专利名称：用于逆转录病毒载体的悬浮包装细胞系的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于逆转录病毒载体的悬浮包装细胞系及其在生产感染性的无复制能力的逆转录病毒载体方面的应用。
病毒由编码病毒基因的基因组和病毒衣壳组成，在逆转录病毒中衣壳可由一些被膜包围。
识别逆转录病毒要区分顺式元件5′-LTR、3′-LTR、包装序列Psi、正链引物结合位点与负链引物结合位点，以及反式元件gag(衣壳蛋白)、pol(反转录酶)和env(被膜蛋白)。反式元件可由病毒基因组上的外源基因代替；然而这样的病毒将依赖于称为辅助病毒的病毒，这种辅助病毒既可以是完整的具感染性的病毒，也可以是非感染性的例如无包装序列的病毒。包含这种非感染性的辅助病毒和/或一种或多种辅助病毒的辅助基因的细胞，称之为包装细胞系，其中辅助病毒基因可为瞬时表达的、游离的或整合到基因组中的基因。因此，包装细胞系并不释放有复制能力的感染性的病毒颗粒。如果辅助基因来自不同的辅助病毒，那么所形成的载体可称作嵌合逆转录病毒载体；这个过程称为假型(pseudoty ping)。通常使用的这种嵌合包装系统有例如携带亲嗜性MoMuLv病毒的gag-pol基因和兼嗜性4070Ampho病毒的env基因的GP+env Am12(Markowwitz，D.G等，Trans.Assoc.Am.Physicians 101(1988)212-218)。甚至可能在包装细胞系中出现来自几种病毒(甚至带有遗传修饰的env基因)的env基因混合物。
包装细胞系也可以包含不完整的分节段形式的病毒辅助基因组，这种情况下可称为含割裂病毒基因组的包装细胞系，这种变异具有更大的安全性来抵抗通过重组事件不期望地释放具有感染性和复制能力的病毒。
然而，如果包装细胞系经除顺式元件外还携带外源基因的逆转录病毒载体转染或转导，那么这些病毒基因组便可作为具感染性但无复制能力的逆转录病毒载体被包装和释放。这种细胞系可称为逆转录病毒生产细胞系。
所有过去制备的逆转录病毒包装细胞系都是以贴壁细胞即贴于表面生长的细胞为基础的基于贴壁细胞NIH3T3的包装细胞系GP+E86和GP+envAm12可见Markowitz.D.G.等在Trans.Assoc.Am.Physicians 101(1988)212-218中的描述。Miller，A.D.等在分子细胞生物学(Mol.and cell Biol.)，6(1986)2895-2902中描述了基于贴壁细胞NIH3T3的包装细胞系PA317。Miller，A.D.等在病毒学杂志(J.Virol.)，65(1991)2220-2224中描述了基于NIH3T3细胞的GALV包装细胞系PG13。Danos，O.等在美国国家科学院院报(PNAS USA)，85(1988)6460-6464中描述了基于NIH-3T3细胞的包装细胞系ΨCre和ΨCrip。
Rigg，R.J.等在病毒学(Virology)218(1996)290-295中描述了基于一种人细胞系的包装细胞系Propack-A。Cosset，F.-L.等在病毒学杂志，69(1995)7430-7436中描述了基于一种人纤维瘤细胞系(HT1080)的包装细胞系FLY A13和FLY RD18。基于D17和其它狗贴壁细胞系的包装细胞系可见WO92/05266的描述。
通常描述的细胞系大多也是贴壁生长。贴壁细胞系的一个优点在于它容易操作。因而贴壁细胞相对容易克隆，并且可使用病毒尤其是逆转录病毒，即经转染或转导后直接克隆选择细胞是可能的。单个克隆可以容易地通过挑选进行识别、计数并分离。死细胞简单地因脱落而不可能被误认为活细胞，为变换培养基仅仅需要简单地通过吸管除去上清液且加入新鲜培养基。接种和维持细胞通常并不关键，因为贴壁细胞形成细胞克隆，并在组织单元中相互刺激生长。转移细胞时，对于贴壁细胞需要额外的胰蛋白酶处理以分散细胞，但通常并不关键。
悬浮生长的细胞需要一系列不同的方法以进行克隆和转导实验。因而克隆选择需要使用固定添加剂如软琼脂，用称作有限稀释的方法系列稀释细胞，直到理论上每个容器只有一个细胞，或者使用表面标记物或荧光标记物(如GFP)，使得可通过FAC分选器直接选择重组细胞。活细胞和死细胞只能通过染色区分。变换培养基总是需要离心步骤。
过去并不知道悬浮生长的细胞系可作为逆转录病毒的包装细胞系。到目前为止也没有实验描述已建立的贴壁生长的包装细胞系可转变为悬浮生长。
令人惊奇的是，本发明证明确实可能将贴壁包装细胞系加以改变以适应悬浮生长，并且所得悬浮包装细胞系能够生产高滴度的病毒。此外证明，通过逆转录病毒包装基因质粒和逆转录病毒载体质粒共转染，可从经典的悬浮细胞系(例如人红细胞白血病细胞系K562、大鼠肝癌细胞系N1-S1和大鼠淋巴瘤细胞系C58)制备生产逆转录病毒的悬浮生长细胞系，即这些细胞系释放能转导其它细胞的逆转录病毒载体颗粒。
除了已提到的悬浮细胞需要其它克隆培养技术这点与贴壁细胞的差异外，生产悬浮包装细胞系的技术流程与多次描述的制备贴壁包装细胞系方法相似，都是通过导入单独不能形成感染性病毒的辅助序列(一段或优选断裂形式)来制备。
一旦生产出悬浮包装细胞系，便可以通过用相容逆转录病毒载体转导，使之转变为释放感染性但无复制能力的逆转录病毒载体的悬浮生产细胞系(例如，一种兼嗜性包装细胞系，其包含来源于一种亲嗜性包装细胞系的载体)，并且优选地可通过用一种逆转录病毒载体质粒转染实现转变。
过去并不知道完全悬浮生长的哺乳动物细胞系可作为逆转录病毒的包装细胞系。过去也没有已知的方法可将建立的贴壁生长的包装细胞系完全转变为悬浮生长。
本发明的目的是提供用于逆转录病毒载体悬浮生长的包装细胞系，以及生产该包装细胞系的方法及其用途。
本发明涉及一种完全悬浮生长的用于逆转录病毒的包装细胞系，该细胞系优选地经逆转录病毒载体转染。
本发明进一步的目的为一种生产逆转录病毒载体的方法，其特征为将用上述载体转导的悬浮生长细胞系悬浮培养，将细胞与细胞上清液分离，并从上清液中分离载体。
包装细胞系可理解为一种哺乳动物细胞系，它包含制备病毒颗粒所必需的gag、pol和env基因(辅助基因)，而不包含具有功能活性的包装序列(Ψ)。这种细胞系单独不能形成包含基因组RNA的病毒颗粒。
具有功能活性的包装序列可理解为逆转录病毒基因组中一段功能上导致RNA基因组包装的区域。它的功能可以通过全部或部分缺失或突变而被失活。
根据本发明，可优选地从贴壁生长的逆转录病毒包装细胞系通过至少三个月时间逐步将贴壁包装细胞系改变为适应悬浮生长，从而生产完全悬浮生长的逆转录病毒包装细胞系(甚至较长时间，如几天，无需生长需要的不溶性基质(细胞粘附的管壁或微载体))。所述步骤包括连续减少培养基中胎牛血清含量直至无血清，反复用胰蛋白酶或/和DNase处理细胞，使用悬浮细胞系专用的培养基(如DMF024A)，优选地采用适于悬浮细胞和杂交瘤细胞的组织培养瓶(Sarstedt)，在一个振摇器上持续振摇培养瓶，细胞浓度在5×104和1×106个细胞/毫升(因此与贴壁培养相比较必须更加频繁地分散细胞)。
根据本发明的完全悬浮生长并由逆转录病毒载体质粒转染或用逆转录病毒载体转导的细胞系，可优选地通过如下方法生产用逆转录病毒载体质粒转染或用逆转录病毒载体转导悬浮细胞系，以共转染或共转导表面标记的方式通过有限稀释和/或加入固定添加剂选择转染或转导的细胞，并分离以此方式所选择的根据本发明的悬浮细胞。悬浮细胞系优选地为逆转录病毒包装细胞系。为了生产悬浮生长的逆转录病毒包装细胞系，优选地将一种逆转录病毒包装细胞系转变成一种悬浮生长的细胞系，该逆转录病毒包装细胞系贴壁生长且由编码辅助序列的核酸和逆转录病毒载体质粒转染，或由逆转录病毒载体转导，上述转变采用的方法为连续减少培养基的血清含量，直至基本上不含血清，反复用胰蛋白酶和DNase处理使细胞脱离支持物，在此过程中细胞浓度维持在5×104至1×106个细胞/毫升的范围内。这一方法的实施特别优选经过一段较长时间，优选为至少三个月。在另一优选的实施方案中，通过有限稀释和/或加入固定添加剂，以共转染或共转导表面标记的方式选择转染或转导的细胞。
令人惊奇的是结果表明，尽管经逆转录病毒载体质粒转染或用逆转录病毒载体转导以后经历几个月大规模的长期操作，以这种方式处理的完全悬浮生长的包装细胞系仍能生产逆转录病毒。
同样令人惊奇的是，通过用逆转录病毒载体质粒转染或用逆转录病毒载体转导，经如有限稀释的分离步骤(其可将细胞稀释至实际每一容器悬液中只有单个细胞)，或采用固定添加剂例如铺上层琼脂或甲基纤维素(Metho Cult H4100/干细胞技术)，或以细胞表面标记的方式分选细胞，从而能够将这种完全悬浮生长的包装细胞系克隆，由此形成的完全悬浮生长的逆转录病毒生产细胞系能够与贴壁逆转录病毒生产细胞系同等程度地生产逆转录病毒载体。
与用搅拌式发酵罐或高密度透析培养方法培养的贴壁逆转录病毒生产细胞系相比较，以这种方式生产的逆转录病毒生产细胞系容许更为简单的大规模培养。
此外，分离载体病毒的方法也不相同。对于贴壁逆转录病毒生产细胞系，仅仅需要移出包含逆转录病毒的培养上清液，并且尽管并非绝对必要，但为了安全的原因仍然总是要实行无菌过滤的步骤；而对于完全悬浮生长的逆转录病毒生产细胞系，更小更轻的逆转录病毒载体颗粒是通过过滤和离心步骤或至少两次离心步骤与较大较重的生产细胞系分离的。
包含治疗基因的逆转录病毒载体被用作逆转录病毒载体质粒或逆转录病毒载体。为了防止在悬浮生产细胞系生产过程中释放有复制能力的逆转录病毒载体，这些载体不包含象gag、pol、env这样的包装序列。治疗相关基因通常插在5′-LTR和3′-LTR之间，并且较为便利的是含有新霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。
无复制能力(复制缺陷)的载体可理解为不包含逆转录病毒基因功能(gag、env、pol)因而不能独立形成病毒颗粒的载体。然而，载体通常包含包装功能(psi)。为了形成感染性的逆转录病毒颗粒，可用复制缺陷型DNA载体转导包含稳定形式之基因功能gag、env和pol(作为游离体或整合到基因组中)的包装细胞系。由于gag、env的功能，形成RNA转录物，其被包装入病毒颗粒。这些病毒颗粒为复制缺陷型的，因为它们包含的RNA基因组并不携带逆转录病毒基因功能。缩略词MoMuLV MoLoney鼠白血病病毒Fcs 胎牛血清ΔLNGFR 低亲和力神经生长因子受体，其细胞内结构域缺失(参见WO95/06723)SV40-P/ESV40的启动子/增强子单元neoR新霉素抗性基因pBR322 大肠杆菌基础载体质粒T25 细胞培养瓶大小CMV-P/E CMV启动子/增强子单元(参见例如EP-B0173177)TK-P单纯疱疹胸苷激酶启动子poly-A 聚腺苷酸化位点hygR潮霉素抗性基因gpt gpt选择基因pUC19 基础载体pUC20 基础载体5′LTR MoMuLV MoMuLV的5′长末端重复序列cfu 集落形成单位本发明由以下实施例和公开发表的文献进一步阐明，其范围源于专利的权利要求书。描述的方法应理解为还可描述甚至经过修饰的发明主题的实施例。实施例1 改变贴壁逆转录病毒包装细胞系使之适应悬浮生长贴壁包装细胞系FLY A13(兼嗜性env，来自MoMuLV)和FLYRD18(env来自猫内源性病毒RD114)(Cosset，F-L.等，病毒学杂志，69(1995)7430-7436)都基于人纤维瘤系HT1080，其通过以下方法步骤经改变以适应为悬浮生长a)改变贴壁包装细胞系以适应悬浮生长I.连续并缓慢减少培养基中的胎牛血清，时间大约5个月；10％FCS-＞5％-＞2.5％-＞2％-＞1％-＞0.5％-＞无血清II.使用用于悬浮细胞系的培养基III.使用用于悬浮细胞系的培养瓶(Sarstedt)IV.在振摇器上连续缓和振摇培养瓶V.维持培养需要经常分离由胰蛋白酶和DNase酶处理形成的细胞团块，并经常分散以保持悬浮。细胞浓度总是关键因素(5×104-1×106个细胞/毫升)，即绝不能太高或太稀。b)瞬时培养的逆转录病毒滴度测定悬浮生长的包装细胞系与相应的贴壁生长的包装细胞系就生产性质进行比较。
为此，用逆转录病毒载体质粒转染所有细胞系，并测定瞬时培养物的逆转录病毒滴度。材料*逆转录病毒载体pLΔNSN(6853bp)[-5′LTR MoMuLV-Ψ-ΔLNGFR-SV40-P/E-neoR-3′LTRMoMuLV-pBR322-质粒部分-]*转染试剂DOSPER；每次每份混合物加20μgDOSPER(制造商Boehringer Mannheim GmbH，GER)*质粒DNA浓度50μg DNA/混合物/质粒方法第1天接种用于转染的细胞贴壁细胞6×105细胞/盘，在60mm培养皿上悬浮细胞3×105细胞/毫升；在用于悬浮细胞的培养瓶中(T25，Sarstedt，竖式的)；总量2毫升。温和振摇，37℃下5％CO2中培养悬浮细胞过液。第2天变换培养基(对于悬浮细胞采用离心和重悬方法)，制备DNA/DOSPER混合物，逐滴加在细胞上(每种情况下100μlDNA/DOSPER混合物)。
37℃、5％CO2温育5～6小时，随后加入培养基。第3天转染24小时后移出上清液，离心(只对于悬浮细胞系)、过滤(0.45μm滤器)，然后在NIH3T3细胞上滴定滴度(G418选择)。
滴度结果约10-14天后。滴度贴壁细胞系 FLY A138×105cfu/ml2×105cfu/mlFLY RD18过去没有测定过转变为悬浮的细胞系FLY A132.4×103cfu/mlFLY RD181×102cfu/ml结果变为悬浮生长的包装细胞系从理论上讲能够生产重组逆转录病毒。滴度的差异是由于在转染和滴度测定时的实验条件不同，例如悬浮细胞和贴壁细胞的转染效率不同，以及无胎牛血清培养基和有胎牛血清培养基中的逆转录病毒的稳定性和感染性不同。实施例2经两个辅助质粒和逆转录病毒载体质粒三重转染悬浮细胞后逆转录病毒的生产一种贴壁细胞系和几种悬浮生长细胞系在瞬时三重转染制备时比较了其形成感染性逆转录病毒颗粒的能力。使用的细胞系贴壁细胞系(对照) NIH3T3(鼠纤维瘤)悬浮细胞系 K562(人红细胞白血病细胞系)N1-S1(大鼠肝癌)C58(大鼠淋巴瘤)材料a)辅助质粒*gag-pol表达质粒pGAPOGPT(10202bp)[-CMV-P/E-gag-pol-polyA-SV40-P/E-gpt-polyA-pUC19-质粒部分-]*ENV表达质粒pENVCHT(7933bp)[-TK-P-hygR-polyA-CMV-P/E-env(兼嗜性)-IpolyA-pUC20-质粒部分-]b)逆转录病毒载体质粒*逆转录病毒载体pLΔNSN(6853bp)[-5′LTR MoMuLV-Ψ-ΔLNGFR-SV40-P/E-neoR-3′LTRMoMuLV-pBR322-质粒部分-]*转染试剂DOSPER(BM)；每次20μgDOSPER/混合物*质粒DNA浓度50μg DNA/混合物/质粒方法第1天接种用于转染的细胞贴壁细胞(NIH3T3)6×105细胞/盘，在60mm培养皿中悬浮细胞3×105细胞/ml；T25培养瓶中(用于悬浮细胞，竖式)；总量2ml，37℃、5％CO2温和振摇悬浮细胞，培养过夜。第2天变换培养基(对于悬浮细胞采用离心和重悬方法)，制备DNA/DOSPER混合物，逐滴加在细胞上(每例100μlDNA/DOSPER混合物)。
37℃、5％CO2温育5～6小时，随后加入培养基。第3天三重转染24小时后除去上清液，离心(仅适于悬浮细胞系)、过滤(0.45μm滤器)并在NIH3T3细胞上滴定滴度(G418选择)大约10～14天以后滴定结果。在NIH3T3上的滴定结果(G418抗性集落数目)NIH3T3(贴壁对照细胞)每1.4ml病毒上清液中3个集落(滴度2cfu/ml)K562每0.8ml病毒上清液中6个集落(滴度7.5cfu/ml)N1-S1每2ml病毒上清液中6个集落(滴度3cfu/ml)C58每2ml病毒上清液中1个集落(滴度0.5cfu/ml)参考文献表Cosset，F-L.等，病毒学杂志，69(1995)7430-7436Danos，O.等，美国国家科学院院报，85(1988)6460-6464Markowitz，D.G.等，Trans.Assoc.Am.Physicians，101(1988)212-218Miller，A.D.等，病毒学杂志，65(1991)2220-2224Miller，A.D.等，分子细胞生物学，6(1986)2895-2902Rigg，R.J.等，病毒学，218(1996)290-295WO92/0526权利要求
1.完全悬浮生长的包装细胞系。
2.完全悬浮生长的包装细胞系，其用逆转录病毒载体质粒转染或用逆转录病毒载体转导。
3.生产完全悬浮生长的包装细胞系的方法，该细胞系用逆转录病毒载体质粒转染或用逆转录病毒载体转导，其中一种悬浮细胞系用逆转录病毒载体质粒转染或用逆转录病毒载体转导，以共转染或共转导表面标记的方式通过有限稀释和/或加入固定添加剂选择转染或转导的细胞，分离以这种方式选择的悬浮细胞。
4.生产悬浮生长的包装细胞系的方法，其中将培养于含血清培养基的用编码辅助序列的核酸和逆转录病毒载体质粒转染的，或用逆转录病毒载体转导的贴壁生长包装细胞系转化为悬浮生长细胞系，方法是通过连续减少培养基中的血清含量直到无血清，反复用胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶处理细胞以便细胞从支持物上脱离，其间悬液中的细胞浓度维持在5×104至1×106个细胞/ml的范围内。
5.按照权利要求4中所要求的方法，其中该方法进行至少3个月的时间。
6.按照权利要求4或5中所要求的方法，其中以共转染或共转导表面标记的方式通过有限稀释和/或加入固定添加剂选择转染或转导的细胞。
全文摘要
本发明涉及一种经逆转录病毒质粒转染或用逆转录病毒载体转导的完全悬浮生长的包装细胞系。本发明还涉及一种从悬浮细胞系或贴壁生长细胞系生产上述细胞系的方法。
文档编号C12N1/15GK1277631SQ98810550
公开日2000年12月20日 申请日期1998年10月22日 优先权日1997年10月25日
发明者S·希伯, S·考赫, T·古特亚尔, U·斯迪格曼斯, R·鲁格 申请人:罗切诊断学有限公司