乳腺癌风险诊断的制作方法

专利名称：乳腺癌风险诊断的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测癌症的存在或者患癌症的风险，特别是乳腺癌。
背景技术：
全球每年有超过100万乳腺癌病例，其中美国约有50万例，英国有4万例，爱尔兰有近2,000例。它是妇女患癌症死亡的主要原因。尽管在西方世界，该病的发病率不断增加，但是更广泛的检查和改善的治疗手段使该病致死率逐渐下降，自1991年以来每年下降1％左右。诊断为早期乳腺癌的患者具有90％以上的5年相对生存率，而被诊断为远处转移的乳腺癌患者中，该比例只有20％。但是，对于乳腺癌来说还没有权威的早期筛选测试，当前所进行的诊断是依据乳房X线照相术(mammography)和细针活检(fine needle biopsy)的结果。乳房X线照相术有其局限性，超过80％的疑似结果为假阳性，而10～15％患有乳腺癌的妇女提供假阴性结果。常常肿瘤发展到晚期才检测出来，减少了患者生存的机会，增加了医疗系统的治疗和管理成本。更灵敏的方法需要检查微小的(直径＜2cm)早期乳房原位癌瘤，以减少患者的死亡率。除了早期检查外，在疾病的恶性或良性的分类、已知癌症的时期判断和肿瘤类型的区分方面也都有严重的问题。最后，还需要监测正在进行治疗的效果，以及识别对特定疗法产生抗性的患者。由于乳腺是少数几个在成年生活中(特别是在妊娠、哺乳和萎缩(involution)期间)会有显著形态和功能变化的器官之一，常会导致同一乳腺在不同时间的分子特征发生变化，这进一步使检测过程复杂化。
疾病诊断常常通过仔细检测少数生物标记的相对水平来进行。尽管近来技术不断进步，目前生物标记对患者护理和临床结果的贡献仍然有限。这是由已有标记的诊断灵敏度和疾病特异性低所致。然而有一些分子生物标记正常规地用于疾病诊断中，例如前列腺特异性抗原用于前列腺癌的筛选，以及新的候选标记正在以不断增长的速度被发现(Pritzker，2002)。人们逐渐相信，使用一组非常有效的生物标记可提高试验的阳性预测值，使假阳性或假阴性达到最小(Srinivas et al.，2002)。另外，现在对神经网络的研究逐渐增多，它为我们显示了这样的前景将来自各生物标记的微弱但独立的信息结合起来，生成预后/预测指数，该指数比各单独的生物标记更具有情报价值(Yousef et al.，2002)。
由于有更多的分子信息可以对照，诸如乳腺癌之类的疾病正在根据与患者结果相关的遗传特征进一步细分，这为医师提供了有价值的信息。分子医学中出现的新技术已经在区别常规病理标准无法识别的疾病亚类方面(Sorlie et al.，2001)，以及识别与癌演进相关的特定遗传事件方面(Srinivas et al.，2002)显示了威力。更多的组织需要被平行处理，这涉及到不同性别和种族之间生物标记的有效性，因而极有必要对各种人群进行大规模筛选。
通过使用新标记，可使对乳腺癌的治疗水平进一步提高，该标记正常情况下只在乳房中表达，但在患病时可在身体其他部位发现。对该疾病有活性的预测物也对治疗该疾病具有应用价值，特别是那些可以预测原位导管癌是否可以发展成浸润性导管癌的预测物。

发明内容
根据本发明的第一方面，一种检测患者存在癌症或者有患癌症风险的方法，包括如下步骤(i)分离患者基因组样本；(ii)检测是否存在或表达本发明中的SEQ ID NO.1序列或其互补序列中所包含的基因，其中存在或表达所述基因表明存在癌症或者有患癌症的风险。
根据本发明的第二方面，一种分离的多核苷酸，包括本发明中的SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的核苷酸序列，或其互补序列，或者至少15个连续核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸可在严格杂交条件下与所述序列(或其互补序列)杂交。
根据本发明的第三方面，一种分离的肽，包括本发明中的SEQ IDNO.3的序列，或者它的至少10个连续氨基酸残基的片段。
根据本发明的第四方面，一种抗体对上述肽具有至少10-6M的亲和力。
根据本发明的第五方面，一种可与SEQ ID NO.1的序列中所包含的内源基因杂交，或者以其他方式抑制所述基因表达的多核苷酸，用于制备治疗癌症，特别是乳腺癌的药物。


本发明参照附图进行叙述，其中图1显示测定在不同组织中是否存在所研究基因的筛选实验结果，T代表肿瘤组织cDNA，M代表来自相同供体的同时切下的乳房组织cDNA；图2显示为了测定在不同组织样本中所研究基因的表达而进行的表达分析结果。
具体实施例方式
本发明依靠识别癌症患者，特别是乳腺癌、子宫癌或睾丸癌患者中所表达的基因。在取自患者的样本中识别出该基因(或其表达产物)说明患者存在癌症或者有患癌症的风险。
本发明进一步涉及可用于癌症的检测、诊断、监测、预测、预防、成像、治疗或确定癌症诱因的试剂，如多肽序列。
本发明特别适于检测子宫癌、睾丸癌或乳腺癌，尤其是ERα-阳性肿瘤。
进行诊断的方法可包括从试样中的mRNA合成cDNA，扩增cDNA上的相应于该基因或其片段的适当的部分，并检测扩增产物作为该组织中存在该疾病的标志，或者检测包含基因序列的mRNA的翻译产物作为存在该疾病的标志。
可用试剂包括多肽或其片段，所述多肽或其片段可用于诊断方法(如RT-PCR、PCR或杂交检测)中，所述检测对象可为从活检组织、血液或其他试样中提取的mRNA；或者作为该mRNA翻译产物的蛋白质；或者针对这些蛋白质的抗体。这些试验还包括根据体内可能的翻译后修饰检测基因产物(蛋白)的方法，所述翻译后修饰包括与诸如辅因子、抑制剂、激活剂和形成亚基复合体的其他蛋白质等分子相互作用。
癌症相关基因包含于如SEQ ID NO.1所示的多核苷酸序列中。推测的编码区如SEQ ID NO.2所示。该基因的表达产物被SEQ ID NO.3识别。识别该基因或其表达产物可利用已知的用于检测或鉴定多核苷酸或多肽的技术进行。例如，从患者中分离的遗传物质可使用可与靶基因特异性杂交的短寡核苷酸探测。寡核苷酸探针可被可检测地标记，例如使用荧光团，以便探针一旦与靶基因杂交即可被检测。或者，该基因或其部分，可使用聚合酶链反应扩增，仍使用标记的寡核苷酸识别扩增产物。
结合该基因，或相关蛋白或抗体的诊断方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)反转录PCR(RT-PCR)实时PCR原位杂交DNA斑点印迹免疫组织化学核糖核酸酶保护测定cDNA阵列技术ELISA排布于固体支持物如玻璃或陶瓷上、可用于结合研究的蛋白、抗原或抗体阵列。
小干扰RNA功能测定。
以上所有技术均为本领域技术人员所公知。
另一检测方法是使用本领域中被称为“分子信标(Molecularbeacon)”的技术。分子信标是被设计成用来检测和定量靶核酸的寡核苷酸。该寡核苷酸通常包括自杂交部分，在缺少靶核酸时可形成茎环结构。荧光部分和猝灭剂部分附着于寡核苷酸的每一端，当寡核苷酸处于茎环取向时两者的位置相邻。在这种取向时荧光被猝灭剂有效阻止。寡核苷酸的环部分与特异性靶核酸互补，如果靶标存在，与靶标的杂交可破坏茎环取向，使荧光素与猝灭剂分开，导致可检测荧光的增加。使用分子信标法检测基因序列公开于美国专利6548254。
本发明还涉及一种分离的多核苷酸，包括SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2的序列，或其互补序列，或者它们的包括至少15个连续核苷酸，优选30个核苷酸，更优选至少50个核苷酸的片段。与以上限定的多核苷酸杂交的多核苷酸，也在本发明的范围之中。杂交通常在严格条件下进行。严格的杂交条件为技术人员所熟知，选择此条件是为了减少非互补杂交的可能性。适当条件的实例公开于Nucleic AcidHybridisation，A Practical Approach(B.D.Hames and S.J.Higgins，editors IRL Press，1985)。更具体地说，严格的杂交条件包括在42℃下，在包括下列成分的溶液中过夜培育50％甲酰胺、5×SSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(ph7.6)、5×Denhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20μl/ml变性的、剪切过的蛙鱼精子DNA，随后在65℃下用0.1×SSC洗涤。
识别该基因使得可以开发新疗法，其中该基因作为治疗分子的靶标。例如，现在有很多已知的分子已经用于开发基因疗法，以靶向和阻止特定基因的表达。一种特殊分子是小干扰RNA(siRNA)，它通过刺激靶mRNA的降解来抑制特定靶蛋白的表达。还知道另一种合成寡核苷酸，它可结合所研究的基因(或其调控元件)以改变表达。与DNA相连的肽核酸(PNA)(PNA-DNA嵌合体)也显示了强诱饵(decoy)活性，可改变所研究基因的表达。这些分子可用于结合基因或其上游调控元件，阻止表达。
本发明还涉及所研究基因的分离的多肽产物。本发明的分离多肽包括SEQ ID NO.3的序列，或者它的至少10个连续氨基酸，优选至少15个连续氨基酸，更优选至少20个氨基酸的片段。这些多肽可用于制备抗体，或者开发可在体内与蛋白结合以抑制其活性的蛋白结合分子。
本发明还包括针对本发明多肽的抗体。抗体对于多肽通常具有至少10-6M，更优选10-9M，最优选至少10-11M的亲和力。抗体可为任何适当类型，包括单克隆抗体或多克隆抗体。还包括可测定试样中存在多肽抗原的检测试剂盒。在一个实施方案中，检测试剂盒包括装有抗体的容器，所述抗体与抗原特异性结合，其中抗原包括由本发明的基因编码的至少一个表位。这些试剂盒可进一步包括带有用于收集试样如血液、唾液、尿液和粪便等的工具的容器。这些工具包括用于收集和稳定血液的刺血针、吸收纸或布，收集和稳定唾液的拭子，收集和稳定尿液和粪便样本的杯子。抗体可附着于固相上，例如玻璃或陶瓷表面。
还可以检测可与抗原特异性结合的抗体是否存在于怀疑含有这些抗体的试样中。该检测方法包括将试样与含有至少一个该基因表位的多核苷酸接触。接触进行的时间和条件应足以使抗原/抗体复合物形成。该方法需要进一步检测复合物，该复合物中包含所述多肽。该多肽复合物可通过重组或合成制备，或者从天然来源纯化。
在本发明一个单独的实施方案中，针对抗原的抗体或其片段可用于检测患者中抗原的成像定位，以用于检测或诊断疾病或病情的目的。这些抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体，或者通过分子生物学技术制备，并且可使用多种可检测试剂标记，包括但不限于放射性同位素。
在进一步的实施方案中，抗体或其片段，不管是单克隆抗体或是多克隆抗体或者通过分子生物学技术制备的抗体，可用作治疗通过本发明基因的表达所鉴定的疾病的治疗剂。抗体可以非衍生形式使用，或者它可使用细胞毒素剂如放射性同位素、酶、毒素、药物、前药等衍生。
术语“抗体”广义上指任何免疫结合试剂，如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体还指具有抗原结合区的任何抗体样分子，包括但不限于抗体片段如单区抗体(single domain antibody，DABS)、Fv、scFv等。制备和利用各种基于抗体的构建体和片段的技术已为本领域所公知。
如果需要，本发明的癌症筛选方法可与其他方法容易地结合，以提供更加准确的诊断或预后标志，因而可提供多标记测试。
以下实施例参照附图用来说明本发明的内容。
实施例利用非同位素差异显示(DDRT-PCR)，从来自乳腺癌患者匹配临床样本的cDNA群中分离到许多差异表达基因片段。这些片段之一(本文称为DD11)显示出在来自许多供体的乳房肿瘤组织样本中显著上调。本文将详细叙述这个新分子标记的表达曲线，其全长以及相应推定的蛋白序列。
材料和方法在来自相同供体的正常乳房组织和肿瘤组织配对之间进行差异基因表达。在完全满足道德要求和征得患者同意的前提下，从英国彼得伯勒Pathlore获得组织样本。在手术摘除肿瘤之后，收集一个肿瘤组织样本，同时收集与之相邻的、一起切下的正常组织。分别利用DynaldT18标记的Dynabeads和SuperscriptII反转录法提取信使RNA并随后合成cDNA。采用差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)观察这些匹配样本基因表达曲线的差异，将显示上调或下调的单基因转录物分离出来并进一步研究。
差异显示反转录PCR(DDRT-PCR)首先由Liang和Pardee(1992)记载，它使用来自两个或更多生物样本的mRNA作为模板，通过反转录使用3个可能的锚定引物之一进行代表性cDNA合成。3个亚群使用相应的锚定引物与80个随机13体引物之一一起分别进行PCR扩增。这个引物组合的数量据估计可代表mRNA群中96％的表达基因(Sturtevant，2000)。对每一套引物，这种对群的细分导致在真核细胞中表达的估计达12,000～15,000种mRNA，通过第二链cDNA合成的末端减少到100～150种转录物。这有助于在聚丙烯酰胺凝胶上进行平行电泳分离和匹配成套引物的准确显影，导致可以识别在一种组织样本中表达而不在另一种组织样本中表达的基因片段。
切除并重新扩增所研究的片段之后通过反向DNA斑点印迹除去假阳性。这需要将每一重新扩增的片段点样至两张尼龙膜上(HybondN+，Amersham Pharmacia Biotech)，并将其与所述片段的供体的肿瘤或正常组织cDNA群杂交。然后将确定为差异表达的片段直接测序，即不经克隆，随后检索网络数据库以确定每条基因是否为新发现的。无法匹配已知基因的片段被看作有可能代表它们的来源——乳腺癌的新标记。各转录物的进一步筛选利用来自多个乳房肿瘤供体的一套匹配cDNA群，通过半定量RT-PCR或实时PCR进行。在所有情况下，β-肌动蛋白用作组成型参照基因，以校准cDNA模板并在PCR过程中作为内部阳性对照。通过在校准的模板上使用基因特异性成套引物来表达每个假定的新标记基因。新基因片段的全长转录物，包括开放读码框(编码该蛋白的那段基因)随后使用被称为5′RACE(cDNA末端快速扩增)的复合物法合成，该方法包含基因特异性延伸和扩增，可由测序验证。
针对来自非乳房组织，包括脑、心脏、淋巴细胞、脾、肾、睾丸和肌肉(来自Origene)的cDNA群，使用来自各新标记的基因特异性引物来测定组织特异性。使用来自更广泛的一组22种人类组织类型的cDNA群进一步测定DD11分子标记。它们如下所示肾上腺 由62供体汇集骨髓由7供体汇集脑，小脑由24供体汇集脑，全部由1供体汇集结肠*由1供体汇集胎儿脑 由59供体汇集胎儿肝脏由63供体汇集心脏由1供体汇集肾脏由1供体汇集肝脏由1供体汇集肺 由1供体汇集胎盘由7供体汇集前列腺 由47供体汇集唾液腺 由24供体汇集骨骼肌 由2供体汇集小肠*由1供体汇集脾 由14供体汇集睾丸由19供体汇集胸腺由9供体汇集甲状腺 由65供体汇集气管由1供体汇集子宫由10供体汇集特别说明的是这些样本多数是人总RNA组II(Clontech)的一部分，但是标有星号的两个样本是以组织块(tissue chunk)形式获自Pathlore(Peterborough Hospital Tissue Bank)，并在RandoxLaboratories Ltd处理。
另外还在道德允许的人类肿瘤样本范围内进行实验，实验方法如获自Pathlore的所述。代表来自卵巢、睾丸、胃、肝脏、肺、膀胱、结肠和胰腺的肿瘤的cDNA通过实时PCR针对β-肌动蛋白和DD11进行实验。
与新标记表达分析一起，对每一乳房组织配对还进行分子特征分析。这需要针对每种组织cDNA在半定量RT-PCR中使用对多种已公开的乳腺癌分子标记具有特异性的成套引物。测定各分子标记之间的关系，对每一样本列成表格用作参照，新标记可与之相比。这样做的目标是对肿瘤类型进行细分，以使新型标记与这些亚类相联系，大大提高诊断标记的效力。
结果和讨论来自乳腺癌供体匹配组织cDNA的一个称为DD11的基因片段，使用差异显示观察到在肿瘤cDNA群中与相应正常组织cDNA相比显著上调。该产物通过反向DNA斑点印迹证实为差异表达。序列分析后检索数据库证实DD11分别与EMBL和SWISSPROT数据库中的已知基因或蛋白均不同源，因此看作可能为新标记。然而它在除去poly-A尾巴之后，与来自人类基因组8号染色体的克隆(RP11-875011)(检索号AC107959)100％同源。
该片段使用来自其他患者捐献的多个匹配乳房肿瘤组织的cDNA群进一步筛选。在筛选的供体样本中，9个中有6个显示表达显著增加，证实了DD11为存在乳房肿瘤的推定的分子标记(图1)。该分析结果通过对所有当前可用的匹配乳房组织样本进行分子特征分析可证实，如下肿瘤中增长 10 52.6％正常情况下增长 15.3％无可辨别差异736.8％无明显表达 15.3％总计19 100％为了帮助进一步分析，采用5′-RACE将该片段延长至包括该基因的全部开放读码框(ORF)，加上任何5′非编码序列。使用该技术，获得了推测的513个核苷酸的全长产物(SEQ ID NO.1)，随后进行数据库检索证明前述的与人类8号染色体的同源性为在全长序列(513/513)上的100％同源性。从该序列中，产生了所有6氨基酸的读码框并且在+2框中发现了推测的小ORF(SEQ ID NO.2)，包含47个氨基酸，包括终止密码子(SEQ ID NO.3)。这个小蛋白与SWALL数据库中的任何已知蛋白均不显示高同源性，所以被认为是新的。
为了测定器官特异性，除了来自乳腺癌供体的成对cDNA外，还对来自8种非乳房人体组织的cDNA群针对DD11引物进行了测定。还利用来自组成型持家基因β-肌动蛋白的引物对相同的样本进行测定，作为阳性对照并校准半定量PCR分析的模板。β-肌动蛋白产物在所研究的所有cDNA群中均强烈扩增，而DD11产物只在乳房肿瘤样本中检测到(图2)。这为该基因可能是存在乳房肿瘤的极强分子标记提供了另一个证据。
该分子标记通过常规和实时PCR分析，利用来自一组22种人体组织类型的cDNA群进一步测试。在所有测试之中，使用Opticon II实时热循环仪(MJ Research)，只在来自胎盘和睾丸的样本检测到DD11。另外，还对道德上允许的人体肿瘤样本范围进行实验，方法如获自Pathlore的所述，以确定该标记是乳房肿瘤特异性还是特异性较差的肿瘤标记。代表来自卵巢、睾丸、结肠、胃、肝脏、肺、膀胱和胰腺的肿瘤的cDNA针对β-肌动蛋白和DD11进行实验。它们之中，DD11只在来自睾丸肿瘤的cDNA中检测到有显著水平。这些PCR扩增所得产物通过直接测序确定为DD11。
使用相结合的一组22种正常人体组织cDNA和8种肿瘤cDNA群，在标准热循环仪上进行常规PCR扩增，证实DD11对非常有限的组织类型具有特异性。在实时PCR测试中，睾丸cDNA群表达DD11，这和睾丸肿瘤一样。显示出显著表达该标记的唯一一种其他群来自子宫样本。胎盘样本显示出低水平表达，但这与睾丸和子宫样本根本不在一个级别。还在其他一些样本中发现了低水平产物，但这些可忽略不计。这说明在所有测试样本中，DD11只在受生殖激素影响的组织中强烈表达。具体地说，这些组织来自乳房和相关肿瘤、睾丸和相关肿瘤以及子宫。胎盘组织也更小程度地表达这种标记。
DD11与最常用作“标准”乳腺癌标记的一些标记，如雌二醇受体(ERα)和人表皮生长因子受体(c-ErbB-2)相比，是极为有利的。这在以下两方面都是显而易见的一是对所有匹配乳腺癌组织样本进行分子特征分析，其中在许多情况下来自相同患者的两个样本有相似的表达；二是使用针对一组来自人体正常和肿瘤组织的内部30个cDNA群的靶特异性引物。
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序列表<110>兰多克斯实验室有限公司<120>乳腺癌风险诊断<130>JWJ01047WO<150>0320648.9<151>2003-09-03<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>513<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1tttatggtca taagcttaga aaatcctttg cccaacataa aataagagaa ctctaatttc 60ttagggagat ttttattaaa tgattagatt tgtagcatat agttgtataa aataagatga120actctaattt cttagggagg ttttattaaa tgattagatt tgtagcatat catcgtgtaa180agtacatgga cattattttt gatatagaaa gtgtagtgtt ccccttcatt gttctgagtt240actctcatct gtccaacccc agcgagccac tgattattcc ctttctctga actttgtggt300gtttatggaa gcttcattcc gtagcacgaa ggcgtcaatc attaatctcg ggtgattagt360cctcaggcat ctccctgctc tgagctgagg ggtgtggtag tgttgaaagt tgcagtgctc420tgatcacgtg gttggttcga ctggtaactg gtccctctct ggcaagagcc acctcatcag480tatcaactca ggaatgctgg aaatcatttt atg 513<210>2<211>138<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
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1.一种检测患者存在癌症或者有患癌症风险的方法，包括如下步骤(i)分离患者基因组样本；(ii)检测是否存在或表达本发明中的SEQ ID NO.1序列所包含的基因，其中存在或表达所述基因表明存在癌症或者有患癌症的风险。
2.根据权利要求1的方法，其中所述基因是SEQ ID NO.2的基因。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述基因组样本取自乳房组织、子宫或睾丸。
4.根据以上任一权利要求的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
5.根据以上任一权利要求的方法，其中所述检测通过使用聚合酶扩增所述基因进行。
6.一种分离的多核苷酸，包括本发明中的SEQ ID NO.1的核苷酸序列，或其互补序列，或者至少15个连续核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸可在严格杂交条件下与所述序列(或其互补序列)杂交。
7.根据权利要求6的分离的多核苷酸，其中所述序列是SEQ IDNO.2的序列。
8.根据权利要求6或7的多核苷酸在体外诊断分析患者患癌症的风险中的应用。
9.根据权利要求8的应用，其中所述癌症为乳腺癌。
10.一种肽，包括本发明中的SEQ ID NO.3的序列，或者它的至少10个连续氨基酸残基的片段。
11.一种抗体，对权利要求10的肽具有至少10-6M的亲和力。
12.一种可与包含权利要求6或7的多核苷酸的内源基因杂交，或者抑制所述基因表达的第二多核苷酸在制备治疗癌症，特别是乳腺癌的药物中的应用。
13.根据权利要求12的应用，其中所述基因包括权利要求7的多核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一种用于预测癌症风险，特别是乳腺癌风险的诊断方法。该方法包括(i)分离患者基因组样本；(ii)检测是否存在或表达本发明中的SEQ ID NO.1的序列所包含的基因，其中存在或表达所述基因表明存在癌症或者有患癌症的风险。
文档编号C12Q1/68GK1846001SQ200480025367
公开日2006年10月11日 申请日期2004年9月2日 优先权日2003年9月3日
发明者M·A·克罗克德, J·R·贝利, J·V·拉蒙特, S·P·菲茨杰拉德 申请人:兰多克斯实验室有限公司