酶活性提高的木聚糖酶的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种具酶活性提高的木聚糖酶，其氨基酸序列为将序列编号2第125位的色氨酸突变成苯丙氨酸，以及将第163位的苯丙氨酸突变成色氨酸的氨基酸序列。
【专利说明】酶活性提高的木聚糖酶 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及一种木聚糖酶，特别是一种酶活性升高的木聚糖酶。 【背景技术】
[0002] 半纤维素（hemicellulose)是构成植物细胞壁的主要成分之一。当中，又以聚木 糖（xylan)为主要的组成，其数量在自然界的多糖中属排名第二。因此，现今对于聚木糖的 工业应用上可说是十分广泛且不容忽视。聚木糖是由属于五碳糖的木糖（xylose)为单位， 以β-1，4-糖苷键（glycosidic bond)所键结而成的长链多糖。自然界中的聚木糖具有复 杂且多样的结构组成，例如：会被甲基团（methyl group)或乙酰基团（acetyl group)所修 饰，甚至也会与其他糖类分子键结，形成不同支链。再者，聚木糖这类的半纤维素会与纤维 素（cellulose)以及木质素（lignin)相互作用结合组成坚韧的植物细胞壁。而生物界中 许多草食动物以及微生物，包含：细菌与真菌等，需要将植物细胞壁中的多糖聚合物分解成 可被体内吸收的单糖，以作为生存能量来源。因此，自然界中这些许多不同的微生物，包含 了在草食性瘤胃动物肠胃道中的共生微生物，通常藉由产生不同种类的多糖分解酶，像是： 纤维素酶或是木聚糖酶等进行协同作用去分解植物细胞壁，进而得到能被生物体所吸收的 单糖。
[0003] 而对于聚木糖这种异质性复杂组成的分解，是需要不同种的分解酶，像是：内切型 木聚糖酶（611(1〇-0-〇-17131^86)、外切型木糖苷酶（0-1，4-171〇81(^86)或者切除其支链 的乙酰木聚糖酯酶（acetylxylan esterase)、聚阿拉伯糖水解酶（arabinase)以及葡萄 糖醒酸苷酶（α-glucuronidase)去参与作用。其中，又以内切型木聚糖酶最为关键。内 切型木聚糖酶（EC3. 2. 1. 8)是一种糖类水解酶，可将聚木糖主链上的β-1，4-糖苷键进 行水解作用，进而分解聚木糖并释放出寡糖。而寡木糖则可进一步地被外切型木糖苷酶 (EC3. 2. 1.37)分解成单糖。
[0004] 至今，木聚糖酶在工业上的应用十分广泛，不论是在饲料、造纸、食品以及纺织业， 甚至在生物质能源上的利用。针对不同工业的应用，木聚糖酶也需要有符合其不同的适用 条件与范围。举例而言，饲料工业需要可耐酸性的酶蛋白，然而造纸工业则偏好适碱性的木 聚糖酶。因此许多研究都在致力于能找出更加符合不同工业上所需的酶蛋白，而除了酶蛋 白特性之外，其比活性也是改良工业酶蛋白的一大重点。酶蛋白本身的比活性愈高，工业制 程上所花费的成本则能降低。因此，能得到符合工业应用条件以及高比活性的工业酶蛋白， 也是目前不论是学术界或产业界都在努力的目标。
[0005] 目前在对于取得更佳酶蛋白的许多相关研究中，除了从自然界中筛选出新基因的 方向之外，就是将现有的酶蛋白加以改造。现今主要有两大改造策略：其一是将基因随机 突变，再以特定作用条件之下，筛选出更符合其工业所需条件的酶突变蛋白。此策略的优 点在于无须深入分析酶蛋白的结构或作用机制，而是直接在特定条件下去找出更好的酶蛋 白，但其缺点即是需要大量的人力以及时间去进行大量筛选，或是要有很有效率且准确的 筛选方法来配合。另一种改造策略则是藉由对于酶结构及其作用机制的研究分析，来找出 对于酶蛋白的活性或特性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行定点突变并分 析，进而得到更佳的酶突变蛋白。其优势是不需耗费许多时间与人力在大量突变与筛选的 步骤，但需要先了解此酶的蛋白结构及其作用机制，才能找出具改造潜力的特定氨基酸。
[0006] 先前提及，木聚糖酶在不同工业上被广泛地应用已久，例如：在造纸工业或饲料工 业等。而良好的工业用木聚糖酶，除了符合其不同作用条件之外，高蛋白产量以及高催化效 率也是一直在追求的目标。因此，木聚糖酶蛋白的比活性也是改良工业酶蛋白的一大重点。 酶蛋白的活性愈高就代表成本的下降以及利润的提高。因此，本发明欲藉由改造基因以改 良酶蛋白活性，相对地减少制程成本，进而有效提升木聚糖酶在工业上应用的产业价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于改造现有木聚糖酶，利用结构分析及定点突变技术，有效提升 木聚糖酶的作用活性，藉以增加木聚糖酶的工业应用价值。
[0008] 为达上述目的，本发明的优选实施方式之一为提供一种木聚糖酶，其氨基酸序列 系为将序列编号2第125位的色氨酸突变成苯丙氨酸，以及将第163位置苯丙氨酸突变成 色氨酸的氨基酸序列。
[0009] 为达上述目的，本发明的优选实施方式之一为提供一种木聚糖酶，其氨基酸序列 系为将序列编号2第125位的色氨酸突变成苯丙氨酸的氨基酸序列。
[0010] 为达上述目的，本发明的优选实施方式之一为提供一种木聚糖酶，其氨基酸序列 系为将序列编号2第163位的苯丙氨酸突变成色氨酸的氨基酸序列。 【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1显示木聚糖酶xyn⑶BFV的基因及氨基酸序列。
[0012] 图2显示木聚糖酶xyn⑶BFV的蛋白立体结构及其与寡糖结合的复合体结构图。
[0013] 图3显示定点突变所采用的引物序列。
[0014] 图4显示木聚糖酶xyn⑶BFV的W125F突变型的基因及氨基酸序列。
[0015] 图5显示木聚糖酶xyn⑶BFV的F163W突变型的基因及氨基酸序列。
[0016] 图6显示木聚糖酶xynCDBFV的W125F/F163W突变型的基因及氨基酸序列。
[〇〇17] 图7显示木聚糖酶xynCDBFV原始蛋白与突变型木聚糖酶的活性测试结果。 【具体实施方式】
[0018] 体现本发明特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的 是本发明能够在不同实施方式上具有各种的变化，然其皆不脱离本发明的范围，且其中的 说明及图式在本质上系当作说明之用，而非用以限制本发明。
[0019] 本发明的木聚糖酶是从瘤胃中的厌氧性真菌Neocallimastix patriciarum所分 离，并经由随机突变的定向演化法（directed evolution)以及定点突变（site-directed mutagenesis)技术而筛选出的多突变点基因，称为xynCDBFV(参考自〇1611，￥.1^，13叩，1'· Y.，and Cheng, K.J. (2001)Can J Microbiol47, 1088-1094)。如图 1所示，xynCDBFV 基因 的全长为678个碱基（DNA序列以序列编号1标示）以及225个氨基酸（氨基酸序列以序 列编号2标示）。为了增加此木聚糖酶的工业应用价值，我们藉由结构分析与定点突变，以 改良其比活性以及催化效能，进而降低工业成本。以下将详述本发明改造木聚糖酶的方法 及其所得到的改良木聚糖酶。
[0020] 首先，将xynCDBFV基因利用EcoRI与Notl构筑到pPICZ α A载体中。利用Pmel 把质粒DNA进行线性化之后，再将其DNA藉由电转步骤送入毕赤酵母内。接着将电转后的 菌液涂于含有100 μ g/ml Zeocin抗生素的YH)培养皿在30° C中培养两天。挑选菌落并 接种到5ml YPD于30° C下培养至隔天，再次接种到50ml BMGY中于30° C下同样培养至 隔天。接着，将培养基换成含有〇. 5%甲醇的20ml BMMY以诱导蛋白表达。每隔24小时取 样并补充0.5%甲醇。从中挑选出其蛋白表达量最好的菌株来进行放大表达。将菌株接种 到5ml YPD之后，再放大到500ml BMGY中，于30° C培养至隔天。接着用250ml BMMY取 代原本的BMGY，以诱导蛋白表达。培养2天之后，将菌液离心，收集上清液，再用含有25mM Tris ;pH7. 5的5L缓冲液进行两次的透析。为了得到高纯度的xyn⑶BFV酶蛋白，我们藉由 快速蛋白质液相层析仪（fast protein liquid chromatography, FPLC)利用DEAE阴离子 交换管柱分离出蛋白纯度达95%以上的xyn⑶BFV酶蛋白，并以10mg/ml浓度在25mM Tris ; 150mM NaCl ;ρΗ7· 5 条件下保存于-80。C。
[0021] 为了利用X-ray结晶学技术解出xyn⑶BFV的蛋白结构，首先藉由蒸气扩散法，在 室温下以座滴式（sitting drop method)进行养晶。利用不同的晶体筛选套组来筛选养晶 条件，并经由调整修正之后找出最佳的条件，其为2M硫酸铵以及0. 1M Tris ;pH8. 5。另外， 利用分子置换法（molecular replacement, MR)解开xynCDBFV的蛋白立体结构。此外，更 进一步地将xyn⑶BFV蛋白晶体浸泡于含有10mM木二糖或四糖的溶液中，再利用X-ray获 得衍射图谱，进而得出xynCDBFV与寡糖物质结合的复合体结构。
[0022] 图2即显示本发明利用X-ray结晶学技术解出xyn⑶BFV的蛋白立体结构及其与 寡糖结合的复合体结构图。从蛋白立体结构观察到在第125位的色氨酸（Trpl25)以及第 163位的苯丙氨酸（Phel63)位于蛋白酶活性区中且皆能与寡糖产生作用力，对于酶活性具 有一定的影响，故被选择作为进行定点突变的位置。
[0023] 为了得到特定氨基酸突变的酶蛋白，本发明利用定点突变（site-directed mutagenesis)技术，以木聚糖酶xynCDBFV基因做为模板进行聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction, PCR)步骤，当中所用的突变引物列于图3,其中W125F指的是第125位的色 氨酸突变成苯丙氨酸，而F163W指的是第163位的苯丙氨酸突变成色氨酸。接着加入Dpnl 于37° C下作用，将原始模板去除，再把质粒送入大肠杆菌感受态细胞中，利用测序以确认 成功突变基因。之后，根据前述方法，将突变成功的基因分别送入毕赤酵母中表达。
[0024] 图4至图6即显示本发明所构筑的三个突变型基因及氨基酸序列，包含W125F、 F163W及W125F/F163W。W125F意指为xynCDBFV第125位的色氨酸突变成苯丙氨酸，F163W 为第163位的苯丙氨酸突变成色氨酸，而W125F/F163W则代表同时将第125位的色氨酸突 变成苯丙氨酸及第163位的苯丙氨酸突变成色氨酸，其中W125F、F163W及W125F/F163W的 DNA序列分别以序列编号3、5、7标示，而W125F、F163W及W125F/F163W的氨基酸序列则以 序列编号4、6、8标示。
[0025] 为了验证木聚糖酶xynCDBFV原始蛋白与突变型木聚糖酶的差异，本发明进一步 测量其酶活性。木聚糖酶的活性测试方式是将1%β_聚木糖与适当浓度的酶蛋白（缓冲液 为0. 05Μ醋酸钠；ρΗ5. 3)以9 :1比例混合一起，在55° C之下作用10分钟。接着加入1倍 体积的1%DNS于100° C沸水中作用10分钟，以停止反应且呈色。测吸光值之前，分别加 入2. 5倍体积的水至呈色管中混合均匀。在0D540波长测定吸光值，再换算成酶活性单位 (unit)。其中酶活性的标准曲线是由木糖标准溶液0-0. 6mg/ml之间制定。而lunit的定 义为每分钟释放1 μ mole产物所需的酶蛋白量。
[0026] 图7显示木聚糖酶xynCDBFV原始蛋白与突变型木聚糖酶的活性测试结果，其 中，不同酶活性是以原始蛋白的酶活性做为100%的基准之下进行比较，而统计分析是利 用T-test的双尾分析，在P〈0. 05时判定为显著性差异（*)，误差线则是以标准误差平均值 (standard error of the mean, SEM)表不。由图中所不结果得知，单一突变W125F与F163W 的比活性高于原始蛋白，而双突变W125F/F163W比活性的增加趋势更为明显，将近有2成。 此外，在毕赤酵母表达系统中，突变蛋白的表达量与原始蛋白相差不大。以总活性而言，也 是W125F/F163W的酶活性为最高，代表着此突变蛋白确实比原始蛋白更具有潜在的应用价 值。
[0027] 综上所述，为了提升木聚糖酶的活性，本发明系将木聚糖酶xynCDBFV的三维立体 结构解析出来，并针对位于蛋白立体结构活性区内的Trpl25及Phel63进行定点突变，得到 的突变型酶蛋白W125F、F163W及W125F/F163W皆具有高于原始蛋白的酶活性，故可降低生 产成本，且更有实际应用在产业上的潜力。
[0028] 再者，木聚糖酶在工业上的应用十分广泛，例如，在食品工业的果汁生产方面，必 须要藉由果胶酶分解水果中大量的果胶质，然而果胶质会与半纤维素等其他物质共存，因 此果汁的生产制程中，在待澄清的汁液内加入木聚糖酶能够帮助果胶酶的作用，进而提高 果汁澄清度。另外在啤酒制成方面，于糖化过程中加入木聚糖酶能够有效地帮助分解大麦 或小麦等主要原料，可降低其黏稠度，进而增加萃取产量跟过滤效果。而在饲料工业方面， 将液体木聚糖酶喷在麸皮类等载体上，再与饲料一同拌混，便能帮助如猪、鸡这类的单胃动 物去分解这些含有半纤维素组成的饲料，进而促进动物肠道对于植物原料的消化与吸收。 再如纺织工业上，木聚糖酶则用于植物原料的浸渍（retting)以获得大麻或亚麻纤维。除 此之外，木聚糖酶在造纸工业的制程上尤为重要，其中的制作纸浆过程里最为关键的就是 纸浆的漂白步骤，它可分解与木质素紧密结合的半纤维素，顺带移除掉带有棕色的残留木 质素及其衍生物，进而有效地达到漂白的结果，因此木聚糖酶可取代传统使用含氯化学物 质的漂白方式，以减少产生有毒副产物。最后，在生物质能源方面，在糖化过程中加入木聚 糖酶能够帮忙将植物原料分解成可被微生物利用的单糖，让特定的微生物能够利用单糖进 行发酵作用，以制造出大量的生物质酒精。由此可知，木聚糖酶能够应用在许多不同的工业 领域上，具有一定的经济价值，而本发明利用基因工程技术去改造蛋白，大幅增加了其木聚 糖酶的活性，更进一步地降低生产成本，增加其产业应用价值。故本发明所提出的木聚糖酶 极具产业价值，依法提出申请。
[0029] 本发明得由本领域技术人员能力范围内而为诸般修饰，然皆不脱如后附权利要求 书的保护范围。
[0002]
[0003]
[0004]
【权利要求】
1. 一种木聚糖酶，其氨基酸序列为将序列编号2第125位的色氨酸突变成苯丙氨酸，以 及将第163位的苯丙氨酸突变成色氨酸的氨基酸序列。
2. 如权利要求1所述的木聚糖酶，其中编码所述序列编号2的基因是从瘤胃真菌 Neocallimastix patriciarum 所分离及突变而来的 xynCDBFV 基因。
3. 如权利要求1所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶的氨基酸序列为序列编号8的氨 基酸序列。
4. 一种木聚糖酶，其氨基酸序列为将序列编号2第125位的色氨酸突变成苯丙氨酸的 氨基酸序列。
5. 如权利要求4所述的木聚糖酶，其中编码所述序列编号2的基因是从瘤胃真菌 Neocallimastix patriciarum 所分离及突变而来的 xynCDBFV 基因。
6. 如权利要求4所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶的氨基酸序列为序列编号4的氨 基酸序列。
7. -种木聚糖酶，其氨基酸序列为将序列编号2第163位的苯丙氨酸突变成色氨酸的 氨基酸序列。
8. 如权利要求7所述的木聚糖酶，其中编码所述序列编号2的基因是从瘤胃真菌 Neocallimastix patriciarum 所分离及突变而来的 xynCDBFV 基因。
9. 如权利要求7所述的木聚糖酶，其中所述木聚糖酶的氨基酸序列为序列编号6的氨 基酸序列。
10. 权利要求1-9中任意一项所述的木聚糖酶在工业中的应用，其中所述工业选自食 品工业、饲料工业、纺织工业、造纸工业以及生物质能源工业。
【文档编号】C12N9/42GK104109660SQ201310134401
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月17日 优先权日:2013年4月17日
【发明者】郭瑞庭, 郑雅珊, 黄建文, 吴姿慧, 赖惠琳, 林正言, 黄婷沅 申请人:东莞泛亚太生物科技有限公司