专利名称：不含酯酶的酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制酶制剂中的酯酶活性的方法，例如用于酶催化生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的酶制剂；还涉及酶制剂的生产方法，例如用于生产7-ACA和/或7-氨基-3-羟甲基-3-头孢烯-4-羧酸的酶制剂。
7-ACA是生产(例如制药)活性头孢菌素类抗生素的关键中间体，例如将7-ACA环系的7位氨基酰化，如用已知在头孢菌素类抗生素的生产中有价值的或在生产这些抗生素的中间体中有价值的基团酰化；例如获得在环系3位有乙酰氧甲基的7-酰化氨基头孢菌素，如头孢噻肟、头孢泊肟(头孢泊肟酯)、头孢来星；及用于生产可衍生自7-ACA的其它头孢菌素类抗生素或其中间体；例如进一步将环系3位的乙酰氧甲基反应获得3位以不同于乙酰氧甲基的基团取代的头孢菌素；例如用已知在生产头孢菌素类抗生素中有价值或已知作为其中间体有价值的基团取代；例如通过乙酰氧基团的亲核取代，或通过将乙酰氧甲基脱乙酰化获得羟甲基(如HACA)，及例如将所得环系3位羟甲基进一步反应，如通过羟基的亲核取代；或去除羟甲基的羟基功能团或去除环系3位的羟甲基；及需要时，将环系4位的羧基酯化，例如用已知在头孢菌素类抗生素的生产中有价值或已知在其中间体中有价值的基团酯化；及需要时通过反应(如按常规方法)获得头孢菌素化合物的盐和/或溶剂化形式。7-ACA和HACA例如可通过环系7位氨基的脱酰化和环系3位乙酰氧甲基的脱乙酰化(例如酶催化)分别从头孢菌素C获得。头孢菌素C酶法脱酰化中有用的酶是例如D-氨基酸氧化酶(DAO)，它催化头孢菌素C的氧化脱胺化，经中间体α-酮己二酰-7-氨基头孢烷酸(KA-7-ACA)形成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Gl-7-ACA)。可将Gl-7-ACA水解，获得戊二酸和7-ACA，例如通过戊二酰酰化酶(GAC)水解。已知含DAO和GAC的酶制剂如微生物细胞可能含有其他酯酶活性。可能发生头孢菌素环结构3位侧链的不希望的脱乙酰化，这例如是由于在酶催化的头孢菌素C脱酰化中存在酯酶活性，可形成如头孢菌素C的3-羟甲基衍生物和Gl-7-ACA。这可能造成7-ACA质量和产率的显著下降。通过丙酮或CuSO4处理在DAO存在下降低酯酶活性的常规方法可不完全地降低酯酶活性。
现出人意外地发现，用苯基甲磺酰氟(PMSF)处理存在DAO活性的有酯酶活性的混合物或存在GAC活性的有酯酶活性的混合物可显著地(如基本上完全)降低酯酶活性，而可分别保留高DAO或GAC活性，如基本上没有变化。这一发现是令人惊异的，因为按照本发明，PMSF(已知通过丝氨酸磺酰化作为含丝氨酸蛋白的不可逆抑制剂)可在DAO活性存在下或在GAC活性存在下选择性地降低存在的酯酶活性，而不显著影响DAO或GAC活性；更令人惊异的是，在GAC活性存在下PMSF对存在的酯酶活性具有选择性和有效的抑制作用，因为酰化酶和酯酶有相似的功能和结构。
一方面，本发明提供一种在具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性和/或戊二酰酰化酶活性的混合物中，例如以微生物细胞的形式或以其无细胞提取物形式存在，在保存D-氨基酸氧化酶活性或戊二酰酰化酶活性的情况下降低(如基本上去除)存在的酯酶活性的方法，包括用苯基甲磺酰基氟处理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性和/或戊二酰酰化酶活性的混合物，其中D-氨基酸氧化酶活性或戊二酰酰化酶活性保留，如用苯基甲磺酰氟处理后与所述处理前的活性基本相同。典型地，D-氨基酸氧化酶活性保留原始值的91％以上，戊二酰酰化酶的活性甚至保留原始值的97％以上。
本发明的方法例如可按如下进行已知的和有商品供应的产DAO活性的微生物包括如三角酵母属(Trigonopsis)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)，优选三角酵母(Trigonopsis variabilis)微生物。已知的和有商品供应的产GAC活性的微生物包括如假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)或转化子，如大肠杆菌转化子，如按常规方法转化的转化子。具有DAO活性或GAC活性和酯酶活性的混合物可通过商业途径获得或按常规方法获得，并可呈无细胞提取物形式，如固定化形式，或呈微生物细胞形式，如部分纯化或未纯化细胞，和/或通透化或未通透化细胞，和/或部分破碎或完整的细胞，和/或固定化或未固定化细胞；如按常规方法可从发酵液中获得的，优选呈无细胞提取物形式，如固定化形式。可从发酵液收获分离微生物细胞并原样使用，如离心发酵液后的湿料形式，或在从发酵液分离之前或之后将细胞按常规方法进一步处理，如将细胞匀浆以获得(如部分)破坏的细胞，和/或将细胞或其碎片通透化以获得通透化细胞或细胞碎片，和/或将细胞或其碎片纯化以获得(如部分)纯化的细胞和/或细胞碎片和/或无细胞(通过絮凝作用)提取物，和/或将细胞或无细胞提取物固定化以获得固定化细胞和/或固定化细胞碎片和/或固定化无细胞提取物。固定化可按常规方法进行；如在丙烯酸(固定化)珠如EupergitR存在下或在离子交换树脂如Relite DianionR存在下按本文实施例中描述的方法进行；或按以下描述的本发明另一方面的方法进行。
微生物细胞可以以如经过缓冲的细胞水悬液的形式使用，将从发酵液中分离的细胞重新悬浮于水或缓冲液中即可得到该悬液，或如果是无细胞提取物，可使用无细胞提取物水溶液。悬液或溶液的pH值应大约为中性，例如pH值6.5-8.5，如7.0或7.0左右比较合适。
本发明优选的具有酯酶活性和DAO活性的混合物应例如基本上没有例如天然过氧化氢酶活性，例如可将具有DAO、酯酶和过氧化氢酶活性的细胞水性混合物在碱性介质(例如pH值9-11.5，如10-11)中处理，例如加入苛性钠溶液，即可得到基本没有天然过氧化氢酶活性的混合物。
对具有酯酶活性和DAO活性的混合物或具有酯酶活性和GAC活性的混合物用PMSF进行处理，例如在加入适当浓度范围(例如0.5％-2.5％，如1％-10％)的PMSF溶液后在适当的温度下(如室温)保温适当的时间(例如几小时，如1-5小时，如2.5-4小时或更长时间)，用适当溶剂(例如醇，如(C1-C4)的链烷醇如乙醇制成PMSF溶液。每100升细胞悬液中加入总量例如1000毫升的PMSF溶液(例如以上所述之浓度范围的PMSF溶液)，实际上可能足以完全且不可逆地去除不需要的酯酶活性，并例如基本上不降低起始混合物中存在的DAO或GAC活性。在相似的反应条件下，比较在从头孢菌素C制备Gl-7-ACA或7-ACA的反应中使用经PMSF处理的具有DAO或GAC活性的混合物和使用未经PMSF处理的具有DAO或GAC活性的混合物所得到的脱乙酰化产物的量，即可测定酯酶活性的去除。
可得到DAO或GAC活性很高的混合物，例如基本上与用PMSF处理前相同，而同时酯酶活性例如基本上完全去除。可根据本发明得到的混合物可用于如从头孢菌素C生产7-ACA。在相同反应条件下，使用经PMSF处理的DAO和/或GAC活性与使用未经PMSF处理的DAO和/或GAC活性相比较，得到的7-ACA的产率和纯度得到提高。因此，例如根据本发明的酯酶活性去除作用可导致减少，例如基本上不产生，在DAO和/或GAC反应中由于酯酶活性而产生的3位脱乙酰化副产品。根据本发明的方法得到的Gl-7-ACA或7-ACA中，不需要的3位脱酰基副产品的量可例如基本上与用作起始材料的头孢菌素C中相同(典型情况是起始活性为3％时，不超过1％，而不使用PMSF时，可升高至6％)。
另一方面本发明提供了生产戊二酰基-7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)用苯基甲磺酰氟处理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性的混合物，以得到例如基本上没有酯酶活性的混合物，且例如基本上具有与用PMSF处理前相同的D-氨基酸氧化酶活性，2)用通过步骤1)得到的混合物与头孢菌素C反应得到戊二酰基-7-氨基头孢烷酸，且如果需要，分离戊二酰基-7-氨基头孢烷酸。
另一方面，本发明提供了生产7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)用苯基甲磺酰氟处理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性的混合物，以得到例如基本上没有酯酶活性的混合物，且例如基本上具有与用苯基甲磺酰氟处理前相同的D-氨基酸氧化酶活性，2)用通过步骤1)得到的混合物与头孢菌素C反应获得戊二酰基-7-氨基头孢烷酸，3)将戊二酰基-7-氨基头孢烷酸转化成7-氨基头孢烷酸，且如果需要，分离7-氨基头孢烷酸。
可用常规方法如化学或酶催化方法或根据本发明的另一方面(如在本文描述的方法)将戊二酰基-7-氨基头孢烷酸转化成7-氨基头孢烷酸。
另一方面本发明提供了一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)用苯基甲磺酰氟处理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性的混合物，获得例如基本上没有酯酶活性的混合物，且例如基本上具有与用PMSF处理前相同的D-氨基酸氧化酶活性，2)用通过步骤1)得到的混合物与头孢菌素C反应以获得戊二酰基-7-氨基头孢烷酸，3)用苯基甲磺酰氟处理具有酯酶活性和戊二酰酰化酶活性的混合物，以获得例如基本没有酯酶活性的混合物，且例如基本上具有与用PMSF处理前相同的戊二酰酰化酶活性，4)将通过步骤2)得到的戊二酰基-7-氨基头孢烷酸与通过步骤3)得到的混合物反应，获得7-氨基头孢烷酸，且如果需要，分离7-氨基头孢烷酸。
本发明从头孢菌素C得到7-ACA的方法可按例如如下实施头孢菌素C起始物可以是例如游离或盐形式头孢菌素C的水悬液或溶液形式；例如头孢菌素C可以是含有头孢菌素C的发酵液形式，例如其中的细胞和固体已被去除(例如用常规方法去除)，或是盐式头孢菌素C如钠盐形式。可用根据本发明经PMSF预处理的具有DAO活性的混合物(例如以上所述形式)处理头孢菌素C悬液或溶液，例如在头孢菌素C水悬液或溶液中加入微生物细胞水悬液或无细胞提取物(或反之)，向悬液或溶液中导入氧，例如以氧气的形式或空气的形式，或它们的混合物的形式导入，需要时在压力下进行。
反应应在适当的pH值下进行，例如大约为中性，如pH6.5-8.0，如7.0-7.5，并在适当的温度下进行(如10℃-30℃)，例如在室温下进行。DAO活性的量，例如相对于头孢菌素C量的具有DAO活性的细胞悬液的量或具有DAO活性的无细胞提取物的量取决于使用的细胞悬液中存在的DAO活性和需要反应的头孢菌素C的量，且要求并不严格；可以很容易地测定例如短时间反应所需的量，例如可用常规方法(例如用HPLC)测定例如规定时间段内在混合物内形成的Gl-7-ACA的量来测定。
可用常规方法将得到的Gl-7-ACA分离并提纯或可原样用于下一步骤，例如用于生产7-ACA。
氧化酶活性可用如下方法测定在pH值为8.0，温度为25℃并向混合物内通入氧气流达到氧饱和时，搅拌下，将0.2-5克通透化细胞形式的具有DAO活性的混合物悬浮在20mM头孢菌素C水溶液内。可用HPLC测定Gl-7-ACA和KA-7-ACA的增加。“1U氧化酶”的活性相当于在以上条件下形成1μmol/min Gl-7-ACA和KA-7-ACA。
Gl-7-ACA的水溶液或悬液，例如根据本发明可得到的或得到的Gl-7-ACA的水溶液或悬液，可与根据本发明用PMSF处理过的具有GAC活性的混合物接触，例如在Gl-7-ACA的水悬液或溶液内加入经过缓冲的细胞悬液或无细胞提取物(或反之)。反应可在适当的pH值下进行，例如略微偏碱性，例如pH值范围7.5-8.5，如8.2左右，适宜的温度范围为10℃-30℃，例如室温。相对于Gl-7-ACA量的GAC活性的量取决于使用的细胞悬液或无细胞提取物中存在的GAC活性和需要反应的Gl-7-ACA的量且并不严格；可以容易地测定例如短时间反应所需的量，例如可通过用常规方法(例如HPLC)测定例如规定时间段内在混合物中形成的7-ACA的量来测定GAC的量。
可用如下方法测定GAC活性在pH值为8.0，温度为37℃情况下，通过搅拌将0.5-2g具有GAC活性的混合物悬浮在含有5mM磷酸盐的2％Gl-7-ACA水溶液中。通过加入100mM氢氧化钠水溶液使pH值保持在8.0，所使用的氢氧化钠的量决定于并相当于分别从Gl-7-ACA形成的戊二酸或7-ACA的量。“1U酰化酶”活性相当于在上述条件下分别形成1μmol/min戊二酸或7-ACA。
可将得到的7-ACA按常规方法分离并提纯，或如需要原样用于进一步加工，例如根据常规方法进行的7-ACA反应。
根据本发明得到的7-ACA具有高纯度，例如得到的7-ACA中3位脱乙酰基产物的含量较低，而7-ACA的产率可以很高，例如与在相同反应条件下使用未经预处理的DAO活性和/或GAC活性的方法相比具有更高产率。
已知含酶的微生物细胞可以被固定化，固定化的含酶的微生物细胞是有用的，例如由于其具有易回收和重复使用的可能。已知的生产固定化微生物细胞的方法有缺陷，例如可能得到酶稳定性差和/或酶比活性低的固定化细胞，和/或固定方法复杂。令人吃惊的是，现在发现了简单的具酶活性微生物细胞(例如具有DAO或GAC活性的微生物细胞)的固定化方法，其中固定化细胞可以以含有稳定的和高比酶活性的固态球形粒子形式得到。
另一方面，本发明提供了从具有酶活性的微生物细胞生产(如)固态球形粒子的方法，包括以下步骤1)用含伯胺或仲胺的聚合物处理微生物细胞，2)用可与水形成两相系统的有机溶剂与微生物细胞混合物接触，例如在可与水形成两相系统的溶剂中加入微生物细胞混合物，3)用双功能剂处理从步骤2)得到的混合物，并分离得到的球形粒子；例如更进一步包括在实施步骤1)或2)前用双功能试剂对微生物细胞进行预处理和/或在分离球形粒子之前向步骤3)得到的混合物中加入与水溶混的溶剂，和/或向步骤1)中得到的混合物中或向实施步骤1)前的微生物细胞中加入一种固体。
本发明的方法可用于固定具有通常被称为生物催化剂的酶活性的微生物细胞。本发明可用的微生物包括所有种类的微生物，如细菌、酵母、真菌和放线菌，例如三角酵母属，如三角酵母，土壤杆菌属(Agrobacterium)，如放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)，红酵母属(Rhodotorula)如红酵母(Rhodotorula glutinis)，侧耳属(Pleurotus)，如糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)，曲霉属，青霉属，假单胞菌属，无色杆菌属，芽孢杆菌属(Bacillus)，如蜡状芽孢杆菌，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；或例如转化子如具有酶活性的大肠杆菌转化子。酶活性包括各种酶活性，如水解酶、异构酶、裂解酶、脱羧酶、氧化还原酶活性。具有酶活性的微生物细胞的例子包括例如侧耳属(例如具有青霉素-V酰化酶活性的糙皮侧耳细胞)，土壤杆菌属(例如具有乙内酰脲酶和/或N-脱氨甲酰酶活性的放射形土壤杆菌细胞)，红酵母属(例如具有酯酶和/或氧化酶活性的红酵母细胞)，三角酵母属，(例如具有DAO活性的三角酵母细胞)，裂殖酵母属(如具有GAC活性的粟酒裂殖酵母细胞)，及转化子细胞(如具有GAC和/或酯酶活性的大肠杆菌转化子)。
本发明的方法对生产可用于从头孢菌素C开始生产7-ACA或HACA的固定化微生物细胞尤其有益。如生产存在酯酶(和/或脱乙酰化酶)活性并具有DAO活性的微生物细胞和/或存在酯酯(和/或脱乙酰化酶)活性并具有GAC活性的微生物细胞。
本发明的方法可按如下步骤实施可以用例如常规方法从发酵液中获得具有酶活性的微生物细胞。微生物细胞包括任何形式的细胞，例如部分纯化或未纯化细胞，和/或通透化或未通透化细胞，和/或例如部分破坏的或完整的细胞。可从发酵液中分离微生物细胞，并原样使用，例如在对发酵液进行离心以后，以湿料的形式使用，或者例如按常规方法，在从发酵液中分离细胞之前或之后对细胞进行进一步处理，如将细胞匀浆以获得部分破碎的细胞和/或将细胞或碎片通透化以获得通透化细胞或碎片和/或将细胞纯化以获得(如)部分纯化的细胞和/或碎片。
在固定微生物细胞之前，可按常规方法将其中不需要的酶活性去除。举例而言，三角酵母属的过氧化氢酶活性，如三角酵母细胞内的过氧化氢酶活性可通在如pH值9-12的碱性pH下处理一段时间(例如大约15分钟或更长)而去除，如任选在例如β-疏基乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)等添加剂存在下，向单独微生物细胞混合物中或存在含伯胺或仲胺的聚合物的微生物细胞混合物中加入苛性钠溶液。
按照本发明，微生物细胞可用双功能剂进行预处理。这里使用的双功能剂应理解为具有至少两个可以与伯胺或仲胺基团进行反应的基团的化合物，包括例如戊二醛、庚二亚胺酸二甲酯、表氯醇、N，N′-羰基二咪唑、1，4-丁二醇二环氧甘油醚、马来酸酐、二环己基碳二亚胺、1，6-己二异氰酸酯，优选戊二醛。对细胞的预处理可在发酵液中进行，也可在分离出微生物细胞之后进行，优选在发酵液内进行。举例而言，可以以例如溶解的形式在微生物细胞悬液内加入双功能剂，例如可以以水溶液使用戊二醛，例如10％-30％的水溶液，并将加入戊二醛后得到的混合物搅拌一段时间，例如30分钟到数小时，如30分钟到5个小时。相对于细胞量的双功能剂的量要求并不严格；例如每100克干细胞重，可方便地使用0.1克-100克(例如使用5克到50克)双功能剂；例如如果使用戊二醛作为双功能剂，则可使用0.5克-200克，如使用1克-100克25％的水溶液。可用例如常规方法分离经过双功能剂预处理的细胞，如通过微滤和/或离心方法进行浓缩并低温贮存，例如以冰冻状态保存。将来使用时，冰冻细胞可用泉水冲使其解冻，且如果需要，可按例如常规方法如微过滤进行浓缩。
微生物细胞(例如按以上描述进行了预处理的微生物细胞)，可以以以例如缓冲的细胞水悬液的形式使用，例如可在pH值6.0-10.0，如8.0或8.0左右，将从发酵液中分离并经过任意进一步处理的细胞重新悬浮于水中，且如果需要，可按常规，向悬液中加入例如常规量的添加剂，例如加入β-疏基乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)。向获得的悬液中加入含伯胺或仲胺的聚合物，包括例如聚乙烯亚胺和聚乙酰胺，优选水溶性的，例如分子量60万-100万的聚乙烯亚胺的如10％-50％水溶液。含伯胺和/或仲胺的聚合物有商品供应或可按常规方法生产。相对于干细胞量的含伯胺和/或仲胺的聚合物的量并无严格要求，包括每100克干重微生物细胞使用例如1克到100克，如5克到70克，如10克到50克。
将细胞/聚合物混合物与可与水形成两相系统的有机溶剂接触，例如向可与水形成两相系统的有机溶剂中导入细胞/聚合物混合物。适宜的有机溶剂包括例如磷酸三烷基酯，如磷酸三丁酯如磷酸三正丁酯，链烷烃如正己烷、正庚烷，芳烃如甲苯，天然或合成油如大豆油、硅氧烷油、柴油，芳族或脂族(例如(C3-C8)烷基如(C4-C6)烷基)单或双羧酸烷基酯，例如(C1-C8)烷基，如(C1-C4)烷基酯，包括戊二酸、琥珀酸、己二酸的二甲基酯或二乙基酯、苯甲酸或苯二甲酸的乙酯、丁酯、二丁酯、二异丁酯，和茴香醇，优选磷酸三烷基酯。有机溶剂的量应使微生物细胞悬液可分散于其中，例如用薄板将微生物细胞搅拌到溶剂中，每克细胞干重可使用例如1ml到100ml，如3ml到50ml溶剂。
将含有细胞、聚合物和有机溶剂的混合液搅拌一段时间，例如直到得到均质悬液，并用双功能剂包括例如戊二醛、表氯醇、N，N′-羰基二咪唑、1，4-丁二醇-二环氧甘油醚、马来酸酐、二环己基碳二亚胺，1，6-己二异氰酸酯进行处理，优选戊二醛。如果用双功能剂对微生物细胞进行过预处理，则适于使用与预处理时所用的双功能剂相同的双功能剂。对双功能剂的量没有严格要求，每100克干重细胞可使用例如0.5克到100克双功能剂，例如使用戊二醛作为双功能剂，则适于使用例如1克到200克25％的戊二醛水溶液。在含有细胞、聚合物和有机溶剂的混合液中加入双功能剂后，交联可在例如几分钟内开始并结束，可在使用的溶剂混合液中得到微生物细胞(例如)固态球形颗粒悬液。如需要，可将得到的悬液可与水溶混的且对酶活性无害的有机溶剂接触，例如对酶活性无损伤的有机溶剂，包括例如醇、酮、聚乙二醇、甘油，优选甘油，例如可向有机溶剂中加入得到的细胞悬液或向得到的细胞悬液中加入溶剂。对水溶性有机溶剂的量无严格要求且包括足以在反应混合液中形成液-液两相的量，例如每100克干重细胞适于使用例如100克到5000克及更多溶剂，例如可使用500克到5000克水溶性有机溶剂。相分离可以在将溶剂与细胞悬液接触后立即发生。形成的(例如)固态球形细胞颗粒可存在与所得的下层水相中。上层，例如主要含有可与水形成两相系统的有机溶剂，可以很容易地分离且例如基本上完全与下层分离并可再次使用，例如用于进一步的细胞固定化。得到的球形细胞颗粒可为固态的，并可按例如常规方法与有机溶混性溶剂相分离，例如将悬液倒入底部有孔的容器中、离心、过滤。可用例如泉水冲洗将分离出的球形颗粒中的溶剂残余去除。
在交联之前，也就是说在加入双功能剂之前，例如在加入可与水形成两相的溶剂之前，可向细胞混合液中加入某种固体，包括例如氧化铝、活性碳、皂粘土。对固体的量无严格要求，适宜的量为每100克干重细胞使用5克到200克，如50克到150克固体。在悬浮于可与水形成两相的溶剂并在该混合物中加入双功能剂发生交联后，可以得到特别易于分离的具有有利的狭窄大小分布范围及优异的机械稳定性的球形细胞颗粒。
根据本发明得到的生物催化剂，例如固态球形微生物细胞颗粒，可以保存以备以后使用，例如冷藏，例如在适当的缓冲液中保存或例如以冰冻形式或以冻干的形式保存。
可根据本发明可得到的、例如这样得到的含有酶活性的微生物细胞球形颗粒是新颖的。
另一方面，本方面提供了可按下述方法得到的、例如如此得到的(例如)固态的具有酶活性的含微生物细胞的球形颗粒，所述方法包括以下步骤1)用含伯胺或仲胺的聚合物处理具有酶活性的微生物细胞，
2)用可与水形成两相系统的有机溶剂与微生物细胞混合物接触，例如在步骤1)之后，向可与水形成两相系统的有机溶剂中加入微生物细胞混混合物，3)用双功能剂处理步骤2)中得到的混合物，并分离得到的球形颗粒；例如，进一步包括在实施步骤1)或2)前用双功能剂对微生物细胞进行预处理；和/或在分离球形颗粒之前，向步骤3)得到的混合物中加入水溶混性溶剂；和/或向步骤1)得到的混合物或实施步骤1)之前的微生物中加入固体。
根据本发明的方法得到的具有酶活性的球形颗粒(例如固态球形颗粒)可用于酶促反应，例如具有DAO活性的(如)固态的(如)用PMSF进行过(预)处理的球形颗粒和具有GAC活性的(如)固态的(如)用PMSF进行过(预)处理的球形颗粒，可用于生产7-ACA和/或Gl-7-ACA和/或HACA。
另一方面，本发明提供了一种生产戊二酰基-7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)用含伯胺或仲胺的聚合物处理具有D-氨基酸氧化酶活性的微生物细胞，2)用可与水形成两相系统的有机溶剂与微生物细胞混合物接触，例如在实施步骤1)后，向可与水形成两相系统的溶剂中加入微生物细胞混混合物，3)用双功能剂处理步骤2)得到的混合物，并分离得到的球形颗粒，且如果需要，用苯基甲磺酰氟处理存在DAO活性的具有酯酶活性的混合物，例如在步骤3)之前，例如在步骤1)之前；或用苯基甲磺酰氟处理步骤3)得到的存在D-氨基酸氧化酶活性具有酯酶活性的球形颗粒，
4)用头孢菌素C与步骤3)得到的球形颗粒反应，得到戊二酰基-7-氨基头孢烷酸，且如果需要，分离戊二酰基-7-氨基头孢烷酸；例如，可进一步将步骤4)得到的戊二酰-7-氨基头孢烷酸转化为7-氨基头孢烷酸。
另一方面，本发明提供了一种生产戊二酰基-7-氨基头孢烷酸的方法，包括用头孢菌素C与步骤3)得到的球形颗粒反应，得到戊二酰基-7-氨基头孢烷酸，且如果需要，分离戊二酰基-7-氨基头孢烷酸。
可用例如常规方法将步骤4)得到的戊二酰基-7-氨基头孢烷酸转化为7-氨基头孢烷酸，例如用化学或酶促方法转化，或按本发明的另一方面的方法，例如使用根据本发明以上叙述可得到的或得到的具有GAC活性的球形颗粒进行转化。如果按照本发明的存在脱乙酰化酶活性并具有DAO酶活性和/或存在脱乙酰化酶活性并具有GAC活性的球形颗粒用于与头孢菌素C或Gl-7-ACA的反应，可得到HACA。
另一方面，本发明提供了按照本发明生产球形颗粒的方法或按照本发明生产的球形颗粒在从头孢菌素C或从戊二酰基-7-氨基头孢烷酸生产7-氨基-3-羟甲基-3-头孢烯-4-羧酸中的应用。
根据本发明生产的7-ACA或HACA可作为生产头孢菌素的中间体，例如作为生产一种头孢菌素类抗生素或其中间体的中间体，通过例如以下方法-将环系7位的氨基酰化-将环系3位的乙酰氧甲基进一步反应-将环系4位的羧基酯化-成盐和/或溶剂化，例如按以上所述进行反应。
另一方面，本发明提供了一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)用含有伯胺或仲胺的聚合物处理具有戊二酰酰化酶活性的微生物细胞，
2)用可与水形成两相系统的有机溶剂与微生物细胞混合物接触，3)用双功能剂处理步骤2)得到的混合物，并分离得到的球形颗粒，4)如果需要，用苯基甲磺酰氟处理存在戊二酰酰化酶活性又具有酯酶活性的混合物，例如在步骤3)之前，例如在步骤1)之前进行处理；或如果需要，用苯基甲磺酰氟处理步骤3)得到的存在戊二酰酰化酶活性又有酯酶活性的球形颗粒，5)将戊二酰基-7-氨基头孢烷酸与步骤3)或步骤4)得到的球形颗粒反应，获得7-氨基头孢烷酸，且如果需要，分离得到的7-氨基头孢烷酸。
另一方面，本发明提供了一种生产头孢菌素的方法，例如生产一种头孢菌素类抗生素或其中间体，其中7-氨基头孢烷酸或7-氨基-3-羟甲基-3-头孢烯-4-羧酸(例如根据本发明生产的7-氨基头孢烷酸)被用作中间体。
本文中“基本”的意思是例如根据情况高于初始值的95％，例如96％，97％，或初始值的低于5％，例如4％，3％。
以下实施例中温度均为摄氏度，以下为所使用的缩略语7-ACA7-氨基头孢烷酸Ceph C头孢菌素CDAOD-氨基酸氧化酶GAC戊二酰酰化酶GDA戊二醛Gl-7-ACA戊二酰基-7-氨基头孢烷酸KA-7-ACAα-酮己二酰氨基头孢烷酸PEI聚乙烯亚胺PMSF苯基甲磺酰氟TBP磷酸三正丁酯“1U氧化酶”活性相当于在25℃，pH值为8的情况下，在氧饱和的20mM头孢菌素C水溶液中形成1μmol/min Gl-7-ACA和KA-7-ACA。
“1U酰化酶”活性相当于在37℃，pH值为8的情况下，在2％的Gl-7-ACA水溶液中形成1μmol/min戊二酸或7-ACA。实施例1获得基本去除酯酶活性的具有DAO活性的混合物的通用程序从具有酯酶活性和DAO活性的水性发酵液中，可按常规方法(参见例如Kublicek-Pranz，E.M.等，Can.J.Microbiol.，1985，31，pp624-628)收获细胞沉淀，将得到的10克细胞沉淀重新悬浮于50ml水中，并在室温下，在pH值为11的情况下用苛性钠溶液处理大约90分钟以去除过氧化氢酶活性。加入磷酸将混合物的pH值调节至大约为7。
向得到的混合物中加入每毫升乙醇中含10毫克PMSF的乙醇溶液500μl，在室温下保温得到的混合物约3小时。得到的细胞悬液可原样用于需要DAO活性的反应。细胞沉淀的DAO活性530U氧化酶用苛性钠处理后的DAO活性490U氧化酶用PMSF处理后的DAO活性450U氧化酶(等于用PMSF处理前活性的92％)。实施例2将按实施例1所述得到的经PMSF处理的具有DAO活性的细胞悬液加入1000ml水中含10克头孢菌素C的溶液中，将获得的溶液的pH值调节至7.5。在室温并向混合液中导入氧气的情况下，将获得的混合物搅拌大约180分钟。Gl-7-ACA产率91％起始头孢菌素C溶液中3位脱乙酰化产物的总量相当于头孢菌素C的3％得到的反应液中3位脱乙酰化产物的总量相当于起始头孢菌素C的3％。
重复实施例2，但使用未经PMSF处理的DAO活性Gl-7-ACA产率88％起始头孢菌素C溶液中3位脱乙酰化产物的总量相当于头孢菌素C的3％得到的反应溶液中3位脱乙酰化产物的总量相当于起始头孢菌素C的6％。实施例3在用PMSF处理前，将按实施例1所述获得的细胞悬液匀浆(匀浆化细胞中DAO活性385U氧化酶)并按实施例1所述用PMSF处理得到的匀浆细胞(匀浆并用PMSF处理的细胞内DAO活性372U氧化酶，相当于用PMSF处理前活性的96％)。按实施例2所述将得到的细胞悬液与头孢菌素C反应。Gl-7-ACA产率93％起始头孢菌素C溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于头孢菌素C的3％获得的反应液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始头孢菌素C的3％。
重复实施例3，但使用未经PMSF处理的DAO活性Gl-7-ACA产率89％起始头孢菌素C溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于头孢菌素C的3％获得的反应液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始头孢菌素的7％。实施例4在用苛性钠处理之前，将按实施例1所述得到的10克细胞沉淀悬浮于50ml水中，向获得的悬液内加入2克聚乙烯亚胺(分子量600000-1000000)，在室温及pH值为11(通过加入苛性钠溶液进行调节)的情况下，将获得的混合液保温90分钟。向获得的混合液中加入磷酸，将pH值调节到8.5，将得到的悬液与50ml甲苯搅拌。得到了溶剂中有细微的滴状细胞颗粒的乳状液，向其中加入8ml 25％的GDA溶液。细微的滴状细胞颗粒固化形成固态球形颗粒。分离固态球形颗粒并用泉水冲洗。
球形颗粒中DAO活性290U氧化酶将获得的固态球形颗粒悬浮于pH7.0的50ml 20mM磷酸缓冲液中，并与500μl类似于实施例1中所述之PMSF溶液混合，将获得的混合液保温180分钟。经PMSF处理的固态球形颗粒的DAO活性305U氧化酶。
将获得的经PMSF处理的固态球形颗粒用于与实施例2所述类似的头孢菌素C的反应。Gl-7-ACA产率92％起始头孢菌素C溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于头孢菌素C的3％获得的反应液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始头孢菌素C的3％。
重复实施例4，但使用未经PMSF处理的固态球形颗粒。Gl-7-ACA产率89％起始头孢菌素C溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于头孢菌素C的3％获得的反应液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始头孢菌素C的7％。实施例5从发酵液中分离出10克重组大肠杆菌株(例如CCM4229，GAC活性720U酰化酶)湿细胞沉淀并冲洗，在50ml pH7.0的50mM的磷酸缓冲液中将湿细胞沉淀重新悬浮。向获得的悬液中加入含10毫克PMSF/毫升的乙醇溶液0.5ml，在室温下搅拌所获得的混合物约3小时。
GAC活性708U酰化酶(相当于用PMSF处理前的98％)。
将10克Gl-7-ACA溶于1000ml水中并将pH值调节为8.2。向其中加入按以上所述得到的经PMSF处理的大肠杆菌悬液，在保持pH值大约为8.0-8.2的情况下，在12℃下将获得的混合液搅拌约180分钟。7-ACA产率93％起始Gl-7-ACA溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于Gl-7-ACA的3％获得的反应液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始Gl-7-ACA的3％。
重复实施例5，但使用未经PMSF处理的GAC活性。7-ACA产率90％起始Gl-7-ACA溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于Gl-7-ACA的3％获得的反应液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始Gl-7-ACA的7％。实施例6将10克洗过的重组大肠杆菌细胞株如CCM4229湿细胞沉淀(GAC活性720U酰化酶)，悬浮于50ml pH7.0的50mM磷酸缓冲液，并在700巴压力下匀浆。将匀浆细胞(GAC活性752U酰化酶)与实施例5中所述之PMSF乙醇溶液混合。PMSF处理过的细胞中GAC活性768U酰化酶。
将获得的悬液加入Gl-7-ACA溶液中，并按实施例5所述进行反应。7-ACA产率89％起始Gl-7-ACA溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于Gl-7-ACA的3％获得的反应液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始Gl-7-ACA的3％。
重复实施例6，但使用未经PMSF处理的GAC活性。Gl-7-ACA产率83％起始Gl-7-ACA溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于Gl-7-ACA的3％获得的反应液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始Gl-7-ACA的6％。实施例7将从10克洗过的重组大肠杆菌细胞株如CCM 4229湿细胞沉淀(GAC活性7350U酰化酶)得到的匀浆细胞悬浮于50ml pH7.0的50mM磷酸缓冲液中，并与絮凝剂(1ml SediflocRCL 900-18/40)混合。向获得的混合液中加入乙酸将pH值调节为5.2，在约40℃并搅拌的情况下将得到的混合物保温约1小时，在10℃下再搅拌1小时。通过离心净化获得的混合液，将含有GAC活性的无细胞上层(GAC活性6150U酰化酶)的pH值调节到7.5，将其与PMSF溶液混合并进行与实施例5类似的保温。经过PMSF处理的无细胞提取物的GAC活性6220U酰化酶。将得到的混合液与10克丙烯酸(固定剂)珠(EupergitRC)混合，用50ml 1mol硫酸钠水溶液处理，在室温及震荡的情况下保温64小时，将获得的荷酶载体材料与固定溶液分离，并作为催化剂用于与实施例5所述类似的Gl-7-ACA溶液的反应。7-ACA产率90％起始Gl-7-ACA溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于Gl-7-ACA的3％获得的反应溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始Gl-7-ACA的3％。
重复实施例7但使用未经PMSF处理的固定化的GAC活性。7-ACA产率83％起始Gl-7-ACA溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于Gl-7-ACA的3％获得的反应液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始Gl-7-ACA的6％。实施例8按与实施例7所述类似的方法固定GAC活性，但不在固定化之后用PMSF处理，而在固定化过程中向含有具有GAC活性的无细胞上清、Eupergit和硫酸钠的混合液中加入1ml与实施例5所述类似的PMSF溶液。
从固定化溶液中分离获得的经PMSF处理的荷酶载体材料，并将其作为催化剂用于与实施例5所述类似的Gl-7-ACA溶液的反应。7-ACA及脱乙酰化产物的产率与实施例7基本相同。实施例9按与实施例7所述类似的方法生产含GAC的上清，但不用PMSF处理(GAC活性5830U酰化酶)。将得到的溶液与40克离子交换树脂混合，将获得的混合物的pH值调节为7.5并在室温及震荡的情况下保温大约300分钟。分离并冲洗获得的离子交换树脂(GAC活性1865U酰化酶)。
将获得的离子交换树脂悬浮于200ml 50mM的磷酸缓冲液中，加入2ml实施例5中使用的PMSF溶液，将得到的混合液在搅拌的情况下保温约180分钟。经PMSF处理的离子交换树脂的GAC活性1810U酰化酶，相当于用PMSF处理前的催化剂中GAC活性的97％。
将获得的经PMSF处理的荷酶离子交换树脂作为催化剂用于与实施例5类似的Gl-7-ACA溶液的反应。起始Gl-7-ACA溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于Gl-7-ACA的3％获得的反应溶液中3位脱乙酰化产物的量相当于起始Gl-7-ACA的3％。实施例10a、预处理在室温、pH值7.5下，于大约1小时内将21g 25％的GDA水溶液搅拌入2.7公斤发酵液中，对其中的三角酵母细胞如ATCC 58536(535克湿重，DAO活性25970U氧化酶)进行预处理。离心获得的细胞悬液收获细胞并以冷冻状态贮存。
通过微过滤用泉水将冰冻细胞解冻并冲洗，并将体积浓缩到大约735ml，浓缩细胞块中的DAO活性26350U。b、聚合物处理将按步骤a得到的735ml细胞(100克细胞干重)与β-疏基乙醇(5mM)、EDTA(2mM)和40克50％的PEI水溶液(分子量60万-100万)悬浮于水中(总体积大约为800ml)，并在室温下缓慢搅拌约90分钟，在此期间通过加入苛性钠溶液使pH值保持为11。向获得的混合物中加入磷酸将pH值调节到9。DAO活性24360U(相当于按实施例10a所述获得的经预处理的DAO活性的94％)。c、交联在室温下，边搅拌边将步骤b中获得的细胞/聚合物混合物加入到位于搅拌容器内的3000ml TBP中。大约30分钟内，可得到均匀地分散于TBP中的细胞/聚合物小滴，向其中加入40克25％GDA水溶液。交联立即开始，并于数分钟后结束。可得到固态球形颗粒形态的细胞。在15℃到20℃下向获得的混合物中加入2000g甘油，完成TBP相和水相的分离。将主要含有甘油和固态球形细胞颗粒的下层与主要含有TBP的上层分离。获得的上层(2900ml)可在例如另一次交联中再次使用。大约90分钟后，将下层内的固态球形颗粒分离并用泉水冲洗以去除残余TBP和甘油。得到580克湿重具有氧化酶活性的固态球形颗粒，相当于121克干重。固态球形颗粒中DAO比活性为32U/克湿重(153U/克干重)，也就是说，总的DAO活性为18560U(相当于按实施例10a所述获得的经预处理的DAO活性的71％)。实施例11将实施例10c中得到的580克固态球形颗粒(湿重)悬浮于2000ml泉水中，并在室温下搅拌。将20mg PMSF溶于20ml无水乙醇中，并将获得的溶液于大约2分钟内加入氧化酶悬液中。将混合液保温约3小时，分离形成的固态球形颗粒，并用乙醇水溶液(1000ml，10％)和泉水冲洗。
得到563g固态球形颗粒(湿重，相当于118克干重)。经PMSF处理的固态球形颗粒的DAO比活性为31U/克湿重(148U/克干重)，也就是说，总的DAO活性为17450U(相当于按实施例10a获得的经过预处理的DAO活性的67％，及用PMSF处理前活性的94％)。获得的固态球形颗粒中的酯酶活性已基本去除。实施例12加入磷酸将按实施例10a和b制得的细胞/聚合物混合物的pH调到9.0，并加入80克氧化铝。按实施例10c所述进行与该混合物的交联。得到630克固态球形颗粒(湿重，相当于193克干重)。该固态球形颗粒中的DAO比活性为26U/克湿重(85U/克干重)，即DAO总活性为16440U(相当于如实施例10a中所得经预处理的DAO活性的63％)。获得了240-500微米的狭窄大小分布范围。实施例13按与实施例10所述类似的方法进行，但不加甘油。在交联后，将悬液搅拌约60分钟。让获得的悬液穿过底部有孔的容器，从而将获得的固态球形颗粒从TBP悬液中分离，孔的大小小于获得的固态球形颗粒的大小。获得2680ml TBP，用泉水冲洗去除获得的固态球形颗粒中的残余TBP。
得到610克固态球形颗粒(湿重，相当于126克干重)，固态球形颗粒的DAO比活性为36U/克湿重(174U/克干重)，也就是说，总的DAO活性为21960U(相当于按实施例10a所述获得的经过预处理的DAO活性的85％)。实施例14将按实施例10和11所述类似方法获得的经PMSF处理的固态球形颗粒(81克湿重，DAO活性2500U)与1升pH值为7.2的75mM的Ceph C溶液混合，在5巴压力下向获得的混合液内导入空气约80分钟。将溶液与固态球形颗粒分离，用HPLC进行分析。在分离出的溶液中可测出0.6mM Ceph C，70.7mM Gl-7-ACA和3mM KA-7-ACA。
将实施例14重复142次，每次使用新鲜的Ceph C溶液和实施例14中所述的经PMSF处理的同一固态球形颗粒。
第142次反应中，在与Ceph C接触约160分钟后，将溶液与固态球形颗粒分离并用HPLC分析。在分离的溶液中可测得0.5mM Ceph C，69.8mM Gl-ACA和0.4mM KA-7-ACA。
反应142次后，固态球形颗粒已使用了308小时，分离出93克固态球形颗粒(湿重，相当于24克干重)。
获得的固态球形颗粒的DAO比活性为12U/克湿重，相当于47U/克干重，也就是说，总的DAO活性为1120U(初始活性的45％)。实施例15分别用3.3克25％的GDA水溶液按与实施例10a所述类似的方法对具有DAO活性的粟酒裂殖酵母细胞，例如ATCC 38399和ATCC38436(湿重分别为82克和90克)进行预处理。收获细胞并保存于冰冻状态。解冻后，将混合物用泉水冲洗并浓缩，从例如ATCC 38399获得164ml中的20.4克干物质，从例如ATCC 38436获得180ml中的24.1克干物质。
按实施例10b所述方法分别用2.8克50％PEI水溶液处理7克细胞干重的例如ATCC 38399和ATCC 38436。
在230ml TBP中加入3.5克25％GDA水溶液和400克甘油，按与实施例10c所述类似的方法，分别在得到的悬液中进行交联。通过滤网用泉水冲洗获得的固态球形颗粒以去除甘油和TBP残余物。
从例如ATCC 38436得到59.5克湿重的具有DAO活性的固态球形颗粒(14.0克干重)，从例如ATCC 38399得到55.6克湿重的具有DAO活性的固态球形颗粒(16.1克干重)。获得的固态球形颗粒与按实施例10c得到的固态球形颗粒表现出相似的DAO反应特性和相似的稳定性特征。
粟酒裂殖酵母适于克隆和表达不同的酶，可以按与本实施例所述类似的简单方法获得其他生物催化剂，如具有其他酶活性的固态球形颗粒。实施例16按与实施例10a中所述类似的方法，用3.3克25％的GDA溶液对糙皮侧耳细胞(90克湿重，18970U青霉素V酰化酶)进行预处理。从生成的细胞悬液中收获细胞并冷冻保存。在解冻后，用泉中冲洗并通过微过滤浓缩。
用7.4克50％PEI水溶液处理得到的18.6克细胞(干重)。在560mlTBP中加入7.4克25％GDA溶液和370克甘油，按与实施例10c类似的方法进行细胞交联。通过滤网用泉水冲洗获得的固态球形颗粒以去除甘油和TBP残余物。
得到223克含青霉素V酰化酶的固态球形颗粒(湿重，相当于29.4克干重)。
青霉素V酰化酶的比活性为50.4U/克湿重，也就是说，总的青霉素V酰化酶是11240U(相当于初始活性的39％)。
1U青霉素V酰化酶相当于在pH7.5及28℃下，在K-青霉素-V磷酸缓冲的溶液液中每分钟形成1μmol 6-氨基青霉烷酸。实施例17按与实施例10a和10b所述类似的方法制备三角酵母细胞，例如ATCC 58536(54克湿重，DAO活性2600U氧化酶)。
按与实施例10c所述类似的方法进行交联，但是在搅拌的情况下向300ml戊二酰二甲酯或己二酸二甲酯(而不是100克干重细胞用3000ml TBP)内加入含有三角酵母细胞的细胞/聚合物混合物。在15℃-20℃下，向每种混合液中分别加入5克25％GDA溶液及400克甘油，按与实施例10c所述类似方法进行交联。
分别得到93.4克和86.9克具有DAO活性的固态球形颗粒(湿重，分别相当于20.6克和20.2克干重)。
DAO比活性分别为14.8U/克湿重或12.5U/克湿重，也就是说，总的活性分别为1382U(初始活性的53％)或1086U(初始活性的42％)。
权利要求
1.一种在具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶和/或戊二酰酰化酶活性的混合物中，在保存D-氨基酸氧化酶活性或戊二酰酰化酶活性的情况下，降低酯酶活性的方法，包括用苯基甲磺酰氟处理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性和/或戊二酰酰化酶活性的混合物。
2.一种生产戊二酰基-7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)用苯基甲磺酰氟处理具有酯酶活性和D-氨基酸氧化酶活性的混合物，2)用头孢菌素C与步骤1)得到的混合物反应以得到戊二酰基-7-氨基头孢烷酸；且如果需要，分离获得的戊二酰基-7-氨基头孢烷酸。
3.一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)用苯基甲磺酰氟处理具有酯酶活性和戊二酰酰化酶活性的混合物，2)用戊二酰基-7-氨基头孢烷酸与步骤1)得到的混合物反应，以获得7-氨基头孢烷酸；且如果需要，分离步骤2)得到的7-氨基头孢烷酸。
4.一种从具有酶活性的微生物细胞生产球形颗粒的方法，包括以下步骤1)用含伯胺或仲胺的聚合物处理微生物细胞，2)用可与水形成两相系统的有机溶剂与微生物细胞混合物接触，3)用双功能剂处理步骤2)得到的混合物；并分离获得的球形颗粒。
5.可按包含以下步骤的方法获得的含有具有酶活性的微生物细胞的球形颗粒1)用含伯胺或仲胺的聚合物处理具有酶活性的微生物细胞，2)用可与水形成两相系统的有机溶剂与微生物细胞混合物接触，3)用双功能剂处理步骤2)获得的混合物；并分离获得的球形颗粒。
6.用包含要求5中定义的步骤的方法获得的球形颗粒。
7.一种生产戊二酰基-7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)用含伯胺或仲胺的聚合物处理具有D-氨基酸氧化酶活性的微生物细胞，2)用可与水形成两相系统的有机溶剂与微生物细胞混合物接触，3)用双功能剂处理步骤2)得到的混合物，并分离获得的球形颗粒，且如果需要，用苯基甲磺酰氟处理存在D-氨基酸氧化酶活性并具有酯酶活性的混合物，或用苯基甲磺酰氟处理存在D-氨基酸氧化酶并具有酯酶活性的从步骤3)获得的球形颗粒，3)用头孢菌素C与从步骤3)获得的球形颗粒反应以获得戊二酰基-7-氨基头孢烷酸，且如果需要，分离戊二酰基-7-氨基头孢烷酸。
8.一种生产戊二酰基-7-氨基头孢烷酸的方法，包括用头孢菌素C与可根据权利要求7定义的步骤3)获得的球形颗粒反应，获得戊二酰基-7-氨基头孢烷酸，且如果需要，分离戊二酰基-7-氨基头孢烷酸。
9.一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，其中根据权利要求2的步骤2)和权利要求7的步骤4)得到的戊二酰基-7-氨基头孢烷酸被转化成7-氨基头孢烷酸。
10.权利要求4的方法或权利要求5的球形颗粒在从头孢菌素C或戊二酰基-7-氨基头孢烷酸生产7-氨基-3-羟甲基-3-头孢烯-4羧酸中的应用。
11.一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，包括以下步骤1)用含伯胺或仲胺的聚合物处理具有戊二酰酰化酶活性的微生物细胞，2)用可与水形成两相系统的有机溶剂与微生物细胞混合液接触，3)用双功能剂处理从步骤2)得到的混合物；并分离获得的球形颗粒，4)如果需要，用苯基甲磺酰氟处理存在戊二酰酰化酶并具有脂酶活性的混合物或用苯基甲磺酰氟处理从步骤3)获得的存在戊二酰酰化酶活性并具有酯酶活性的球形颗粒，5)用戊二酰基-7-氨基头孢烷酸与从步骤3)或步骤4)获得的球形颗粒反应以获得7-氨基头孢烷酸，且如果需要，分离获得的7-氨基头孢烷酸。
12.一种生产头孢菌素的方法，其中根据权利要求3-9中任一项生产的7-氨基头孢烷酸或7-氨基-3-羟甲基-3-头孢烯-4羧酸被用作中间体。
13.根据权利要求1-4、7-9或11-12中任一项的方法生产的产品。
全文摘要
一种在具有酯酶活性和D－氨基酸氧化酶活性和/或具有酯酶活性和戊二酰酰化酶活性的混合物中,通过用苯基甲磺酰氟处理,在保存D－氨基酸氧化酶活性或戊二酰酰化酶活性的同时降低酯酶活性的方法;用含伯胺或仲胺的聚合物、可与水形成两相系统的有机溶剂和双功能剂处理具有酶活性的微生物细胞可获得球形颗粒形态的固定化生物催化剂;所述方法和生物催化剂在7－氨基头孢烷酸、7－氨基－3－羟甲基－3－头孢烯－4－羧酸及头孢菌素类抗生素的生产中的应用。
文档编号C12N11/04GK1269830SQ98808968
公开日2000年10月11日 申请日期1998年9月8日 优先权日1997年9月9日
发明者A·雷克特, W·里索斯特, F·克诺斯德, N·帕尔马 申请人:生物化学有限公司