基于芯片进行规模化快速制备单根寡核苷酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及芯片合成寡核苷酸的技术领域，特别是涉及单根寡核苷酸低成本规模 化制备方法。更具体的说，本发明涉及利用聚丙烯酰胺凝胶分离方法对芯片合成所得的寡 核苷酸混合物进行分离的方法。本发明还涉及针对单根寡核苷酸快速制备方面的芯片上寡 核苷酸库的设计方法。
【背景技术】
[0002] 标准的DNA化学合成是从3'端到5'端延长核苷酸链的循环过程。二十世纪八十年 代，已经发展了四步法亚磷酰胺化学合成方法[1]。这个方法现在仍被大多商业化DNA合成 公司所采用。该过程将酸活化的脱氧核苷亚磷酰胺（Deoxynucleoside phosphoramidite) 分子耦合到一个被固定在固相上（一般是硅材质表面）的脱氧核苷酸分子上。在第一个合 成循环中，核苷酸链将从第一个被固定在表面的受保护的核苷酸分子开始延伸。其中，经常 采用的固定化表面主要是可控孔度玻璃（controlled pore glass，CPG)或者聚苯乙稀珠子 (polystyrene beads, PS beads)。目前，基于四步法合成方法的DNA全自动合成仪已经可 以将单次合成的通量从1根提高到1，536根序列[幻。目前，商业化提供的CPG合成长寡核 苷酸（<60nt)的价格可以达到$0. 10-0. 20/nt，较长的寡核苷酸及进一步合成的基因价格 大约是 $0· 40-1. ΟΟ/bp [幻。
[0003] 传统的DNA合成方法受到通量和成本限制，合成的寡核苷酸只能充当PCR或者定 点突变的引物。但随着DNA化学合成技术的发展，尤其是基于微阵列技术的并行合成寡核 苷酸合成技术的发展[4][反幻，大量寡核苷酸序列可以在几厘米见方的芯片上并行合成， 通量得到提升，对应的成本也随之降低，可以直接应用到代谢工程改造、药物开发、基因组 功能分析等领域。
[0004] 人工合成的高保真的寡核苷酸多用来制作单链核酸探针，检测序列特异性的分 子，包括DNA与蛋白质、药物或其他配体分子之间的相互作用，从而应用到核酸杂交、原位 杂交荧光检测（FISH)、噬菌体展示、核磁共振NMR等技术中[Z]。另外，DNA或RNA可以在 细胞内结合序列互补的基因组DNA或转录的mRNA，造成基因沉默或蛋白表达水平下调，弓丨 起表型的改变。因此，寡核苷酸也可以应用到基因功能检测、基因治疗相关的药物开发等方 面。比如，双链DNA寡核苷酸可以作为检测哺乳细胞对外源DNA相关应答的工具[§]，也可 以用来作为敲除细胞内相关基因序列或调控序列从而研宄基因功能的工具。
[0005] 另外，蛋白表达相关调控因子，如启动子、核糖体结合位点等序列都是短的 DNA(即寡核苷酸）序列，这种类型的寡核苷酸可以直接进行人工合成。因此，研宄者们可 以通过理性设计和构建寡核苷酸文库，来达到优化蛋白质表达的目的。如Schlabach, M. R.等人通过人工设计合成了一套启动子文库，分别克隆到含有GFP基因的表达载体中，控 制表达蛋白产生荧光信号，经过FACS筛选得到强启动子，用来优化哺乳细胞内蛋白表达水 平[殳]。
[0006] 寡核苷酸相关分子，包括反义 RNA「101, aptamers Till、siRNAs (small-interferin g RNAs) [1￡]等可以选择性调控疾病相关基因的表达，具有成为治疗人类疾病的药物的潜 力。在发达国家，已经有不少分子进入了临床研宄[11]。而反义寡核苷酸，可以直接作为 药物治疗疾病，如Isis' s Vitravene就是市场上开发的第一个治疗患视网膜炎的AIDS病 人的寡核苷酸药物[Ii].另外，dsDNA可以克隆到转录载体中直接转录得到RNA分子，比 如microRNA前体等，继而应用到各项RNA干扰相关的研宄中。近些年来，双链RNA包括 siRNA(small interfering RNA)和 shRNA(short hairpin RNA) Γ15, 161 的研宄进入快速 发展阶段。其中，shRNA可以通过化学合成单链后退火得到，也可以通过RNA聚合酶III转 录寡核苷酸DNA模板得到。通常60-100bp的双链DNA寡核苷酸中含有19-29bp与目标基 因同源的序列，并且该部分序列存在两份，形成回文结构，经过酶切，会形成发夹结构[II]。 因此，人工合成长寡核苷酸除了可以作为长链DNA组装的起始元件，还可以用来构建RNA转 录模板文库及各种短DNA文库，在很大程度上扩大了寡核苷酸应用的范围。
[0007] 化学合成的寡核苷酸可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)[迟]、高效液相色谱 (HPLC)[丛]、毛细管电泳（CE)等方法进行纯化。一般PAGE纯化是使用变性聚丙烯酰胺凝 胶电泳分离DNA后，从凝胶中回收目标DNA。该方法得到的DNA纯度可以大于90 %，尤其对 大于50mer的寡核苷酸有效。使用HPLC的方法纯化DNA更加高效且方便，可以达到很高的 纯度（>95% )和灵敏度，但是成本相比PAGE方法偏高，且更适用于小于50mer的未修饰寡 核苷酸。已经商业化应用的HPLC纯化选用的有简易反相柱C18柱、反相净化滤芯（RPC)纯 化柱等。其中C18柱对DNA有特异性吸附，可以被有机溶液洗脱，而不会被水洗脱，因此能 有效地去除盐分，但不能有效去除比目的片段小的小片段。RPC纯化原理与反相HPLC-样， 但是更加有效且经济。超高效液相色谱（UPLC)是一种比HPLC方法更快速、更高效和更高 分辨率的DNA检测分离技术。已发展的纯化方法多用于纯化寡核苷酸化学合成中的N-I长 度的边反应产物，目标产物是单一的一条DNA。
[0008] 目前，商业化提供的CPG合成寡核苷酸（<60nt)的价格一般在$0· 10-0. 20/nt，更 长的寡核苷酸（<200nt)价格大约会上升到到$0.40-1. 00/nt Q]。众所周知，CPG合成方法 可以提供大量高保真性的寡核苷酸DNA，但是存在通量低、成本高的缺点。因此，过去二十 年，基于芯片的寡核苷酸合成方法得到快速发展，该方法可以提高合成通量并降低成本 [3, 20-25]。有报道称420, 000根寡核苷酸可以在同张芯片上合成，成本可以降到0. 001-10 美分/nt [玉M]。但是芯片合成方法得到的寡核苷酸是一个复杂的混合物（序列不同，长度 也可能不同）[迷]，单种寡核苷酸的量极低（IO 4-IO6个分子）[沒]。目前单根寡核苷酸的商 业合成还是使用CPG合成方法，限制了寡核苷酸在代谢工程改造、药物开发、基因组功能分 析等方面的应用潜力。所以，更高通量、更低成本的单根寡核苷酸合成方法应该被开发。目 前还没有基于芯片大规模制备单根寡核苷酸的技术的报道。基于芯片合成的寡核苷酸混合 库，分离独立寡核苷酸时，可以采用的方法是直接分离方法或者特异性引物扩增。但是具有 以下难点：（1)单独寡核苷酸的绝对量极少（IO 4-IO6个分子[互])，无法直接应用到下游，也 无法直接进行分离（单种寡核苷酸的浓度过低，也不足以分辨）；（2)背景序列复杂[迷]， 因此无论是直接分离（背景序列长度不一，具有相同长度的寡核苷酸也不在少数，因此无 法直接分离），还是选择性扩增（复杂背景导致非特异性扩增），都存在技术难度。同时，特 异性扩增需要合成序列特异的引物，针对整张芯片不同寡核苷酸序列进行特异性引物合成 的话，成本过高。
【发明内容】
[0009] 基于上述问题，本发明建立了一套基于芯片合成的高通量低成本的单根寡核苷酸 规模化分离制备方法。本发明以一种新的、基于微芯片的高并行DNA原位合成方法[M，盟] 进行寡核苷酸的大量合成。采用的4K芯片可以最高合成接近4, 000根不同的寡核苷酸。在 设计寡核苷酸序列时，引入通用引物将芯片合成的全部寡核苷酸分成一系列亚库，从而降 低寡核苷酸混合物的复杂性；每个亚库含有5-11根长度不同的寡核苷酸，相邻长度的寡核 苷酸相差至少4碱基，从而可以通过PAGE方法分辨并分离。另外，得到的寡核苷酸序列中包 括目标序列及其两端的通用引物，该序列可以通过IIS型内切酶移除引物得到目标寡核苷 酸；也可以作为模板，根据使用者的需求使用通用引物来自行扩增。本发明通过芯片合成 了 615根不同的寡核苷酸，分为88个寡核苷酸亚库，合成寡核苷酸总长度达62, 809碱基， 构成了包括绿色荧光蛋白、木糖异构酶、三种纤维素酶编码基因（共6, 441碱基对），以及 223种线虫来源的microRNA前体模板DNA (共19, 930碱基对）。通过条件优化，本发明可以 在22h之内得到纳摩尔级的PAGE纯度的分离的双链寡核苷酸，花费最低可降至$0. 004/碱 基，并且，随着单张芯片合成量的提高，成本可以进一步降低。本发明可以提供的单根寡核 苷酸从通量、成本、产量和保真度方面都可以满足科研中对大量独立寡核苷酸序列的需求， 在通量和成本方面优于目前商业化提供的单根寡核苷酸（>60碱基），极大地填补了单根寡 核苷酸（>60碱基）高通量低成本合成这方面的空白。
[0010] 具体地，本发明提供一种高通量合成和纯化寡核苷酸的方法，所述方法包括以下 步骤：1)设计寡核苷酸序列，在寡核苷酸两端加上通用引物，以将合成的全部寡核苷酸分 成若干亚库，不同亚库具有不同的通用引物，同一亚库具有相同通用引物，所述通用引物上 含有IIS型内切酶的酶切位点；2)进行基于微芯片的DNA原位合成并洗脱合成产物；3)利 用所述通用引物对所述合成产物进行PCR扩增；4)分离扩增产物。
[0011] 在一个优选的实施方案中，所述亚库以要合成的寡核苷酸片段大小来分配。
[0012] 在一个优选的实施方案中，在寡核苷酸和一侧的通用引物之间还具有接头序列。
[0013] 在一个优选的实施方案中，所述接头序列在所述寡核苷酸的3'端。
[0014] 在一个优选的实施方案中，所述接头序列含有Iis型内切酶的酶切位点。
[0015] 在一个优选的实施方案中，每个亚库含有5-11根长度不同的寡核苷酸。
[0016] 在一个优选的实施方案中，每个亚库中相邻长度的寡核苷酸相差至少4个碱基。 [0017] 在一个优选的实施方案中，步骤4)中的分离使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行。
[0018] 在一个优选的实施方案中，所述聚丙烯酰胺凝胶浓度为8% -10%且为非变性的。
[0019] 在一个优选的实施方案中，所述方法在步骤4)后还包括用IIS型内切酶酶切和/ 或用相应通用引物选择性PCR扩增分离后的独立寡核苷酸的步骤。
[0020] 在一个优选的实施方案中，所述IIS型内切酶是内切酶Sch I，Bbs I或Bsa I。
[0021] 在一个优选的实施方案中，所述微芯片是4k芯片。
[0022] 附图简述
[0023] 图1单根寡核苷酸制备分离原理。芯片合成的寡核苷酸混合库中的单根寡核苷酸 序列两端可以引入不同组的通用引物对，通过PCR扩增得到独立的各个寡核苷酸亚库。每 个寡核苷酸亚库包含5-11根不同的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同长度，相邻寡核苷酸 之间的长度差别至少4碱基。
[0024] 图2单根寡核苷酸设计原理。需要合成的目标寡核苷酸两端引入通用引物，该引 物部分序列可以通过IIS型限制性内切酶切除，而不会破坏目标序列，也不会残留额外的 碱基。有些寡核苷酸两端除了通用引物序列，另外还在DNA的3'端引入了接头序列，该接 头序列同样可以通过IIS型内切酶切除。
[0025] 图3寡核苷酸亚库完整性验证设计原理（基因组装）。分离寡核苷酸亚库得到的 单根寡核苷酸可以通过基因序列组装来验证是否存在序列缺失或错误（非目标寡核苷酸 序列）。此处，构成同一根基因片段的寡核苷酸并不属于扩增时同一组寡核苷酸亚库。基因 序列通过软件DNAWorks或TmPrimer切割成为多个片段，进而切割成一组寡核苷酸。这些 寡核苷酸可以通过后续的组装得到全长基因 DNA。
[0026] 图4 PAGE分离寡核苷酸亚库。8% PAGE分离寡核苷酸亚库（A，B)。 A. EGFP亚库al的8 % PAGE分离，目标条带（泳道1)如箭头所示，分别是 IOlbp, IlObp, 115bp, 120bp, 125bp ;B. CtCBH 6个亚库的分离（泳道1~6)，每个亚库分别 含有9, 9, 8, 8, 8, 5根不同的寡核苷酸。以上相邻大小的寡核苷酸之间的差异至少4个碱基。 其中，CtCBH亚库2 (泳道2)的目的条带使用箭头标注，分别是73bp，80bp，85bp，91bp，96b p，IOlbp, 105bp, 109bp, 115bp。以上泳道 M 表不 20bpDNA Ladder Marker(Takara)。
[0027] 图5单根寡核苷酸组装片段DNA。A. PAGE分离CtCBH亚库3,泳道M:20bp DNA ladder marker (Takara);泳道I:CtCBH亚库3寡核苷酸，目标条带7lbp-116bp,共8条寡 核苷酸序列；B.分离后再扩增的单根寡核苷酸（可组装成为TrCBH片段2)，泳道1~11: 组成TrCBH片段2的11条分离后的寡核苷酸；C. Sch I对合成的寡核苷酸（构成TrCBH片 段2)进行酶切，寡核苷酸在酶切前后的大小差别30个碱基的通用引物序列长度，泳道1 : 酶切前；泳道2 :酶切后；D.酶切后的寡核苷酸组装成为TrCBH片段2,目标片段334bp，泳 道1 :组装使用构成该片段序列的完整的11条寡核苷酸；泳道2 :组装时缺一条寡核苷酸； E. CtCBH全长基因的融合，目标片段I. 6kb (泳道1)。
[0028] 图6制备单寡核苷酸的完整性验证。分离制备得到的寡核苷酸用于组装基因 DNA 全长，并进行测序验证。目的基因分别是OXI (1. 3kb)，TrCBH (1. 4kb)，CtCBH (1. 6kb)和 TrEGl (I. 3kb)〇
[0029] 图7单根寡核苷酸分离制备时间成本。第一步：芯片合成寡核苷酸（<12h);第二 步：从芯片上洗脱寡核苷酸混合物（1小时）；第三步：寡核苷酸亚库扩增（1-1. 5小时）；第 四步：寡核苷酸亚库内的单根寡核苷酸分离（3小时）；第五步：分离后的单根寡核苷酸进 行选择性扩增（使用通用引物或者特异性引物）（1-1. 5小时）；第六步：含有不同通用引 物结合序列的寡核苷酸混合进行退火反应，暴露DNA链上的错误碱基，形成错配（3小时）； 第七步：MICC纠错，该系统全称是MutS固定化纤维素柱，基于MutS错配结合蛋白对双