专利名称：：基于马传染性贫血病毒(eiav)的逆转录病毒载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及逆转录病毒载体，尤其(但不仅仅)涉及衍生自非灵长类动物慢病毒，并能将遗传物质转移至非分裂或缓慢分裂细胞的逆转录病毒载体。有段时间，人们对研制基于慢病毒(逆转录病毒的小亚组)的逆转录病毒载体系统相当有兴趣。这一兴趣的诱因首先是使用基于HIV的载体将抗HIV治疗剂靶向HIV易感细胞的想法，其次是下列推测，即由于慢病毒能感染非分裂细胞(Lewis&Emerman1993，病毒学杂志，68，510)，基于这些病毒的载体系统将能转导非分裂细胞(如Vile&Russel1995Brit.Med.Bull，51，12)。基于HIV的载体系统已经产生(Buchschacher&Panganiban1992，病毒学杂志，66，2731)，使用该系统转导了CD4+细胞，并按预期的那样转导了非分裂的细胞(Naldini等，1996科学272，263)。另外，慢病毒载体能很稳定地长期表达所需基因。对经转导的大鼠神经元细胞而言至少为3个月。基于MLV的载体仅能在6周内稳定表达所需基因。迄今为止产生的基于HIV的载体在转导细胞中导致整合的原病毒，其末端具有的HIVLTR限制了这些载体的使用，因为除非使用内部启动子，否则LTR不得不用作任何插入基因的表达信号。内部启动子的使用具有显著的缺陷，将其它启动子置于逆转录病毒LTR转录单位内会导致不可预测的后果，其详细记载于Bowtell等，1988，病毒学杂志，62，2464；Correll等，1994，血液84，1812；Emerman和Temin1984细胞39，459；Ghattas等，1991，分子细胞生物学，11，5848；Hantzopoulos等，1989PNAS86，3519；Hatzoglou等，1991，生物化学杂志，266，8416；Hatzoglou等，1988，生物化学杂志，263，17798；Li等，1992，人类遗传学理论，3，381；McLachlin等，1993，病毒学，195，1；Overell等，1988，分子细胞生物学，8，1803；Scharfman等，1991PNAS88，4626；Vile等，1994，基因理论，1，307；Xu等，1989，病毒学，171，331；Yee等，1987PNAS84，5197。涉及的因素包括两个启动子的相对位置和方向，启动子的特性，表达的基因和所采用的任何选择方法。内部启动子的存在会影响包装细胞系所能达到的转导效价和整合载体的稳定性。HIV和其它慢病毒LTR对基因表达具有病毒特异性的需求。例如，HIVLTR在缺乏病毒Tat蛋白时不具活性(Cullen1995AIDS9，S19)。因此，需要以某种方式修饰LTR以改变基因表达的需求。一些基因治疗应用特别地需要组织特异性的基因表达。HIV载体有很多显著的缺陷，限制了它们对某些疾病的治疗应用。HIV-1的缺陷在于它是携有潜在的致癌蛋白质和序列的人类病原体。导入在包装细胞中产生的能表达HIVgag-pol的载体颗粒会将这些蛋白质导入患者体内，从而导致血清转变的风险。为此，需要研制不会将HIV蛋白质导入患者体内的基于慢病毒的载体。现在，我们已发现可以提供改良的慢病毒载体，该载体克服了基于HIV载体的局限性。在研制任何逆转录病毒载体系统时，重要的是从逆转录病毒基因组中除去可抑制载体转移异源基因能力的序列或可将不利的蛋白质编码序列转移至靶细胞的序列。逆转录病毒可被有效包装的RNA序列长度有限，因此，逆转录病毒基因组长区域的存在严重限制了载体对异源编码RNA的编码能力。我们还发现可以基于非灵长类动物慢病毒提供慢病毒载体，该载体对异源编码序列具有高编码能力，并且将逆转录病毒的组分转移至靶细胞的能力降低。我们惊奇地发现需要从非灵长类动物慢病毒中得到的载体基因组序列的量基本上低于基于HIV的载体所需要的量。对包装HIV载体基因组的序列需求是复杂的。HIV-1包装信号包含剪接供体位点，并含有gag基因的5’非翻译区域部分，其推定的二级结构含有4个短茎-环。基因组别处的其它序列对HIV的有效衣壳化也是至关重要的。例如，有效包装可归功于gag蛋白编码序列的前350个bp，并且涉及env未完全确定的区域。为了构建能表达异源基因的HIV载体，使用了延伸至350bp长的gag蛋白编码序列的包装信号。我们惊奇地发现非灵长类动物慢病毒的包装信号结构与HIV的完全不同。不同于4个茎-环的短序列后接着不完全确定的gag和env序列区域，我们发现gag基因的较短区域足以进行有效包装。实际上，EIAV载体中gag基因较大区域的缺失是有利的，其可导致较高滴度的病毒载体产生。可使用这一信息提供由非灵长类动物慢病毒序列构建的改良载体，相对于HIV载体而言，其具有高滴度和有利特征。本发明的第一方面提供了含有非灵长类动物慢病毒的缺失gag基因的逆转录病毒载体基因组，其中gag中的缺失除去了gag编码序列核苷酸350下游的一个或多个核苷酸。优选缺失从核苷酸350至少延伸至gagpol编码区的C末端。更优选缺失另外还除去了gag编码区的核苷酸300，最优选缺失仅保留gag编码区的前150个核苷酸。然而，也可使用甚至更多的gag缺失，例如，gag编码区含有gag编码区的前109个核苷酸。gag编码区也可仅含有gag编码区的前2个核苷酸。慢病毒基因组的其它特征包含在病毒基因组中，是转导靶细胞，复制，逆转录和整合所必需的。它们至少是含有R区域和U5区域的序列，含多嘌呤序列片断(PPT)的3’LTR序列和非灵长类动物慢病毒的3’LTR序列或含有非灵长类动物慢病毒序列和其它元件的杂合LTR的LTR部分。任选地，逆转录病毒基因组含有得自逆转录病毒的辅助基因，例如但不限于rev基因，tat基因，vif基因，nef基因，vpr基因或S2基因。也可添加其它组分，例如内含子，剪接供体位点，rev效应元件(RRE)，克隆位点和选择标记基因。另外，我们已惊奇地阐明可构建出非灵长类动物慢病毒基本的载体系统，该系统在载体生产或转导分裂和非分裂细胞时既不需要S2，Tat，env也不需要dUTP酶。因此，根据本发明的另一方面，衍生得到载体的非灵长类动物慢病毒基因组缺乏一个或多个辅助基因。辅助基因的缺失非常有利。首先，它使产生的载体不含一般与慢病毒(如HIV)感染之疾病相关的基因。尤其是tat和env与疾病相关。其次，辅助基因的缺失使载体能包装更多的异源DNA。第三，可删除功能未知的基因，例如dUTP酶和S2，从而降低导致不利影响的风险。另外，我们发现非灵长类动物慢病毒基因组的前导序列是gag和gagpol高效蛋白质表达所必需的。因此，根据本发明的另一方面，衍生得到载体的非灵长类动物慢病毒基因组缺乏tat基因但包括5’LTR末端和gagATG之间的前导序列。这些资料进一步确定了一套最佳慢病毒载体的极限必需功能组分。所提供的载体具有最大的遗传能力和高滴度，但不具有功能未知(S2，UTP酶)因此可能存在风险，或者是与AIDS相关的HIV蛋白质类似物(tat，env)的辅助基因。本发明提供了衍生自非灵长类动物慢病毒基因组的逆转录病毒载体，其(1)含有缺失的gag基因，其中gag中的缺失除去了gag编码序列核苷酸350下游的一个或多个核苷酸；(2)其中非灵长类动物慢病毒基因组中缺失了一个或多个辅助基因；(3)其中非灵长类动物慢病毒基因组缺乏tat基因但包括5’LTR末端和gagATG之间的前导序列；以及(1)，(2)和(3)的组合。在优选的实施方案中，逆转录病毒载体含有(1)和(2)和(3)的全部特征。本文所用的“非灵长类动物”载体指的是衍生自最初不是感染灵长类动物，尤其是人的病毒的载体。因此，非灵长类动物病毒载体包括感染非灵长类哺乳动物，如狗，绵羊和马，爬行动物，鸟类和昆虫的载体。本文所用的慢病毒载体是含有至少一个慢病毒组成成分的载体。优选该组成成分参与载体感染细胞，表达基因或进行复制的生物学机制。非灵长类动物慢病毒可以是一般不感染灵长类动物的慢病毒科家族的任何成员，其包括猫免疫缺损病毒(FIV)，牛免疫缺损病毒(BIV)，山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)，梅迪维斯纳病毒(MVV)或马传染性贫血病毒(EIAV)。优选慢病毒是EIAV。马传染性贫血病毒感染所有的马，导致血浆病毒血症和血小板减少(Clabough等，1991，病毒学杂志，656242-51)。据认为，单核细胞变为巨噬细胞的成熟化过程可控制病毒的复制。EIAV具有最简单的慢病毒基因组结构。除了gag，pol和env基因外，EIAV还编码3个其它基因tat，rev和S2。Tat可作为病毒LTR的转录激活剂起作用(Derse和Newbold1993，病毒学，194530-6；Maury等，1994，病毒学，200632-42)，而Rev通过rev效应元件(RRE)调节和协同病毒基因的表达(Martarano等，1994，病毒学杂志，683102-11)。据认为，这两种蛋白质的作用机制与灵长类动物病毒的相应机制非常类似(Martano等，文献同上)。S2的功能未知。另外，已鉴定出EIAV蛋白质Ttm，它是由在跨膜蛋白质开始处与env编码序列剪接到一起的tat第一外显子编码的。除蛋白酶外，非灵长类动物慢病毒的逆转录酶和整合酶含有第4个编码dUTP酶的pol基因产物。它对这些慢病毒感染某些非分裂细胞类型的能力起到一定的作用。本发明第一方面的病毒RNA由启动子转录，所述启动子可以是病毒或非病毒来源，但能介导真核细胞如哺乳动物细胞中的表达。任选在启动子上游或下游加入增强子。RNA转录物终止于可以由慢病毒的3’LTR提供的聚腺苷酸化位点或不同的聚腺苷酸化信号。因此，本发明提供了DNA转录单位，其含有能介导逆转录病毒载体基因组表达的启动子并任选含有增强子。本文所述转录单位含有的核酸区域含有能被转录的序列。因此，此定义中包括编码mRNA，tRNA和rRNA的序列。对启动子而言，序列可以是有义或反义方向。根据众所周知的技术，使用反义构建体可抑制基因在细胞中表达。核酸可以是例如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其类似物。编码mRNA的序列任选包括一些或所有5’和/或3’转录但一般不翻译或要不然与翻译的编码序列相连的侧翼序列。还可任选包括一般与转录序列相连的相关转录控制序列，例如转录终止信号，聚腺苷酸化位点和下游增强子元件。核酸可包括cDNA或基因组DNA(可含有内含子)。术语“启动子”使用的是本领域的一般含义，例如基因表达的Jacob-Monod理论中的RNA聚合酶结合位点。术语“增强子”包括与转录起始复合物的其它蛋白质组分结合因而利于由其相关启动子介导的转录启动的DNA序列。优选编码第一病毒载体组分的转录单位的启动子和增强子具有强活性，或在生产本发明的逆转录病毒载体的条件下能在生产细胞中被强诱导，和/或在生产第二病毒载体的条件下能在原代靶细胞中被强诱导。优选编码第二病毒载体组分的转录单位的启动子和增强子具有强活性，或能在靶细胞中被强诱导。启动子和/或增强子的活性可以是组成型有效的，或受组织或时间的限制。适当的受组织限制的启动子/增强子例子包括在肿瘤细胞中具有高活性的启动子/增强子，例如MUC1基因，CEA基因或5T4抗原基因的启动子/增强子。受时间限制的启动子/增强子例子包括对局部缺血和/或低氧反应的启动子/增强子，例如低氧效应元件或grp78或grp94基因的启动子/增强子。一个优选的启动子-增强子组合是人巨细胞病毒(hCMV)主要即时早期(MIE)启动子/增强子组合。可以改变下列区域中的LTRU3(为了得到强组成型表达，诱导型表达或组织特异性表达)；R(为了除去TAR茎环)；或U5(为了使用例如得自牛生长激素基因的增强的不基于U5的聚腺苷酸化信号)。在一个构型中，内部启动子盒是反向的，聚腺苷酸化信号被置于盒的下游。在另一实施方案中，所用的聚腺苷酸化信号含有至少一个内含子。本发明的载体可以使用自我灭活的策略。通过缺失转录增强子或3’LTR之U3区域中的增强子和启动子已构建出自我灭活的逆转录病毒载体。一轮载体复制之后，这些改变被拷贝至5’和3’LTR中，产生无活性的原病毒。然而，这种载体中LTR内部的任何启动子仍具有活性。使用此策略消除了病毒LTR中的增强子和启动子对内部置入基因转录的影响，这种影响包括增加转录或抑制转录。还可使用该策略消除3’LTR下游转录至基因组DNA中。人基因疗法对此很在意，因为在该疗法中防止激活内源性癌基因非常重要。还构建出另一种类型的自我灭活载体，该载体具有侧翼于包装信号的直接重复序列以使包装信号在逆转录的过程中经常被缺失，产生包装缺损病毒。由于足够长的直接重复序列的存在，所得原病毒中的大多数失去其包装序列。通过设计载体，使包装信号缺失重建在G418中选择被载体感染之细胞的neo标记nad，缺失率可增加至100％。此策略对基因疗法应用特别有用，因为在基因疗法中，基因转移之后载体的任何扩散都是不必要的。在本发明第一方面的其它优选实施方案中，所需的一个或多个目的核苷酸(NOI)被导入载体的克隆位点。这种治疗基因可由置于逆转录病毒LTR中的启动子表达，或由导入克隆位点的内部启动子表达。适当的NOI克隆序列包括治疗和/或诊断用的序列，其包括但不限于编码细胞因子，趋化因子，激素，抗体，经改造的免疫球蛋白-样分子，单链抗体，融合蛋白，酶，免疫共-刺激分子，免疫调制分子，反义RNA，靶蛋白的transdominant阴性突变体，毒素，条件毒素，抗原，肿瘤抑制蛋白和生长因子，膜蛋白，血管活性蛋白和肽，抗病毒蛋白和核酶及其衍生物(如连接有报道基团)的序列。当被包括时，这种编码序列一般与适当的启动子可操作相连，所述启动子可以是驱动核酶表达的启动子或不同的启动子。NOI编码序列可编码融合蛋白或编码序列区段。可使用本发明的逆转录病毒载体将NOI，例如激活前体药物的酶传递至肿瘤位点以治疗癌症。此时，将适当的前体药物与适当的激活前体药物的酶联合使用以治疗个体(如患者)。适当的前体药物与载体一起被施用。前体药物的例子包括表鬼臼毒素吡喃葡糖苷磷酸酯(与碱性磷酸酶联合，Senter等，1988，ProcNatlAcadSci854842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶联合，Mullen等，1994，癌症研究，541503-1506)；阿霉素-N-对羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素-V-酰胺酶联合，Kerr等，1990，癌症免疫及免疫疗法31202-206)；对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸酯(与羧肽酶G2联合)；头孢菌素氮芥氨基甲酸酯(与β-内酰胺酶联合)；SR4233(与P450还原酶联合)；9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(与HSV胸苷激酶联合，Borrelli等，1988ProcNatlAcadSci857572-7576)；芥子前体药物(与硝基还原酶联合，Friedlos等，1997，药物化学杂志，401270-1275)和环磷酰胺(与P450联合，Chen等，1996，癌症研究561331-1340)。通过病毒或非病毒载体可将本发明的载体传递至靶位点。众所周知，载体是允许或便于一个实体从一个环境转移至另一个环境的工具。例如，重组DNA技术中使用的一些载体能将如DNA区段(如异源DNA区段，如异源cDNA区段)的实体转移至靶细胞。任选地，一旦进入靶细胞，载体可发挥作用以将异源DNA维持在细胞内或可用作DNA复制单位。重组DNA技术中所用载体的例子包括质粒，染色体，人造染色体或病毒。非病毒传递系统包括但不限于DNA转染方法。本文中的转染包括使用非病毒载体将基因传递至靶哺乳动物细胞的方法。典型的转染方法包括电穿孔，DNAbiolistics，脂质介导的转染，紧密DNA介导的转染，脂质体，免疫脂质体，脂质转染法，阳离子试剂-介导的，阳离子表面的亲水脂分子(CFA)(天然生物技术199614556)及其组合。病毒传递系统包括但不限于腺病毒载体，腺相关病毒(AAV)载体，疱疹病毒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体，杆状病毒载体。载体的其它例子包括来自体内的传递系统，其包括但不限于DNA转染法，如电穿孔，DNAbiolistics，脂质介导的转染，紧密DNA介导的转染。术语“逆转录病毒载体颗粒”指的是经包装的逆转录病毒载体，其优选能结合并进入靶细胞。正如论述载体时所讨论的，相对于野生型逆转录病毒而言，颗粒的组分可被修饰。例如，可对颗粒的蛋白质外膜中的Env蛋白进行基因修饰以改变其靶向特异性或获得一些其它所需的功能。优选病毒载体优先转导某些细胞类型。更优选病毒载体是靶向载体，即具有相对于天然病毒而言有所改变的组织嗜性从而使载体靶向特定的细胞。对于逆转录病毒载体而言，通过修饰Env蛋白可达到这一目的。逆转录病毒第二载体的Env蛋白需要在原代靶细胞中成为无毒性的包膜或以无毒性的量产生的包膜，例如MMLV兼嗜性包膜或经修饰的兼嗜性包膜。在这种情况下，优选安全性特征是缺失逆转录病毒组分之间同源的区域或序列。优选包膜可转导人细胞，适当的env基因的例子包括但不限于VSV-G，MLV兼嗜性env，如4070Aenv，RD114猪白血病病毒env或流感病毒的血细胞凝集素(HA)。Env蛋白能与有限量人细胞类型上的受体结合，并且可以是含有靶向组成成分的经改造的包膜。env和gag-pol编码序列由在选定包装细胞系中具有活性的启动子和(任选地)增强子转录，转录单位由聚腺苷酸化信号终止。例如，如果包装细胞是人细胞，适当的启动子-增强子组合是人巨细胞病毒主要即时早期(hCMV-MIE)基因的启动子-增强子，可使用SV40病毒的聚腺苷酸化信号，其它适当的启动子和聚腺苷酸化信号是本领域已知的。包装细胞可以是被治疗的个体体内的包装细胞，或也可以是体外培养的细胞，如组织培养细胞系。适当的细胞系包括哺乳动物细胞，如得自鼠成纤维细胞的细胞系或人细胞系。优选包装细胞系是人细胞系，例如293细胞系，HEK292，293-T，TE671，HT1080。或者，包装细胞可以是得自被治疗的个体的细胞，例如单核细胞，巨噬细胞，干细胞，血细胞或成纤维细胞。从个体中分离细胞，体内施用包装和载体组分，接着再施用自身包装细胞。或者，给体内包装细胞施用包装和载体组分。将逆转录病毒包装和载体组分导入个体细胞的方法是本领域已知的。例如，一个方法是通过瞬时三联转染将产生逆转录病毒载体颗粒所需的不同DNA序列，如env编码序列，gag-pol编码序列和缺损的逆转录病毒基因组同时导入细胞(Landau&Littman1992，病毒学杂志，66，5110；Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)。在一个实施方案中，本发明的载体构型将3个转录单位用作其生产系统，它们可表达基因组，gag-pol组分和包膜。包膜表达盒可包括多种包膜之一，如VSV-G或多种鼠逆转录病毒包膜，如4070A。通常，这3个表达盒由3个瞬时转染进入适当细胞系，如293T的质粒表达或由稳定生产细胞系中的整合拷贝表达。另一种方法是使用另一种病毒作为3个表达盒的表达系统，所述病毒如杆状病毒或腺病毒。这些都是核表达系统。迄今为止，使用痘病毒表达逆转录病毒或慢病毒载体系统的所有组分尚未见描述。尤其是，尽管慢病毒不寻常的密码子使用及其RNA操作系统，如rev/RRE系统的需求是给定的，目前仍不清楚所有3个表达盒的掺入及其随后在载体中的表达是否可行，所述载体在胞质而不是核中进行表达。迄今为止，仍存在这种可能性，即载体组分的表达及其在基因传递载体中的功能需要主要的核因子和核RNA操作途径。本文描述了这种系统，证明慢病毒组分可在胞质中制备，它们装配成功能性的基因传递系统。该系统的优点是使痘病毒易于处理，表达水平升高，并能将内含子维持在载体基因组中。因此，根据本发明的另一方面，提供了用于体内基因传递的杂合病毒载体系统，该系统含有可得自或基于痘病毒的第一病毒载体和可得自或基于vectroviral载体，优选慢病毒载体，甚至更优选非灵长类动物慢病毒载体的第二病毒载体。由第一载体DNA编码的逆转录病毒载体生产必需的基因的表达可产生第二载体。所述基因包括逆转录病毒的gag-pol，包膜病毒和含有一个或多个治疗或诊断用NOI的缺损逆转录病毒载体的env基因。缺损的逆转录病毒载体一般含有具有逆转录功能的序列，5’长末端重复(LTR)的至少一部分，3’LTR的至少一部分和包装信号。如果需要使第二载体变为复制缺损的，第二载体可由位于单个或两个或多个腺病毒或其它第一载体上的多个转录单位编码。在一些治疗或实验的情况下，应避免在体外由MVA衍生制备EAIV的需要。MVA-EIAV杂合体被直接传递至患者/动物体内，例如将MVA-EIAV静脉内注射至小鼠的尾静脉中，此重组病毒感染鼠的多个组织，如肺，脾脏等。被感染的细胞表达具有转导活性的EIAV，其含有基因治疗用的治疗基因。EIAV载体颗粒从这些细胞中芽出，并转导相邻的细胞。被转导的细胞则含有整合拷贝的EIAV载体基因组并表达治疗基因产物或其它所需的基因产物。如果治疗基因产物的表达对宿主具有潜在的毒性，可通过特异性启动子，如低氧效应元件(HRE)调节表达，该元件可将表达限制于低氧环境中的那些细胞。针对肺/气管上皮细胞的基因治疗，如治疗囊性纤维化，MVA-EIAV可以是鼻内传递的气溶胶形式。或者，可体外转导巨噬细胞，然后再次进行转导以产生基于EIAV的载体的巨噬细胞工厂。另外，由于MVA不具有复制能力，MVA-EIAV杂合体也可用于治疗免疫抑制的宿主。痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒属的原型成员，它是第一个用于表达重组外源蛋白质的病毒(Mackett等，1982，Paoletti&Panicalli1982)。痘苗病毒具有大于180kb的大DNA基因组，有报道表明它可容纳大至25kb的外源DNA(Merchlinsky&Moss1992)。几个其它的痘病毒株已被改造为重组表达载体(参见Carroll和Moss1997的综述)，例如禽痘病毒(Taylor&Paoletti1988)，金丝雀痘病毒(Taylor等1991)，猪痘病毒(vanderLeek等1994)和昆虫痘病毒(Li等1997)。另外，出于对安全性的考虑，已开发出几个高度减毒的痘苗病毒株，它们对人和其它哺乳动物细胞无害，例如经修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)(Mayr1978，Sutter1992)，NYVAC(Paoletti等1994)，DNA复制酶缺损的痘苗病毒(Holzer等1997)。这些病毒都可以用于本发明。MVA得自具有复制能力的痘苗天花疫苗株Ankara。在鸡胚成纤维细胞中传代＞500次之后，病毒分离株在包括小鼠的多种免疫缺损动物模型中表现出高度减毒(Mayr等1978)。用减毒的分离株MVA接种120，000个人，大多数人无免疫应答(Mahnel1994)，也没有不良反应。研究表明MVA可感染多种哺乳动物细胞，但仅在仓鼠肾细胞BHK-21中观察到生产性的感染(Carroll1997)。在所有其它受试的哺乳动物细胞系中，观察到早期表达，DNA复制和晚期表达导致非感染性的不成熟病毒颗粒的产生(Carroll1997，Meyer1991)。病毒复制研究表明极少数哺乳动物细胞可支持很低水平的感染性病毒产生，即每个细胞中产生1个感染性MVA颗粒的BS-C-1细胞(Carroll和Moss1997)。晚期基因表达通常产生比受早期启动子控制的那些基因多10倍以上的蛋白质(Chakrabarti等1997，Wyatt等1996)。在所有其它减毒痘病毒株中，很少在哺乳动物细胞中观察到晚期基因表达。逆转录病毒载体系统，如MLV-HIV和慢病毒载体系统的产生需要构建表达病毒基因组和必需结构蛋白的生产细胞系以制备具有转导能力的病毒。一般说来，这是相对无效的方法，当病毒是具有毒性包膜蛋白，如VSV-G的假型病毒时，该方法会进一步复杂化。由重组痘病毒表达功能性基因组和所需的结构蛋白可避免很多目前无效的逆转录病毒和慢病毒载体生产技术。另外，这种重组痘病毒可直接注射至患者体内以在体内产生逆转录病毒或慢病毒。因其非-复制表型及其进行早期和强晚期表达以产生高滴度载体制品的能力，MVA是特别适于构建痘病毒-逆转录病毒或痘病毒-慢病毒杂合体的痘病毒。为了产生功能性的逆转录病毒或慢病毒载体基因组，RNA基因组的5’端应是精确无误的(Cannon等，1996)。对基于痘苗病毒的生产系统而言，这是一个挑战，因为很多痘苗病毒启动子含有转录效力的下游决定因素(Davison1989b，Moss1996)。然而，我们找到了几个解决问题的方法a．使用T7启动子和T7终止序列。b．使用早期启动子(其中RNA起始位点下游的序列不是高度保守的)(Davison1989a)。c．使用痘苗病毒中期和晚期启动子，其需要起始位点下游的其它序列与产生真正的5’末端的策略相结合，或者将其它下游序列置于两个R区域。对晚期启动子转录起始位点下游4个核苷酸的特定序列是有要求的(Davison1989b,Moss1996)。在第一种情况下，核酶被置于启动子下游，R区域上游。核酶被设计成顺式裂解RNA以产生正确的5’末端。在第二种情况下，方法是修饰R区域以掺入额外的序列。对5’和3’LTRR区域都必须这么做。具有依赖于T7的系统的优点是它需要通过两个重组痘苗病毒感染细胞以产生转导EIAV病毒颗粒。例如，一个MVA可携有载体基因组(在T7启动子的控制之下)和gag/pol和env序列(在痘苗病毒启动子的控制之下)。其它MVA可携有受痘苗病毒启动子控制的T7聚合酶基因(Wyatt等1995)。本发明的逆转录病毒载体颗粒也能够转导不能被非慢病毒，如MLV有效转导的缓慢分裂的细胞。缓慢分裂的细胞约3至4天分裂1次，其包括某些肿瘤细胞。尽管肿瘤含有快速分裂的细胞，但一些肿瘤细胞，尤其是肿瘤中心的细胞分裂仍很缓慢。或者，靶细胞可以是能进行细胞分裂的生长停滞的细胞，例如肿瘤块中央部分的细胞或干细胞，如造血干细胞或CD34-阳性细胞。或者，靶细胞可以是分化细胞的前体，例如单核细胞前体，CD33-阳性细胞或骨髓前体。或者，靶细胞可以是分化细胞，例如神经元，星形细胞，胶质细胞，微胶质细胞，巨噬细胞，单核细胞，上皮细胞，内皮细胞或肝细胞。从人个体分离之后，靶细胞可被体外转导或直接进行体内转导。本发明载体系统对一个或多个治疗基因的传递可以单独使用或与其它治疗或治疗组分联合使用。例如，可使用本发明的逆转录病毒载体传递一个或多个可用于治疗WO-A-98/05635中所列疾病的NOI。为了易于参考，下面列出其中的一部分疾病癌症，炎症或炎性疾病，皮肤病，发烧，心血管病，出血，凝结和急性期反应，恶病质，厌食，急性感染，HIV感染，休克状态，移植物-抗-宿主反应，自身免疫病，重复灌注损伤，脑膜炎，偏头痛和依赖于阿斯匹林的抗-血栓形成；肿瘤生长，发病和扩散，血管生成，转移，恶性肿瘤，腹水，恶性胸膜渗漏；大脑局部缺血，局部缺血性心脏病，骨关节炎，风湿性关节炎，骨质疏松，气喘，多发性硬化，神经退化，早老性痴呆，动脉粥样硬化，中风，脉管炎，局限性回肠炎和溃疡性结肠炎；牙周炎；龈炎；牛皮癣，特应性皮炎，慢性溃疡，大疱性表皮松解；角膜溃疡，视网膜病和外科伤口愈合；鼻炎，过敏性结膜炎，湿疹，过敏症；再狭窄，充血性心脏病，子宫内膜异位，动脉粥样硬化或endosclerosis。另外，或者，可使用本发明的逆转录病毒载体传递一个或多个可用于治疗WO-A-98/07859中所列疾病的NOI。为了易于参考，下面列出在人或兽药中可治疗的其中一部分疾病细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制剂或免疫刺激剂活性(如治疗免疫缺损，包括如免疫缺损病毒感染；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和很多自身免疫病，防止移植排斥或诱导肿瘤免疫力)；调节血细胞生成，如治疗骨髓或淋巴疾病；促进骨，软骨，腱，韧带和神经组织的生长，如愈合创伤，治疗烧伤，溃疡，牙周病和神经退化；抑制或激活促滤泡激素(调制能育性)；趋化活性(例如将特异性细胞类型移动至受伤或感染位点)；止血和溶栓活性(如治疗嗜血杆菌病和中风)；抗炎症活性(如治疗脓毒性休克或局限性回肠炎)；抗微生物剂；代谢或行为的调制剂，止痛剂；治疗特异性缺损疾病；治疗例如牛皮癣。另外，或者，可使用本发明的逆转录病毒载体传递一个或多个可用于治疗WO-A-98/07859中所列疾病的NOI。为了易于参考，下面列出其中一部分疾病巨噬细胞抑制和/或T细胞抑制活性，因此，抗炎症活性；抗-免疫活性，即针对细胞和/或体液免疫反应，包括与炎症不相关之反应的抑制作用；抑制巨噬细胞和T细胞粘附细胞外基质组分和纤连蛋白的能力，以及上调T细胞中的fas受体表达；抑制不必要的免疫反应和炎症，包括关节炎(包括风湿性关节炎)，与超敏反应相关的炎症，变态反应，气喘，全身性红斑狼疮，胶原病和其它自身免疫病，与动脉粥样硬化相关的炎症，动脉粥样硬化，粥样硬化性心脏病，重复灌注损伤，心动停止，心肌梗塞，血管炎，呼吸窘迫综合征或其它心肺病，与消化道溃疡相关的炎症，溃疡性结肠炎和其它胃肠道疾病，肝纤维变性，肝硬变或其它肝病，甲状腺炎或其它腺病，肾小球肾炎或其它肾和泌尿道疾病，耳炎或其它耳-鼻-喉疾病，皮炎或其它皮肤病，牙周炎或其它牙病，睾丸炎或睾丸附睾炎，不育症，睾丸外伤或其它与免疫相关的睾丸病，胎盘功能异常，胎盘机能不全，习惯性流产，惊厥，惊厥前期和其它与免疫和/或炎症相关的妇科疾病，前眼色素层炎，中眼色素层炎，后眼色素层炎，结膜炎，脉络膜视网膜炎，眼色素层视网膜炎，视神经炎，眼内炎症，如视网膜炎或类囊肿斑水肿，交感性眼炎，巩膜炎，视网膜着色，退化性fondus病的免疫和炎症成分，眼外伤的炎症成分，由感染引起的眼炎症，增生的玻璃体-视网膜病，急性缺血性视觉神经病，过多瘢痕形成，例如青光眼滤过手术之后的瘢痕形成，抗眼移植物的免疫和/或炎症反应和其它与免疫和炎症相关的眼炎，与自身免疫病相关的炎症(此时，在中枢神经系统(CNS)或任何其它器官中，免疫和/或炎症抑制将是有利的)，帕金森氏病，治疗帕金森氏病引起的并发症和/或副作用，AIDS-相关的痴呆综合征，HIV相关的脑病，视神经脊髓炎，Sydenham舞蹈病，早老性痴呆和其它CNS退化性疾病或紊乱，Stokes氏病的炎症成分，脊髓灰质炎后综合征，精神病的炎症成分，脊髓炎，脑炎，亚急性致硬化全脑炎，脑脊髓炎，急性神经病，亚急性神经病，慢性神经病，急性感染性多神经炎，Sydenham舞蹈病，重症肌无力，假-肿瘤脑，Down氏综合征，Huntington氏综合征，肌萎缩性侧索硬化，CNS受压或CNS外伤或CNS感染的炎症成分，肌肉萎缩和营养不良的炎症成分，中枢和外周神经系统的免疫和炎症相关疾病，外伤后炎症，脓毒性休克，传染病，手术的炎症并发症或副作用，骨髓移植或其它移植并发症和/或副作用，基因治疗的炎症和/或免疫并发症和副作用(例如因为被病毒载体感染)，或与AIDS相关的炎症，阻遏或抑制体液和/或细胞免疫反应，通过减少单核细胞或淋巴细胞的量来治疗或缓解单核细胞或白细胞增殖性疾病，例如白血病，移植天然或人造细胞，组织和器官(例如角膜，骨髓，器官，晶状体，起搏器，天然或人造皮肤组织)时预防和/或治疗移植排斥。本发明还提供了通过基因疗法治疗个体的药物组合物，其中组合物含有治疗有效量的本发明的逆转录病毒载体或由其产生的或得自该载体的病毒颗粒，所述载体含有一个或多个可传递的治疗和/或诊断用NOI。药物组合物可用于人或动物。一般说来，医生可决定最适于个体受试者的实际剂量，该剂量取决于特定个体的年龄，体重和反应。组合物可任选含有药物可接受的载体，稀释剂，赋形剂或佐剂。药物载体，赋形剂或稀释剂的选择取决于给药途径和标准的药物学操作方法。除载体，赋形剂或稀释剂外，药物组合物可含有任何适当的结合剂，润滑剂，悬浮剂，包被剂，增溶剂和其它能辅助或增加病毒进入靶位点的载体试剂(例如脂质传递系统)，也可含有这些试剂作为载体，赋形剂或稀释剂。适当时，可通过下列方式中的任何一种或多种施用药物组合物吸入剂，栓剂或阴道药栓的形式，典型地为洗剂，溶液，乳剂，软膏或撒粉的形式，使用皮肤贴片，以含有如淀粉或乳糖之赋形剂的片剂形式口服，或者以单独或与赋形剂混合的胶囊或卵状小体形式口服，以含有调味剂或着色剂的酏剂，溶液或悬浮液的形式口服，或者可以非肠道注射，例如intracavernosally，静脉内，肌内或皮下注射。对于非肠道给药而言，最好以无菌水溶液的形式使用组合物，所述溶液可含有其它物质，例如足够的盐或单糖以制备与血液等渗的溶液。对于口或舌下给药而言，可以按常规方式配制的片剂或锭剂形式施用组合物。通过本发明的载体系统传递一个或多个治疗基因的方法可以单独使用，或与其它治疗或治疗成分联合使用。可治疗的疾病包括但不限于癌症，神经病，遗传病，心脏病，中风，关节炎，病毒感染和免疫系统疾病。适当的治疗基因包括编码肿瘤抑制蛋白，酶，前体药物激活酶，免疫调制分子，抗体，经改造的免疫球蛋白样分子，融合蛋白，激素，膜蛋白，作用于血管的蛋白质或肽，细胞因子，趋化因子，抗病毒蛋白质，反义RNA或核酶。在本发明治疗方法的优选实施方案中，使用本发明的载体系统将编码前体药物激活酶的基因传递至肿瘤，随后用适当的前体药物治疗个体。前体药物的例子包括表鬼臼毒素吡喃葡糖苷磷酸酯(与碱性磷酸酶联合，Senter等，1988，ProcNatlAcadSci854842-4846)；5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶联合，Mullen等，1994，癌症研究，541503-1506)；阿霉素-N-对羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素-V-酰胺酶联合，Kerr等，1990，癌症免疫及免疫疗法31202-206)；对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸酯(与羧肽酶G2联合)；头孢菌素氮芥氨基甲酸酯(与β-内酰胺酶联合)；SR4233(与P450还原酶联合)；9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(与HSV胸苷激酶联合，Borrelli等，1988ProcNatlAcadSci857572-7576)；芥子前体药物(与硝基还原酶联合，Friedlos等，1997，药物化学杂志，401270-1275)和环磷酰胺或异环磷酰胺(与细胞色素P450联合，Chen等，1996，癌症研究561331-1340)。根据本发明，可使用本领域技术人员熟知的标准分子生物学技术。文献中完整描述了该技术。例见Sambrook等(1989)分子克隆；实验室手册；Hames和Glover(1985-1997)DNA克隆操作方法，第Ⅰ-Ⅳ卷(第2版)；免疫球蛋白基因工程方法，McCafferty等(1996)，“抗体工程操作方法”。参照下列附图，在实施例中进一步描述了本发明图1-显示出质粒pESP，pONY3和pONY2.1nIsLacZ之转录单位的结构。图2-显示出整合EIAV载体的PCR分析，用EIAV载体转导细胞(泳道1和5)或模拟转导细胞(泳道2和6)的基因组DNA进行PCR。pONY2.1nIsLacZ(泳道3和7)和pONY3(泳道4和8)被用作对照。A.PCR检测EIAVLTR。B.PCR检测pol。图3-显示出用于鉴定EIAV载体之包装需求的缺失质粒的载体转录单位结构。图4-显示出得自pONY2.13LacZ中存在的gag转录单位的RNA二级结构预测。图5描述了衍生自EIAV基因组的载体。图6描述了衍生自EIAV的gagpol构建体。图7描述了含有S2缺失的EIAV载体。图8描述了具有缺失的S2和dUTP酶基因的EIAVgagpol构建体。图9描述了EIAV基本载体。图10描述了显示出本发明EIAVgagpol构建体分析的凝胶。图11显示出pONY4载体的例子。图12显示出两个SIN载体。图13描述了具有割裂polyA信号的载体。图14描述了具有割裂polyA信号的载体。图15描述了具有割裂polyA信号的载体。图16显示出具有割裂polyA信号的pONY4-GFP的构建。图17显示出MLV/EIAV载体的构建。图18显示出构建MLV/EIAV载体所用的引物。图19显示出pONY-小鼠的完整序列。图20和21显示出PCR的引发过程。图22显示出pEMVA4(用引物EMAV1-8进行PCR之后)。图23显示出pEMVA4。图24显示出pEMVA5。图25和26显示出5’末端形成的锤头策略的例子。图27显示出pEMVA6。图28显示出pEMVA7和pSynpONY4.1。图29显示出EMVA10/11。图30显示出pEMVA9。图31显示出pEMVA10。图32显示出pLWHORSE3.1。图33显示出pMCRev。图34显示出pYFVSVG。图35显示出pYFAmpho。图36显示出重组的MVA构建体。图37显示出pSC65的完整序列。图38显示出pLW22的完整序列。详细解释图1．该研究中使用的质粒。显示出EIAV的基因组结构，其包括剪接供体(d1，d2和d3)和剪接受体位点(a1，a2和a3)。也显示出gag,pol,env,tat,rev,S2和病毒LTR的位置。质粒pESP是含有SV40启动子和嘌呤霉素抗性基因的EIAV载体基因组。质粒pONY3是EIAVgagpol表达质粒。pONY2.1nIsLacZ是含有HCMVIE增强子/启动子和β-半乳糖苷酶基因(nlslacZ)的EIAV载体基因组。图2显示出整合EIAV载体的PCR分析，用EIAV载体转导细胞(泳道1和5)或模拟转导细胞(泳道2和6)的基因组DNA进行PCR。pONY2.1nIsLacZ(泳道3和7)和pONY3(泳道4和8)被用作对照。A．PCR检测EIAVLTR。B．PCR检测pol。表2。转导分裂和非分裂细胞。根据Lewis等(Lewis,P.F和M.Emerman，1994，病毒学杂志，68510-6)的方法，用(空心柱)或不用(阴影柱)蚜肠霉素处理293T细胞，然后用EIAV载体pONY2.1nIsLacZ或MLV载体HIT111(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)进行转导。48小时之后，用X-gal染色细胞，将两次独立实验的滴度平均值计算为每ml的lacZ集落形成单位。实验之间的误差不超过10％。图10显示出gagpol表达构建体的分析。通过SDS/PAGE电泳分离30微克总细胞蛋白质，转移至硝酸纤维素滤膜上，用抗-EIAV抗体进行探测。第二抗体是抗马HRP(Sigma)。，将三次独立实验的滴度平均值计算为每ml的lacZ集落形成单位。实验之间的误差不超过10％。用EIAVgagpol共转染pONY2.1nIsLacZ和包膜表达质粒。实施例1-构建含有缺失的gag基因的EIAV载体为了构建无复制能力的EIAV载体系统，我们将Payne等(1994，普通病毒学杂志，75425-9)所述的感染性原病毒克隆pSPEIAV19(登记号为U01866)用作起点。根据Payne等(文献同上)的编号系统除去对应于5835/6571位的HindⅢ/HindⅢ片断以简单地缺失部分env，籍此构建原始的基于EIAV的载体。此片断被pTIN500(Cannon等，1996，病毒学杂志，708234-8240)中受SV40早期启动子控制的嘌呤霉素抗性基因所取代，产生pESP(图1)。通过用pESP和pRV67(Kim等，1998，病毒学杂志，72(1)811-6)磷酸钙转染293T细胞(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)产生病毒原种，质粒pRV67中的水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)由HCMV-IE增强子/启动子表达。也可使用其它VSV-G表达质粒，例见Yee等，1994，PNAS919564-9568。按下述使用所得上清液转导人肾(293T)和犬骨肉瘤细胞(D17)。转染48小时之后，收集组织培养液，流过0.45μm滤器进行过滤。用含有8μg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物的培养基制备10倍稀释物，然后将500μl等分试样置于前一天接种有1.6×105个细胞/孔D17细胞的12孔培养板中。2小时后，加入1ml培养基。2天后，加入嘌呤霉素至终浓度为4μg/ml，再持续保温7天。作为阳性对照，将基于鼠白血病病毒(MLV)的载体(pTIN500)与pHIT60(MLVgagpol)和pRV67(Cannon等，1996，病毒学杂志，708234-8240)联合使用，其中pTIN500含有受SV40早期启动子控制的嘌呤霉素抗性基因。用EIAV载体进行嘌呤霉素选择达7天之后，在任一种细胞类型上都未观察到抗性集落。MLV载体在293T细胞上产生了5.0×104c.f.u./ml，在D17细胞上产生了1.0×104c.f.u./ml。对此结果作类似的扩展，即在缺乏tat，因而不能产生足够量的重要成分，如gagpol和tat时，EIAVLTR在人细胞中不具有功能。因此，构建了另一个载体系统，其含有3个转录单位以产生1)载体基因组RNA；2)env和3)gag-pol。为了确保产生足够量的每种成分，env和gag-pol转录单位由在选定人包装细胞系中具有活性的启动子-增强子转录。通过这种方式，产生了足够量的gag-pol(最可能是tat)以确保有效产生有转导能力的载体颗粒。构建了载体基因组，该基因组的pol区域内具有下述报道基因。通过将由pSPEIAV19经PCR扩增的EIAVLTR插入pBluescriptⅡKS+(Stratagene)构建出质粒pONY1。使用pfu聚合酶，用下列引物PCR扩增EIAV克隆pSPEIAV19的5’LTR5’GCATGGACCTGTGGGGTTTTTATGAGG3’GCATGAGCTCTGTAGGATCTCGAACAGAC通过补平5’突出端使扩增子成为平端，使用T4DNA聚合酶将其插入用BssHⅡ切割，通过除去3’突出端而成为平端的pBluescriptⅡKS+中。此构建体被称为pONY1，相对于pBluescriptⅡKS+的β-半乳糖苷酶而言，其方向为5’至3’。对pONY1的测序未显示出有突变。用MluⅠ(216/8124)切割载体基因组pSPEIAV19DH，插入用MluⅠ(216)切割的pONY1中以制备pONY2。用BssHⅡ消化(619/792)pBluescriptⅡKS+得到多克隆位点。通过补平5’突出端使其成为平端，连接至用BglⅡ和NcoⅠ(1901/4949)切割的pONY2中，通过补平5’突出端使其成为平端。相对于EIAV序列而言，方向为3’至5’，称之为pONY2.1。通过将pLNCX(登记号M28246)(PstⅠ/HindⅢ)插入pSP72(Promega)产生pSPCMV。将pTIN414(CannonPM等，病毒学杂志，70，8234-8240)的β-半乳糖苷酶基因插入pSP72(XhoⅠ/SphⅠ)中产生pSPlacZ。β-半乳糖苷酶基因的5’末端被pAD.RSVbgal(J.Clin.Invet.90626-630，1992)的SV40T抗原核定位信号取代。用XhoⅠ/ClaⅠ切割pAD.RSVbgal，并插入用XhoⅠ/ClaⅠ切割的pSPlacZ中产生pSPnlslacZ。用PstⅠ切下pSPlacZ和pSPnlslacZ中CMV核定位和非核定位的β-半乳糖苷酶，以EIAV的5’至3’方向将其插入pONY2.1的PstⅠ位点。所得构建体被称为pONY2.1nlslacZ和pONY2.1lacZ。将pONY2ΔH的MluⅠ/MluⅠ片断插入哺乳动物表达载体pCl-neo(Promega)中以制备EIAVgagpol表达质粒(pONY3)，从而使gag-pol基因由hCMV-MIE启动子-增强子表达。具体地说，用MluⅠ(216/8124)切割gagpolpSPEIAV19DH并插入用MluⅠ(216)切割的pCl-neo(Promega)中以制备pONY3。质粒pONY3不应产生功能性的基因组，因为其缺乏适当的LTR序列。按与基于MLV的载体相同的方法(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)，通过用3种质粒pRV67，pONY3和pONY2.10nlsLacZ瞬时共转染293T细胞以产生病毒，然后按下述用病毒转导293T细胞和D17细胞。转染48小时之后，收集组织培养液，流过0.45μm滤器进行过滤。用含有8μg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物的培养基制备10倍稀释物，然后将500μl等分试样置于前一天接种有1.6×105个细胞/孔D17细胞的12孔培养板中。2小时后，加入1ml培养基，再持续保温48小时，使用大肠杆菌β-半乳糖苷酶的X-gal染色方法评估LacZ基因的表达(macGregor等，1991，分子生物学方法，Vol7，EJMurray编，p217-235)。在这两种情况下，病毒以约105LacZ-转导细胞-形成单位(l.f.u.)/ml的频率转导细胞，该频率比由pHIT111产生的基于MLV的载体约低10倍。这些数据表明我们已制备出基于EIAV的载体系统，也暗示着用外源DNA取代env的HindⅢ/HindⅢ片断可破坏基因组的功能。接着，我们鉴定了EIAV载体颗粒成为假型病毒的能力，所述假型病毒具有得自其它病毒的包膜蛋白。用产生MLV兼嗜性(pHIT456)和MLV亲嗜性(pHIT123)包膜(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)以及VSV-G(pRV67)的包膜表达质粒共转染pONY2.10nlsLacZ和pONY3(表1)。用包膜质粒共转染pHIT111(MLV载体基因组)和pHIT60(MLVgagpol表达质粒)作为阳性对照(表1)。用病毒上清液转导多种细胞系，包括人肾(293T)，鼠胚(NIH3T3)和犬骨肉瘤(D17)细胞系。如所预期的，病毒的细胞嗜性在很大程度上由包膜决定。EIAV可以是具有兼嗜性包膜的假型病毒，但转导效率有所不同。兼嗜性假型病毒在D17细胞上的滴度约为102，在NIH3T3细胞上的滴度约为103，在293T细胞上的滴度约为104。这些差异的原因未被深究。EIAV也可以是具有MLV亲嗜性包膜的假型病毒，这些病毒以104l.f.u./ml的滴度转导NIH3T3细胞，用具有VSV-G包膜的EIAV假型病毒转导所有受试细胞系。不同包膜和细胞类型之间的滴度不同，对非鼠细胞而言，整体效率相对较高，但仍低于鼠载体系统的效率。总之，这些数据表明EIAV载体系统并不依赖于EIAV包膜，其可有效地成为具有3个赋予宽宿主范围之包膜的假型病毒。这使得该系统与目前使用的基于MLV的系统一样有用。按相同的方式，使用RD114包膜，例如使用pRDF(Cosset等，1995，病毒学杂志，697430-7436)也可使EIAV载体成为假型病毒。为了鉴定转导事件，我们进一步对被具有VSV-G的EIAV假型病毒载体转导的293T细胞进行了PCR分析。具体地说，我们想知道与具有gagpol表达质粒pONY3的重组体相反的载体基因组是否已成为β-半乳糖苷酶基因的转导载体。当使用分离自转导细胞的基因组DNA时，使用特异于EIAVLTR的引物进行PCR扩增，得到预期的310bp的PCR产物(图2A，泳道1)。当将模拟转导的293T细胞DNA用作模板时，未检测到PCR产物(图2A，泳道2)。pONY2.10nlsLacZ被用作阳性对照(图2A，泳道3)。当pONY3被用作模板时未检测到PCR产物(图2A，泳道4)。使用pol特异性引物时PCR产物的缺乏(图2B)进一步证实pONY3中的gagpol序列未整合至宿主染色体中。总之，这些数据说明真正的载体基因组转导了细胞。为了测定EIAV载体是否保留了转导非分裂细胞的能力，根据已知方法(Lewis和Emerman1994)，通过用蚜肠霉素处理将293T细胞滞留在G1/S相，然后用具有VSV-G的基于EIAV和基于MLV的假型病毒载体转导细胞。与未经处理的细胞相比，在经蚜肠霉素处理的细胞中，MLV载体的转导效率要低4个数量级。MLV细胞转导的不完全阻断可能是分裂细胞小群体所致。与之形成对照的是，在基于EIAV的载体中未观察到显著差异。这表明EIAV载体与HIV载体一样都可有效地转导非分裂细胞。载体基因组pONY2.10lacZ含有1377个核苷酸长的gag。使用RNA二级结构预测(“http://www.ibc.wustl.edu/～zuker/ma/”)鉴定gag前导序列和5’末端内可能的茎环结构。根据这些预测，在pONY2.10lacZ的gag区域进行4种缺失(图1)。使用标准方法通过PCR诱变进行缺失。pONY2.1lacZ含有1377个核苷酸长的gag(从1901位核苷酸开始缺失)pONY2.11lacZ含有354个核苷酸长的gag(从878位核苷酸开始缺失)pONY2.12lacZ含有184个核苷酸长的gag(从708位核苷酸开始缺失)pONY2.13lacZ含有109个核苷酸长的gag(从633位核苷酸开始缺失)pONY2.14lacZ含有2个核苷酸长的gag(从526位核苷酸开始缺失)按与基于MLV的载体相同的方法(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)在3质粒共转染中使用这些载体，将产生的病毒滴定在293T细胞和D17细胞上。发现gag编码序列的前109个核苷酸是除非翻译区域外的最大包装所需的；pONY2.13lacZ(表2)。在D17细胞上发现类似的滴度。图4显示出得自pONY2.13lacZRNA之gag序列的推测的二级结构。根据图4中推测的二级结构，在pONY2.13lacZ的主要剪接供体密码子的上游和下游区域内又进行了4种缺失。pONY2.21lacZ含有第409至421位核苷酸的缺失pONY2.22lacZ含有第424至463位核苷酸的缺失pONY2.23lacZ含有第470至524位核苷酸的缺失pONY2.24lacZ含有第529至582位核苷酸的缺失pONY2.25lacZ含有第584至645位核苷酸的缺失pONY2.26lacZ含有第409至421位核苷酸的缺失和第470至524位核苷酸的缺失按上述方法，在3质粒共转染中使用这些载体，将产生的病毒滴定在D17细胞上。发现此区域的缺失严重影响病毒的滴度(表3)。构建体pONY2.23和2.26给出最低的滴度。它们都含有第470至524位核苷酸的缺失。最不严重的缺失是第409至421位核苷酸的缺失。根据这些数据，主要剪接供体周围的区域对最佳包装是有用的。可使用类似的二级结构预测和缺失分析来鉴定其它非灵长类动物慢病毒的包装信号。表1．病毒载体的转导效率<tablesid="table1"num="001"><table>载体包膜滴度(l.f.u./ml)aD17NIH3T3293TpONY2.1nlslacZ模拟＜1＜1＜1pONY2.1nlslacZpHIT456(MLVamp)1.0×1028.4×1022.0×104pONY2.1nlslacZpHIT123(MLVeco)＜11.5×104＜1pONY2.1nlslacZpRV67(VSVG)1.0×1053.6×1032.0×105pHIT111模拟＜1＜1＜1pHIT111pHIT456(MLVamp)1.3×1052.6×1062.0×107pHIT111pHIT123(MLVeco)＜12.8×106＜1pHIT111pRV67(VSVG)3.0×1062.0×1055.0×106</table></tables>a转导了每种细胞类型，转导靶细胞48小时之后，染色β-半乳糖苷酶活性。将3次独立实验的平均滴度计算为每ml的lacZ形成单位。实验之间的误差不超过10％。用EIAVgagpol表达质粒(pONY3)共转染pONY2.1nlslacZ和包膜表达质粒。用MLVgagpol表达质粒(pHIT60)共转染pHIT111和包膜表达质粒。表2<tablesid="table2"num="002"><table>载体基因组滴度(l.f.u./ml)pONY2.103.30E+04pONY2.111.60E+05pONY2.121.40E+05pONY2.131.70E+05pONY2.145.40E+02模拟1.0E+01</table></tables>表3<tablesid="table3"num="003"><table>载体基因组滴度(l.f.u./ml)2.211.20E+042.223.80E+032.231.20E+022.245.20E+022.255.60E+022.261.00E+022.134.00E+04</table></tables>实施例2-构建pEGASUS-1按下述制备基于EIAV的载体(pEGASUS-1)，其仅含有759个核苷酸长的EIAV序列(第268-675位核苷酸和第7942-8292位核苷酸)。通过PCR扩增，由pONY2.10LacZ得到包含EIAV多嘌呤序列片断(PPT)和3’LTR的序列，所用引物为PPTEIAV+(Y8198)GACTACGACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG和3’NEGSpeⅠ(Y8199)CTAGGCTACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAG。纯化产物，用SpeⅠ(ACTAGT)消化，并连接至用SpeⅠ消化并用碱性磷酸酶处理而制备的pBSⅡKS+中。筛选转化至大肠杆菌XL-1Blue之后得到的菌落中是否存在3’LTR，所述LTR的方向应使3’LTR的U5区域邻近pBSⅡKS+接头的NotⅠ位点。测定克隆插入物的序列，结果表明与EIAV克隆pSPEIAV19(ACU01866)相比，它仅含有一个变化，即R区域的碱基3和4之间的‘C’插入。在PCR反应所用的模板中也发现了相同变化。该克隆被称为pBS.3’LTR。接着，将报道基因盒CMV启动子/LacZ导入pBS.3’LTR的PstⅠ位点。CMV/LacZ盒为pONY2.10LacZ(见上文)的PstⅠ片断。连接上述片断，用连接物转化大肠杆菌XL-1Blue。大量克隆中CMV/LacZ插入物的定向使得LacZ基因邻近3’LTR，通过使用标准方法将其转染至293T细胞系中来评估CMV/LacZ盒的活性。选择转染后48小时通过用X-gal显色而呈现蓝色细胞的克隆待用，并称之为PBSCMVLacZ.3’LTR。在表达载体pCIEneo中构建EIAV载体的5’区域，pCIEneo是pCIneo(Promega)经修饰的衍生物，其另外包含上述完整CMV启动子之5’末端的约400bp片断。使用引物VSAT1(GGGCTATATGAGATCTTGAATAATAAAATGTGT)和VSAT2(TATTAATAACTAGT)，pHIT60为模板，通过PCR扩增得到该400bp的片断。用BglⅡ和SpeⅠ消化产物，连接到已经过类似消化的pCIneo中。使用引物CMV5’EIAV2(Z0591)(GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTG)和3’PSI.NEG(GCTGAGCTCTAGAGTCCTTTTCTTTTACAAAGTTGG)，以？为模板DNA扩增从R区域至gag编码区之第150位核苷酸(核苷酸268至675)的EIAV基因组片断。引物CMV5’EIAV2的5’区域含有紧接CMV启动子转录起始位点上游的序列，并可被SacⅠ切割。3’PSI.NEG与通过缺失分析(上文)限定的EIAV包装序列的3’端结合，并含有XbaⅠ位点。用SacⅠ和XbaⅠ切下PCR产物，连接至为连接而制备的经相同酶消化的pCIEneo中。该操作将EIAVR区域的起点置于CMV启动子的转录起始位点，如此产生的转录物从EIAV所用的真正的起始位置开始，并延伸至包装信号的3’端。通过限制性分析评估正确的克隆，测定其序列，选择被称为pCIEneo.5’EIAV的克隆供进一步研究。接着，将pBS.CMVLacZ.3’LTR中的CMVLacZ和3’LTR盒导入pCIEneo.5’EIAV。用ApaⅠ消化pBS.CMVLacZ.3’LTR，用T4DNA聚合酶除去3’突出端，然后用NotⅠ消化。通过标准分子生物学技术纯化含有CMVLacZ.3’LTR的片断。用SalⅠ消化pCIEneo.5’EIAV，接着用T4DNA聚合酶补平5’突出端，籍此制备与上述片断连接用的载体。然后用NotⅠ消化DNA，纯化后用于连接反应。转化大肠杆菌XL-1Blue之后，通过限制性分析筛选出存在插入物的菌落以鉴定出被称为pEGASUS-1的所需克隆。使用实施例1所述的3质粒共转染系统比较pEGASUS-1EIAV载体与pONY2.10LacZ的功能。得自两个载体的滴度差不多，这表明pEGASUS-1含有以良好效率包装所需的所有序列。实施例3-将RRE导入EIAV载体通过导入其它元件改善滴度对EIAV载体pEGASUS-1作进一步改进。方便导入所述元件的位点是SalⅠ位点，该位点位于包装信号3’端XbaⅠ与pEGASUS-1之CMV/LacZ盒上游之间。例如，可将HIV或EIAV的RRE插入该位点。使用引物RRE(+)GTCGCTGAGGTCGACAAGGCAAAGAGAAGAG和RRE(-)GACCGGTACCGTCGACAAGGCACAGCAGTGG，通过PCR扩增由HIV-1分子克隆pWI3(Kimpton和Emerman1992，病毒学杂志，662232-2239)得到HIV-1RRE。用SalI消化DNA片断和pEGASUS-1，连接后转化大肠杆菌XL-1Blue。筛选存在HIVRRE的菌落，将含有正向或反向HIVRRE的两个克隆用于进一步研究。通过进行4质粒共转染在293T细胞中检测载体pEGASUS-2.HIVRRE(+)或pEGASUS-2.HIVRRE(-)，其中表达HIV-1rev蛋白的质粒pCIneoHIVrev与载体pONY3和pRV67质粒共转染。按下述通过PCR扩增得到文献中限定(Martarano等，1994)的EIAVRRE。使用pONY2.10LacZ作为模板进行2次扩增，得到两部分EIAVRRE。使用引物ERRE1(TTCTGTCGACGAATCCCAGGGGGAATCTCAAC)和ERRE2(GTCACCTTCCAGAGGGCCCTGGCTAAGCATAACAG)得到5’元件，使用引物ERRE3(CTGTTATGCTTAGCCAGGGCCCTCTGGAAGGTGAC)和引物ERRE4(AATTGCTGACCCCCAAAATAGCCATAAG)得到3’元件。这些产物互相退火，因此可用于第二次PCR反应，得到‘编码’EIAVRRE的DNA。前10轮循环不用引物ERRE1和ERRE4，然后在反应中加入这两种引物再进行10轮扩增循环，籍此建立PCR扩增。用SalⅠ消化所得PCR产物和pEGASUS-1，连接后转化大肠杆菌XL-1Blue。筛选含有正向或反向EIAVRRE的克隆用于进一步研究。在4质粒共转染中评估这些载体的活性，用SalⅠ消化pEGASUS-1，连接后转化大肠杆菌XL-1Blue。筛选含有正向或反向EIAVRRE的克隆用于进一步研究。在3质粒共转染(EIAVrev由pONY3提供)或上述4质粒共转染实验(使用pCIneo.EIAVRev提供其它的EIAVrev)中评估这些载体的活性。为了构建pCIneo.EIAVREV，通过PCR扩增得到EIAVREV编码序列。使用上述EIAVRRE所用的两步“重叠”PCR扩增法得到EIAVREV序列。两次反应的模板是pONY3，5’片断的引物是EIAVREV5’O(CCATGCACGTCTGCAGCCAGCATGGCAGAATCGAAG)和EIAVREVIN(CCTGAGGATCTATTTTCCACCAGTCATTTC)，3’产物的引物是EIAVREVIP(GTGGAAAATAGATCCTCAGGGCCCTCTGG)和EIAV.REV3’O(GCAGTGCCGGATCCTCATAAATGTTTCCTCCTTCG)。10轮循环之后加入引物EIAVREV5’O和EIAV.REV3’O进行第二次PCR扩增。将所得产物与PCR片断“TA”克隆载体pCR2.1(Invitrogen)连接，通过限制性酶分析评估EIAVREV插入物的方向，进一步证实了正确EIAVREV序列的存在。该构建体被称为pTopoRevpos。通过用SpeⅠ和NotⅠ消化从pTopoRevpos中切下EIAVREV插入物，连接至已用NheⅠ和NotⅠ消化的pCIneo中。实施例4-转导人巨噬细胞按下述从富含白细胞的血液(得自国立输血机构，SouthmeadRdBristol,UK)中得到人原代单核细胞。根据厂商说明，通过在Ficoll不连续梯度(Pharmacia)上离心富集外周血单核细胞(PBMC)。将该细胞群体粘附至含有RPMI1640培养基(Dutch改良的；Sigma)的组织培养用塑料板上，从中得到巨噬细胞，所述培养基含有2％热灭活人AB血清(Sigma)或10％FCS(Sigma)。用培养基充分洗涤培养板以除去未粘附的细胞。将3种质粒共转染至293T细胞中可得到转导实验所用的病毒。实验所用载体是pONY2.13衍生物，其中CMV/LacZ报道基因盒已被CMV/绿色荧光蛋白(GFP)取代。按下述制备载体pONY2.13GFP。用BglⅡ和XbaⅠ从pEGFP-N1(Clontech“http://www.clontech.com/”)中切下编码红移GFP的序列和真核翻译信号，并连接至已用相同酶消化的通用克隆载体pSP72(Promega)中。然后使用XhoⅠ切下编码GFP的序列，连接至已用XhoⅠ切割(籍此释放LacZ编码区)的pONY2.13中。转化大肠杆菌XL-1Blue之后，通过限制性分析测定GFP插入物相对于CMV启动子的方向能使表达按预期完成的克隆，通过将DNA转染至293T细胞进一步证实GFP的表达。将3种质粒共转染至293T细胞并在转染后42-48小时收集回收载体将组织培养液流过0.45μm滤器进行过滤，4℃，用SW40Ti转子，以50，000g(20Krpm)的转速离心90分钟以沉淀病毒。将病毒重新悬浮于50-100μl完全培养基中达2小时，再用于转导实验。按下述用pONY2.13GFP载体进行转导用培养基将按5×105个细胞/孔的密度接种于48孔培养板的巨噬细胞洗涤1次，然后在细胞孔中再放300μl培养基。在培养基中加入病毒，缓慢吸放2至3次以确保混匀。转导后3至5天评估转导效率。使用荧光显微镜测定被转导的巨噬细胞的数目。监测一段时间(例如几周)内GFP的表达。或者，用携有LacZ标记物的载体进行转导。在该实验中，通过使用免疫学方法检测β-半乳糖苷酶的存在来评估转导效率。实施例5-体内转导EIAV载体至大鼠脑用含有1份Nembutal(0.1ml/35gm体重)，1份Novetal(0.1ml/35gm体重)和2份dH2O的溶液麻醉成年Wistar大鼠，并置于脑功能区定位仪中。沿着头皮的腹侧至尾侧长度进行中线切开，将皮肤拉向一边以露出颅骨。使用3.00mm后和3.00mm侧的脑功能区定位坐标(由Bregma测定)，在颅骨中钻一个直径为1mm的孔。使用10μlHamilton注射器或1.0μl细玻璃毛细管单侧皮质内注射EIAV载体至距脑表面不同深度处。将注射器在注射部位放5分钟以防止回流。对照动物只接受用10μlHamilton注射器或1.0μl细玻璃毛细管皮质内注射的盐水。然后缝合动物待其恢复。48小时之后，按上述将这些动物深度麻醉，用200ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌流心脏。然后解剖取出脑，在干冰制冷的异戊烷(-30℃)中冷冻，用低温控制器在10μm处进行冠切割。将穿过注射位点和2mm腹侧和尾侧的每第5个切片集中到Super-Frost载玻片上，固定，用X-gal染色或进行免疫染色或用CresylViolet染色。实施例6-转导在培养中分化的支气管细胞上皮细胞可分化形成上皮样单层，该单层显示出(＞1000Ωcm3)电阻和骰状形态。有多种方法可做到这一点，例如Fuller等，1984。这会产生极化细胞。该极性是功能性的，它模拟了体内上皮细胞。因此按实施例1至3所述，用载体和制品穿过基底外侧表面或尖顶表面即可用EIAV载体转导这些细胞。实施例7-基本EIAV系统为了消除辅助基因或具有有害作用的编码序列对治疗应用的风险，构建了缺乏tat，S2和dUTP酶的载体系统。构建S2突变体A)载体基因组pONY2.13lacZ含有gag的109个核苷酸(第633-4949位核苷酸缺失)(pONY2.13lacZ的描述见上文)。使用该载体制备EIAV载体基因组，通过缺失第5345-5397位的核苷酸从中消除了S2表达。除去了S2的ATG起始密码子和env的起始密码子。为了制备S2中的缺失，使用pONY2.13DNA为模板，用SY2/SY5和SY3/SY4进行PCR。收集这两种PCR产物，用引物SY5和SY3进行PCR。将1.1kb的产物连接至pGEMT-easy(Promega)中以制备pGEMS2，测序以进一步证实缺失。通过用CelⅡ从pGEMS2中切下1.1kbS2区域并连接至pONY2.13lacZ中可制备pONY2.13lacZDS2。B)gagpol构建体将pONY3中S2的相同区域缺失以防止pONY3DS2和pONY2.13DS2之间的重组重建S2基因。使用pONY3DNA为模板，用SY1/SY2和SY3/SY4进行PCR扩增以制备pONY3DS2。收集这两种PCR产物，用引物SY1和SY3进行PCR。将0.7kb的产物连接至pGEMT-easy(Promega)中以制备pGEMS22，测序以进一步证实缺失。通过用NotⅠ从pGEMS22中切下0.7kbS2编码区域并插入pBluescriptKS+(Stratagene)中可制备pBPCRS2。将pONY3(2.2kb)的EcoRV和NcoⅠ片断插入已用EcoRV和NcoⅠ切割的pBPCRS2中可制备pBpONYS2。然后用EcoRV和CelⅡ进行切割(2.9kb片断)并插入已用EcoRV和CelⅡ切割过的pONY3中以制备pONY3DS2。构建dUTP酶突变体通过将第4176位核苷酸由T定点诱变为A残基可制备pONY3DdUTPase(Payne等，病毒学，210302-313)。该突变使天冬氨酸变为谷氨酸。使用PCR引物dUTPaseF和dUTPaseR，通过PCR扩增可实现该突变。模板DNA是pONY3。将PCR产物插入pGEMT-easy中，测序以进一步证实突变。所得载体为pGDdUTPase。用NotⅠ和EcoRV切割pONY3(4.6kb)并插入pBluescriptKS+(Stratagene)中以制备pBEV。用PacⅠ和PstⅠ切割pGDdUTPase，将0.4kb的带插入用PacⅠ和PstⅠ切割过的pBEV中，所得载体被称为pONY3pBDUTPase。经NotⅠ和EcoRV切割后(4.6kb)插入pONY3中以制备pONY3DdUTPase。构建S2和dUTP酶双突变体为了制备pONY3的双突变体，使用了构建体pBpONYS2。用PacⅠ和PstⅠ切割pGDdUTPase，将片断插入用PacⅠ和PstⅠ切割过的pBpONYS2中以制备构建体pS2DdUTPase。然后用EcoRV和CelⅡ切割并插入用EcoRV和CelⅡ切割过的pONY3中以制备pONY3DS2DdUTPase。分析S2和dUTP酶突变体按与基于MLV的载体相同的方法(Soneoka等，1995，核酸研究，23628-633)，在3质粒共转染的多种组合中使用pONY2.13lacZDS2，pONY3DdUTPase和pONY3DS2DdUTPase载体产生病毒，在处于分裂或非分裂状态的293T和D17细胞上滴定产生的病毒。通过用蚜肠霉素处理(9)将细胞滞留在G1/S相，然后用具有VSV-G的基于EIAV和基于MLV的假型病毒载体转导细胞(表4)。与未经处理的细胞相比，在经蚜肠霉素处理的细胞中，MLV载体的转导效率要低4个数量级。MLV细胞转导的不完全阻断可能是分裂细胞小群体所致。与之形成对照的是，在基于EIAV的载体中未观察到显著差异。这表明基于EIAV的系统在生产或转导时不需要S2或dUTP酶。Payne等(Payne等，病毒学，210302-313)和其他人已证明EIAVdUTP酶是感染马巨噬细胞所必需的。这表示EIAV感染巨噬细胞的限制。通过转导在基本培养基中培养7天的海马胚胎第14天的神经元细胞以检测S2和dUTP酶突变体的特性。多种EIAV载体之间没有显著差异。然而，MLV载体的转导效率显著降低。这表明S2和dUTP酶不是转导生理学上非分裂细胞所必需的。简单地说，我们得出结论对于载体生产或转导而言，载体系统的任何部分都不需要tat，S2和dUTP酶。实施例8-添加Rev/RRE上文已描述了pEGASUS-1的构建。该载体含有759bp长的EIAV序列。当反式提供Rev时，将EIAVRRE(0.7kb)导入pEGASUS-1产生pEGASUS/RRE，导致滴度增加4倍(表2)。该载体目前含有1.47kbEIAV。实施例9-构建改良的gagpol表达质粒在pONY3中，gagpol编码序列的起始位点之前有一段延伸的5’非翻译区域。这一异常长的序列可能会使gagpol盒的表达受到损害。为了改良gagpol的表达，可修饰pONY3以除去其余的5’LTR。通过用NarⅠ和EcoRV切割pONY3可做到这一点。将2.4kb的片断插入pBluescriptKS+(Stratagene)的ClaⅠ和EcoRV位点以制备构建体pBSpONY3.0。用XhoⅠ和EcoRV切割pBSpONY3.0，将2.4kb的片断插入pONY3的XhoⅠ和EcoRV位点以制备pONY3.1。该操作除去了引物结合区域内5’LTR至NarⅠ位点这一段序列(386个核苷酸)。该构建体使滴度增加了2倍，蛋白质的表达也有所增加(图10)。pONY3.1与pONY3类似，也编码gag，gagpol，tat，S2和Rev。由于S2突变实验证明S2不是生产系统或EIAV载体基因组所必需的，因此可以设计不含S2的gagpol表达构建体。产生了两个这种构建体，即pHORSE和pHORSE3.1。使用pONY3为模板DNA，用EGAGP5’OUTER/EGAGPINNER3和EGAGP3’OUTER/EGAGPINNER5经PCR扩增制备pHORSE。纯化这两个PCR产物，集中并使用引物EGAGP5’OUTER/EGAGP3’OUTER再次进行扩增。将该产物插入pSP72的XhoⅠ和SalⅠ位点，制备出pSP72EIAVgagpol0’lap。用PvuⅡ和NcoⅠ切割pONY3，将4.3kb的片断插入用PvuⅡ和NcoⅠ切割过的pSP72EIAVgagpolO’lap中，制备出pSPEGP。用XhoⅠ和SalⅠ切割该载体(4.7kb)并插入pCI-Neo的XhoⅠ和SalⅠ位点。该构建体被称为pCIEGP。用SalⅠ切下pEGASUS中的RRE(0.7kb)，插入pCIEGP构建体的SalⅠ位点，制备出pHORSE。当在存在或缺乏pCI-Rev(表达EIAVRev开放阅读框的构建体，见上文)时检测pHORSE构建体的蛋白质表达时，发现它与预期的相同，对Rev有依赖性。然而，蛋白质表达水平低于pONY3.1。另外，当用于产生病毒时，滴度比pONY3.1的低100倍。出乎意料地是，当将pONY3.1的前导序列(含有从5’LTR之U5末端至gag383-524nt的ATG起始密码子的序列)插入pHORSE，制备出pHORSE3.1时，蛋白质表达和病毒生产得以改善。通过用pONY3.1的1.6kbXhoⅠ/XbaⅠ片断取代pHORSE中1.5kb的XhoⅠ/XbaⅠ片断制备出pHORSE3.1。用pHORSE3.1得到的滴度类似于用pONY3.1得到的滴度。相对于pONY3.1而言，pHORSE3.1滴度略低的原因可能是用pHORSE3.1进行4质粒共转染(因为该系统依赖于Rev)的需求所致。因此，我们得出结论基本的EIAV载体系统应具有该前导序列以使gagpol的表达水平最大化。当pHORSE3.1，pRV67，pCIRev和pEGASUS/RRE被用于4质粒共转染时(表6)，产生了高滴度的病毒(2.0×104l.f.u./ml)。该系统缺乏Tat中负责Tat反式激活的第二个外显子(Southgate等，病毒学杂志，1995，692605-2610)。这表明Tat不是基于EIAV的载体系统所必需的。通过对pHORSE3.1的骨架进行改造以表达Rev(用EIAVRev的开放阅读框取代Neo开放阅读框)可消除对4质粒共转染的需求。通过用StuⅠ和BstⅪ切割pCI-Neo并用T4DNA聚合酶补平5’突出端即可做到这一点。籍此产生4.6kb的载体片断，其中插入了得自pTopoRevpos的Rev开放阅读框(用SacⅠ和XbaⅠ切割产生0.6kb的带，其中使用T4DNA聚合酶补平5’突出端)。该载体被称为pCREV。用XhoⅠ和NotⅠ从pHORSE3.1中切下包括RRE和前导序列的EIAVgagpol读码框(5.5kb)，插入pCREV的XhoⅠ和NotⅠ位点，得到pEGPR3.1。EIAVgagpol的密码子最优化应消除gagpol蛋白质表达对RRE/Rev系统的依赖性。使用异源RNA输出系统，如得自摩-傅猴病毒(MPMV)的组成型运输元件(CTE)也可消除pEGASUS-1对Rev/RRE的需求(Bray等，PNAS，1994，911256-1260，Kim等，1998)。表4载体gagpolD17细胞上的比例滴度(l.f.u./ml)(非分裂细胞分裂细胞非分裂细胞/分裂细胞)S2+S2+,dUTPase+2.2×1051.1×1050.5S2-S2+,dUTPase+l.5×l051.3×1050.9S2-S2-,dUTPase+1.0×1051.2×1051.2S2-S2-,dUTPase-1.5×1051.6×1051.1S2+S2-,dUTPase+2.2×1052.3×1051.0S2+S2-,dUTPase-1.5×1051.4×1051.0S2+S2+,dUTPase-1.5×1051.4×1051.0MLV载体1.2×1076.7×1050.0006模拟实验＜1＜11pONY2.10LacZ和pEGASUS+/-EIAVRRE的比较具有Rev的滴度高于pEGASUS-l的滴度，甚至在不舍RRE时也是如此，REV的作用可能由gagpol表达增强来体现。表6用pCI-Rev和pRV67对293T细胞进行转染。将病毒滴定至D17细胞上。引物SY5ACCCCGTACGTCTTCCCGAGCG(下划线的是SunⅠ)dUTPaseFGTTATTAATTAATGGAGGAATAATTGAAGAAGGATATAC(下划线的是PacⅠ)(黑体的碱基是由T至A的单碱基变化，该变化使dUTP酶灭活)dUTPaseRTCTTCTGCAGGTCCTGATCCTTGCTTAGTGC(下划线的是PstⅠ)S2StopRGACCATGTTACCCCTTTACCATTAACTCCCTAATATCAAAC(黑体的碱基是由TATGG至TTAGG的变化，该变化除去了S2的起始密码子)S2StopFGTAAAGGGGTAACATGGTCAGCATCGCATTCTACGGGGGAATCC(黑体的碱基是由TATGG至TACGG的变化，该变化除去了S2的起始密码子)EGAGP5’OUTERCCATGCACGTCTCGAGCCAGCATGGGAGACCCTTTGAC(下划线的是XhoⅠ)EGAGP3’OUTERCGAGCTAGAGGTCGACTCAATTTGGTTTATTAGTAAC(下划线的是SalⅠ)EGAGPINNER3GCAATGGAATGACATCCCTCAGCTGCCAGTCC(下划线的是PvuⅡ)EGAGPINNER5GGGATGTCATTCCATTGCCACCATGGGAAGTATTTATCACTA(下划线的是NcoⅠ)实施例10-pONY4载体系列为了避免在转录EIAV基因组时使用Tat并增加全长转录物的量，对pEGASUS载体(实施例2)而言可用HCMV增强子/启动子取代EIAVU3(5’LTR)。质粒构建pONY2.11lacZ的gag中含有缺失，仅保留了373bp的gagORF。通过用pEGASUS-1的CMVLTR取代5’LTR可制备pONY4。用BglⅡ/XhoⅠ切割pEGASUS-1释放出3.2kb片断(含有CMVLTR)，将该片断插入用BglⅡ/XhoⅠ切割的pSP72中。该构建体被称为pSPPEG213。用HpaⅠ/NarⅠ切割该构建体，将1.3kb的片断(包含CMVLTR)插入用NaeⅠ/NarⅠ切割的pONY2.11lacZ中。pONY4.1在lacZ基因下游(SfuⅠ和SalⅠ位点之间)含有缺失(2.1kb)，使得tat,S2,env,rev和RRE或者缺失或者被大大截短(图11c)。通过用SfuⅠ/SalⅠ切割，用Klenow聚合酶使之成为平端并进行再连接可制备出pONY4.1。通过用pEGFP-N1(Clontech)的GFP基因平端片断(BamHⅠ/XbaⅠ切割后再用Klenow聚合酶使之成为平端)取代pONY4的lacZ基因(SacⅡ/KpnⅠ切割后再用Klenow聚合酶使之成为平端)可制备pONY4G。载体的产生和检测用16微克载体质粒，16微克gagpol质粒和8微克包膜质粒，通过磷酸钙法转染铺于10cm培养皿中的人肾293T细胞以产生载体原种。转染36-48小时之后，过滤(0.45μm)上清液，等分成小份，储存于-70℃。4℃，以20000rpm超速离心(SW40Ti转子)90分钟以制备浓缩的载体制品。将病毒重新悬浮于PBS中达3-4小时，等分成小份，储存于-70℃。在8μg/ml1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物的存在下进行转导。始终可观察到pONY2.11lacZ产生的滴度比较少缺失的pONY2.10lacZ产生的滴度约高2至4倍。对pONY4而言，当其5’LTR中的U3被CMV增强子/启动子取代时，滴度又增加了5至10倍。实施例11-EIAV“自我-灭活”的载体(SIN-载体)LTR中的元件会影响得自EIAV载体的转基因在特定细胞类型中的表达。为了除去该元件，可构建SIN(自我灭活的)载体，然而，有效产生载体所必需的某些序列必须维持，这一需求影响到该载体的精确构型(分子细胞生物学，1996，Sep；16(9)4952-5l)。RNA结构是通过裂解和聚腺苷酸化特异性因子进行poly(A)位点识别的决定因素，GraveleyBR,FlemingES,GilmartinGM，病毒学杂志，1996，Mar；70(3)1612-7，两个不大相关的慢病毒中通过U3序列增强mRNA3’加工的共有机制，GraveleyBR,GilmartinGM。另外，SIN载体提供了避免在转导细胞中产生全长转录物的途径。制备了两个SIN载体一个含有推定的重要序列(用于聚腺苷酸化)，该序列位于MluⅠ和MunⅠ位点之间，另一个中缺失了所述序列。缺失的5’边界是距3’LTR之U3区域的5’末端112个碱基处。图12中示出了两个SIN载体的结构。pONY4G.SIN-MLU和pONY4G.SIN-MUN载体中存在的缺失以破折线表示，引物以斜体表示。使用pONY4G为模板，经聚合酶链反应扩增得到核苷酸7300至8079(根据登记号为U01866的EIAV克隆pSPEAIV19计数)之间的DNA序列。扩增的有义引物为ERRE3，反义引物为SIN-MLU(C7143GTCGAGCACGCGTTTGCCTAGCAACATGAGCTAG，黑体为MluⅠ位点)或SIN-MUN(C7142GTCGAGCCAATTGTTGCCTAGCAACATGAGCTAG，黑体为MunⅠ位点)，其中下划线序列与(pSPEIAV19)的核苷酸8058-8079互补。分别用NspⅤ和MluⅠ或MunⅠ消化PCR产物，然后连接至分别用NspⅤ(SfuⅠ)和MluⅠ(部分消化)或MunⅠ消化过的pONY4G中。实施例12-具有反向构型内部启动子-报道基因盒的EIAV载体在如pONY4Z或pONY4G的EIAV载体中，内部CMV-报道基因盒的定向使自5’LTR和内部启动子的转录方向相同，在两个启动子的转录物中使用了3’LTR的聚腺苷酸化信号。通过调转内部启动子-报道基因盒的方向得到另一种构型，然而，聚腺苷酸化信号必需置于盒的下游。按下述制备一例“反向”载体。用PstⅠ消化pONY4Z，用T4DNA聚合酶补平突出的末端。将其用作“载体”片断与pEGFP-C1的MluⅠ/AseⅠ片断(含有包括CMV-GFP-SV40早期mRNApolyA信号盒的序列)进行连接。连接前，用T4DNA聚合酶使该片断成为平端。载体编码质粒被称为pONY4Greverse。通过与分别表达EIAVgag/pol和VSV-G蛋白的pONY3.1和pRV67共转染，从pONY4Greverse中回收载体颗粒。pONY4Greverse对D17犬细胞的滴度比平行回收的pONY4G载体低13倍。pONY4Greverse的滴度较低可能是驱动基因组转录的CMV启动子和GFP相互之间的干扰所致，然而，插入的CMV-GFP-polyA盒中存在的得自SV40的聚腺苷酸化信号对基因组RNA的截短作用也是一个原因。通过用牛生长激素聚腺苷酸化(BGHpA)信号取代pONY4Greverse的聚腺苷酸化信号可制备改良载体。为了进行这种改良，用BstAPⅠ消化pONY4Greverse，用T4DNA聚合酶使其成为平端，用PstⅠ进行切割。将该“载体”片断与代表BGHpA的DNA片断连接，后一片断的制备方法如下用SphⅠ消化pcDNA3.1+(Invitrogen)，然后用T4DNA聚合酶使其成为平端，再用PstⅠ进行切割。实施例13-构建并使用含有内含子的polyA信号在本文所述的pONY载体中，所用聚腺苷酸化信号得自EIAV，其位于3’LTR的R和U5边界。该信号可能不是最优化的，因为它们不是共有序列(见Whitelaw和Proudfoot，1986EMBO5；2915-2922和Levitt等，1989，Gen.andDev.3；1019-1025，其中描述了聚腺苷酸化信号的共有序列)。改良病毒聚腺苷酸化的一个方法是用共有的/强聚腺苷酸化信号的polyA取代3’LTRpolyA信号。通过这种方法，使生产细胞中的信号最优化。然而，转导后丢失了该信号，因为在复制过程中，5’LTR是polyA信号的来源(见逆转录病毒1998CSH出版社(J.Coffin编)，有关逆转录病毒生命周期的综述)。解决这一问题(转导后没有强的聚腺苷酸化信号)的新方法是以下列详细描述的方式导入polyA信号该方法使用“割裂的polyA信号”，其中通过内含子将aataaa基元与必需的g/u盒分开。Liu等人(1993N.A.R.21；5256-5263)以前使用过该信号，他们阐明aataaa和g/u盒之间的大缺口会使polyA信号失去功能，聚腺苷酸化过程先于剪接。通过将割裂的polyA信号置于逆转录病毒载体中，该信号在转导靶细胞之前不再起作用。这是因为聚腺苷酸化先于剪接，因此生产细胞中的载体表达过程中不使用上游割裂的polyA信号。图13图示了含有割裂的polyA信号的逆转录病毒载体在生产和转导细胞中是如何起作用的。首先，该图阐明尽管存在上游共有的聚腺苷酸化信号，但必要时使用病毒或其它polyA信号仍可使原始载体转录物平常的3’LTR聚腺苷酸化。这是因为尽管上游polyA信号在最终的载体基因组中是有功能的，但聚腺苷酸化机器并没有读出该信号，因为该信号只在除去内含子时产生，而并不存在于主要的RNA转录物中。第二，该图阐明通过转导，所得载体转录物在第一信号处被聚腺苷酸化；该信号已成为正常的强的聚腺苷酸化信号，而没有内含子将必需的aataaa和g/u盒分开。在逆转录病毒载体中包含这种割裂的polyA信号有下列很多优点(1)在转导细胞内使用强的不基于病毒的聚腺苷酸化信号会增强所述细胞中的基因表达。(2)使用基于天然LTR(见图13)之信号上游的polyA信号，转导后会产生较短的在其3’端含有较少病毒序列的RNA转录物，因此不能进行随后的逆转录病毒的逆转录。实际上，如果目的基因由内部启动子(如CMV)而不是LTR表达，转导细胞中表达所得的转录物可被设计成根本不含病毒序列(见图13A)。(3)包含3’LTR上游信号意味着割裂polyA信号下游RNA的表达仅限于生产细胞，因为转导细胞中不转录这种RNA。因此将某些序列的表达(如IRESneo；见图14B)限于生产细胞。(4)生产细胞中内含子的存在将有助于载体RNA由核输出。(5)由于转导后存在内部功能性的polyA信号，因此必要时可除去/缺失5’LTR中的病毒polyA信号(逆转录过程中为3’位置的拷贝)。这么做的用途是防止生产细胞中自5’LTR启动子-近侧的聚腺苷酸化过程(见Scott和Imperiale1997(分子细胞生物学，172127-35))，因此促进病毒全长转录物的产生。实例为了阐明该信号在逆转录病毒中的用途；按图15所述构建“割裂的polyA信号”盒；其中内含子序列得自pCI(Promega)。制备好以后，使用与pONY4-GFP(图16)唯一的sse8387位点相容的PstⅠ将该盒克隆至pONY4GFP载体中。转导后，所得载体的3’LTR之前被聚腺苷酸化，因此3’至lacZ的病毒RNA不能被转录(图16)。实施例14-构建MLV/EIAV载体通过用MLV等同物取代EIAVLTR序列，pONY载体的重复区域(R)内不再具有功能性的tar元件，结果，U3启动子不需要转导细胞中的Tat即可行使功能。图17描述的是用图18所述引物经重叠PCR制备载体的过程。使用引物Me1和Me2由MLV载体pHIT111(Soneoka等，1995，NAR23628-633)扩增PCR产物，而使用引物Me3和Me4由pONY4lacZ扩增产物。然后在无引物的PCR反应中将所得的两个产物混合以重叠它们(图17的阴影部分显示出两个产物之间的同源性)。用BglⅡ和XbaⅠ切割最终的全长产物，并用于取代pONY4lacZ(含有CMV/R/U5)的Bgl1-XbaⅠ片断，制备出pONY4-5’MLV。所得载体具有得自MLV的CMV/R/U5序列，该序列与EIAVU5序列(整合前由整合酶进行基因组识别所需的序列)相连。下一步包括用引物Me5和Me6由pONY4LacZ模板进行PCR扩增和用引物Me7和Me8由pLXSN模板(Miller和Rosman1989生物技术7980-990)进行PCR扩增。然后通过无引物的PCR重叠这两个PCR产物(引物之间的同源性由开口的框表示)，用NspⅤ和MunⅠ切割所得片断，插入pONY4-5’MLV的NspⅤ-MunⅠ位点；从而用与pONY4lacZ之3’UTR/ppt/U3整合酶结合位点融合的3’MLVLTR取代3’EIAVLTR。所得质粒被称为pONY-MOUSE(见图19完整的DNA序列)，当在HIT系统中与pONY3.1和pRV67联合时，滴度为104-5/ml。实施例15-驱动慢病毒载体基因组的早期启动子在此实施例中，EIAV基因组由痘苗病毒早期启动子P7.5E(Davison1989a)表达。启动子经改造后可产生具有正确5’RNA末端的EIAV基因组。另外，还将痘苗病毒早期终止序列插入EIAV基因组的下游。将所得产物插入转移质粒pSC65，它可同源重组至MVA基因组的TK区域。通过其缺乏对BudR的敏感性这一特征来选择重组病毒(Earl等，1998)。图11图示说明了实施例10所述的EIAV基因组载体pONY4.0和pONY4.1以及痘苗病毒转移载体pSC65(Chakrabarti等，1997)。P7.5E序列是AAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATT。早期启动子的早期终止序列是TTTTTNT(N=任何核苷酸)(Fields)。按下述进行DNA操作，图20和21给出了PCR引物的序列。引物为EMVA1/2的PCR产生了U3区域被P7.5E启动子取代的5’LTR。使用HindⅢ/PstⅠ位点将其插入质粒pSP72(Promega)以制备pEMVA1。EIAVU3含有与痘苗病毒早期终止规则相匹配的序列(TTTTTAT)。使用引物EMVA3/4和EMVA5/6和重叠PCR，将该区域突变为TTTCCAT以防止早期终止。使用BglⅡ/PstⅠ位点将该PCR产物插入pEMVA1，产生pEMVA2。使用引物EMVA7/8将终止序列(TTTTTTTTT)插入3’LTRR区域的下游。使用MunⅠ/BglⅡ位点将该PCR产物插入pEMVA2得到pEMVA3。经由NarⅠ/NspⅤ位点将EIAV载体基因组的其余部分(pONY4)插入该质粒得到pEMVA4(图22)。然后用PacⅠ/BglⅡ切割，插入用PacⅠ/BamHⅠ切割过的pSC65中，得到pEPONY4(BglⅡ和BamHⅠ相容)(图23)。这样就除去了两个痘苗病毒启动子和pSC65的lacZ编码盒。为了制备该构建体与pONY4.1类似的基本EIAV基因组版本，用SalⅠ/NspⅤ切割pEMVA4，使其成为平端并再连接以制备出pEMVA5(图24)。这样就除去了lacZ基因末端和末端包膜区域之间的很多序列，因此该载体不含Tat，Rev，S2和Env。相关描述见实施例10。然后用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割过的pSC65中，制备出pEPONY4.1(BglⅡ和BamHⅠ相容)(图24)。这样就除去了两个痘苗病毒启动子和pSC65的lacZ编码盒。使用BHKTK-ve细胞系(ECACC85011423)和构建重组痘病毒的标准方法(Earl等，1998a&1998b)，pEPONY4.0和pEPONY4.1都适于将基因组表达盒插入MVA基因组的TK区域(CarrollMW和MossB病毒学1997Nov24；238(2)198-211)。实施例16-驱动慢病毒载体基因组的合成的早期/晚期启动子痘苗病毒合成的早期/晚期启动子对RNA起始位点的下游序列是有要求的(Davison1989b)。为此，用于产生逆转录病毒基因组的启动子要么R区域被修饰，要么使用核酶产生正确的5’末端。修饰R区域是困难的，因为起始位点还未全部被鉴定，其序列也有差异(Davison1989b)。下文描述了由合成的早期/晚期启动子(Psyn)表达EIAV基因组的转移质粒的产生。启动子的下游插入了核酶以确保产生正确的RNA5’末端。该构建体还含有早期终止序列。DNA操作如下引物为EMVA9/1的PCR产生了U3区域被Psyn启动子和锤头核酶取代的5’LTR(图25和26)。使用PacⅠ/NarⅠ位点将其插入质粒pEMVA4(实施例15)，制备出pEMVA6(图27)。用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割过的pSC65中，制备出pSynPONY4(BglⅡ和BamHⅠ相容)(图27)。这样就除去了两个痘苗病毒启动子和pSC65的lacZ编码盒。为了制备该构建体与pONY4.1类似的基本EIAV基因组版本，用SalⅠ/NspⅤ切割pEMVA6，使其成为平端并再连接以制备出pEMVA7(图28)。然后用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割过的pSC65(痘苗病毒转移载体)中，制备出pSynPONY4.1(BglⅡ和BamHⅠ相容)(图28)。这样就除去了两个痘苗病毒启动子和pSC65的lacZ编码盒。用构建重组痘病毒的标准方法(Earl等，1998a&1998b)，pSynPONY4.0和pSynPONY4.1都适于将基因组表达盒插入MVA基因组的TK区域(CarrollMW和MossB病毒学1997Nov24；238(2)198-211)。实施例17-驱动慢病毒载体基因组的T7启动子可使用T7启动子产生逆转录病毒基因组，其可制备出正确的5’末端。下文描述了由T7启动子(T7)表达EIAV基因组的转移质粒的产生。还将T7终止序列插入该启动子的下游。将所得产物插入转移质粒pSC65，它可同源重组至MVA基因组的TK区域。T7启动子需要T7聚合酶，可以使用由痘苗病毒启动子表达T7聚合酶的MVA病毒(Wyatt等，1995)。T7启动子具有序列(-)TAATACGACTCACTATAGG(+2)，转录自A之后开始，优选自连续几个G开始。T7终止序列是CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG。T7启动子和终止序列描述于质粒pCITE-4a(+)(Novagen)中。DNA操作如下引物为EMVA10/11的PCR(图29)产生了U3区域被T7启动子取代的5’LTR。使用PacⅠ/NarⅠ位点将其插入质粒pEMVA4，制备出pEMVA8(图30)。引物为EMVA11/7的PCR产生了具有T7终止序列的3’LTR部分，使用MunⅠ/BglⅡ位点将其插入pEMVA8以制备pEMVA9。用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割过的pSC65(痘苗病毒转移载体)中，制备出pT7PONY4(BglⅡ和BamHⅠ相容)(图30)。这样就除去了两个痘苗病毒启动子和pSC65的lacZ编码盒。为了制备该构建体与pONY4.1类似的基本EIAV基因组版本，用SalⅠ/NspⅤ切割pEMVA9，使其成为平端并再连接以制备出pEMVA10(图31)。然后用PacⅠ/BglⅡ切割并插入用PacⅠ/BamHⅠ切割过的pSC65(痘苗病毒转移载体)中，制备出pT7PONY4.1(BglⅡ和BamHⅠ相容)(图31)。这样就除去了两个痘苗病毒启动子和pSC65的lacZ编码盒。用构建重组痘病毒的标准方法(Earl等，1998a&1998b)，pT7PONY4.0和pT7PONY4.1都适于将基因组表达盒插入MVA基因组的TK区域(CarrollMW和MossB病毒学1997Nov24；238(2)198-211)。实施例18-构建EIAVgag/pol盒以在痘苗病毒中表达EIAVgag/pol的表达一般需要Rev/RRE，因为Rev能使未剪接的转录物输出至核外。由于痘病毒位于胞质中，因此EIAV病毒RNA的输出应该不成问题。但是，如果Rev具有其它功能，例如可维持RNA稳定性或作为翻译增强子起作用，可以类似的方式将其表达为EIAVgag/pol(Martarano1994)。或者，可使EIAVgag/pol序列的密码子最优化以克服输出的Rev/RRE需求并增强RNA的稳定性。下文描述了由合成的早期/晚期启动子(Psyn)表达EIAVgag/pol的载体的产生。将其插入转移质粒pLW-22(Wyatt和Moss附录1，Earl等1998a&b)，它可同源重组至MVA基因组的DelⅡ区域。通过其表达的lacZ来选择重组病毒。用XhoⅠ/NotⅠ切割pHORSE3.1(实施例9)给出5.5kb的带，从而得到包括前导序列和gag/pol开放阅读框和RRE的EIAVgag/pol(图32)。然后将其插入用SalⅠ/NotⅠ(SalⅠ和XhoⅠ相容)切割的痘苗病毒转移载体pLW-22中，制备出pLWHORSE3.1(图32)。实施例19-构建EIAVrev盒以在痘苗病毒中表达如果由痘病毒产生EIAV病毒载体需要Rev，可由合成的早期/晚期启动子(Psyn)进行表达。将该构建体插入转移质粒pMCO3，它可同源重组至MVA基因组的DelⅢ区域。通过其表达的GUS来选择重组病毒(Carroll等，1995)。DNA操作如下质粒pCIRev描述于实施例9。该质粒是EIAVRev表达质粒。用AflⅡ/NotⅠ切割(0.6kb)，通过T4DNA聚合酶使其成为平端，插入用PmeⅠ切割的pMCO3(Carroll等，1995)中，得到pMCRev(图33)。实施例20-构建异源包膜盒以在痘苗病毒中表达EIAV可以是具有多种包膜，如VSV-G和兼嗜性MLV包膜的假型病毒。下文描述了由P7.5早期/晚期启动子表达兼嗜性包膜或VSV-G包膜的MVA转移载体的产生。转移载体是pYF6，它可同源重组至MVA的HA区域。通过直接对env的表达进行活免疫染色可选择重组病毒。为了产生含有VSV-G盒的转移载体，用SmaⅠ/EcoRⅤ切割VSV-G表达质粒pRV67(Kim等，1998)(1.7kb)，将所得片断插入用SmaⅠ切割的pYF6中，制备出pYFVSVG(图34)。类似地，为了产生类似的兼嗜性包膜构建体，用XbaⅠ切割pHIT456(Soneoka1995)，用T4DNA聚合酶使2.2kb的带成为平端，插入用SmaⅠ切割的pYF6中，得到pYFAmpho(图35)。用构建重组痘病毒的标准方法(Earl等，1998a&1998b)，pYFAmpho和pYFVSVG都适于将基因组表达盒插入MVA基因组的HA区域(CarrollMW和MossB病毒学1997Nov24；238(2)198-211)。实施例21-构建和扩增MVA-Lenti重组体通过依次与相关转移质粒重组，构建出重组痘苗病毒，所述病毒含有多个编码EIAV载体成分的插入物(图25)。下文例举了v.MEeG-Or的构建(图36)1．用携有gag-pol的质粒(pLWHORSE3.1)转染BHK-21或CEF细胞，所述细胞以前曾被MVA感染过(Carroll和Moss1997，Earl等1998a&b)。2．感染2天后，在BHK-21/CEF上检测重组MVA病毒，在细胞上覆盖一层琼脂培养基，其中含有由pLW22表达的颜色标记β-半乳糖苷酶的底物(Chakrabarti等，1985)。3．挑选蓝色噬斑，进行噬斑纯化直至得到均一的重组病毒群体。4．然后用重组病毒与含有其它重组基因的转移质粒重组pMCRev，其中基于GUS表达进行选择(Carroll和Moss1995)，基因组(pEPONY4.0)，其中使用BudR基于TK阴性表型进行选择(Carroll和Moss1997，Earl等1998a&b)和VSVG(pYFVSVG)，其中通过直接免疫染色VSVG来鉴定重组体(Earl等1998a&b)。按下述在BHK-21或CEF细胞中扩增重组病毒增殖痘苗病毒高度减毒的毒株MVA衍生自有复制能力的毒株Ankara，并且在原代的鸡胚成纤维细胞中经过570次传代。起初认为MVA复制局限于CEF细胞，因为哺乳动物细胞中的复制极少见报道。然而，进一步的分析表明仓鼠幼肾细胞(BHK-21)能支持高滴度的MVA产生。因此，MVA可在BHK-21或原代CEF细胞上生长(Carroll和Moss1997，病毒学238198-211)。为了制备CEF细胞，取出10天龄鸡胚的内脏，除去四肢和头，铰碎，在0.25％胰蛋白酶溶液中进行消化并于37℃保温。将细胞悬浮液流过一层过滤筛以进行过滤，洗涤细胞，在SorvallRC-3B中以2000rpm的转速离心5分钟使细胞浓缩。将细胞悬浮于含有10％FCS的MEM中，等分至175cm培养瓶中，37℃在CO2温箱中保温。当细胞单层95％铺满时，用胰蛋白酶进行消化，用于接种另一培养瓶或6孔培养板。或者，将原代培养物转移至31℃的温箱中待用(Sutter和Moss(1992)ProcNatlAcadSciUSA8910847-1085l)。制备粗的，半纯化的和纯化的病毒原种粗的病毒原种可用于初步的重组病毒分析或作为病毒原种用于随后的高滴度病毒的制备。通过离心出细胞膜和核或通过防止预表达的重组蛋白产物和细胞器污染的其它步骤(包括蔗糖离心)可对痘苗病毒制品进行半纯化。所用方法为Earl等1998a&b；Earl和Moss，文献同上，pp.16.17.1-16.17.16；Earl和Moss，文献同上，pp.16.18.1-16.18.10；和Bronte等(1997)ProcNatlAcadSciUSA94(7)3183-3188所述方法的改良方法。粗病毒在CEF或BHK-21(得自ATCC)中培养MVA，在175cm2组织培养瓶中，在HeLa或BS-C-1(ATCC)中培养WR。简单地说，用感染复数约为1pfu的MVA或WR感染铺满的细胞单层。将病毒悬浮于10ml含有2％FCS的MEM中，并加入含有铺满的细胞单层的175cm2组织培养瓶中。37℃接种1小时之后，再加入20ml含有2％FCS的MEM。48至72小时之后，将感染的细胞刮到培养基中，1500g沉淀5分钟。为了制备粗病毒，将细胞重新悬浮于每个175cm2组织培养瓶中的2mlMEM(2％)中。将细胞冻融3次，超声处理，等分至1ml冷冻管中。冻融代表性的等分试样，滴定以测定病毒浓度。将病毒原种储存于-20℃以下。半纯化的制品按上述收集感染细胞(Earl等1998a&b；Earl和Moss，1991)。离心后将细胞重新悬浮于PBS(2ml/175cm2培养瓶)中，在冰上，在适当密封的玻璃dounce匀浆器中经30至40次摩擦以匀浆细胞。通过显微镜检查细胞破裂情况。300g离心5分钟(4℃)以除去核，细胞器和膜，保留上清液。将细胞沉淀物重新悬浮于1ml/175cm2培养瓶中，再次离心。收集上清液，等分后冷藏。纯化的制品按上述收集感染细胞(Earl等1998a&b；Earl和Moss，1991)，重新悬浮于10mMTris.Cl,pH9.0(2ml/175cm2培养瓶)中，从此将样品置于冰上。按上述使用10mMTris进行匀浆。使用XL2015超声杯(Misonics,USA)，以最大输出量(500W)超声处理裂解物1分钟(在冰上)。将样品置于冰上1分钟，重复超声处理3次。每次最多超声处理5ml样品，超声处理过程中要加冰。将裂解物小心地铺在SW-27离心管中的17ml36％蔗糖(溶于10mMTris.Cl,pH9.0)垫层上。4℃，用SW-27转子，以13500rpm(32，900×g)的转速将裂解物离心80分钟。弃去上清液，将病毒沉淀物重新悬浮于无菌的PBS中，在超声杯中超声处理1分钟(在冰上)。等分浓缩的病毒并储存于-20℃以下。实施例22-由MVA-EIAV杂合体产生EIAV载体颗粒如上所述大规模制备重组MVA-EIAV制品。使用这些制品感染不允许MVA进入的哺乳动物细胞以使所得上清液仅含有EIAV和非感染性的MVA(Meyer等，1991，Carroll和Moss1997)。适当的细胞系是MRC5(ATCC)。以3为感染复数感染细胞。感染可进行48小时左右，然后收集上清液，EIAV载体颗粒可直接使用或通过超速离心或交叉-流动法进行浓缩/纯化。为了大规模生产制品，可在悬浮液中或在微载体上或在滚动瓶中进行培养。按此方法制备的携有目的基因的EIAV载体可用于在体内或体外转导靶细胞。参考文献Blomer.U..Naldini,L..Kafri.T_Trono,D_Verma,I.M_andGage,F.H.(1997).用慢病毒载体在成年神经元中进行高效和持续基因转移，病毒学杂志，71，6641-6649。Blomer,U_Naldini.L_Verma,I.M_Trono,D_andGage,F.H.(1996).将基因疗法应用于GNS，人类分子遗传学，5SpecNo,1397-404。Clever,J_Sassetti,C_andParslow.T.G.(1995)。人免疫缺损病毒1型5’包装信号的RNA二级结构和针对gag基因产物的结合位点，病毒学杂志，69，2101-9。Clever.J.L..andParslow,T.G.(1997)。RNA二聚体化或衣壳化有缺陷的突变的人免疫缺损病毒1型基因组，病毒学杂志，71，3407-14。Fields,B.N_Knipe,D.M_andHowley,P.M.(1996).FieldsVirology,R.M.Chanock,J.L.Melnick,T.P.Monath,B.RoizmanandS.E.Straus.编.(philadelphia.NewYork:Lippincott-RavenPublishers).FullerS.vonBonsdorffCH,SimonsK.水泡性口炎病毒仅通过极化上皮细胞系MDCK的基底层表面感染和成熟，细胞，1984Aug;38(1)65-77Harrison,G.S_Long,c.J_Maxwell,F_Glode,L.M..andMaxwell,I.H.(1992).在含有整合的，受HIV-调节的白喉毒素A链基因的细胞中抑制HIV的产生，爱滋病研究和人逆转录病毒，8，39-45。HayashiT,ShiodaT,IwakuraY.ShibutaH.人免疫缺损病毒1型的RNA包装信号，病毒学，1992Jun;188(2)590-599KimV.N_MitrophanousK_KingsmanS.M_KingsmanA.J.1998.基于人免疫缺损病毒1型的慢病毒载体的基本需求，病毒学杂志，199872811-6.Kim,S.Y_R.Bym,J.Groopman,andD.Baltimore.1989.人免疫缺损病毒感染过程中DNA和RNA合成的时序特征差异基因表达的证据，病毒学杂志，633708-3713。Lewis,P.F..andM.EmerD18n.1994.通过有丝分裂传代是致癌逆转录病毒而不是人免疫缺损病毒所必需的，病毒学杂志，68510-6。MannR,MulliganRC,BaltimoreD.逆转录病毒包装突变体的构建及其产生无辅助病毒的缺损逆转录病毒的用途，细胞，1983May；33(1)lS3-lS9Martarano,L_Stephens,R_Rice,N..andDerse,D.(1994).马传染性贫血病毒反式调节蛋白Rev控制病毒mRNA的稳定性，累积和其它的剪接方式，病毒学杂志，68，3102-11。Naldini,L_Blomer,U..Gage,F.H_Trono,D_andVerma,IM.(1996).注射了慢病毒载体的成年大鼠脑中转基因的有效转移，整合和持续的长期表达，ProcNatlAcidSciUSA93.11382-11388.Naldini,L..Blomer,U_Gallay.P..Ory.D_Mulligan.R_Gage,F.H_Verma,IM_andTrono.D.(1996).通过慢病毒载体进行体内基因传递并稳定转导非分裂细胞(见评论)，科学272.263-7.Payne,S.L..Rausch.J_Rushlow.K.Montelaro,R.C..Issel,C..Flaherty.M_Perry,S_Sellon,D_andFuller,F.(1994).鉴定马传染性贫血病毒的传染性分子克隆，普通病毒学杂志，75，425-9。Yee,1.-K_M.Atsushi,P.LaPorte.K.Bouic.J.C.Burns.andT.Friedmann(1994)产生高滴度泛嗜性逆转录病毒载体的一般方法高效感染原代肝细胞，Proc.Nlt1.Acad.Sci.USA919564-9568。Zufferey,R_Nagy.D_Mandel.R.1..Naldini,L_andTrono.D.(1997).多重减毒的慢病毒载体获得有效的体内基因传递，NatBiotechnol15，871-875。Cannon1996病毒学杂志，1996708234-40.基于鼠白血病病毒的Tat可诱导的长末端重复取代载体抗人免疫缺损病毒基因疗法所用的新系统，CannonPM,KimN,KingsmanSM,KingsmanAJ.CarrollMW,MossB大肠杆菌β-葡糖醛酸酶(GUS)用作重组痘苗病毒的标记，生物技术199519352-4CarrollMW.MossB痘苗病毒高度减毒的MVA毒株的宿主范围和细胞病理学重组病毒在非人哺乳动物细胞系中的增殖和产生，病毒学，1991238198-211ChakrabartiS,BrechlingK,MossB痘苗病毒表达载体β-半乳糖苷酶的共表达能可见地筛选重组病毒噬斑，分子细胞生物学，1985123403-9ChakrabartiS,SislerJR,MossB生物技术199761094-7用于蛋白质表达的严密的，合成的痘苗病毒早期/晚期启动子Davison1989a，分子生物学杂志，198920；210(4)749-69。痘苗病毒早期启动子的结构，DavisonAJ,MossBDavison1989b分子生物学杂志，1989210(4)771-84.痘苗病毒晚期启动子的结构，DavisonAJ,MossBPL.Earl(a).N.Cooper，LSWyatt,B.Moss&M.W.Carroll1998制备细胞培养物和痘苗病毒原种，分子生物学最新方法增刊，43Unit16.16.IohnWileyandSonsInc.PL.Earl(b),B.MossL.S.Wyatt,&M.W.Carroll1998产生重组痘苗病毒，分子生物学最新方法增刊43Unit16.17.分子生物学最新方法，JohnWileyandSonsInc.FlexnerC.HuginA.MossB自然1987330(614S)259-62通过载体介导的IL-2表达防止痘苗病毒感染免疫缺损小鼠HolzerGW,FalknerFG通过互补细胞系构建必需的DNA修复酶尿嘧啶DNA糖基化酶缺损的痘苗病毒，病毒学杂志，1997714997-5002KimVN,MitrophanousK,KingsmanSM,KingsmanAJ基于人免疫缺损病毒1型的慢病毒载体的基本需求，病毒学杂志，199872811-6MackettM,SmithOL,MossB痘苗病毒可选择的真核克隆和表达载体，ProcNatlAcadSciUSA198279237415-9MahnelH,MayrABerlMunchTierarJ.tlWochenschr1994Aug；107(8)253-6[使用疫苗株MVA进行抗人和动物正痘病毒之免疫的经验].[德文]ZenlralblBakteriol[B]1978Dec；167{5-6)375-90MartaranoL.StephensR,RiceN.DerseD马传染性贫血病毒反式调节蛋白Rev控制病毒mRNA的稳定性，累积和其它的剪接方式，病毒学杂志，1994May；68(5)3102-11MayrA.SticklH,MullerHK,DannerK,SingerH[天花免疫接种株MVA标记、遗传结构、亲代接种的经验以及具有主动防御机制的生物体的行为].ZentralbJBakteriol[B].1978Dec；167(5-6)375-90。德文。MeyerH,SutterO,MayrA高度减毒的痘苗病毒MVA基因组中缺失的图谱及其对毒力的影响，普通病毒学杂志，1991721031-8MossB痘病毒科病毒及其复制Chapter83.p2637-2672.InFields,B.N_Knipe,D.M.&HowJey,P.M.FieldsVirology.第3版，ednVol.2edsChanock,R..M..Melnick,J.L,Monath,T.P..R.oiZman.B.&Straus,S.E.Lippincott-RavenPublishers.Philadelphia.NewYork,1996MossB,CarrollMW,WyattLS,BenninkJR,HirschVM,OoldsteinS,ElkinsWR,FuerstTR,Lifsonm.PiatakM,RestifoNP,OverwijkW.ChamberlainR,RosenbergSA,SutterG,宿主范围受限的，非复制痘苗病毒载体用作候选疫苗，AdvExpMedBioi1996；3977-13PanicaliD.PaolettiE构建痘病毒作为克隆载体将单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因插入传染性痘苗病毒的DNA中ProcNatlAcadSciUSA1982794927-31SoneokaY,CannonPMRamsdaleEE,GriffithsJC.RomanoG,KingsmanSM,KingsmanAJ1995核酸研究，199523628-33。用于产生高滴度逆转录病毒载体的瞬时3质粒表达系统SutterG,MossB非复制的痘苗病毒能有效表达重组基因ProcNatlAcadSciUSA1992Nov15；89(22)10847-51TaylorJ.WeinbergR.TartagliaJ.RichardsonC.AlkbatibG,BriedisD,AppelM,NortonE,PaolettiE非复制病毒载体用作有效疫苗表达麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)糖蛋白的重组canarypox病毒，病毒学，1992Mar；187(1)321-8PaolettiE,TartagliaJ.TaylorJ安全有效的痘病毒载体-NYVAC和ALVAC.DevBioiStand1994；8265-9WyattLS,MossB,RozenblattS用于在哺乳动物细胞中进行瞬时基因表达的编码噬菌体T7RNA聚合酶的复制缺损的痘苗病毒，病毒学，1995Jun20；210(1)202-5WyattLS,CarrollMW,CzemyCP,MerchlinskyM,SislerJRMossB修饰痘苗病毒Ankara的宿主范围限制的标记恢复，病毒学，1998251334-42WyattLS.ShorsST.MUIphyBR,MossB开发能有效抗动物模型中的副流感病毒3感染的复制缺损的重组痘苗病毒疫苗，疫苗，1996Oct；14(1S)1451-8权利要求1．衍生自含有缺失gag基因的非灵长类动物慢病毒基因组的逆转录病毒载体，其中gag中的缺失除去了gag编码序列中核苷酸350下游的一个或多个核苷酸。2．权利要求1的逆转录病毒载体，其中缺失从核苷酸350至少延伸至gagpol编码区的C末端。3．权利要求1或2的逆转录病毒载体，其中缺失另外还除去了gag编码区的核苷酸300。4．权利要求1的逆转录病毒载体，其中缺失保留了gag编码区的前150个核苷酸。5．权利要求1的逆转录病毒载体，其中缺失保留了gag编码区的前109个核苷酸。6．权利要求1的逆转录病毒载体，其中缺失仅保留了gag编码区的前2个核苷酸。7．衍生自非灵长类动物慢病毒基因组的逆转录病毒载体，其中非灵长类动物慢病毒基因组中缺失了一个或多个辅助基因。8．权利要求7的逆转录病毒载体，其中辅助基因选自dUTP酶，S2，env和tat。9．衍生自慢病毒基因组的逆转录病毒载体，其中非灵长类动物慢病毒基因组中缺失了tat基因，但包括5’LTR末端和gagATG之间的前导序列。10．上述任一权利要求的逆转录病毒载体，其至少含有马慢病毒的一个成分。11．权利要求10的逆转录病毒载体，其中马慢病毒是EIAV。12．权利要求11的逆转录病毒载体，其中逆转录病毒载体基本上衍生自EIAV。13．用于生产上述任一权利要求中逆转录病毒载体的逆转录病毒载体生产系统，其包括含有非灵长类动物慢病毒的gag-pol基因和包膜基因的包装细胞。14．由权利要求13的生产系统生产的逆转录病毒载体。15．杂合病毒载体系统，其含有衍生自痘病毒的第一病毒载体和衍生自逆转录病毒的第二病毒载体。16．可由权利要求1至12任一项或权利要求14或15的逆转录病毒载体得到的逆转录病毒颗粒。17．被权利要求1至12任一项或权利要求14或15的逆转录病毒载体或权利要求16的逆转录病毒颗粒转染或转导的细胞。18．权利要求1至12任一项或权利要求14或15的逆转录病毒载体或权利要求16的逆转录病毒颗粒或权利要求17的细胞用于制备药物的用途。19．权利要求1至12任一项或权利要求14或15的逆转录病毒载体或权利要求16的逆转录病毒颗粒或权利要求17的细胞用于制备将NOI传递至有此需求的靶位点的药物组合物的用途。20．包括用权利要求1至12任一项或权利要求14或15的逆转录病毒载体或权利要求16的逆转录病毒颗粒或利用权利要求17的细胞转染或转导细胞的方法。21．传递系统，其形式为权利要求1至12任一项或权利要求14或15的逆转录病毒载体或权利要求16的逆转录病毒颗粒或权利要求17的细胞。22．权利要求1至12任一项或权利要求14或15的逆转录病毒载体或权利要求16的逆转录病毒颗粒或权利要求17的细胞的传递系统，其中传递系统含有非逆转录病毒表达载体，腺病毒和/或质粒。23．参照附图，基本上如上文所述的逆转录病毒载体。24．参照附图，基本上如上文所述的逆转录病毒载体生产系统。25．参照附图，基本上如上文所述的逆转录病毒颗粒。26．用参照附图，基本上如上文所述的逆转录病毒载体转染或转导的细胞。27．参照附图，基本上如上文所述的逆转录病毒载体的用途。28．用参照附图，基本上如上文所述的逆转录病毒载体转染或转导细胞的方法。29．传递系统，其形式为参照附图，基本上如上文所述的逆转录病毒载体。全文摘要衍生自含有缺失gag基因的非灵长类动物慢病毒基因组的逆转录病毒载体,其中gag中的缺失除去了gag编码序列中核苷酸350下游的一个或多个核苷酸。文档编号A61K48/00GK1285000SQ9881376公开日2001年2月21日申请日期1998年12月22日优先权日1997年12月22日发明者A·J·金斯曼,M·W·卡洛尔,J·罗尔,K·米特洛法诺斯,N·金申请人:牛津生物医学(英国)有限公司