调控11β-羟类固醇脱氢酶1的表达用于治疗眼科疾病的制作方法

专利名称：调控11β-羟类固醇脱氢酶1的表达用于治疗眼科疾病的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗和/或预防与lip-羟类固醇脱氢酶1 (11P-HSD1) 的高水平的表达或活性相关的眼睛疾病的方法和组合物；其特别地但是不 是专门治疗青光眼。在优选的实施方案中，本发明涉及应用RNAi技术下 调lip-HSDl的表达。
背景技术：
青光眼是失明的一个主要的诱因。世界上大约15%的失明病例是由青 光眼导致的。最常见的类型，原发性开角青光眼，在年龄超过40岁的普 通群体中具有1/200的流行率。青光眼已经简单地定义为由高于其正常生 理界限的眼内压(IOP)的持续稳定地升高引起的眼组织损伤作用。尽管一些 病因可能参与青光眼并发症，但是在治疗选择中的绝对的决定性因素是虹 膜角膜角内的压力中的原发性和/或诱导的变化的量。
尽管在青光眼中升高的IOP导致神经损伤的病理生理机制尚是未知 的，但是，目前的治疗包括目的在于降低这种压力的药物治疗或手术。可 以使用四种类型的药物，尝试对升高的IOP的药物抑制(1)水性体液形 成抑制剂(诸如碳水化酶抑制剂，(3-肾上腺素阻断剂，和a2-肾上腺素受 体激动剂)；(2)縮瞳药(诸如拟副交感神经药，包括拟胆碱药和抗胆碱酯 酶抑制剂)；(3)眼色素层巩膜流出增强剂；和(4)高渗剂(其在睫状上皮 细胞内产生穿过血液/水性屏障的渗透压梯度)。出现第五类药物，神经保 护药，作为药物治疗的重要的补充，其包括，例如，NOS抑制剂、兴奋性 氨基酸拮抗剂、谷氨酸受体拮抗剂、程序性细胞死亡抑制剂和钙通道阻断 剂。
各种眼疾病以及它们的治疗的综述可以在下述参考文献中找到 Bunce等，2005, Associations between the deletion polymorphism of the angiotensin 1-converting enzyme gene and ocular signs of primary open-angleglaucoma (血管紧张素1-转化酶基因的缺失多态性和原发性开角青光眼的 眼睛体症之间的相关性).Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol.(临床实验眼 科学档案)；243(4):294; Costagliola等，2000, Effect of oral losartan potassium administration on intraocular pressure in normotensive and glaucomatous human subjects( 口服氯沙坦钾对正常血压和青光眼人受试者的眼内压的作 用).Exp Eye Res (实验眼科研究)71(2): 167; Costagliola等，1995, Effect of oral captopril (SQ 14225) on intraocular pressure in man ( 口月艮卡托普禾U (SQ 14225)对人的眼内压的作用).Eur J Ophthalmol.(欧洲眼科学杂志)， 5(1 ):19; Cullinane 等,2002, Renin-angiotensin system expression and secretory function in cultured human ciliary body non-pigmented epithelium (肾素-血管紧张素系统在培养的人睫状体无色素上皮细胞中的表达和分 泌功能).Br J Ophthalmol.(英国眼科学杂志)，86(6):676; Sakaguchi等，2002, Chymase and angiotensin converting enzyme activities in a hamster model of glaucoma filtering surgery (类胰凝乳蛋白酶和血管紧张素转化酶在青光眼 过滤手术的仓鼠模型中的活性).CurrEyeRes.(现代眼科研究)24(5):325; Shah等，2000, Oculohypotensive effect of angiotensin converting enzyme inhibitors in acute and chronic models of glaucoma (血管紧张素转化酶抑制 剂在急性和慢性青光眼模型中的眼低压作用).J Cardiovasc Pharmacol (心 血管药学杂志)，36(2):169,和Wang等，2005, Effect of CS-088, an angiotensin ATI receptor antagonist, on intraocular pressure in glaucomatous monkey eyes (CS-088, —种血管紧张素ATI受体拮抗剂，对青光眼样猴 子眼的眼内压的作用).ExpEyeRes.(实验眼科研究)，80(5):629。
RNA干扰是由短的干扰RNAs (siRNA)介导的序列特异性转录后基 因沉默作用。在20世纪90年代早期，在植物中发现这种现象后，Andy Fire 和Craig Mello证明双链RNA (dsRNA)在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis degans)中以极度有效的方式特异性并且选择性地抑制基因表达(Fire等, 1998， Potent and specific genetic interference by double stranded RNA in Caenorhabditis elegans (双链RNA在秀丽隐杆线虫中的有力的和特异性的 遗传干扰).Nature (自然)，391:806)。第一链(有义RNA)的序列与靶 信使RNA (mRNA)相对应的区域一致。第二链(反义RNA)与所述mRNA
互补。结果表明，获得的dsRNA比相对应的单链RNA分子(特别是反义 RNA)更加有效数个数量级。
当酶，DICER，遇到dsRNA并且将其切成叫作小干扰RNAs(siRNA) 片段时，RNAi作用开始。这种蛋白属于RNA酶III核酸酶家族。蛋白质 复合物将这些RNA残余物聚集起来，并且将它们的密码用作寻找并且破 坏细胞中具有匹配的序列的任何RNAs如靶mRNA的指导(参见，Bosher 禾口 Labouesse, 2000， RNA interference: genetic wand and genetic watchdog (RNA干扰遗传指挥棒和遗传的监察者).Nat Cell Biol (自然细胞生物 学)，2000, 2(2):E31,禾口 Akashi等，2001， Suppression of gene expression by RNA interference in cultured plant cells (在培养的植物细胞中通过RNA干 扰抑制基因表达).Antisense Nucleic Acid Drug Dev (反义核酸药物研发)， 11(6):359)。
在尝试将RNAi用于基因敲除中，应该意识到，哺乳动物细胞已经发 展了许多针对病毒感染的保护机制，其可能妨碍这种方法的应用。事实上， 极低水平的病毒dsRNA的存在引发干扰反应，导致对翻译的普遍的非特异 性的抑制，其又引发程序性细胞死亡(Williams, 1997, Role of the double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) in cell regulation (双链 RNA-激活的蛋白激酶(PKR)在细胞调控中的作用).Biochem Soc Trans, 25(2):509; Gil禾口 Esteban， 2000， Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): mechanism of action (通过dsRNA-依赖性蛋白激酶(PKR)诱导程序性细胞死亡作用机制).Apoptosis (程序 性细胞死亡)，5(2): 107-14)。
在2000年，据报道，在小鼠卵母细胞和早期胚胎中，dsRNA特异性抑 制3种基因。翻译停滞，并且因此随着胚胎继续发育，没有观察到PKR反 应(Wianny禾口Zernicka-Goetz， 2000, Specific interference with gene ftmction by double-stranded RNA in early mouse development (双链RAN在早期小鼠 发育中对基因功能的特异性干扰).Nat Cell Biol (自然细胞生物学)， 2(2):70)。在Ribophama AG (Kulmbach,德国)的研究表明RNAi在哺乳动 物细胞中功能性，其使用短(20-24个碱基对)的dsRNA关闭人细胞中的基 因，而不起始急性阶段反应。其它研究组进行的类似的实验证实了这些结
果。 (Elbashir等,2001, RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide認As (認A干扰是由21-和22-个核苷酸的RNAs介导的). Genes Dev (基因发育),15(2): 188; Caplen等，2001, Specific Inhibition of gene expression by small double stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems(在无脊椎和脊椎系统中小的双链RNAs对基因表达的特异性抑制). Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国国家科学院学报)，98:9742)。在各种正 常的和癌症人和小鼠细胞系中检测，确定短的发夹RNAs (shRNA)可以如 它们的siRNA负体一样有效地使基因沉默(Paddison等，2002, Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells (矢豆的 发夹RNAs (shRNAs)在哺乳动物细胞中诱导序歹l」-特异性沉默).Genes Dev
(基因发育)，16(8):948)。最近，另一组小RNAs (21-25个碱基对)表现出 介导基因表达的下调。这些RNAs，小时序调控的RNAs (stRNA)，在秀丽 隐杆线虫的发育过程中调控基因表达的时间(关于综述，参见Banerjee和 Slack, Control of developmental timing by small temporal RNAs: a paradigm for RNA-mediated regulation of gene expression (通过小时序RNAs对发育时 间的控制基因表达的RNA-介导的调控的范例).Bioessays (生物论文)， 2002， 24(2): 119-29，和Grosshans与Slack， 2002, Micro-RNAs : small is plentifbl(微小RNAs:小而丰富).JCell Biol(细胞生物学杂志)，156(1):17)。 科学家已经在一些系统中使用RNAi，包括秀丽隐杆线虫、果蝇
(Drosophila)、锥虫(trypanosomes)以及其它的无脊椎动物。最近一些 组已经表明在不同的哺乳动物细胞系(特别在HeLa细胞)中对蛋白质生物 合成的特异性抑制，这表明，RNAi是一种用于在体外使基因沉默的广泛 适用的方法。基于这些结果，RNAi已经迅速成为确认(鉴定和指定)基 因功能的公认的工具。使用短dsRNA寡核苷酸的RNAi将产生对只是部分 测序的基因的功能的理解。
正如己经阐述的那样，IOP通过水性体液(AH)的产生(取决于通过睫 状上皮双层的钠转运)和排出(主要通过小梁网)之间的平衡而维持。AH 被分泌到眼睛的后室中，从虹膜和晶状体之间的睫状上皮细胞流过，通过 瞳孔，进入前室，并且最后放射样流入外周，在那里它主要通过在小梁网 (TM)中的巩膜静脉窦而流出，并且在更少程度上通过眼色素层巩膜流出途
径流出 (Davson H. The aqueous humour and intraocular pressure (水性体液 和眼内压),在Davson，s Physiology of the Eye (Davson眼生理学),第5 版.伦敦，Macmillan出版社，1990:3-95; Hart WM. Intraocular pressure (眼内 压).在HartWM,编，Adler，s Physiology of the Eye (Adler眼生理学).St Louis, Mosby-Year书籍公司(Mosby-Year Book Inc) ，1992:248-267)。
在外周上皮组织中，钠和水转运受皮质类固醇和lip-羟类固醇脱氢酶 (1113-HSD)同工酶(lip-羟类固醇脱氢酶l(lip-HSDl),从可的松激活皮质 醇；和11P-羟类固醇脱氢酶2(11(3-HSD2),将皮质醇灭活成可的松)的调控。 ll卩-HSDl广泛表达，在许多糖皮质类固醇靶点组织中最显著，所述糖皮质 类固醇耙点组织包括肝、脂肪组织、骨骼、以及肺、血管系统、卵巢和中 枢神经系统。
在人的眼睛中已经描述了 11 P-HSD的表达。11 (3-HSD2在角膜内皮细胞 中表达，而11P-HSD1更广泛地表达在小梁网、晶状体上皮细胞和角膜上皮 细胞中表达(Tomlinson JW. 11Beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 in human disease: a novel therapeutic target (人疾病中的1型11P-羟类固醇脱氢 酶新的治疗靶点).MinervaEndocrinol. 2005年3月；30(1):37-46)。
11(3-HSDl，而不是lip-HSD2，位于人的无色素神经上皮细胞或NPE 中(Rauz S， Walker EA, Shackleton CHL, Hewison M, Murray PI, Stewart PM. Expression and putative role of 11卩匿hydroxysteroid dehydrogenase isozymes within the human eye (1 ip-羟类固醇脱氢酶同工酶在人眼睛内的表达和推 定的作用).Invest Ophthalmol Vis Sci (研究眼科学和视觉科学)2001; 42:2037-42; Suzuki T, Sasano H, Kaneko C, Ogawa S, Darnel AD, Krozowski ZS. Immunohistochemical distribution of 11卩-hydroxysteroid dehydrogenase in human eye (1 ip-羟类固醇脱氢酶在人眼睛中的免疫组织化学分布).Mol Cell Endocrinol(分子细胞内分泌学)2001; 173:121-5; Mirshahi M, Nicolas C, Mirshahi A， Hecquet C， d，Hermies F, Faure JP，等，The mineralocorticoid hormone receptor and action in the eye (眼睛中的盐皮质激素激素受体和作 用).Biochem Biophys Res Commun (生物化学生物物理学研究通讯)1996; 219:150-6; Stokes J, Noble J, Brett L, Philips C, Seckl JR, O'Brien C，等， Distribution of glucocorticoid and mineralocorticoid receptors and
1 ip勿droxysteroid dehydrogenases in human and rat ocular tissues (糖皮质激 素和盐皮质激素受体以及liP-羟类固醇脱氢酶在人和大鼠眼组织中的分 布).Invest Ophthalmol Vis ScK研究眼科学和视觉科学)2000; 41:1629-38)。 原位杂交将11(3-HSD1的表达限定在睫状上皮细胞中，而睫状体组织的 RT-PCR分析证实11(3-HSD1，以及另外的糖皮质激素受体和盐皮质激素受 体的表达(Rauz S, Cheung CM, Wood PJ, Coca-Prados M， Walker EA, Murray PI， Stewart PM. Inhibition of 11 beta勿droxysteroid dehydrogenase type 1 lowers intraocular pressure in patients with ocular hypertension (在,患有 眼高压的患者中，抑制1型11(3-羟类固醇脱氢酶降低了眼内压).QJM.,2003 年7月；96(7);481-90)。酶llp-HSDl在决定细胞内糖皮质激素浓度中起着 关键的作用，其通过在可逆的反应中从无活性的可的松和l l-脱氢皮质酮再 生活性糖皮质激素(在人类中为皮质醇，在大鼠和小鼠中为皮质酮)。在 水性体液中己经记录了14: l的高的皮质醇/皮质酮比例，这与局部皮质醇-产生系统一致(Rauz S， Walker EA, Shackleton CHL, Hewison M, Murray PI, Stewart PM. Expression and putative role of 11 p勿droxysteroid dehydrogenase isozymes within the human eye ( 1 l卩-f圣类固醇脱氢酶同工酶 在人眼睛中的表达和推定的作用).Invest Ophthalmol Vis Sci.(研究眼科 学和视觉科学)2001;42:2037-42)。
在实验性无对照(uncontrolled)的研究中，给志愿者口服施用甘珀酸 (CBX)， ll卩-HSDl的一种抑制剂，导致17.5。/。的IOP减少，表明ll卩-HSDl 活性可以部分调控钠通过NPE-色素双层的转运，并且因此导致水性体液的 分泌(Rauz S， Walker EA, Shackleton CHL, Hewison M， Murray PI, Stewart PM. Expression and putative role of 11卩勿droxysteroid dehydrogenase isozymes within the human eye (11(3-羟类固醇脱氢酶同工酶在人眼睛中的 表达和推定的作用).Invest Ophthalmol Vis Sd.(研究眼科学和视觉科学) 2001; 42:2037-42)。此外，健康志愿者和患有眼高压的患者(IOP升高， 但是没有视神经病)的随机的、安慰剂对照的研究评估了CBX对IOP的作 用(Rauz S, Cheung CM, Wood PJ， CocaPrados M, Walker EA, Murray PI, Stewart PM. Inhibition of 11卩勿droxysteroid dehydrogenase type 1 lowers intraocular pressure in patients with ocular hypertension (在患有目艮高压的患
者中，抑制l型lip-羟类固醇脱氢酶降低眼内压).QJM., 2003年7月； 96(7):481 -90)。
前文是与RNAi相关的相关技术的讨论。所述讨论只是为了理解其所 随后的发明而提供，并不是承认任何所述的工作是本发明的现有技术。
发明概述
在本发明中，我们提供了通过使用siNA调控lip-羟类固醇脱氢酶l (11(3-HSDO的表达和/或活性而用于治疗眼科疾病的方法和组合物。在 优选的实施方案中，所述眼科疾病特征在于，在动物，包括人中的改变的 IOP。特别地，所述眼科疾病是青光眼。
本发明的另一个方面涉及一种分离的siNA化合物，其包括与选自SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 61的核苷酸序列互补的序列，或者包括选自SEQ ID NO 62-SEQ ID NO 122组的核苷酸序列。
本发明的另一个方面涉及包括靶向liP-HSDl的siNA化合物的药物组 合物。
除了治疗青光眼之外，所述方法还适用于治疗眼的前室的其它疾病。 特别地，所述方法可以用于治疗特征在于在眼睛中的改变的水性形成或流 出的疾病。可以按照本发明进行治疗的疾病的实例包括局部疾病，如感染 或炎症，和全身疾病，如眼色素层炎或系统疾病的表现。此外，本发明的 某些实施方案提供用于糖尿病视网膜病的治疗。
下调作用可以通过使用双链核酸部分而实现，所述双链核酸部分叫作 siNA或小的干扰NA，其针对ll(3-HSDl的mRNA表达进行干扰。尽管修饰
的核酸或相似的化学合成的实体也包括在本发明的范围之内，但是所述 siNA优选地是siRNA。
本发明的优选实施方案涉及siNA的局部应用。本发明的实施方案还提 供用于治疗眼科疾病的药物组合物。本发明可以用于局部眼科治疗、参与 青光眼发病机理的靶基因的领域，以及应用化学合成的实体治疗动物(包 括人)的领域。
附图
描述
图l显示与lip-HSD的两种备选的转录物相对应的GenBank登记号。
图2显示选作本发明的siNA的耙序列的耙基因序列的短片段。
图3显示本发明的siNA分子。
图4显示在正常血压的新西兰兔中，两种siRNAs对IOP减少的最大作 用。值表示相比于对照(只使用赋形剂的对侧眼睛)的IOP减少的百分数 的平均值和它们的标准误差(SD)。所用的siRNAs是llHSD/01: CCACAUCACCAACGCUUCUdTdT (SEQ ID 133;与人SEQ ID N。 IOO同 源的兔序歹J)和UHSD/02: CGUCAAUGUAUCAAUCACUdTdT (SEQ ID 134;具有最佳得分并且无相应的公开的人序列的兔序列)。
图5显示在正常血压的新西兰兔中，随着时间，siRNA 11HSD/02对IOP 减少的体内作用。相比于对照，四次连续使用265吗的siRNA对IOP产生 20.34的减少。相反，合成的siRNA对IOP水平没有任何作用。
每个值代表在4只不同的动物中，相比于对照(只用赋形剂的对侧眼 睛)的IOP减少的百分数的平均值。
发明详述
在第一个方面中，本发明涉及siNA在制备用于治疗眼科疾病的药物中 的应用，其中所述siNA能够抑制ll(3-羟类固醇脱氢酶l (lip-HSDl)的表达。
当按照本发明应用时，术语抑制包括11P-HSD1的下调。在一个实施方 案中，按照本发明的眼科疾病特征在于，在患者中改变的眼内压(IOP)。在 另一个实施方案中，所述眼科疾病选自包括下列各项的组青光眼、感染、 炎症、眼色素层炎、和系统疾病的表现。所述眼科疾病可以选自青光眼或 糖尿病视网膜病。按照本发明，可以在患者的眼中抑制耙基因的表达。
在一个实施方案中，按照本发明的siNA是siRNA。优选地，所述siRNA 是dsRNA。
尽管关于RNAi的机制还是未知的，但是产生特异性dsRNA寡核苷酸 所需要的步骤是清楚的。已经表明，长度为21-26个核苷酸的dsRNA双链体 链在产生RNA干扰中最有效。因此，在一个实施方案中，本发明的siNA 长度为21-26个核苷酸。然而，按照本发明的siNA化合物的长度是没有限 制的。选择基因内的正确的同源区也是重要的。当考虑产生用于RNAi的 dsRNA时，诸如距离起始密码子的距离、G/C含量和腺苷二聚体的位置的 因素是重要的。然而，所述因素的一个后果是，人们可能需要检测一些不 同的序列用于最有效的RNAi，并且这可能是成本高的。
在1999年，Tuschl等(Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro (在体外通过双链RNA的耙点mRNA降解).Genes Dev.(基 因发育)，1999; 13(24):3191-7)解释了siRNAs的沉默作用，表明它们的效率 是双链体长度、3'-突出端的长度和在这些突出端中的序列的函数。基于这 一奠基性工作，Eurogentec推荐应该应用下述指南选择耙mRNA区域，以 及因此siRNA双链体的序列
由于RNAi取决于复合蛋白质相互作用的建立，所以，显而易见地， mRNA靶应该没有不相关的结合因子。在这种情形中，由于它们可能更富 含调控蛋白结合位点，所以，应该避免5，和3，不翻译区(UTRs)和接近起始 密码子的区域。因此，siRNA的序列选择如下
在mRNA序列中，选择位于AUG起始密码子下游或终止密码子上游 50-100 nt的区域。
在这一区域中，寻找下述序列AA(N19),CA(N19)。计算每一条鉴定 的序列的G/C百分比。理想地，G/C含量是50。/。，但是它必须低于70%，并 且大于30%。
优选地，避免含有下述重复的序列AAA， CCC, GGG， TTT， AAAA, CCCC, GGGG, TTTT。
还进行按照mRNA的二级结构的可及性预测。还使用最适合前述标准 的核苷酸序列进行了BLAST (即，NCBIESTs数据库)，以确保只有一种 基因将被失活。
为了将结果的阐释最大化，当使用siRNAs时，应该采取下述预防措施
在分开的实验中，总是检测有义和反义的单链。
尝试合成的siRNA双链体。这应该具有与你的siRNA相同的核苷酸
组成但是缺少与任何其它基因(包括你的基因)的显著的序列同源性。
如果可能，使用两种独立的siRNA双链体敲除相同的基因，以控制 沉默过程的特异性。 实际上，将每种选择的基因作为核苷酸序列引入到预测程序中，所述 预测程序考虑上述所有的变量，用于设计最适的寡核苷酸。这种程序扫描
任何mRNA核苷酸序列寻找易于被siRNAs耙向的区域。这种分析的输出是 可能的siRNA寡核苷酸的得分。最高得分用于设计双链的RNA寡核苷酸 (典型地21bp长，但是其它的长度也是可能的)，其典型地通过化学合成 制备。
按照本发明的核苷酸可以包括一个或多个修饰的寡核苷酸。所述一个 或多个修饰目的在于增加siNA的稳定性或可用性。在下文引用的公布中描 述了适当的修饰的实例，每一公布通过引用结合于此。按照本发明的这样 修饰的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯核苷酸间连接，2'-0-甲基核糖核 苷酸，2'-脱氧-氟核糖核苷酸，2'-脱氧核糖核苷酸，"通用碱基"核苷酸， 5-C-甲基核苷酸，以及反向脱氧非碱基(deoxyabasic)残基的结合，在 siRNA的两个互补链之间的化学交联，和siRNA的一条链的3，末端的化学 修饰，中间修饰，例如，糖修饰，核酸碱基修饰和/或主链修饰。描述了2，-氟修饰的核糖核苷酸和2'-脱氧核糖核苷酸。
研究表明，用脱氧核糖核苷酸取代具有两个核苷酸的3'-突出端的 21-mer siRNA双链体的3'-端核苷酸突出片段对RNAi活性没有不利影响。 已经报道了，在所述siRNA的每一端，用脱氧核糖核苷酸取代多达4个核苷 酸是很好耐受的，而用脱氧核糖核苷酸完全取代导致没有RNAi活性 (Elbashir 2001)。另外，Elbashir等还报道了用2，-0-甲基核苷酸取代siRNA 完全消除了RNAi活性。
可以使用在WO2005/044976中所述的亲和性修饰的核苷。这一公布描 述了包括修饰的核苷的寡核苷酸，以具有对于它们在靶mRNA和/或互补 siNA链中的互补核苷酸的增加的或减少的亲和力。
GB2406568描述了化学修饰的备选的修饰的寡核苷酸，以提供对降解 的提高的抗性或增加的吸收。这样的修饰的实例包括硫代磷酸酯核苷酸间 连接，2'-0-甲基核糖核苷酸，2'-脱氧-氟核糖核苷酸，2'-脱氧核糖核苷酸， "通用碱基"核苷酸，5-C-甲基核苷酸，以及反向脱氧非碱基残基结合。
WO2004/029212描述了修饰的寡核苷酸，以增强所述siRNA的稳定性或提高靶向效率。修饰包括在siRNA的两个互补链之间的化学交联，和 siRNA的链的3'端的化学修饰。优选的修饰是内部修饰，例如，糖修饰， 核酸碱基修饰和/或主链修饰。描述了2'-氟修饰的核糖核苷酸和2'-脱氧核
糖核苷酸。
WO2005/040537还描述了可以用于本发明的修饰的寡核苷酸。 如利用dsNA和修饰的dsNA —样，本发明可以使用短的发夹NA
(shNA); siNA分子的两条链可以通过接头区连接，其可以是核苷酸接头或
非-核苷酸接头。
除了按照本发明的与mRNA靶区域中的序列互补的siNA之外，可以使 用简并siNA序列，来耙向按照本发明的同源区域。简并siNA序列可以按照 技术人员己知的方法设计。例如，WO2005/045037描述了设计靶向这样的 同源序列的siNA分子，例如，通过结合不规范的碱基对，例如，错配和/ 或摆动碱基对，其可以提供其它的靶序列。在鉴定错配的情形中，不规范 的碱基对(例如，错配和/或摆动碱基)可以用来产生靶向多于一种基因序 列的siNA分子。在一个非限制性实例中，不规范的碱基对如UU和CC碱基 对用来产生能够耙向具有序列同源性的不同的靶的序列的siNA分子。因 此，使用本发明的siNAs的一个优点在于，可以设计单一的siNA，以包括 与在同源基因之间保守的核苷酸序列互补的核酸序列。在这种方法中，单 一的siNA可以用来抑制多于一种基因的表达，而不是使用多于一种siNA 分子来耙向不同的基因。
本发明的优选的siNA分子是双链的。本发明的一种siNA分子可以包括 平端，即，不包括任何突出的核苷酸的末端。在一个实施方案中，本发明 的siNA分子可以包括一个或多个平端。在优选的实施方案中，所述siNA 分子具有3'突出端。本发明的siNA分子可以包括具有n个核苷酸(5^n》1) 的3'突出端的双链体核酸分子。Elbashir(2001)表明，当包含3'-端二核苷酸 突出端时，21个核苷酸的siRNA双链体最有活性。
还关于物种之间的序列保守性而筛选了候选寡核苷酸，以促进从动物 到人类临床研究的转换。在本发明的优选的实施方案中，使用了保守的寡 核苷酸；这允许单一的寡核苷酸序列用于动物模型和人类临床试验二者 中。
本发明可以包括同时施用一种或多种种类的siNA分子。可以选择这些 一种或多种种类，以靶向相同的或不同的mRNA种类。优选地，所述siNA 靶向选自SEQID l-SEQID61的序列，或者靶向包括SEQID 1-SEQ ID 61
的序列。
与lip-HSD的两种备选的转录物相对应的GenBank登记号显示在表l 中。本发明允许每种转录物形式的单一靶向。因此，在一个实施方案中， 所述siNA靶向在表l中所示的llp-HSD的一种剪接形式。
RNAi针对的所选的寡核苷酸序列显示在表2中。显示的序列是siNA耙 向的DNA序列。因此，本发明使用具有与指定的DNA序列互补的序列的 NA双链体。
表2中所示的序列不是限制性的。靶DNA不必要在AA或CA之后。此 外，耙DNA可以由侧连任何邻近的序列的表2中所包括的序列而组成。
在另一个方面中，本发明涉及治疗眼科疾病的方法，其包括施用siNA， 其中所述siNA能够抑制11 (3-HSD1的表达。所述siNA按照本发明定义。
在另一个方面中，本发明还涉及抑制11P-HSD1的表达的方法，其包括 施用能够抑制ll卩-HSDl的表达的siNA化合物。所述siNA按照本发明定义。
在另一个方面中，本发明涉及一种靶向ll(3-HSDl的分离的siNA化合 物，其中所述siNA化合物包括与选自SEQ ID 1- SEQ ID 61的核苷酸序列互 补的序列。在一个实施方案中，所述siNA化合物可以包括选自SEQIDNO 62-SEQIDN0 122的组的核苷酸序列。特别地，本发明涉及一种用作药物 的分离的siNA分子，其包括与选自SEQID l-SEQID61的核苷酸序列互补 的序列或SEQ ID No 62-122的序列。
在最后一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括本文所述的一种 分离的siNA化合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包括靶向 ll卩-HSDl的分离的siNA化合物，其中所述siNA化合物包括与选自SEQ ID 1-SEQ ID 61的核苷酸序列互补的序列，或者包括选自SEQ ID NO 62-SEQ IDN0 122组的核苷酸序列。
本发明的siNA分子及其制剂或组合物可以按照本领域通常所知的那 样直接或局部(例如，局限性地)施用到眼睛。例如，siNA分子可以包括 递送赋形剂，其包括脂质体，用于施用给受试者。载体和稀释剂以及它们
的盐可以存在于药用制剂中。核酸分子可以通过本领域的技术人员已知的 各种方法施用到细胞，所述方法包括但不限于，包封在脂质体中，通过离 子电渗，或者通过结合到其它赋形剂中，诸如可生物降解的聚合物、水凝
胶、环糊精聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)和PLCA微球体，可生物降解
的纳米胶囊，和生物黏附的微球体，或者通过蛋白质载体。在另一个实施 方案中，本发明的核酸分子还可以用聚吖丙啶及其衍生物，诸如聚吖丙啶
-聚乙二醇-N-乙酰基半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚吖丙啶-聚乙二醇-三-N-乙酰基半乳糖胺(PEI-PEG-三GAL)衍生物。
本发明的siNA分子可以与破膜剂(membrane disruptive agent)禾口/或阳 离子脂质或辅助脂质分子复合。
可以用于本发明的递送系统包括，例如，水性和非水性凝胶，乳膏， 多乳液，微乳液，脂质体，油膏，水性和非水性溶液，洗液，气雾剂，碳 氢化合物基质和散剂，并且可以包含赋形剂，诸如增溶剂，渗透增强剂(例 如，脂肪酸，脂肪酸酯，脂肪醇和氨基酸)，以及亲水聚合物(例如，聚 卡波非和聚乙烯吡咯垸酮)。在一个实施方案中，所述药用载体是脂质体 或透皮增强剂。
本发明的药物制剂是以适合施用如系统或局部施用到细胞或受试者 中的形式存在，所述受试者包括，例如人。适当的形式部分取决于用途或 进入的途径，例如，口服、透皮或通过注射。其它因素是本领域内已知的， 并且包括这样的考虑，诸如防止所述组合物或制剂行使其作用的毒性和形 式。
本发明还包括为储存或施用而制备的组合物，其包括在药用载体或稀 释剂中的药物有效量的需要的化合物。治疗应用可接受的载体或赋形剂是 制药领域公知的。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂、这些 包括苯甲酸钠、山梨酸、和对-羟基苯甲酸的酯。另外，可以使用抗氧化剂 和悬浮剂。
药物有效剂量是预防、抑制发作或治疗(将症状减轻到某种程度，优 选地是减轻全部症状)疾病状态所需要的剂量。所述药物有效剂量取决于 疾病的类型，所用的组合物，施用途径，被治疗的哺乳动物的类型，在考 虑中的具体哺乳动物的身体特征，同时用的药物，以及医学领域的技术人
员应该意识到的其它因素。
一般地，施用活性成分的量在0.1mg/kg和100 mg/kg体重/天之间。 本发明的制剂可以以剂量单位制剂施用，所述剂量单位制剂包含常规 无毒的药用载体、佐剂和/或赋形剂。制剂可以以适于口服使用的形式，例 如，作为片剂、药片、锭剂、水性或油性混悬液、分散的散剂或粒剂、乳 剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。口服应用需要的组合物可以按照本领域 己知用于制备药物组合物的任何方法制备，并且这样的组合物可以包含一 种或多种这样的甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂，以提供制药学上别致 而可口的制剂。片剂包含与适用于制备片剂的无毒药用赋形剂混合的活性 成分。
例如，这些赋形剂可以是惰性稀释剂；诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、 磷酸钙或磷酸钠；粒化和崩解剂，例如，玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例 如淀粉、明胶或阿拉伯树胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石 粉。所述片剂可以是不包被的，或者它们可以通过已知的技术进行包被。 在一些情形中，这样的涂层可以通过已知的技术制备，以延缓在胃肠道中 的崩解和吸收，并且由此在更长的时间周期提供缓慢恒定的作用。例如， 可以使用时间延迟物质，诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服应用的制剂还可以作为硬明胶胶囊存在，其中活性成分与惰性固 体稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者作为软明胶胶囊存在，其 中所述活性成分与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性混悬液包含与适用于制备水性混悬液的赋形剂混合的活性物质。 这样的赋形剂是混悬剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶；分散或湿 润剂可以是天然存在的磷脂，例如，磷脂酰胆碱，或烯化氧与脂肪酸的縮 合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙垸与长链脂肪醇的縮合产物， 例如，十七烷乙烯氧基十六垸醇，或烯化氧与衍生于脂肪酸和己糖醇的偏 酯(partial ester)的缩合产物，如聚氧依稀山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷 与来脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合产物，例如聚乙烯脱水山梨糖醇单油 酸酯。所述水性混悬液还可以包含一种或多种防腐剂，例如乙基、或正丙 基对-羟基苯甲酸酯， 一种或多种着色剂， 一种或多种调味剂，和一种或多种甜味剂，如蔗糖或糖精。
油性混悬液可以通过将所述活性成分混悬在植物油如花生油、橄榄 油、芝麻油或椰子油中，或者混悬在矿物油如液体石蜡中而配制。所述油 性混悬液可以包含增稠剂，例如蜂蜡，硬石蜡或十六烷醇。可以加入甜味 剂和调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂 如抗坏血酸而保存。
适合通过加入水而制备水性混悬液的分散的散剂和粒剂提供与分散 剂或湿润剂、混悬剂以及一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散 或湿润剂或混悬剂由上文已经提及的那些举例。还可以存在其它的赋形 剂，例如，甜味剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物制剂还可以以水包油的乳剂形式存在。油相可以是植物 油或矿物油或这些的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如 阿拉伯树胶或黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆、磷脂酰胆碱，以及衍 生于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或偏酯，例如失水山梨糖醇单油酸酯，和所 述偏酯与环氧乙烷的縮合产物，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。所 述乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以用甜味剂如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖 配制。这样的制剂还可以包含缓和剂、防腐剂和调味剂与着色剂。所述药 物组合物可以以无菌注射水性或油质混悬液的形式存在。
这种混悬液可以按照已知的技术使用上文已经提及的那些适当的分 散剂或湿润剂和混悬剂配制。
无菌注射制剂还可以是在无毒的肠胃外(parentally)接受的稀释剂或 溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，例如，作为在l，3-丁二醇中的溶液存在。 其中可以使用的可接受的赋形剂和溶剂是水，Ringer's溶液和等渗氯化钠 溶液。另外，无菌的、不挥发的油常规用作溶剂或混悬介质。出于这一目 的，可以使用任何少刺激的不挥发的油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。 另外，脂肪酸如油酸用于制备注射剂。
本发明的核酸分子还可以以栓剂的形式施用，例如，用于所述药物的 直肠施用。这些组合物可以通过将药物与适当的无刺激性的赋形剂混合而 制备，所述适当的无刺激性赋形剂在常温下是固体而在直肠温度下是液体，并且因此将在直肠中融解，而将药物释放。这样的物质包括可可脂和 聚乙二醇。
本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠胃外施用。所述药物，取决于 所用的赋形剂和浓度，可以悬浮在或溶解在赋形剂中。有利地，佐剂，如 局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂，可以溶解在所述赋形剂中。
应该理解，对于任何具体的受试者，特定的剂量水平取决于许多因素， 包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、综合健康、性别、日常饮食、 施用时间、施用途径、和排泄速率、药物组合以及进行治疗的具体疾病的 严重性。
为了施用给非人动物，所述组合物还可以加入到动物饲料或饮用水 中。可以便利地配制动物饲料和饮用水组合物，以致动物在其日常饮食中 采用治疗适量的组合物。还可以便利地将所述组合物作为预混合物存在， 以添加到饲料或饮用水中。
本发明的核酸分子还可以与其它治疗化合物组合施用给受试者，以提 高整体治疗效果。使用多种化合物治疗适应证可以增加有益作用，同时减 少副作用的存在。
备选地，本发明的某些siNA分子可以在细胞内从真核启动子表达。可 以递送能够表达所述siNA分子的重组载体并且其存在于耙细胞中。备选
地，可以使用提供核酸分子的瞬时表达的载体。必要时，这样的载体可以
重复施用。 一旦表达，所述siNA分子与靶mRNA相互作用，并且产生RNAi 反应。siNA分子表达载体的递送可以是系统的，诸如通过静脉内或肌内施 用，通过施用给从受试者移植的靶细胞，然后将其重新引入到受试者中， 或者通过允许引入到需要的靶细胞的任何其它方式。
获得siRNA双链体
RNAs优选地使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合 成仪化学合成。将siRNA双链体的一条或两条链用2'-脱氧或2'-0-甲基寡核 糖核苷酸取代消除了在苍蝇提取物中的沉默(Elbashir等.2001)。然而，在 哺乳动物细胞中，似乎可能地用2'-0-甲基寡核糖核苷酸取代有义siRNA(Ge等.RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription (通 过直接靶向mRNA进行降解而RNA干扰流感病毒的产生并且间接地抑制 所有的病毒RNA转录).ProcNatlAcadSciUS A (美国国家科学院学报)， 2003; 100(5):2718-23)。
最便利地，siRNAs从商业RNA寡聚物合成供应商获得，它们出售不同 质量和价位的RNA-合成产物。通常，21-nt的RNAs不是太难合成，并且容 易地以适用于RNAi的质量提供。
RNA合成试剂的供应商包括普洛里格(Proligo)(汉堡，德国)， Dharmacon研究(Dharmacon Research)(拉斐牛寺(Lafayette), CO,美国)， Glen研究(Glen Research)(斯特林(Sterling), VA，美国)，ChemGenes (阿 什兰(Ashland) , MA,美国)，禾口Cruachem (Glasgow,英国)，Qiagen (德国)， Ambion (美国)和Invitrogen (苏格兰)。前述常规的RNA合成公司有资格提 供siRNAs，其具有用于耙点确定的许可。特别地，我们的siRNA供应商是 Ambion， Dharmacon和Invitrogen，它们是提供关于siRNA的传统的常规化 学合成服务，并且提供用HPLC纯化并以干燥形式与无RNA酶的水一起递 送的siRNA的公司。关于RNAi和siRNA方法的基于中枢网路的资源，以及 与其它siRNA相关的产品和服务的链接，可以在上文提及的供应商的网页 上找到。
当使用单链RNA分子时，退火步骤是必需的。重要的是，所有处理步 骤应该在无菌的、无RNA酶的条件下进行。为了使RNAs退火，首先，必 须通过在260纳米(nm)的UV吸收而将寡聚物定量。然后使用下述基于 Elbashir等(2001)的方法进行退火
分别等分，并且将每种RNA寡聚物稀释到50pM的浓度。
将30 pl的每种RNA寡聚物溶液和15 |nl 5X退火缓冲液组合。最终缓 冲液浓度是100 mM醋酸钾，30 mM HEPES-KOH pH 7.4， 2 mM醋 酸镁。终体积是75pl。
将所述溶液在90。C温育1分钟，将管子离心15秒，在37。C静置1小 时，然后在室温下使用。所述溶液可以在-2(TC冷冻保存，并且冷 冻-解冻多达5次。siRNA双链体的终浓度通常是20 nM。备选地，已经退火的dsRNA可以从供应商处购买。
还可以使用化学修饰的核酸。例如，关于可以使用的修饰的类型的综
述在WO03/070744中提供，其内容通过引用结合于此。特别要注意这一公 布的第11-21页。其它可能的修饰如上文所述。技术人员应该意识到可以结 合到RNA分子中的其它类型的化学修饰。
"体外"系统
为了检验siRNA干扰的特异性，使用表达耙基因的不同的细胞培养物， 诸如无色素的睫状上皮细胞NPE，睫状上皮细胞OMDC，或胚胎肾细胞 HEK293。备选地，使用细胞膀胱癌细胞系T-24、肺癌细胞系A549或人胚 胎角化细胞HEK。
将所述细胞用相应的siRNA双链体温育，并且进行关于靶基因表达的 下调作用的分析。为了将siRNA敲除与培养细胞中的特异性表型联系在一 起，需要证明靶蛋白质的减少或者至少证明靶mRNA的减少。
靶基因的mRNA水平通过实时定量PCR(RT-PCR)定量。此夕卜，可以以 本领域公知的各种方法确定蛋白水平，诸如使用针对不同的靶的特异性抗 体的蛋白质印迹分析允许直接监测靶蛋白的减少。
siRNA双链体的转染
本领域公知技术的一些实例如下我们可以是使用阳离子脂质，诸如 RNAiFect转染试剂(Qiagen)禾卩脂转染胺2000试齐U(Invitrogen)，实施siRNA 双链体的单一转染，并且在转染后24、 48和72小时测定沉默。
典型的转染方法可以实施如下对于6孔平板的一个孔，我们使用终 浓度100nM的siRNA进行转染。按照RNAiFect方法，在转染前的那天，我 们在3 ml含有DMEM、 10%血清、抗生素和谷氨酰胺的适当的生长培养基 中接种2-4X 105个细胞/ 匕并且在正常生长条件下(37'C和5。/。 C02)培养细 胞。在转染那天，细胞必须达到30-50%汇合。我们将15 pl20iaM的siRNA 双链体(对应100nM的终浓度)稀释在85pl的缓冲液EC-R中，以提供100 ial的终体积，并且通过涡旋混合。对于复合物形成，我们将19(ilRNAiFect 转染试剂加入到稀释的siRNA中，并且通过吹吸或涡旋混合。在将样品在
室温下温育10-15分钟以允许形成转染复合物后，我们将所述复合物用具有
低抗生素的2.9 ml新鲜生长培养基逐滴加入到细胞中。在涡旋振荡所述板
以确保转染复合物的均匀分布后，我们将所述细胞在它们正常的生长条件 下培养。第二天，将所述复合物去除，并且加入新鲜和完全的生长培养基。
为了监测基因沉默，在转染后24、 48和72小时收集细胞。脂转染胺2000 试剂方法非常相似。在转染前的那天，我们在3 ml含有DMEM、 10%血清、 抗生素和谷氨酰胺的适当的生长培养基中接种2-4X 105个细胞/孔，并且在 正常生长条件下(37'C和5。/。 C02)培养细胞。在转染那天，细胞必须达到 30-50%汇合。我们将12.5 pl 20 一的siRNA双链体(对应100 nM的终浓度) 稀释在250 pl的DMEM中，以提供262.5 pl的终体积，并且混合。此外，将 6^1脂转染胺2000稀释在250 plDMEM中，并且混合。在室温下温育5分 钟后，将稀释的寡聚体和稀释的脂转染胺组合，以允许在室温下温育20分 钟的过程中形成复合物。而后，我们将所述复合物用具有低抗生素的2ml 新鲜生长培养基逐滴加入到细胞中，并且通过前后旋转平板而轻轻混合， 以确保转染复合物的均匀分布。我们将所述细胞在它们正常的生长条件下 培养，并且在第二天，将所述复合物去除，并且加入新鲜和完全的生长培 养基。为了监测基因沉默，在转染后24、 48和72小时收集细胞。
转染效率可以取决于细胞类型，而且取决于传代次数和细胞的汇合。 形成siRNA-脂质体复合物的时间和方式(例如，颠倒相对于涡旋)也是关 键的。低的转染效率是失败的沉默的最常见的原因。良好的转染是重要的 问题，并且需要对要用的每种新细胞系进行仔细地检查。可以检测转染报 道基因的转染效率，例如，CMV-推动的EGFP表达质粒(例如，来自克隆 泰克(Clontech))或B-Gal表达质粒，并且然后在第二天通过相差和/或荧 光显微镜评估。
siRNA双链体的检测
取决于耙蛋白的丰度和寿命(或周转)，敲除表型可以在1-3天后或者 甚至更久以后变得明显。如果没有观察到表型，蛋白的耗尽可以通过免疫 荧光或蛋白质印迹观察到。
在转染后，将从细胞提取的总RNA级分用DNA酶I预处理，并且使
用随机引物用于反转录。使用覆盖至少一个外显子-外显子连接的特异性引
物对进行PCR扩增，以控制前-mRNAs的扩增。非耙mRNA的RT/PCR 也需要作为对照。不可检测的耙蛋白的减少的mRNA的有效耗尽可以表 明，在细胞中可能存在稳定的蛋白质的大的储备。备选地，实时PCR扩 增可以用来以更精确的方式检测mRNA的减少或消失。实时反转录酶(RT) PCR最特异性、灵敏性和可再现性地定量模板的初始量。实时PCR监测 在反应过程中出现的荧光，作为在每个PCR循环中的扩增子产量的指征。 在反应中，这种信号以对PCR产物的量的正比例增加。通过记录在每个 循环中的荧光发射的量，可以在指数阶段过程中监测PCR反应，在所述 指数阶段中，PCR产物的量的最初的显著增加与靶模板的初始量相关。
为了验证在细胞培养物中鉴定的差异表达的基因的干扰模式，按照供 应商的方法实施qRT-PCR。对于定量RT-PCR(qRT-PCR)，大约250 ng总 RNA用于反转录，然后在含有Master SYBR Green I的反应混合物中使用 对每种基因特异的引物进行PCR扩增。基本的PCR条件包括在91°C30 分钟的初始步骤，然后是40个循环95°C 5秒，62°C 10秒，和72°C 15 秒。使用与每种靶基因相对应的特异性的引物序列。b-激动蛋白mRNA的 定量用作数据标准化的对照。当所选的内源/内部对照的基因表达更丰富， 并且保持恒定，在样品中，与总RNA成比例时，相关基因表达的比较进 行得最好。通过使用不变的内源对照作为活性参照，mRNA靶的定量可以 关于加入每一反应中的总RNA的量的差异进行标准化。
动物研究
新西兰兔是设计研究IOP的实验平台的黄金标准。它容易处理，并且 它具有大眼睛，大小与人的器官相似。另外，测量IOP的现有装置不适合 用于具有小眼睛的动物，诸如小鼠或大鼠。最后，兔具有可以在局部使用 商购降血压药物而下降至其值的多达40。/。的IOP (约23mmHg)。因此， 尽管可能产生兔青光眼模型(例如，手术阻断巩膜外层静脉或者人工封闭 小梁网)，由于在我们的掌握中，IOP的药理学下降可以容易地并且可再 现地测量，所以，我们已经使用了正常血压的兔。
实验方法
使用正常血压的新西兰白兔(雄性，2-3 kg)。将动物词养在具有食物 和水的自由通道的独立的笼子中。将它们置于人工的12小时光照/12小时 黑暗的循环中，以避免不可控制的IOP的昼夜摆动。动物处理和治疗按照 欧洲国会指示(European Communities Council Directive) (86/609/EEC)和视 觉禾口目艮禾斗学研究协会 (Association for Research in Vision and Ophthalmology)关于在眼科学和视觉研究中使用的动物的阐述进行。
药物典型地通过在角膜表面上缓慢输注小体积(典型地40 pl)而施用。 对侧的眼睛只用赋形剂处理，并且可以在每次实验中用作对照，以免存在 与另一只眼睛相同的现象。可以避免在同一只动物中进行多次实验。
使用接触式压力计(TONOPEN XL, Mentor, Norwell, Massachusetts)进 行IOP测量。由于其可靠性和小的大小，TonoPen压力计是非常方便的。 对角膜表面使用压力计传感器，巧妙地使用这种仪器进行测量。这种装置 已经证明是在兔中测量3-30 mm Hg范围内的眼内压的选择的压力计 (Abrams等.Comparison of three tonometers for measuring intraocular pressure in rabbits (在兔中测量眼内压的三种压力计的比较).Invest Ophthalmol Vis Sci (研究眼科学和视觉科学).1996年4月；37(5):940-4)。 所有的测量都落入这一区间内眼内压的平均基线值是17.0±0.39mmHg Cn-lOO)。由于IOP从晚上到白天有变化，所以，所有的实验在同一时间 进行，以允许IOP更稳定，并且允许与赋形剂治疗的客观比较。为了避免 动物的痛苦，将兔局部麻醉(丁氧普鲁卡因/丁卡因，0.4%/l%，在盐水溶 液中(l/4v:v))。在进行每次眼内压测量之前，将溶液应用(lOpl)到角膜 上。将siRNA或盐水以40pl的体积局部应用到角膜上。
在兔中应用siRNA的标准方法如下在连续4天内，每天将在盐水溶 液(0.9% w/v)中的终体积40 |il的siRNA的剂量应用到一只眼睛中。对侧的 眼睛作为对照，并且在同一时间点，将40 pi的无菌盐水(0.9% w/v)缓慢输 注于其上。在10天的过程中，在每次应用前，和在输注后2小时、4小时 和6小时，测量IOP。在第二和第三天之间观察到最大反应。为了比较 siRNA与其它降压化合物的作用，检测了适利达(拉坦前列素0.005%)和 Trustop(多佐胺2%)，并且在相同条件下测量IOP。 基于上文所述的标准方法，处理兔。这些实验表明两种siRNAs对正 常血压的新西兰兔的IOP的减少的最大作用。在图4中的值代表相对于对 照(只用赋形剂的对侧眼睛)的IOP减少的百分数的平均值和它们的标准 误差(SD)。 所用的 siRNAs 为 11HSD/01: CCACAUCACCAA CGCUUCUdTdT (SEQ ID 133;与人SEQ ID N。 100同源的兔序列)和 11HSD/02: CGUCAAUGUAUCAAUCACUdTdT (SEQ ID 134;具有最佳得 分并且无相应的公开的人序列的兔序列)。
结果还表示了随着时间，siRNA 11HSD/02对正常血压的新西兰兔的 IOP减少的体内作用(图5)。相比于对照，四次连续使用265吗的siRNA 对IOP产生20.34的减少。相反，合成的siRNA对IOP水平没有任何作用。 每个值代表在4只不同的动物中，相比于对照(只用赋形剂的对侧眼睛) 的IOP减少的百分数的平均值。
权利要求
1.siNA在制备用于治疗眼睛疾病的药物中的应用，其中所述siNA能够抑制11β-羟类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)的表达。
2. 权利要求l的应用，其中所述眼睛疾病特征在于在患者中改变的眼 内压(IOP)。
3. 权利要求l或2的应用，其中所述眼睛疾病选自包含青光眼、感染、 炎症、眼色素层炎和系统疾病的表现的组。
4. 前述权利要求任一项的应用，其中所述眼睛疾病是青光眼。
5. 前述权利要求任一项的应用，其中所述眼睛疾病是糖尿病视网膜病。
6. 前述权利要求任一项的应用，其中在患者的眼睛中，所述靶基因表 达被抑制。
7. 前述权利要求任一项的应用，其中所述siNA是siRNA。
8. 权利要求7的应用，其中所述siRNA是dsRNA。
9. 权利要求7的应用，其中所述siRNA是shRNA。
10. 前述权利要求任一项的应用，其中所述siNA包括一种或多种修 饰的寡核苷酸。
11. 前述权利要求任一项的应用，其中将所述siNA局部施用到患者的 眼睛中。
12. 权利要求ll的应用，其中将所述siNA施用到患者的角膜中。
13. 前述权利要求任一项的应用，其中使用多种种类的siNA。
14. 权利要求13的应用，其中所述多种种类靶向同一mRNA种类。
15. 前述权利要求任一项的应用，其中所述siNA靶向选自SEQIDNO 1-SEQIDN061的序列，或者耙向包括SEQ ID NO 1-SEQIDNO 61的序 列。
16. 前述权利要求任一项的应用，其中所述靶基因是11(3-HSD1，并且 所述siNA耙向选自SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 61的序列，或者靶向包括 SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 61的序列。
17. 前述权利要求任一项的应用，其中本发明的siNA分子包括选自 SEQ IDN0 62-SEQ ID NO 122的组的核苷酸序列。
18. 权利要求17的应用，其中所述siNA分子包含3'突出端。
19. 一种治疗眼睛疾病的方法，其包括施用siNA，其中所述siNA能 够抑制llp-HSDl的表达。
20. —种靶向11P-HSD1的分离的siNA化合物，其中所述siNA化合 物包括与选自SEQIDNO 1-SEQIDN0 61的核苷酸序列互补的序列。
21. —种靶向llp-HSDl的分离的siNA化合物，其中所述siNA化合 物包括选自SEQIDN0 62-SEQIDNO 122的组的核苷酸序列。
22. 权利要求20和21的分离的siNA化合物，其中所述siNA是 siRNA。
23. 权利要求22的分离的siNA化合物，其中所述siRNA是dsRNA。
24. 权利要求22的分离的siNA化合物，其中所述siRNA是shRNA。
25. 按照权利要求20-24中任一项所述的分离的siNA化合物，其中所 述siNA包括修饰的寡核苷酸。 '
26. 权利要求20-25的分离的siNA化合物，其还包括3'突出端。
全文摘要
本发明涉及用于治疗眼睛疾病的siNA组合物和方法，其中所述siNA化合物能够抑制11β-羟类固醇脱氢酶(11β-HSD1)的表达。
文档编号C12N15/113GK101346467SQ200680049061
公开日2009年1月14日 申请日期2006年10月25日 优先权日2005年10月25日
发明者M#+[a]·康塞普希翁·希门尼斯戈麦斯, 安娜·伊萨贝尔·希门尼斯安东, 安赫拉·塞斯托·亚格 申请人:西伦蒂斯公司