专利名称：一种用于药物筛选的仿生细胞生物反应装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于药物筛选的仿生细胞生物反应装置，属于生物工程领域。
在上述方案的基础上，在所述的细胞增殖方瓶的入口或出口的管路上设置一个或分别设置一个用于加入药物流体的进样阀，可实现在细胞培养周期的任意时段加入被筛选的样品。
本发明提供的生物反应装置还包括一个废液瓶，该废液瓶通过管道与缓冲瓶连通，其瓶盖上安装有带过滤器的气体出口；当培养液消耗较大时，或者在循环过程中需要清空缓冲瓶时，可将缓冲瓶中的液体导入废液瓶中保存。
为了实现培养过程的自动化管理，该装置还包括一台含有软件控制程序的计算机，该计算机通过一块数据接口卡与所述装置中的蠕动泵和电磁阀相连。
为了实现筛选样品与培养液预混合，可在系统中安置一个磁力搅拌器，将缓冲瓶放在磁力搅拌器上。
本发明与传统培养方瓶相比，具有以下优点及突出性效果①该装置由于设置了培养液储瓶和缓冲瓶，使培养液从培养液储瓶加入增殖方瓶，增殖方瓶中的培养液进入缓冲瓶保存，可保证方瓶中的细胞营养液定期更新，实现各种细胞达到高密度培养，延长细胞培养周期，并可方便地从缓冲瓶取样分析；还可在细胞培养过程中通过阀的切换实现缓冲瓶的培养液再次进入培养方瓶，实现培养液的定期循环。②在培养方瓶和缓冲瓶的流路中连接可加入筛选物流体的进样阀，可实现在细胞培养周期的任意时段加入被筛选的样品，使药液进入培养方瓶与细胞进行共培养；还可在细胞培养过程中多次加入被筛选的样品，做到连续给药、控制药物作用时间等。③可以在药物与细胞共培养一定时段后将药物与细胞分离，清空缓冲瓶后向系统中加入其他筛选样品，实现多药物的不同时间作用的研究。④通过调控培养方瓶流经的液体流速可以模拟血管中的血液流速，研究药物对细胞的作用情况。另外，可以按肠道蠕动频率控制药物停留时间，模拟肠道运动状态下的药物作用情况。⑤可实现培养过程的自动化管理。
图2为
图1中细胞增殖方瓶的结构示意图。
图3为装有加样阀的生物反应装置的结构示意图。
图4为装有废液瓶的生物反应装置的结构示意图。
图5为装有检测控制系统的生物反应装置的结构示意图。
图6为计算机与执行元件的电路连接原理图。
图7为控制软件的流程框图。
图8是利用图5所示装置培养Hela细胞生长状况(图例中所标小时数为给排液的操作周期)。
图9是利用图5所示装置培养Sh-Sy5y细胞生长状况(图例中所标小时数为给排液的操作周期)。
图10是利用图1所示装置研究去甲斑蝥素对生长72小时的细胞作用18小时后的抑制率。
图11是利用图1所示装置研究去甲斑蝥素对生长72小时的细胞作用42小时后的抑制率。
图12是利用图1所示装置研究槐定碱经细胞增殖方瓶与Hela细胞作用后的变化情况。
图13是利用图1所示装置研究槐定碱经细胞增殖方瓶与Sy5y细胞作用后的变化情况。
图14是利用图1所示装置研究槐定碱经细胞增殖方瓶与HepG2细胞作用后的变化情况。
本发明提供的用于药物筛选的仿生细胞生物反应装置(如图1所示)，主要由培养液储瓶11，细胞增殖方瓶2和缓冲瓶12组成。所述的培养液储瓶装有气体导管4，气体导管4上安装有蠕动泵51和过滤器71，并插入11的底部；培养液储瓶11的瓶口上还装有气体出口，通过过滤器72与大气相通。所述的缓冲瓶12的瓶口分别装有气体出口和可供取样分析的取样口10，气体出口经过滤器73与大气相通；取样口10通过蠕动泵55，可将缓冲瓶12中的培养液取样分析。细胞增殖方瓶的结构如图2所示，其瓶盖上装有液体和气体进入口21，在其底部设有与瓶壁相切的出口22。细胞增殖方瓶2的进口经过三通100，分别经电磁阀61，蠕动泵52与培养液储瓶11相连；经电磁阀66和蠕动泵53与缓冲瓶12相连。细胞增殖方瓶的出口22经蠕动泵54与缓冲瓶12相连。
含5％二氧化碳的空气被蠕动泵51泵入，经过滤器71过滤后，进入11的培养液中，使培养液被气体饱和；由蠕动泵52将培养液沿箭头方向送入细胞增殖方瓶2，此时，电磁阀61打开，66关闭。需要更换2中的培养液时，蠕动泵54和52同时打开，细胞增殖方瓶2中的培养液被54抽走进入缓冲瓶12，培养液储瓶11中的培养液通过蠕动泵52进入细胞增殖方瓶2，对培养液进行补充。此项功能可实现细胞培养液定期更换，延长了细胞培养周期，同时可实现细胞的高密度培养。被筛选样品在接种的同时一次性加入细胞增殖方瓶2，或在培养期间将瓶盖打开加入。
图3所示的是一种可在细胞培养过程中在线加入筛选样品的药物筛选的仿生细胞生物反应装置，即在细胞增殖方瓶2和缓冲瓶12之间设有可供样品注入的进样阀3。在细胞培养过程中，可由进样阀加入筛选样品，由流路中的液体循环带入细胞增殖方瓶与方瓶中的细胞进行共培养。进样阀3可设置于细胞增殖方瓶的出口22与缓冲瓶12之间，筛选样品在缓冲瓶12中进行预混合后进入细胞增殖方瓶2，将缓冲瓶置于磁力搅拌器9上可实现筛选样品与培养液充分混合(如图5中的部件9)；也可将进样阀3设置于三通100和细胞增殖方瓶2之间，筛选物直接进入细胞增殖方瓶2。通过进样阀3可在不同时间多次加入筛选样品；或者在三通100和细胞增殖方瓶2之间和细胞增殖方瓶的出口22和缓冲瓶12之间分别设置一个进样阀，这样可同时满足上述预混合或不需要预混合的两种功能。
图4为装有废液瓶的生物反应装置的结构示意图，该装置是一种可进行同一细胞不同时段多种药物作用的药物筛选的仿生细胞生物反应装置，它是在图3的基础上又设置了一个废液瓶13。所述的废液瓶13与缓冲瓶12通过蠕动泵56连接，瓶口设有气体出口，通过过滤器74与大气相通。在筛选的第一种药物作用结束后，将缓冲瓶12中的培养混合物在蠕动泵56的作用下转移至废液瓶13，并用新鲜培养液清洗系统，再从进样阀3加入第二种筛选样品。
为了对上述反应装置的运行过程进行自动化管理，该装置还包括一台含有软件控制程序的计算机8(如图5所示)，该计算机通过一块数据接口卡201与所述装置中的蠕动泵和电磁阀(执行元件)相连。图6为计算机与执行元件连接的电路图。由A/D，D/A，I/O组成的数据接口卡201通过电阻204，三极管202与继电器203相连。继电器控制执行元件205的动作。数据接口卡直接插接于计算机主板上。
图7为计算机控制软件的流程框图。用户选择“流路模式”后，在“流程序列”栏内输入每步的操作参数。其中每行的第一列为要执行的流路号。点击“运行”键后，程序开始执行第一行内的操作，当第一步操作结束后，当前操作行数加一。如果当前操作行内流路号为零时，说明所有操作均已执行，程序结束。如果当前操作行内流路号不为零时，执行该行操作，并重复以上步骤。用户选择“泵操作模式”后，选择要操作的泵，并设定阀的开关状态和泵的等待时间t1，运行时间t2、间隔时间t3、运行速度及运行次数。运行开始后，程序开始计时，等待t1后，程序控制泵以设定的速度开始运行，运行时间为t2。运行结束后，已运行次数加1。如果已运行次数小于设定的运行次数，则再次计时，等待时间改为t3。时间到后，泵再次开始运行，并重复以上步骤。可以按肠道蠕动频率控制药物停留时间，模拟肠道运动状态下的药物作用情况，筛选药物，实现培养过程的自动化管理。
实施例1(细胞培养)利用图5所示装置，首先将系统部件，包括供气通路、培养液储瓶、细胞增殖方瓶、缓冲瓶和废液瓶按流程要求连接并检查气密性后，置于高压蒸汽锅中按常规通用方法灭菌。灭菌冷却至不高于37℃后，在无菌操作台中将事先已过滤除菌的培养液500ml装入培养液储瓶中，并在细胞增殖方瓶中接入细胞，接种密度约5×104个/ml，瓶中初始液量约20ml。此后，将细胞增殖方瓶置于温度已设定在37℃的水浴箱中，启动细胞增殖方瓶供气系统，静态维持12小时后，根据研究需要对细胞增殖方瓶定时或连续给排培养液，供细胞生长。图8和图9为对Hela细胞和Sh-Sy5y细胞的培养结果。
实施例2(去甲斑蝥素(Nc)对细胞增殖方瓶中细胞的作用效果)利用图5所示装置，所用Nc的药物浓度为10μg/ml，所用细胞为SH-SY5Y。Nc对细胞增殖方瓶中细胞的作用方式为周期作用方式。72小时后观察，实验结果如图10所示，数据均为4次实验平均值。图中横坐标细胞增殖方瓶CPB8，细胞增殖方瓶CPB12，细胞增殖方瓶CPB24和细胞增殖方瓶∞表示每隔8小时，12小时，24小时以及∞小时给药一次的操作。其中，∞小时即间隔时间为无限长，实际就是普通方瓶中的作用方式，在实际实验中则不需在细胞增殖方瓶上实验，以多孔板替代即可。
由图10表示药物作用18小时的结果，由此可见，相比于其它操作频率，多孔板中的细胞在相同浓度Nc作用下，经相同时间后，对药物作用表现出更显著的敏感性。而此时多孔板中的细胞则已处于衰亡期，而其它频率下的对照组细胞尚处于良好活性状态。显然，多孔板中的细胞之所以对药物表现出更大的敏感性，是因为其细胞本身已经处于不良活性状态，即自身的衰弱而导致的。相对于细胞增殖方瓶中的细胞，这一显著的药物敏感性即为假阳性。已有研究表明，在固定浓度下，Nc对细胞的抑制率随时间的增长而增大。图11表示药物作用42小时的结果，由此可见，细胞增殖方瓶中细胞符合此趋势，而多孔板中的细胞却表现出了与此相反的变化趋势。这是因为，多孔板中的细胞经72小时生长后已进入衰退期，活性开始下降，从抑制率的计算方法看，这会导致抑制率不升反降。而细胞增殖方瓶中细胞经72小时生长后其细胞活性依然处于稳定期，有良好活性，自然会现出符合“抑制率随时间的增长而增大”的规律。由此可见，由多孔板中所获结果又具有了假阴性。
上述研究表明，细胞增殖方瓶不仅可有效避免药效研究中出现伪结果的现象，而且还可用于需进行长时间考察药效的研究。
实施例3(槐定碱(Sp)对活细胞的动态作用)利用图5所示装置，槐定碱(Sp)为实验药物，以Sy5y，Hela和HepG2为施用对象，实验中Sp对细胞增殖方瓶中细胞的作用方式是循环作用。相比于普通方瓶，这一方式是细胞增殖方瓶所特有的。以Sp对细胞增殖方瓶中细胞的静态作用和对普通方瓶中细胞的作用结果为对照，实验结果如图12，13和14所示。其共同规律是，在普通方瓶和细胞增殖方瓶的静态作用过程中，以及细胞增殖方瓶循环状态的初始阶段中，Sp无论与那一种细胞作用其浓度均降低，且在相同环境和操作条件下下降趋势相同，但下降速率和幅度却依次增高。在细胞增殖方瓶中，无论Sp与细胞是处于循环作用还是静态作用其下降速率和幅度均大于普通方瓶，其原因应是细胞增殖方瓶中的细胞比普通方瓶中的数量多且活性稳定，显示了更强的代谢Sp的能力。与此同时也可看到，相比于细胞增殖方瓶静态培养，Sp在细胞增殖方瓶循环状态初始阶段的下降速率和幅度又明显大于前者，显然，循环操作使得细胞对Sp吸附或代谢的能力增强，表现为Sp的变化程度增大。从这一角度看，细胞增殖方瓶循环操作起到了放大药物变化的作用。
另外，在Sp与Sy5y和HepG2细胞的循环作用中，Sp的浓度出现了反弹(参见图13和14)，而不象与Hela细胞作用中所表现出的持续降低现象(参见图12)。在Sp浓度反弹时，均发现Sy5y和HepG2细胞已出现死亡现象，这一现象应是Sp和循环作用的共同结果。
权利要求
1.一种用于药物筛选的仿生细胞生物反应装置，其特征在于该装置主要包括一个细胞增殖方瓶(2)，培养液储瓶(11)和缓冲瓶(12)，所述的细胞增殖方瓶的瓶盖上设有可供液体和气体进入口(21)，在其底部设有与瓶壁相切的出口(22)；在所述的培养液储瓶(11)的瓶盖上分别设有带过滤器的气体出口和气体入口，在缓冲瓶(12)瓶盖上分别设有带过滤器的气体出口和取样口(10)，培养液储瓶和缓冲瓶分别通过蠕动泵、阀门及相应的管路与细胞增殖方瓶(2)的进口(21)连通；所述的细胞增殖方瓶底部出口(22)通过蠕动泵(54)和管路与缓冲瓶(12)连通。
2.按照权利要求1所述的仿生细胞生物反应装置，其特征在于在所述的细胞增殖方瓶(2)的入口或出口的管路上设置一个或分别设置一个用于加入药物流体的进样阀(3)。
3.按照权利要求1或2所述的仿生细胞反应装置，其特征在于该装置还包括一个废液瓶(13)，该废液瓶通过管道与缓冲瓶连通，其瓶盖上安装有带过滤器的气体出口。
4.按照按照权利要求3所述的仿生细胞反应装置，其特征在于该装置还包括一台含有软件控制程序的计算机(8)，该计算机通过一块数据接口卡(201)与所述装置中的蠕动泵和电磁阀相连。
5.按照权利要求1所述的反应装置，其特征在于在所述的缓冲瓶底部设置一个磁力搅拌器(9)。
全文摘要
一种用于药物筛选的仿生细胞生物反应装置，属于生物工程技术领域。该装置主要由细胞增殖方瓶、培养液储瓶、缓冲瓶、废液瓶、进样阀、计算机以及相应的蠕动泵、电磁阀和连接管路组成。与传统的方瓶相比，该装置可保证方瓶中的细胞营养液定期更新，在细胞培养周期的任意时段加入被筛选的样品，做到连续给药、控制药物作用时间，实现各种细胞的高密度培养，使药液进入培养方瓶与细胞进行共培养，延长细胞培养周期，并可方便地取样分析。另外可以模拟血管中的血液流速，研究药物对细胞的作用情况，达到药物筛选；可以按肠道蠕动频率控制药物停留时间，模拟肠道运动状态下的药物作用情况，筛选药物，实现培养过程的自动化管理。
文档编号C12M1/00GK1446924SQ0310912
公开日2003年10月8日 申请日期2003年4月4日 优先权日2003年4月4日
发明者罗国安, 王义明, 肖炘, 肖盛元, 梁宁 申请人:清华大学