1的酵母菌流感疫苗接种鼠的血清抗体滴度


SQ皮下表6.使用pYD1的酵母菌轮状病毒疫苗接种鼠的血清抗体滴度

给药和输送 可以将本发明的改良微生物传输到肠道黏膜，以把抗原和异源核酸转导给危难之中的动物。可以用广泛的制药学上可以接受的赋形剂配制本发明中的免疫原性制剂和基因转导制剂。用于治疗目的、制药学上可以接受的载体已经在制药学领域为人们所熟知，并可参见相关文献，例如，《雷明顿药物科学》(A.P.Gennaro编著；Mack，1985)。一套接种方案由如下步骤组成在1～6天内进行一次或多次的“初始”接种，紧随其后的12～24天内的一次或多次强化接种，以及在30～36天内进行一次或多次的选择性强化接种。单独一次初始接种，再于该时间期限内进行一次单独的强化接种，这在一般情况下是足以达到目的的。
就其本身而言，可以根据已知的任何一种方式对改良微生物的培养物进行配方设计，例如，用于动物口服接种的活细菌形式的配方设计或配制品、用于益生菌接种的配制品，治疗胃肠功能紊乱。配制品也可以是这样一种形式适合于通过摄取、或经由管子或导管接种到胃或肠道黏膜的形式。依据本发明，改良微生物的培养物可以是一种适合于口服接种的形式，它可以是固体、半固体或液体的形式，这包括但不局限于细菌的溶液和/或悬浮液。配制品也可以是一种肠溶性包被制剂的形式；合适的胶囊封装用化合物包括但不局限于聚氨基葡萄糖、麦芽糖糊精、脂质、寡聚糖与多聚糖；这种封装也可以提高细菌培养物的货架寿命。此外，如果需要的话，本发明也可以设计为并被用作栓剂的形式，用于直肠或阴道接种；气溶胶或吸入剂用于气管支气管内接种；以及其它类似的形式。这类配方的配制品为精于制药学技术的人们所熟知。对所用剂量和接种方式都可以进行调整以取得最佳功效，并且依赖于精通医学技术的人们能够意识到的因素。
改良微生物的培养物也可以被准备为粉末的形式，如冰冻干粉，它需要在使用之前重新配制，例如用合适的液体溶解；或者是固体或液体配制品的形式，与固体、半固体或液体食物混合后进行接种。它们也可以是发酵配制制品的形式，例如酸奶酪或干酪。正因如此，改良微生物的培养物可以包含一种或多种制药学上可以接受的载体/赋形剂，例如水。改良微生物培养物也可以包含一种或多种佐剂，包括适合于口服接种的免疫佐剂，只要它们与细菌宿主或酵母菌宿主兼容，并且不妨碍它的预期免疫原特性；例如，可以使用生理性pH的无菌盐水或磷酸盐缓冲液。防腐剂、稳定剂、染料甚至调味剂都可以被用于药物制品中；例如，可以把苯甲酸钠、山梨酸以及p-羧基苯酸酯作为防腐剂加入；也可以使用抗氧化剂(硬化防止剂)与悬浮剂。
进行接种的首选途径就是口服摄取细菌培养物。生物学制剂的配方设计最好包括改良微生物的发酵制品与奶制品，例如，以酸奶酪配制品的形式进行口服接种，这样就可以按日常习惯摄入酸奶酪而接种。因而在另一个实施方案中，本发明旨在提供一种新颖的药物制剂，它包括改良微生物和生物学上可以接受的载体，如酸奶酪，其中改良微生物能够编码治疗和/或预防疾病所需要的有效计量的DNA、cDNA、RNA或蛋白质。关于溶菌酶处理的原生质体，在口服摄入之前，也可以把原生质体培养物与非毒性的、制药学上可以接受的载体物质(如，酸奶酪)轻轻地混合。
给予特定病人的改良微生物的有效剂量依赖于多种因素，其中部分因素会因病人不同而不同。一位合格的临床医生应该能够确定要给予患者的抗原性或治疗性制剂的有效剂量，以产生恰当的免疫或治疗反应。制剂的剂量依赖于治疗类型、接种途径、抗原或治疗剂的性质以及引起治疗效应的合适的吸收速率等。利用LD50动物数据以及可以得到的经由肠道黏膜摄取和/或吸收的其它信息，临床医生可以根据给药途径来确定个体的最大安全剂量；利用平时的经验，合格的临床医生也能够在常规的临床实践中把特定的治疗性制剂的用量最优化设计。
这里所介绍的用于胃肠道内细菌转导和细胞溶解的所有方法，都能够以相似的方式应用于大肠杆菌细菌，该细菌也是身体细菌群落的一个自然组成部分。也可以从肠道黏膜选择或分离大肠杆菌的非致病性菌种。表达质粒和载体及其在大肠杆菌中的转化在此之前已被清楚阐明，因此上面所介绍的修饰改良也可以通过常规的重组体技术来实现。
一旦根据本发明的规则正确地合成了微生物制剂，本发明的微生物制剂可以被用来有效地诱发免疫反应，并且向一个广泛的动物肠黏膜提供异源核酸，这些动物包括但不局限于灵长类、山羊、牛、马、鸟、鱼、猪、小鼠、大鼠、猫及狗。
除非是特别的指明，所有表示成分的量与特性的数据如分子质量、反应条件以及在规范与声明中所使用的这类指标都要这样理解已经用术语“关于”在所有情况下都作了修正。相应地，除非是指向对立面，在下列规范与附加声明中所用到的数字参量都是近似值，这些数值可以根据本发明所寻求的预期特性而变化。最后，且并非试图将等价物学说的应用限制于本声明的范畴，对每一数字参量都应该至少依据所报道的有意义数字(有效数据)的数值、并且运用普通的舍入技巧进行解析分析。尽管用以阐明本发明主要范围的数字范围和参数是近似值，但是在特定的实例中，我们尽可能地提出精确数据。然而，任何数值都不可避免地含有某些误差，这可能是由它们各自的实验测定中产生的标准偏差所引起。
在描述本发明的上下文中(特别是在下列声明中的上下文中)所使用的术语“a”、“an”、“the”以及相似的指代物，除非在这里不同地指明或者同上下文明显相抵触，都必须对其进行分析以同时含盖单数和复数，。在这里复述数值范围，仅仅是为了在个别提及该范围内每一独立数值时提供一个速记方法。除非是在这里不同地指明，每一单独的数值都与该规范说明呈为一体，好象是在这里个别地复述它一样。这里所说明的所有方法都可以根据任何合适的顺序进行，除非是这里不同地指明或者是明显地与上下文相矛盾。使用这里所提供的任何与所有的例子，或者使用可效仿性语言(例如，“such as”)仅仅是为了更好地阐明本发明，而不是对发明的适用范围加以限制，否则就予以声明。本说明中的任何语言都不应被这样理解为暗示任何发明实施必须的非声明要素。
对这里所公开的可选择要素或者发明的具体实施方案进行分类，都不应被理解为限制。每一组成员可能被单独地提及与声明，或者同组内其它成员或这里发现的其它要素一起被声明提及。可以预见得到会有这样一种情况一个组内的一个或多个成员可能被包括在内，或者是因为合适的时间和/或专利权限问题而被从组中剔除。当发生这样的包含或剔除时，此时的说明是包括修正后的组别，以执行在附加声明中使用的所有Markush组别的已成文说明。
在这里说明了本发明的首选实施方案，包括本发明人所知道的应用本发明的最好模式。当然，该领域普通技术人员会通过阅读说明书明白对那些优选实施方案的变化。本发明人希望有经验的技术人员正确处理这样的变化，并且希望以其它不同的方式运用本发明，而不仅仅使用本申请特定说明的方法。因此，本发明包括了所有所附的，法律上适用的权利要求中限定的发明主题的全部修饰与等同替换。而且，本发明包括了在所有可能的变异范围内对上面所说明的因素可作的任何结合，除非是本申请不同地说明或者明显地与上下文相抵触。
而且，大量的专利文献与公开发表的文献作为参考贯穿于本说明书的始末。对上述所引用的每一参考文献与公开发表的文献通过参考其全文而使之独立地成为一体。
作为结束语，应该理解本申请所公开的发明实施方案是例证本发明的法则原理；可采用的其它修正也在本发明的范围内；因而，通过举例的方式，而不是通过限制的方式，本发明可根据这种原则采用替换性说明。因此，本发明并不仅仅限制在上述显示说明的内容。
序列表<110>圣必健公司<120>将核酸和/或蛋白质转导至肠黏膜的方法及其制剂<130>21823.11<160>32<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>1ccgggtaccg agctcgaatt c 21<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>2cgggatccgg tggccagaac tatggactta atatac 36<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>3ccggaattct taatttatcc catcaacgac 30<210>4<211>34
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>4cgggatccgg tggtggtgac acaatattat aggc34<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>5ccggaattct tagatgcata ttctgcac 28<210>6<211>34<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>6cgggatccgg tggtggtcat tcaattcaaa ctgg34<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>7ccggaattct tacttgtcaa tggtgaa27<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸<400>8ccggatccat gagatttcct tcaattttta c 31<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>9gcgaattcag cacctctttt atccaaagat acc 33<210>10<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>10ccatcgatgg ttctgctagc gccaaaagct c 31<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>11cagctcgagt tagaatagca ggtacgac 28<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>12aattcgacac aatatgtata ggctac 26<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>13cgacacaata tgtataggct ac 22<210>14<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>14accaagcttg atgcatattc tgcac 25<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>15cggaattcca ttcaattcaa actggaag 28<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸
<400>16accaagcttc ttgtcaatgg tgaatgg 27<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>17cggaattcca gaactatgga cttaatatac 30<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>18accaagctta tttatcccat caacgac 27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>19cggaattcat ggctagcaaa ggagaag 27<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>20ggaagcttat cgatgttgta cagttc 26
<210>21<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>21aattttaccc atacgacgtc ccagattacg ctggtgccg 39<210>22<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>22aattcggcac cagcgtaaac tgggacgtcg tatgggtaa 39<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>23aatttcatca ccatcaccat cacggtgccg 30<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>24aattcggcac cgtgatggtg atggtgatga 30
<210>25<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>25taggcccagc cggccgccgc tagcaaagga gaagaactct tcactgg47<210>26<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>26aaggcgcgcc atcgatgttg tacagttcat c 31<210>27<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>27taggcccagc cggccgccca gaactatgga cttaatatac40<210>28<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<23>寡核苷酸<400>28aaggcgcgcc atttatccca tcaacgac 28<210>29<211>39
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>29taggcccagc cggccgccga cacaatatgt ataggctac 39<210>30<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>30aaggcgcgcc gatgcatatt ctgcactgc29<210>31<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>31taggcccagc cggccgccca ttcaattcaa actggaagtc40<210>32<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸<400>32aaggcgcgcc cttgtcaatg gtgaatgg 28
权利要求
1.一种在动物体内诱导免疫反应的方法包括，向实验动物提供一种按口服接种配方设计的免疫原性制剂，其中所述的免疫原性制剂包括具有表达载体的微生物体，而所述的表达载体含有编码抗原的异源核酸。
2.根据权利要求1所述的在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的微生物体是指酵母菌或细菌。
3.根据权利要求1所述的在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的抗原选自肿瘤、细菌、病毒、寄生虫与真菌。
4.根据权利要求3所述的在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的病毒选自流行性感冒、肝炎、HIV和轮状病毒。
5.根据权利要求2所述的在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的酵母菌选自酿酒酵母菌、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis.、S.servazzii、S.unisporus与S.kluyveri。
6.根据权利要求2所述的在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的细菌包括双歧杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、durans肠球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热乳杆菌、干酪乳杆菌及植物乳杆菌。
7.根据权利要求1所述的在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的口服配方制剂选自粉剂、冻干粉剂、液体配制品、半固体的酸乳与干酪。
8.一种动物体内诱导免疫反应的方法，包括提供一种按口服接种配方设计的转化酵母菌，其中所述的酵母菌含有编码抗原的异源核酸，而抗原被表达在所用酵母菌表面上。
9.根据权利要求8所述的在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的酵母菌是指酿酒酵母菌。
10.根据权利要求8所述的在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的抗原源自病毒。
11.一种在动物体内诱导免疫反应的方法，包括提供一种按口服接种配方设计的转化酿酒酵母菌，其中所述的转化酿酒酵母菌含有编码来自甲型流行性感冒病毒的免疫保护性抗原决定簇的异源核酸。
12.根据权利要求11所述的在动物体内诱导免疫反应的方法，其中所述的免疫保护性抗原决定簇是流感HA或NA。
13.一种免疫原性制剂，包括具有表达载体的微生物体口服配方，其中所述的表达载体含有编码抗原的异源核酸。
14.根据权利要求13所述的免疫原性制剂，其中所述的微生物体是酵母菌或细菌。
15.根据权利要求13所述的免疫原性制剂，其中所述的抗原选自肿瘤、细菌、病毒、寄生虫和真菌。
16.根据权利要求15所述的免疫原性制剂，其中所述的病毒选自流感、肝炎、HIV和轮状病毒。
17.根据权利要求14所述的免疫原性制剂，其中所述的酵母菌选自酿酒酵母菌、S.exiquus、S.telluris、S.dairensis、S.servazzii、S.unisporus与S.kluyveri。
18.根据权利要求14所述的免疫原性制剂，其中所述的细菌包括双歧杆菌、嗜热链球菌、粪肠球菌、durans肠球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热乳杆菌、干酪乳杆菌及植物乳杆菌。
19.根据权利要求13免疫原性制剂的组成，口服接种配方选散剂、冻干粉、液体配制品、半固体的酸乳及干酪。
20.一种免疫原性制剂，包括转化酵母菌口服配方，其中所述的酵母菌含有编码抗原的异源核酸，而抗原被表达在所用酵母菌表面。
21.根据权利要求20所述的免疫原性制剂，其中所述的酵母菌是酿酒酵母菌。
22.根据权利要求20所述的免疫原性制剂，其中所述的抗原源自病毒。
23.一种免疫原性制剂，包括转化酿酒酵母菌的口服配方，其中所述的转化酿酒酵母菌含有编码来自流感A的免疫保护性抗原决定簇的异源核酸。
24.根据权利要求23所述的免疫原性制剂，其中所述的免疫保护性抗原决定簇是流感病毒HA或NA。
全文摘要
本发明提供了利用基因修饰的微生物进行体内异源核酸输送的方法和制剂，特别是提供了将异源核酸转导至动物肠道黏膜的制剂和相关方法。尤其是，利用基因修饰的正常微生物群直接转导转化异源核酸，或者是提供至少表达一种异源核酸的基因修饰的微生物。典型的正常微生物群包括细菌、细菌融合体与酵母菌。异源核酸可以编码免疫保护性抗原决定簇(抗原)或其它基因治疗蛋白。
文档编号A61K38/19GK1642579SQ03807298
公开日2005年7月20日 申请日期2003年1月27日 优先权日2002年1月31日
发明者陈巍, 傅晓丽, 雪莉·诺莱尼, 张智清 申请人:圣必健公司