专利名称：人肝细胞生长因子基因重组逆转录病毒载体的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种携带人肝细胞生长因子基因的重组逆转录病毒载体的建立。
背景技术：
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)，又称为扩散因子(scatter factor，SF)，是在体内广泛分布的可使多种组织再生的实效分子。HGF除了对肝细胞以外，对肾小管、肺上皮细胞等多种上皮细胞及血管内皮细胞、肌卫星细胞、心肌细胞、软骨细胞等亦具有生长促进作用，并且其生物学活性不仅是促生长，还有运动促进和诱导形态形成等多方面的作用。最近研究表明，HGF还有抗凋亡、血管新生和作为神经生长因子等作用。HGF的上述任何作用对于器官形成与组织再生都是必需的，它不仅对急性脏器损伤，对于目前尚无根治手段的进行性纤维化性疾病也显示出极佳的治疗效果，为再生医学在许多难治性疾病的治疗上提供了新的思路，在基因治疗、细胞工程、组织工程中均具有广泛的应用空间。
HGF作为具有重要生物学功能的细胞因子已被广泛应用于临床疾病的治疗，其来源主要是从人血浆和胎盘中提取纯化。但由于机体内HGF浓度极低(50-100μg/100L血浆，1mg/50个胎盘)，而且制备的HGF往往是单链pro-HGF与异二聚体HGF的混合物，这样制备HGF费时、费力、活性差且成本昂贵。利用基因工程表达人HGF是大量获取具有生物学活性HGF的有效途径。因此我们建立能稳定、高效表达HGF的重组逆转录病毒载体，期望能够使HGF得到更广泛的、科学的应用。
作为基因转染的工具之一，逆转录病毒因其稳定、高效表达目的基因而广受青睐。我们选择改造的复制缺陷型逆转录病毒载体pMSCVneo，将人HGF克隆至该载体，进行病毒包装并筛选出具有高滴度感染性重组病毒产生细胞株PT-HGF。此外，pMSCVneo载体最大的优势在于它不仅能够使携带的基因在分裂相细胞中高效表达，还能使外源基因高效表达于静止期细胞，这样可以建立稳定、高效表达HGF的干细胞系用于干细胞工程。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种人肝细胞生长因子基因重组逆转录病毒载体；本发明的第二个目的是应用该携带人肝细胞生长因子的重组逆转录病毒载体建立了高滴度产生人肝细胞生长因子逆转录病毒颗粒的包装细胞株PT-HGF。
本发明的具体实施方案如下1.根据hHGF-cDNA编码区的序列并分别引入HpaI和BamHI酶切位点合成引物，以pcDNA3-HGF质粒为模板克隆到HGF质粒。
2.将带有HpaI和BamHI酶切位点的HGF质粒插入到pMSCVneo载体的多克隆位点上，获得携带目的基因的逆转录病毒载体pMSCV-HGF。经限制性内切酶消化及DNA序列测定证实我们克隆的目的基因序列正确，重组逆转录病毒载体pMSCV-HGF构建成功。
3.以NIH3T3细胞为指示靶细胞计算抗性集落形成个数，测定pMSCV-HGF病毒滴度，筛选出具有最高病毒滴度(8.8×107cfu/ml)的细胞集落，扩大培养后建立高滴度表达HGF的PT-HGF包装细胞株。
4.转染了pMSCV-HGF的PT67细胞和NIH3T3细胞RNA提取后，经RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳，出现396bp的扩增条带，证实HGF基因在PT-HGF和感染了pMSCV-HGF的NIH3T3细胞中有转录。
通过建立人肝细胞生长因子基因重组逆转录病毒载体及高滴度产生人肝细胞生长因子逆转录病毒颗粒的包装细胞株PT-HGF，以达到高效、稳定表达人肝细胞生长因子基因，发挥其促细胞分裂、形态形成、运动、血管形成及抗凋亡等生物学功能的目的。此类重组逆转录病毒载体的构建将在以基因工程、干细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
图1是重组逆转录病毒质粒pMSCV-HGF的构建流程图。
图2是重组逆转录病毒质粒pMSCV-HGF的鉴定。
MDL15000分子量标志物；1T-HGF经HpaI/BamHI双酶消化(3.1kb+2.2kb)；2pMSCV-HGF经HpaI单酶消化(8.7kb)；3pMSCV-HGF经HpaI/BamHI双酶消化(5.15kb+3.55kb)；4PCR产物(2.2kb)。
图3是pMSCV-HGF感染NIH3T3细胞进行病毒滴度测定的结果。
(A)10-2倍稀释；(B)10-4倍稀释；(C)10-6倍稀释。
图4是RT-PCR检测PT67细胞和NIH3T3细胞中hHGFmRNA的表达。
1人胎肝裂解物(阳性对照)；2PT-HGF细胞；3PT67细胞；4感染pMSCV-HGF的NIH3T3细胞；5NIH3T3细胞。
具体实施例方式
实施例1、重组逆转录病毒质粒pMSCV-HGF的构建。人肝细胞生长因子基因cDNA克隆自pcDNA3-HGF质粒，根据hHGF-cDNA编码区的序列并分别引入HpaI和BamHI酶切位点合成引物，引物序列及其多聚酶链式反应(PCR)的条件如下 50μl反应体系包括1ul cDNA(100ng/ul)，primer1和2各1μl(20μM)，4μl dNTP(2.5mM)，1μl Pyrobest Taq DNA聚合酶(TakaRa公司，5u/μl)，5μl 10×PCR Buffer，37μl灭菌水。反应条件为94℃变性3min；94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 2min，30个循环72℃ 7min。反应产物克隆至pGEM-T eassy载体(Promega公司，美国)，获得克隆质粒T-HGF。提取T-HGF质粒用限制性内切酶HpaI和BamHI消化，回收目的片段插入到pMSCVheo载体的HpaI和BglII位点上，获得携带目的基因的逆转录病毒载体pMSCV-HGF，重组质粒分别经HpaI单酶消化和HpaI、BamHI双酶消化后，TAE琼脂糖凝胶电泳分别得到8.7kb和5.15、3.55kb的条带，与预期结果符合；对其进行正、反向测序及分析表明，其开放阅读框正确，没有发生移码改变。表明我们克隆的目的基因序列正确，重组逆转录病毒载体pMSCV-HGF构建成功(见图1、2)。
实施例2、逆转录病毒产生细胞株的建立和筛选。PT67细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液(完全培养液)培养至95％汇合。将pMSCV-HGF 5μg加入250μl无血清培养液，取LF2000 10μl加入250μl上述培养液，两者混匀室温放置20min。将PT67细胞用培养液洗2次，缓慢滴入用1ml培养液稀释的DNA-LF2000混合液。培养6h后，加入1ml含20％胎牛血清的培养液，继续培养24h后更换完全培养液。细胞转染48h后按1∶15传代，加入含600μg/ml G418筛选14d，直至抗性细胞集落形成。挑选大的健康的细胞集落，用完全培养液扩大培养，以制备含病毒的包装细胞上清、测定病毒滴度并冻存细胞。
实施例3、重组逆转录病毒pMSCV-HGF病毒滴度的测定和PT-HGF细胞株的建立。生长状态良好的NIH3T3细胞常规培养24h至60％汇合，将制备的病毒液相应作10-2、10-4、10-6倍稀释，加入polybrene至终浓度为8μg/ml。倒去细胞培养液，分别吸取1ml稀释的病毒液加入培养皿中，常规培养5h，补加2ml含胎牛血清的培养基常规培养24h，更换新鲜含500μg/ml G418的培养基，每3d换液一次，培养14d待长出肉眼可见的集落后，倾去培养液，以纯甲醛固定后用姬母萨染色，用克隆计数仪自动计数，再乘以稀释倍数后得病毒滴度(cfu)。我们共挑选出病毒滴度＞106cfu的包装细胞6个，筛选出具有最高滴度(8.8×107cfu/ml)的包装细胞(见图3)，扩大培养后建立高滴度表达HGF的包装细胞株PT-HGF。
实施例4、重组逆转录病毒液中野生型病毒的检测。将以上病毒滴度测定所得NIH3T3多克隆用完全培养液扩大培养48h，收集所得细胞上清再次感染NIH3T3细胞，加500μg/mlG418筛选，5d后细胞全部死亡。提示PT67细胞不产生可检测出的辅助病毒，用它制备的逆转录病毒可以感染人和其他哺乳动物细胞可以广泛使用而且较为安全。
实施例5、重组逆转录病毒的表达和鉴定。根据hHGF-cDNA编码区的序列设计合成引物，并进行逆转录PCR(RT-PCR)反应。引物序列P15′-GTTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，P25′-GAGCCAGGGCAGTAATCTC-3′，用TRIzol试剂提取已经和尚未转染pMSCV-HGF的PT67细胞及NIH3T3细胞总RNA进行RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳，观察到396bp的扩增条带，而未转染pMSCV-HGF的对照细胞则未见阳性条带，证实HGF基因在PT-HGF细胞株和感染pMSCV-HGF的NIH3T3细胞中有转录(结果见图4)。
权利要求
1.人肝细胞生长因子基因重组逆转录病毒载体的构建，其特点是通过基因工程的方法构建人肝细胞生长因子基因逆转录病毒载体制备重组病毒。
2.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒制备方法，其特征在于建立高滴度产生重组人肝细胞生长因子基因逆转录病毒颗粒的包装细胞株。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种携带人肝细胞生长因子(hepatocytegrowth factor，HGF)基因的重组逆转录病毒载体的建立。本发明提供了一种携带人肝细胞生长因子基因的重组逆转录病毒载体，并建立高滴度产生人肝细胞生长因子逆转录病毒颗粒的包装细胞株PT－HGF，以达到高效、稳定表达人肝细胞生长因子基因，发挥其促细胞分裂、形态形成、运动、血管形成及抗凋亡等生物学功能的目的。此类重组逆转录病毒载体的构建将在以基因工程、干细胞工程乃至组织工程等为基础的再生医学中具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效益和经济效益。
文档编号C12N7/01GK1536085SQ0310926
公开日2004年10月13日 申请日期2003年4月9日 优先权日2003年4月9日
发明者裴雪涛, 王韫芳, 南雪, 岳 文, 白慈贤, 阎舫 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所, 中国人民解放军军事医学科学院野战输