专利名称：：一种微量肝组织体外孵育进行cyp450酶活性检测的方法
技术领域：
：本发明属生物化工
技术领域：
，涉及一种酶的活性检测方法，特別是涉及一种微量肝组织体外孵育进行CYP450酶活性检测的方法
背景技术：
：细胞色素P450是一类参与内源性和外源性化合物代谢的酶，该酶主要存在于生物体的内质网内，属于混合功能氧化酶系统中的一种，由CYP450(细胞色素P450酶)酶系作用的药物生物转化是药物代谢的重要环节，同时许多药物又对CYP450酶系活性有抑制或诱导作用。药酶CYP450某一亚型受到诱导或抑制时均可诱发药物相互作用，例如同时服用西米替丁和特非那丁，由于特非那丁主要由细胞色素CYP3A(CYP450亚酶)代谢，而西米替丁对CYP3A有强抑制作用，合并用药会引起特非那丁血药浓度升高而致心脏毒性，从而诱发尖端扭转型室速。药物如果对细胞色素P450(CYP450)酶有抑制作用，则会引起药物相互作用，而药物相互作用就可能引起严重的不良反应。因此在药物的研发过程中进行临床前(体外)和临床(体内)相互作用研究非常重要，对于药物的临床应用有重要意义。肝脏是生物体对药物代谢的主要脏器，研究药物的肝脏代谢对于药物体内代谢途经研究有着重要意义，目前细胞色素P450与药物代谢之间关系研究日趋增多，利用肝微粒体作为体外孵育体系对细胞色素P450酶系进行研究已经是公认的成熟的实验平台，但是常规肝微粒体测定法需要的肝脏组识量大，达5g，而且手续很繁杂，超速离心后再要进行高速离心。超速离心不仅设备昂贵(约需4-7万美金)，而且离心时间长(70min)。
发明内容本发明的目的是建立一种可靠、简便的微量肝组织体外孵育进行CYP450酶活性检测的方法，用液相色谱串联质潜法检测探针底物和相应代谢产物浓度，以它们的代谢比，求出P450酶的活性，从而预测与细胞色素P450酶相关的代谢性药物相互作用。为达到上述目的，采用的技术方案是，临床用肝微量穿刺法取0.10.2g微量肝组织，或动物试验处死小鼠取出肝脏，建立微量肝组织体外孵育体系，再用液相色谱串联质潜法(简称LC-MS/MS)检测探针底物和相应代谢产物浓度，以它们的代谢比，求CYP450酶的活性。具体步骤是1.溶液配制l.l匀浆液KC16g、三羟甲基氨基甲垸(简称Tris)3.0g加入至500ml蒸馏水中；1.2孵育液:500ml蒸馏水中加入K2HP(Xllg，再用HC1调节pH至7.4;1.3沉淀剂三氯乙酸(简称TCA)加蒸馏水制成重量体积比10%(mg/ml)的溶液备用；1.4探针底物和代谢产物储备液分别称取适量探针底物A和相应的代谢产物B，用甲醇溶解并稀释至所需浓度lmg/ml的甲醇溶液；这里所述探针底物A和相应的代谢产物B是指非那西丁(简称PN)/对乙酰氨基酚(简称ACE)、或咖啡因/副黄嘌呤(CYP1A2)、或右美沙芬/右非烷(CYP2D6)、或甲苯磺丁脲/4-羟基甲苯磺丁脲/羧基甲苯磺丁脲(CYP2C9)、或奥美拉唑/5-羟基奥美拉唑(CYP2C19)、或咪达唑仑A'-羟基咪达唑仑(CYP3A4)2.样品处理2.1临床用肝微量穿刺法取0.10.2g微量肝组织，或动物试验处死小鼠取出肝脏称重。2.2.以重量体积比1:3(mg/ml)比例加入步骤1.1所述匀浆液，制成匀浆，再在4°C以下lOOOOg离心20min得到上清液。3.孵育体系3.1配制设孵育体系终体积为250ul，在离心管中按要求加入下列各物质称12.2mgMgCl26H20溶于lml蒸馏水中，取用25u1;称6.0mgP-烟酰胺腺苷二核苷磷酸(简称P-NADP)溶于lml孵育液中，取用25"1;称22.6mg磷酸葡萄糖(简称6—G-p)溶于lml孵育液中，取用25nl;取5"16—G-p酶于100u1的孵育液中稀释，取用5p1;加入步骤1.2所述孵育液95u1;加入步骤2.2所述匀浆上清液50y1;以及加入25u1经稀释到浓度为lOOug/ml的步骤1.4所述药物探针底物A储备液的甲醇溶液，。3.2孵育将上述配制好的孵育体系，置于37'C恒温水浴中孵育30min，再在4'C以下10000g离心20min后，取离心上清液100ul，加步骤1.2所述孵育液350u1，混合均匀后取100u1，加步骤1.3配制的沉淀剂TCA溶液100u1，再混匀，取混合液用20%的甲醇稀释10倍，作为单探针药物LC-MS/MS测定进样样品，再用液相色谱串联质潜法检测探针底物和相应代谢产物浓度，以它们的代谢比，求出P450酶的活性，评价药物对肝脏P450亚酶的影响。本发明的有益效果是与常规肝微粒体测定方法相比，本发明的优点是-1.微量常规的肝微粒体提取法需要取肝脏组织5g，而本发明只需要0.l0.2g的微量肝组织就可以进行细胞色素P450酶活性的检测。在临床和动物实验中能取到的肝脏只能是很微量的，因此本发明不仅可用于动物实验，而且可用于临床微量肝组织肝药酶活性检查。2.省时简便肝微粒体孵育体系的处理过程需差速离心，即先用超速离心，再用高速离心，本发明不仅省去了设备昂贵的超速离心这一步，大大节约了检测的成本和时间，而且更接近肝组织代谢过程，更好地模拟了肝酶代谢环境。3.确立了可以评价酶代谢活性的指标代谢比。以下结合附图对本发明作进一步说明-图1为药物C灌胃剂量与药物代谢比关系图。具体实施例方式实施例1:1.溶液配制l.l匀浆液KC16gTris3.Og加入至500ml蒸馏水中1.2孵育液:500ml蒸馏水中加入K2HP04llg，再用HC1调节pH至7.4;1.3沉淀剂TCA加蒸馏水制成10X(W/V)的溶液备用。1.4探针底物和代谢产物储备液PN、ACE分别称取适量，用甲醇溶解并稀释至所需浓度110mg/ml的甲醇溶液。2.样品2.l健康昆明鼠20只，雄性，随机分成四组，每组5只称重，第一天禁食12小时后灌胃，对照组给予生理盐水，其他三组分别给予药物C(如黃连素衍生物)高中低相应剂量药物，低剂量组0.3mg/ml、中剂量组0.6mg/ml、高剂量组L2mg/ml。2.2.每天灌胃，晚上禁食，持续8天，第八天或微量肝穿刺取0.10.2g肝组织、或处死小鼠取出肝脏、称重，以1:3(mg/ml)比例加入步骤1.1所述匀浆液，制成匀浆，再在4'C以下10000g离心20min得到上清液。3.孵育体系3.1配制设孵育体系终体积为250"1，在离心管中按要求加入下列各物质称12.2mgMgCl2.6H20溶于lml蒸馏水中，取用25uI;称6.Omge-NADP溶于lml孵育液中，取用25"1;称22.6mg6—G-p溶于lml孵育液中，取用25iU;取5ul6—G-p酶于100的孵育液中稀释，取用5ul;加入步骤1.2所述孵育液95"1;加入步骤2.2所述匀浆上清液50n1;以及加入步骤1.4所述药物PN的甲醇溶液25u1，浓度为100ug/ml。3.2孵育将上述配制好的孵育体系，置于37'C恒温水浴中孵育30ndn，再在4。C以下10000g离心20min后，分别取所得匀浆上清液100u1，加步骤1.2所述孵育液350ul，混合均匀后取100ul，再加步骤1.3所述沉淀剂TCA100yl，取混匀后混合液用20%的甲醇稀释10倍，作为单探针药物LC-MS/MS法测定的进样样品备用。4.单探针药物LC-MS/MS法测定4.1标准品和质控品的配制从步骤1.4所述探针底物和代谢产物储备液中将PN、ACE用步骤1.2所述孵育液稀释成lmg/ml(稀释液)，按PN:ACE-1:1比例，与步骤1.2所述孵育液配制得各物质的标准品和质控品，浓度范围1Ug/ml—500ug/ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注S:标准品工作液；Q:质控品工作液。4.2.样品于各尖底管中分别加入步骤4.1所述各溶液50n1，再加入步骤2.2所述肝脏匀浆上清液1001以及步骤1.2所述孵育液350u1混匀，再取混合液100n1加入100y1的沉淀剂，再混匀，用20%的甲醇稀释10倍。4.3液相色谱条件分析柱CapcelPakCl8(2.0mmI.D.X100mm,5um，No:AKIA01046)，预柱；流动相0.1%的甲酸水溶液和0.1%的甲酸乙腈溶液；流速0.3ml/min;柱温室温；进样体积20ul;分析时间7.5min;保留时间PN:5.47min;ACE:4.05min。梯度洗脱程序为03分钟，水相从90%变成45%;3.03.1分钟，水相回复至90%，平衡4min。4.4质谱条件质谱条件电喷雾离子源，正离子扫描；雾化气12;碰撞气12;气帘气10;离子源电压5500;离子源温度450;MRM扫描分析，离子选择通道分别为180.0/110.0(PN)，152/110.0(ACE)。其他参数见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注Ql一级质谱;Q3三.级质潜；DP去簇电压；FP聚焦电压；EP入口电压CE碰撞能；CXP出口电压；4.5测定取步骤4.1配制的标准品、质控品和步骤4.2配制的样品各10u1进样。4.6计算步骤2.1所述样品，肝脏生化功能及CYP1A2酶活性的变化数据列于下表(每只小鼠测三次)，用外标法以峰面积计算，得代谢比。NO.PNng/mlACEng/ml比值每只平均代谢率每组平均代谢率空白组1-126490.90.341-229789.90.301-33081110.362-13091030.332-230089.40.302-3303930.313-12181250.573-23071090.363-33151300.414-12951180.404-23191240.394-32881280.445-12431740.725-22041350.665-32451650.670.330.310.450.410.680.44中剂量组1-11861650.891-21841500.821-31521460.962-11691731.022-21451521.052-31851630.883-12011510.753-21771510.853-31731710.994-11561561.004-21821290.711901802011861812042522422332482472591741981691521371531601671591221261451291041301471501670.800.760.760.860.920.780.480.520.620.520.420.500.840.760.990.770.850.540.480.860.70低剂量组1-123i譽2312322330^>123444翻52■4-31581530.970.895-11391481.065-21701110.655-31701630.960.890.90高剂量组1-12851220.431-22351190.511-32491060.430.452-11961380.702-22041660.812-31781480.830.783-11481551.053-21472011.373-31321951.481.304-12301400.614-21721620.944-31241281.030.865-11501821.215-288.61701.925-31371891.381.500.98结论由上表数据可见，药物C灌胃量增加，平均代谢率也相应增加，证明药物C是CYP1A2的诱导剂。实施例2.高中低剂量药物C给小白鼠灌胃后CYP1A2酶活性变化的确证实验1.健康昆明鼠32只，雄性，随机分成四组，每组8只，称重。2.空白对照组(生理盐水)，低剂量组0.64mg/ml、中剂量组1.6mg/ml、高剂量组4mg/ml剂量组。3.第一天禁食12小时后灌胃，对照组给予生理盐水，其他各组给予高中低相应剂量药物。4.每天灌胃，晚上禁食，持续8天，第八天处死小鼠取出肝脏。5..肝脏加非那西丁探针药进行体外孵育，以LC-MS/MS检测评价药物C对肝脏CYP1A2的影响。溶液配制和孵育方法，以及LC-MS/MS检测方法均与实施例1相同。验证了实施例1的可重复性，再次证明药物C是CYP1A2的诱导剂。权利要求1.一种微量肝组织体外孵育进行CYP450酶活性检测的方法，其特征在于临床用肝微量穿刺法取0.1～0.2g微量肝组织，或动物试验处死小鼠取出肝脏，建立微量肝组织体外孵育体系，再用液相色谱串联质潽法检测探针底物和相应代谢产物浓度，以它们的代谢比，求出P450酶的活性。2.根据权利要求1所述一种微量肝组织体外孵育进行CYP450酶活性检测的方法，其特征在于具体步骤是1)溶液配制1.l)匀浆液KC16g、Tris3.Og加入至500ml蒸馏水中；1.2)孵育液500ml蒸馏水中加入1(2朋04llg,再用HC1调节pH至7.4;1.3)沉淀剂TCA加蒸馏水制成10%(W/V)的溶液备用；1.4)探针底物和代谢产物储备液分别称取探针底物A和相应的代谢产物B适量，用甲醇溶解并稀释至所需浓度lmg/ml的甲醇溶液2)样品处理2.1)临床用肝微量穿刺法取0.10.2g微量肝组织，或动物试验处死小鼠取出肝脏称重；2.2)以1:3(W/V)比例加入步骤1.1)所述匀浆液，制成匀浆，再在4'C以下10000g离心20min得到上清液；3)孵育体系3.1)配制设孵育体系终体积为250u1，在离心管中按要求加入下列各物质称12.2mgMgCl26H20溶于lml蒸馏水中，取用25n1;称6.Omge-NADP溶于lml孵育液中，取用25u1;称22.6mg6—G-p溶于lml孵育液中，取用25nl;取5ul6—G-p酶于100u1的孵育液中稀释，取用5ul;加入步骤1.2)所述孵育液95u1;加入步骤2.2)所述匀浆上清液50u1;以及加入25u1稀释到浓度为100ug/ml的步骤1.4)所述药物探针底物A储备液的甲醇溶液；)孵育将上述步骤3.1)配制的孵育体系，置于37nC恒温水浴中孵育30min，再在4。C以下10000g离心20min后，分别取离心上清液IOOU1，加步骤1.2)所述孵育液350ul，混合均匀后取100ul，加步骤1.3)配制的沉淀剂TCA100nl，再混匀，取混合液用20%的甲醇稀释10倍；4)单探针药物LC-MS/MS法测定将上述步骤3.2)配制的孵育液作为单探针药物LC-MS/MS测定进样样品，再用液相色谱串联质潜法检测探针底物和相应代谢产物浓度，以它们的代谢比，求出P450酶的活性，预测与细胞色素P450酶相关的代谢性药物相互作用。3.根据权利要求2所述一种微量肝组织体外孵育进行CYP450酶活性检测的方法，其特征在于所述探针底物A/相应的代谢产物B是非那西丁/乙酰氨基酚、或咖啡因/副黄嘌呤、或右美沙芬/右非烷、或甲苯磺丁脲/4-羟基甲苯磺丁脲或/羧基甲苯磺丁脲、或奥美拉唑/5-羟基奥美拉唑、或咪达唑仑/l-羟基咪达唑仑。全文摘要一种微量肝组织体外孵育进行CYP450酶活性检测的方法，其特征在于临床用肝微量穿刺法取0.1～0.2g微量肝组织，或动物试验处死小鼠取出肝脏，建立微量肝组织体外孵育体系，再用单探针药物进行液相色谱串联质潽法检测探针底物和相应代谢产物浓度，以它们的代谢比，求出P450酶的活性。本发明的优点是1.微量只需要0.1～0.2g的微量肝组织就可以进行细胞色素P450酶活性的检测，不仅可用于动物实验，而且可用于临床微量肝组织肝药酶活性检查；2.省时简便省去了常规方法中需设备昂贵的超速离心，不仅大大节约了检测的成本和时间，而且更好地模拟了肝酶代谢环境；3.确立了可以评价酶代谢活性的指标代谢比。文档编号G01N30/00GK101308119SQ20081003612公开日2008年11月19日申请日期2008年4月16日优先权日2008年4月16日发明者琛余,红周,周菊珍,渊张,施孝金,李春霞,李雪宁,王书云,陈伟力申请人:上海市徐汇区中心医院