专利名称：烟草曲茎病毒DNAβ分子、表达载体及外源基因表达方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种烟草曲茎病毒DNAβ分子、表达载体及外源基因表达方法。
背景技术：
粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminivirus，WTG)在分类上属于双生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)病毒，包括100多个独立种。在自然条件下，WTG均由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播，其病毒粒子形态为孪生颗粒状，大小18×30nm，基因组为单链环状DNA，大小2.5-3.0kb。大多WTG病毒包含2个大小相近的DNA组份，称DNA-A和DNA-B。DNA-A和DNA-B大部分序列不同，但在非编码区中有约200个核苷酸序列几乎相同(同源性大于95％)，称为共同区(common region，CR)，共同区包含有病毒复制、转录起始和包装所需的序列，并可形成茎环结构。目前，WTG中少数病毒，如番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)(泰国的TYLCV除外)、番茄曲叶病毒(TLCV)、棉花曲叶病毒(CLCuV)和胜红蓟黄脉病毒(AYVV)，仅发现有DNA-A，对TYLCV和TLCV的致病性测定表明，DNA-A能侵染番茄、本氏烟(Nicotiana benthamiana)和普通烟(N.tabacum)，并表现出与田间相近的症状，侵染后的植株能被粉虱传播。而与TYLCV、TLCV不同的是，用胜红蓟黄脉病毒(AYVV)的DNA-A的侵染性克隆虽能系统侵染胜红蓟，却不形成典型的黄脉症状。进一步研究发现，AYVV DNA-A需要一种新型的DNA分子(称为DNAβ)共同侵染才能引起典型的症状。除保守的TAATATTAC序列以外，DNAβ与DNA-A没有显著的同源性，其复制、包裹、移动及介体传播等都依赖于DNA-A编码的蛋白。DNAβ并不是病毒移动、复制所必需。DNAβ能编码一个118个氨基酸的ORF——称C1 ORF，该ORF并非DNAβ复制所必须的。
通常，利用基因工程表达外源蛋白的方法主要是通过细菌发酵。该方法表达量高、简便易行、成本较低，但由于细菌为原核生物，不能对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰，如酰胺化、糖基化，因而使得表达的外源蛋白生物学活性较低或丧失活性，有的甚至不能表达。另外一种方法是在植物中表达外源基因，植物生产成本低，种植条件简单，易成活，能再生；无须严格的纯化程序；能对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰，克服了微生物发酵生产的缺点；转基因植物所产生的外源蛋白中不带有感染人体的病原体，比之动物反应器更具安全性；使用方便，可直接口服，易于生产、运输，便于推广普及等特点使其成为外源蛋白的重要表达系统，其中应用得最为广泛的方法是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物基因组DNA的稳定基因转化或直接DNA转移技术，例如基因枪。然而，尽管应用了优化的调节序列，转基因植物通常合成低水平的外源mRNA甚至形成基因沉默，导致表达的外源蛋白量很低或难以检测，通常低于总可溶寄主蛋白的1％(W/W)。此外，稳定的转化和再生方法耗时费力、且无法预测，并且对于极少数易加工植物种类仍有限制，其中包括最重要的单子叶农作物、豆科作物和多年生木本类物种。
近年来，利用植物病毒作为外源基因表达载体的策略受到了广泛的关注。植物病毒基因组小、易于进行遗传操作；增殖快，通常在接种后1-2周以内就可达到最大量的积累；病毒增殖水平较高，可高效表达药物(有时每公斤鲜叶可表达高达数克的产物)，相对于基因遗传转化，其表达量高达100多倍；许多植物病毒很容易通过机械接种方式快速大量地对商业规模的大面积不同农作物接种，因而植物病毒载体能在不同作物中同时大量产生所需的外源蛋白，使大批量生产成为可能；利用植物病毒载体由于外源基因只在细胞中表达，不能稳定地整合到植物基因组，因而不会产生类似转基因植物可能产生的安全性问题。一旦合适的病毒表达载体构建完成，就可在大量不同的病毒寄主种类中快速筛选外源基因的表达水平，来选择最适寄主植物，即受病毒侵染影响最小，且外源蛋白产量最高的寄主植物。目前，已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体，并成功表达了多种蛋白。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种烟草曲茎病毒DNAβ分子。
本发明的另一个目的在于提供一种烟草曲茎病毒表达载体，它以一种粉虱传双生病毒——烟草曲茎病毒(TSCV)的卫星DNA作为外源基因表达载体。
本发明的另一个目的在于提供一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法。
本发明的一个方面在于提供一种烟草曲茎病毒DNAβ分子，该卫星的核苷酸序列含有Seq ID No.5-8所示的序列；或Seq ID No.5-8的序列中每条序列的互补序列；或与Seq ID No.5-8所示的序列有至少70％的同源性的同源序列；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与Seq ID No.5-8所示的序列杂交。
在本发明的另一个方面，提供了一种烟草曲茎病毒表达载体，该表达载体是一种粉虱传双生病毒——烟草曲茎病毒(TSCV)的卫星DNAβ作为外源基因表达载体。本发明不仅包括以Seq ID No.5-8所示的完整序列所构建的植物表达载体，本发明还包括Seq ID No.5-8所示的部分序列，如其中的启动子序列构建的表达载体。
在本发明的另一个方面，提供了一种生物反应器表达外源基因的方法。该方法以TSCV及其伴随的卫星DNAβ作为表达载体，通过将外源基因以插入或置换的方式组装至TSCV卫星DNA有功能的ORF上，如ORF Cl，构建含有外源基因的重组卫星DNA，在辅助病毒DNA-A存在的条件下接种植物并表达外源基因，或接种植物组织、植物细胞培养物，在组织培养条件下表达外源基因。
为实现上述目的，本发明可以采用以下技术方案中的一种(a)获得TSCV DNA-A和DNAβ的全长基因组克隆，并构建含部分重复或2个拷贝以上的DNA-A和DNAβ的植物表达载体，且在DNAβ上以替换或插入的方式组装外源基因，获得重组卫星DNAβ，将上述植物表达载体分别转染农杆菌后注射接种植物。
(b)获得TSCV DNA-A和DNAβ的全长基因组克隆，并构建含部分重复或2个拷贝以上的DNA-A和DNAβ的克隆载体或植物表达载体，且在DNAβ上以替换或插入的方式组装外源基因，获得重组卫星DNAβ，将上述载体用基因枪等轰击植物或植物细胞培养物。
(c)获得TSCV DNA-A和DNAβ的全长基因组克隆的PCR产物或酶切产物，且在DNAβ上以替换或插入的方式组装外源基因，获得重组卫星DNA，将上述产物用基因枪等轰击植物或植物细胞培养物。
本发明中，卫星DNA“ORF C1”是指其互补链上编码的一个大小为118个氨基酸的ORF，它分别对应于Seq ID No.5-8所示的序列的互补序列的785～1143、770～1126、787～1143、784～1140位上。
在本发明中，“克隆载体”是指本领域中常用的用于基因克隆的载体，如pUC载体，pBR322及其衍生物，pGEM序列载体；“表达载体”是指常用的真核表达载体，如pBINplus、pBI121、pBIN121等。
本发明具有以下优点1)该表达系统为真核表达系统，能对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰；2)植物病毒不会感染动物，使用安全，该载体虽然进入细胞中，但只作瞬间的基因表达，病毒DNA不能整合到宿主细胞组中，因而不会产生类似转基因植物可能产生的安全性问题；3)双生病毒增殖速度快，在植株体内拷贝数高，外源基因在较短的时间内，通常在接种后2周就可达到最大量的积累，能快速高效地表达外源基因，4)双生病毒基因组小，且为DNA病毒，可直接体外进行遗传操作，而RNA病毒基因组则需要能转录成侵染性RNA的cDNA，对设备和技术要求高，提高了生产成本，5)RNA病毒复制依赖于其自身编码地上RNA依赖的RNA聚合酶，该酶复制时缺乏纠错机制的的错误率，使得RNA病毒载体因基因不稳定而易丧失价值。双生病毒的复制依赖于寄主细胞核DNA复制机器，因而得利于DNA依赖的DNA聚合酶的纠错机制，复制地保真度高，6)本表达载体采用农杆菌针刺接种植物，对设备要求低，发病率达到100％，简便高效，7)本表达载体中卫星不会破坏辅助病毒的复制体系的完整性，且卫星与辅助病毒DNA序列无同源性，不会因同源重组而导致外源基因的丢失，可持续高效地表达不同的外源蛋白。
具体实施例方式
实施例1 烟草曲茎病毒及其卫星基因组全序列的克隆和测定1.植物总DNA的抽提称取0.5-1g叶片，加液氮研磨至粉末状，加入15ml抽提Buffer(100mMTris Cl pH8.0，50mM EDTA pH8.0，500mM NaCl，临用前加入β-巯基乙醇2.3μl/ml)，继续研磨，转移至50ml离心管所有样品保持在4℃.加入1ml 20％SDS，温和地颠倒混匀，65℃温浴10min.加入5ml 5M KAc，温和地颠倒混匀，冰上放置20分钟.4000rpm离心30分钟，上清液经纱布过虑倒入预冷的15ml异丙醇的50ml离心管中，混匀，-20℃放置30min(或-80℃放置10min).13000rpm离心15min，弃上清，沉淀用0.75ml TE溶解(50mMTris-Cl pH 8.0，10mM EDTA)，并转移至1.5ml离心管，加入15μl 1μg/ml的RNase，37℃温浴30min.14000rpm离心10min，上清夜倒入含0.75ml预冷异丙醇的1.5ml离心管中，加入75μl 3MNaAc pH5.2，-20℃放置30min(或-80℃放置10min).13000rpm离心15min，用70％乙醇洗沉淀.待酒精完全挥发后，溶于300μl TE2.PCR扩增、克隆以及全基因组序列测定和分析以烟草曲茎病毒总DNA为模板，根据该病毒报道的序列设计一对全长abutting引物Y35F5’-CTGGATCCATTAGTAAACGAGTTTC-3’(SEQ ID No.1)和Y35R5’-TAGGATCCCACATAGTGCGGAGTGC-3’(SEQ ID No.2)进行扩增，PCR产物为约2.7kb的条带，经QiaGen胶纯化Kit回收后克隆至pGEM-TEasy Vector，获得阳性克隆pGEM-T DNA-A。同样利用引物beta015’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’(SEQ ID No.3)与beta025’-GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’，(SEQ ID No.4)对DNAβ组分进行扩增，PCR产物克隆至pGEM-T Easy Vector，获得一个全长copy的克隆pGEM-Tβ，对其进行序列测定，获得DNAβ的全长基因组序列，即Seq ID No.5-8所示的序列。实施例2 烟草曲茎病毒DNA-A和DNAβ侵染性克隆载体的构建a).DNA-A侵染性克隆的构建双生病毒的农杆菌接种的侵染性克隆需要1.3-2.0个copy，必须包括共同区。利用BamHI和HindIII双酶切以及BamHI单酶切pGEM-T-DNA-A，分别获得0.9和1 copy的DNA-A，凝胶电泳后回收酶切片断，将前者与BamHI和HindIII双酶切的植物表达载体pBINplus连接，获得插入0.9个copy的DNA-A的植物表达载体pBINplus 0.9A，BamHI切开pBINplus 0.9A，并插入1 copy的DNA-A，筛现正向串联重复的阳性克隆，即获得插入1.9个copy的DNA-A的植物表达载体pBINplus 1.9A。b).DNAβ侵染性克隆的构建以KpnI不完全酶切pGEM-T-β，凝胶电泳回收后与KpnI完全酶切pGEM-T-β获得的1 copy的DNAβ片断连接，获得2个copy DNAβ的pGEM-T2β，再利用pGEM-T Easy Vector两侧的EcoRI位点切下两个copy的DNAβ，插入植物表达载体pBINplus的EcoRI位点，并转化感受态细胞DH5α，从而获得DNAβ的侵染性克隆pBINplus 2β。
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.2taggatcccacatagtgcggagtgc 25SEQ ID NO.3信息(i)序列特征(A)长度25碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3ggtaccactacgctacgcagcagcc 25SEQ ID NO.4信息(i)序列特征(A)长度25碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.4ggtacctaccctcccaggggtacac 25SEQ ID NO.5信息(i)序列特征(A)长度1354碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.5accggtggcg agcggggcct ttggtgttga tggtgggtcc cacttatgaa attgtgccat 60aaatggtcca aaaagggtta ctgggcatgc aattgggcct tcttgttggg ctctttcaat 120ttgggtctaa catagtactc cgttgataat aataaaattt attttattat ttaatactta 180tgttattcat tacatactga ttaaaatacg tattcataca ttagctattg tccctatatc 240atatccttct gctacgtcta tatcatcaac agccgcttct tgcatcatca ggatgtcaat 300ggtctggacc atgtcctctt gtttgaaatt ccgtatggtg gattcattgt acattatgcg 360taataaatta cgtattcctt cctctaagtt attgaaattg aatggttgca tgatcccact 420atgtccgtat gggatcgtgt atctcctctt tgccagtgct ggtgattttg ttgatatcaa 480ttcaatctga acaacgattg aattttcctc cttcaacttt acatcaacga tgaactccat 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NO.6信息(i)序列特征(A)长度1354碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ii)分子型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO.6accggtggcg agcggggtct ttggtgctga tggtgggccc cacatatgaa attgggcctt 60aaatgggcca aaaaagatta ctgggtatgc aatttggtct cttgttgggc tctttcaatt 120tgggtctaca cagtactacg ttgataatat aaatatttat tttattattt aatacttatg 180ttatgcatta catacggatt aaaatacgta ttcatacatt agctattgtc cctatatcat 240aatcttcctc tacgtctata tcctcaacag ccgcttcttg catcatcagg atatcaatcg 300tctggaccat gtcctcctgt ttgaaatctc gtattgtgga ttcgttgtac attatacgta 360ataaattacg tattccttcc tctaagttat tgaaattgaa tggtggtatg atcccactat 420gtccgtatgg gatgatgtat ttcctctttg ccagtgctgg tgattttgtt gatatcaatt 480caatctgaac aacgattgaa ttgtcctcct tcaacttaac atcaacgatg aactccatgc 540ccttcttgtt gttgtattta attgtcatat ttgttcttgt gaccaaaacg ttagttctgt 600ccctttaaat aatcattttc atatgctatt catggtctga aatgatttac gtgtttcttg 660cttgttcata tgtttggtag tggagatctt tgtatcggat gtgacgctgt tgttaatggt 720gtggttaatg tgtaattaga attaaatgtg tagttagacg ttagtactaa tcataacatg 780attaggaaag gaaaaaagaa 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1.一种烟草曲茎病毒DNAβ分子，其特征在于，它是一种单链环状DNA分子，该序列含Seq ID No.5-8的序列中每条序列的互补序列或有70％的同源性以上的同源序列。
2.一种新型的烟草曲茎病毒表达载体，其特征在于，它以一种粉虱传双生病毒——烟草曲茎病毒(TSCV)的卫星DNAβ作为外源基因表达载体。
3.一种外源基因表达的方法，其特征在于，它以TSCV的卫星DNAβ作为表达载体，通过构建含有外源基因的重组卫星DNA，并与TSCV DNA-A接种植物并表达外源基因，或接种植物组织、植物细胞培养物，在组织培养条件下表达外源基因。
4.根据权利要求3所示的外源基因的表达方法，其特征在于，该方法包括获得TSCV DNA-A和DNAβ的全长基因组克隆，并构建含部分重复或2个拷贝以上的DNA-A和DNAβ的植物表达载体，且在DNAβ上以替换或插入的方式组装外源基因，获得重组卫星DNAβ，将上述植物表达载体分别转化农杆菌后注射接种植物。
5.根据权利要求3所示的外源基因的表达方法，其特征在于，该方法包括获得TSCV DNA-A和DNAβ的全长基因组克隆，并构建含部分重复或2个拷贝以上的DNA-A和DNAβ的克隆载体或植物表达载体，且在DNAβ上以替换或插入的方式组装外源基因，获得重组卫星DNAβ，将上述载体用基因枪等轰击植物或植物细胞培养物。
6.根据权利要求3所示的外源基因的表达方法，其特征在于，该方法包括获得TSCV DNA-A和DNAβ的全长基因组克隆的PCR产物或酶切产物，且在DNAβ上以替换或插入的方式组装外源基因，获得重组卫星DNA，将上述产物用基因枪等轰击植物或植物细胞培养物。
全文摘要
本发明公开了一种烟草曲茎病毒DNAβ分子、表达载体及外源基因表达方法。该烟草曲茎病毒DNAβ分子全基因组序列与SEQ ID No.5～No.8中任意一个序列至少有70％的同源性。本发明提供的表达载体是以一种粉虱传双生病毒—烟草曲茎病毒(TSCV)的卫星DNAβ作为表达载体，可以对外源蛋白进行有效表达。本发明进一步提供了一种以植物为生物反应器表达外源基因的方法，它以TSCV的卫星—DNAβ作为表达载体，通过构建含外源基因的重组卫星DNA，接种植物并表达外源基因，或接种植物组织、植物细胞培养物，在组织培养条件下表达外源基因。
文档编号C12N15/83GK1425771SQ0215987
公开日2003年6月25日 申请日期2002年12月24日 优先权日2002年12月24日
发明者周雪平, 李正和, 陶小荣, 谢艳, 崔晓峰 申请人:浙江大学