专利名称：：一种安全的植物抗逆表达载体及在转基因植物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明构建了一种安全的植物抗逆表达载体，并实现含有目的基因(DREB2A)的该载体在百脉根中的抗旱性表达。本发明属于植物转基因
技术领域：
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背景技术：
：自从1983年世界上诞生第一例转基因植株以来，转基因作物的安全性曾经在全球范围引起很大争议，一个主要的原因是在转基因操作过程中的初期，为了筛选含有目的基因的细胞的需要，用于植物表达的载体往往含有抗生素基因和除草剂基因，而当筛选得到目的细胞后，抗生素基因就没有用途了，但它在转基因材料中的存在会带来环境和食品上的安全隐患。因此，近些年来植物转基因研究的热点之一就是实现安全性标记，其中糖代谢相关基因研究得最多也最深入，木糖异构酶(xyloseisomerase,XI)基因(XylA)是这类选择标记之一。大肠杆菌XylA基因编码的木糖异构酶能够催化木糖转变为木酮糖，从而被生物体利用。多数植物并不能利用木糖的原因在于其体内缺乏木糖异构酶，因而木糖异构酶可以用来作为植物转化的筛选标记，其原理是木糖在XylA的催化下能转变成木酮糖(xylulose)，再经过磷酸戊糖途径分解代谢，最终为细胞生长所利用。在以木糖为唯一碳源或者主要碳源的培养基上，转化细胞因能利用木糖而呈现优势生长，非转化细胞则因碳源供应不足而使生长受到抑制。该酶广泛分布于动物和部分植物体内，并且广泛应用于食品工业中，用于生产果糖或高果糖浆，因而不会对人类和动物的健康带来威胁，事实上动物体内也都能合成木糖异构酶。植物通过一些特定基因的表达来应答干旱、高盐和低温胁迫等逆境胁迫，这些基因的表达产物可以分为两类一类是起直接保护细胞免受水分胁迫作用的物质，包括相关功能蛋白、渗透调节因子的合成酶、解毒物质等；另一类主要是起调节作用，并不直接参与保护，包括传递信号和调控基因表达的转录因子、感应和传导胁迫信号的蛋白激酶等。然而，目前的抗逆转基因研究中，主要是将相关的单一基因(即编码上述第一类产物的基因)直接转到植物中，得到的转基因植物时常不能获得预期的抗性，主要是因为对干旱、盐碱的应答反应并不是一两个基因的表达所能完成的，相反，在大多数情况下是多基因协同作用的结果。因而，转入具有多重作用的转录因子或信号转导基因被认为是一种更为有效的方法。例如，转入DREB类转录因子(DREB2A基因是其中之一)的拟南芥、水稻、油菜、烟草、番茄等植物体内的游离脯氨酸含量提高，植物的抗逆性明显增强。
发明内容本发明公开一种安全的植物抗逆表达载体，目的是为培育环境安全、抗逆性优良的转基因植物提供一种有效的表达载体。用该载体转化植物，可以避免使用抗生素和除草剂，筛选获得高抗逆性的转基因植物。本发明的安全性植物抗逆表达载体，其特征是以木糖异构酶基因XylA为筛选标记、启动子为物理因素诱导型的启动子rd29A,目的基因是抗逆性转录因子DREB2A。本发明的安全性植物抗逆表达载体是用木糖异构酶基因XylA及其所带rd29A启动了替换了基础载体pCAMBIA3301的标记基因潮霉素抗性基因及其启动子，抗逆性转录因了-基因DREB2A编码序列替换了报告基因Gus的编码序列而构建成的。这两基因位于载体T-DNA左边界LB和右边界RB序列之间。其中，XylA基因表达框结构是从5'到3'端方向依次为(I)CaMV35S启动子，(II)TMVRNA的Q片断，(III)木糖异构酶基因XylA编码序歹U，(IV)CaMV35SPoly-A序歹ij;DREB2A基因表达框机构是从5'到3'端方向依次为(I)CaMV35S启动子，(II)抗逆转录因子DREB2A编码序列，(III)NosPoly-A序列。本载体中的启动子是rd29A，这个启动子克隆自拟南芥，该启动子驱动的GUS基因在高盐、高渗和ABA诱导下均能表达，且其表达量不低于组成型的35S启动子。另外，在不存在诱导条件下有非常微弱的表达，属于正常，因为在拟南芥中，rd29A基因有很微量的组成型表达，将含有这类应答元件的启动子，连接上感兴趣的基因，便能组成一个分了开关系统。把这样的分子开关系统应用于转基因植物中，就可以让目标基因在植物体受到干旱、高盐、低温等逆境胁迫或者有外源ABA诱导的时候才表达。目前，该分子开关系统已经得到了广泛的应用。本发明的安全性植物抗逆表达载体转化大肠杆菌DH5a，获得含有该载体的大肠杆菌转化子。本发明的安全性植物抗逆表达载体转化农杆菌EHA105，获得含有该载体的农杆菌转化子，利用该转化子，可以获得环境安全、抗逆的转基因植物。利用含有本发明的安全性植物抗逆表达载体的农杆菌EHA105转化子，转化豆科牧草百脉根，以木糖异构酶XylA为筛选标记进行筛选，可获得高抗逆性的转基因百脉根植株。实验证明，本发明的载体转化率高；并且本发明获得的转基因植物拥有很强的抗逆性(例证抗干旱实验见实施例7)。以下通过附图和实施例对本发明进一步说明。图l是中间载体pCRD—GUS的构建流程。图2是中间载体pCRD—XI的构建流程。图3是安全性抗逆载体pXIRD—D2A的构建流程。图4是百脉根的转化和筛选过程。图5是转基因植株的PCR检测结果。图6是转基因百脉根的抗旱能力测定结果。具体实施例方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。实施例l:安全性植物抗逆表达载体pXIRD—D2A的构建首先将质粒pCAMBIA3301驱动GUS的35S启动子替换成诱导型启动子rd29A(启动子片段来源于本实验室构建的载体T-Prd29A:其构建过程是PCR法扩增出拟南芥的rd29A基因(GenBankaccessionmimberD13044)的核苷酸序列，连接入pGEMT-easy载体得到的。)用历"JIII、双酶切下pCAMBIA3301的35S启动子，然后切下的35S位置连接入rd29A启动子，获得中间载体pCRD—GUS(详细构建过程见附图l)。再用///"^111、K/7"I双酶切中间载体pCRD—GUS，切下phosphinothricin基因及其启动子，替换以35S-Q-XylA片段(该片段来源于本实验室构建的载体pBin438-XI:其构建过程是PCR法扩增出以大肠杆菌基因组DNA为模板的XI基因(GenBankaccessionnumberIDeoeMOO}，以XI基因替换pBin438载体BADH基因序列得到的。)，得到中间载体pCRD—XI(详细构建过程见附图2)。载体构建的最后一步是中间载体pCRD—XI中的报告基因GUS被换成目标基因DREB2A:用5g/11、Affin双酶切pCRD—XI，切下2048bp的GUS基因(具内含子)，插入末端分别为5gni和5^EII的DREB2A片段(DREB2A片段来源于本实验室构建的载体T-D2A:其构建过程是PCR法扩增出拟南芥的DREB2A基因(GenBankaccessionnumberID830424),连接入pGEMT-easy载体得到的。)，最终获得以木糖异构酶基因为选择标记，rd29A启动子驱动DREB2A基因表达的质粒载体pXIRD—D2A(详细构建过程见附图3)表l.l、表1.2和表1.3是上述实验涉及到的酶切反应体系，电泳条件和连接反应体系。表1.1历wffll和A:;7"I双酶切反应和电泳体系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>37。C反应过夜，然后用lxTAE(0.04mol/LTris-乙酸，O.OOlmol/LEDTA)酉己制0.8。/o琼脂糖凝胶，在琼脂糖凝胶内加入EB(溴化乙锭)至终浓度为0.5昭/ml，在5V/cm的电压下电泳。表1.2连接反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表i.3^grn和Ayffin双酶切反应和电泳体系<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>先加5WEII酶，并在反应液表面封加石蜡油，65'C反应8h，然后加SgZII酶37'C反应过夜，然后用lxTAE(0.04mol/LTris-乙酸，0.001mol/LEDTA)配制0.8。/。琼脂糖凝胶，在琼脂糖凝胶内加入EB(溴化乙锭)至终浓度为0.5pg/ml，在5V/cm的电压下电泳。实施例2:含pXIRD—D2A的大肠杆菌转化子的获得大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备取存于-70'C的菌种在LB(配制方法见表2.1)平板上划线活化，37'C培养12-16小时；挑取单菌落在5mlLB培养基中，37'C200rpm振荡培养过夜；取200pl培养过夜的菌液加入至U20mlLB培养基中，37'C200rpm振荡培养3-4小时，至OD6oo值在0.3-0.4之间，将菌液分装于1.5ml离心管中，冰浴10分钟，4'C4000rpm(约1600g)离心10分钟；弃上清，用lml冰预冷的0.1MCaCh溶液重悬，冰浴30分钟，4'C4000rpm离心10分钟，重复此步骤一次；弃上清，用100nl冰预冷的0.1MCaCl2和100^U甘油重悬菌体，即得到感受态细胞。感受态细胞可立即冻存于-70备用。0.1MCaCl2和甘油使用前均经121'C高压蒸汽灭菌15分钟。取实施例l中的连接产物(含有目的基因DREB2A)1(Hd加入到感受态细胞DH5a悬液中，冰浴30分钟，之后42'C热激90秒，然后迅速插入冰中，并于2-4分钟，随后加入800pl的LB培养基，37。C200rpm振荡培养1.5-2.0小时。4000rpm离心5分钟，倒出上清，用剩余的上清重悬菌体，均匀涂布在含50吗/mlkanamycin的LB平板上37'C培养过夜。挑取长出的菌落2-3个，接种于5mlLB培养液中(含50吗/mlkanamycin)，37。C200rpm振荡培养过夜，用碱裂解法小量制备质粒，经PCR和酶切检测后，挑出阳性克隆，其所对应菌落即为转化子，保存于-70'C。表2.1LB液体培养基的成分胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10gddH20溶解后pH值用NaOH调到为7.0。若为固体培养基，则加入1.5%的琼脂粉。实施例3:含载体pXIRD—D2A的农杆菌转化子的获得7农杆菌EHA105感受态细胞的制备取保存于-70'C的EHA105菌种在含50吗/mlrifampicin的LB(配制方法见表2.1)平板上划线活化，28'C培养36-48小时；挑取单菌落在5ml含50吗/ml的rifampicin的LB培养基中，于28'C在200rpm条件下振荡培养24小时。按l:IOO大比例将菌液转接到新的培养基中，于28'C在200rpm条件下振荡培养6-7小时，至OD,值为0.6。收集菌液分装于1.5mL离心管中，然后13000rpm离心30s，弃上清。用800pl的250mM的CaCl2重悬菌体沉淀，13000rpm离心30s，弃上清。用100pl的250m的CaCl2溶液重悬沉淀，冰上放置4小时，即为感受态细胞，保存于-7(TC备用。250mM的CaCl2溶液使用前经12rC高压蒸汽灭菌15分钟。取实施例2中含pXIRD—D2A的大肠杆菌转化子提取的质粒(pXIRD—D2A)6pl于100111体积的农杆菌EHA105感受态细胞悬液中，立即于冰上放置30min，然后从冰上取出迅速浸入液氮中5min，再37。C水浴5min。最后加入800juH本积的LB液体培养基，28。C温育3-5小时后，4000rm离心5分钟，倒出上清，用剩余的上清重悬菌体，均匀涂布在含50吗/ml的kanamycin、50ng/ml的rifampicin的LB平板上28。C培养36-48小时。挑取长出的菌落2-3个作PCR检测，阳性菌落即为转化子，保存于-70'C。实施例4:利用含pXIRD—D2A的农杆菌获得转基因百脉根a.外植体准备。百脉根种子经表面消毒后浸泡24小时，置于放有湿润滤纸的培养皿中，光照培养2天后，将发芽种子接种于MSO培养基中，7天左右取无菌苗子叶，顶端切去1/3作为外植体，接种于培养基I(见表4丄下同)中，预处理3d。b.菌液准备。将带有pXIRD—D2A的EHA105农杆菌分别涂在含有50ng/ml的kanamycin、50吗/ml的rifampicin，pH7.0的YEB(见表4.2)平板上活化，挑取单菌落，用YEB液体培养基培养至OD柳值在0.6-1.0之间，收集菌体，用MS0液体培养基重悬至OD60Q值为l.O，温育4小时左右备用。c.转化、共培养。将预处理3天的外植体在上述菌液中浸泡30min，吸干菌液转入培养基II中共培养l-3天。d.抑菌、筛选。共培养后转入培养基III中；约7天后转入培养基VI中。待农杆菌被抑制住之后(约3周)，转到培养基V中。外植体在培养基VI中已开始分化出不定芽，在培养基V中继续分化和生长。e.待不定芽长至3cm左右时将不定芽切下，在培养基VI继续筛选培养，约25天后将生根的抗性苗转到MSO培养基上扩繁，7天后获得抗性再生植株。上述百脉根转化所需的培养基见表4.1。表4.1百脉根转化所需的培养基(pH6.0)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>灭菌后加100mMMgSO4至终浓度为2mM;100mMMgS04溶液，高温灭菌后用。固体培养基在液体培养基中加入1.5%的琼脂粉。实施例5:转基因植株的分子检测用CTAB法提取转基因植株的基因组DNA，以此DNA作为PCR检测的模板，设计引物对DREB2A是否转入百脉根进行检测。PCR引物为上游引物5'-CTCTGATCATAAACTGCCATAGATCTGGATCC-3'下游引物5'-CTTGGATCTGGAGAACTAAGGTACCGGTGACC-3'PCR运行参数为首先94'C变性5min;然后35个循环循环步骤为94'C变性50s，53'C退火50s，72X:延伸75s;最后72。C补充延伸10min。PCR产物经l。/。琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像仪分析，结果见图5，非转基因植株(标为"一")无带出现，而转基因植株(标号l一6)出现和质粒(标号"+")—致的目的条带，说明目的基因已经转入百脉根中。实施例6:木糖异构酶作为筛选标记的百脉根转化体系的效率从外植体准备开始，直到获得抗性再生植株的时间记为转化周期；用PCR分子手段，确定阳性植株，以下式计算转化率阳性再生植株数转化率(％)=-X100%抗性再生植株数转化结果见表6.1。表6.1木糖筛选体系与除草剂筛选体系的比较转化体系筛选剂转化周期(天)转化率(％)木糖筛选体系木糖9346.7实施例7:利用pXIRD—D2A获得的转基因百脉根的抗旱性转基因植株在MS0培养基上长到4一5厘米后，移栽到花盆中(夏天温室条件，光照和温度同室外，湿度70%左右，人为浇水)，待生长两个月后，停止浇水，分别观察停止浇水15天后，21天后，27天后转基因植株和非转基因植株的生长情况，如图6所示，15天后，非转基因植株生长受到抑制，转基因植株生长正常；21天后，非转基因植株基本呈现枯蒌，转基因植株能够生长但受到抑制；27天后，非转基因植株完全死亡，转基因植株能够维持生长，部分呈现绿色；同时也能观察到花盆里的土壤随着不浇水的天数增多，干燥和板结程度加重。综上所述，表明转基因百脉根植株比非转基因百脉根植株的抗旱能力显著增强。权利要求1.一种重组质粒载体，其特征在于该载体组合含有rd29A启动子，木糖异构酶基因XylA和抗逆转录因子基因DREB2A。2.权利要求1所述的质粒载体，其特征在于基因表达框架位于载体T-DNA左边界LB和右边界RB序列之间。其中，XylA基因表达框结构是从5'到3'端方向依次为(I)CaMV35S启动子，(II)TMVRNA的Q片断，(III)木糖异构酶基因XylA编码序列，(IV)CaMV35SPoly-A序列；DREB2A基因表达框机构是从5'到3'端方向依次为(I)CaMV35S启动子，(II)抗逆转录因子基因DREB2A编码序列，(III)NosPoly-A序列。3.权利要求1所述质粒载体的构建方法，包括以下步骤用木糖异构酶基因XylA及其所带rd29A启动子替换了基础载体pCAMBIA3301的标记基因潮霉素基因及其启动子；抗逆性转录因子基因DREB2A编码序列替换了报告基因Gus的编码序列。4.按照权利要求1所述的质粒载体，其特征在于含有转化该载体的大肠杆菌。5.按照权利要求1所述的质粒载体，其特征在于含有转化该载体的农杆菌。6.利用权利要求1所述的质粒载体得到的转基因植物。7.利用含有权利要求1所述质粒载体的农杆菌EHA105转化子，转化豆科牧草百脉根，以木糖异构酶XylA为筛选标记进行筛选，得到的高抗逆性的转基因百脉根植株。全文摘要本发明公开一种安全的植物抗逆表达载体，以木糖异构酶基因XylA为筛选标记、启动子为物理因素诱导型的启动子rd29A，目的基因是抗逆性转录因子基因DREB2A，本发明为培育环境安全的抗逆性优良的转基因作物提供一种有效的表达载体，用该载体转化植物，可以避免使用抗生素和除草剂，筛选获得高抗逆性的转基因植物。文档编号A01H1/00GK101423844SQ20081005156公开日2009年5月6日申请日期2008年12月10日优先权日2008年12月10日发明者刘艳芝,林春晶,蔡勤安,邢少辰,郭喜英,韦正乙申请人:吉林省农业科学院