专利名称：疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗组合物，包括来自HPV株系并可选地连接有一种免疫融合配偶体的E6或/和E7或E6、E7融合蛋白，其与一种含有CpG的寡聚核苷酸一起配制成疫苗，发现该疫苗在治疗或预防人乳头瘤病毒诱导的肿瘤或损伤中有效。特别是，本发明涉及含有融合蛋白的疫苗，包括一种提供T辅助细胞的表位的蛋白或蛋白的一部分(如流感嗜血菌B的蛋白D)以及来自人乳头瘤病毒的抗原(如含有来自与癌症相关HPV16或18株系的的E6或E7蛋白)，发现该融合蛋白在治疗或预防人乳头状瘤诱导的肿瘤中有效，其中该疫苗用作为佐剂的含有CpG的寡聚核苷酸一起配制而成。
人乳头状瘤病毒是小的裸露的DNA肿瘤病毒(7.9千碱基对，双链)，它具有高度的种间特异性。已经描述了有70种以上独特的人乳头状瘤病毒(HPV)的基因型。乳头状瘤病毒的分类以所来源的物种(人类、牛等)以及与来源于同一物种中其他乳头状瘤病毒的遗传相关性的程度为基础。HPV通常是皮肤或黏膜表面所特有的，已经大致地分为“低度”和“高度”危险病毒。
低度危险的HPV通常引起持续几个月或几年的良性损伤(疣或乳头瘤)。高度危险的HPV与肿瘤前的损伤和癌症相关。HPV病毒和人类癌症之间最为肯定的联系是存在于HPV16和18与子宫颈癌之间的关系。在子宫颈癌中也发现了数十种其它类型的HPV，包括HPV31和HPV32，虽然其存在的几率较低。
在年轻的性生活活跃的妇女中，生殖器官的HPV感染很普遍，大多数个体或者清除感染，或者如果发展到损伤，这些症状将消退。受感染的个体中仅有一部分个体的损伤将发展成高度的上皮内的瘤形成，其中仅有一部分进一步发展成侵袭性的癌症。
引起HPV感染的分子事件目前尚未清楚地确定。缺乏适当的传播人乳头状瘤病毒的体外系统阻碍了关于该病毒周期的最佳信息的发展。
目前，借助细菌的克隆系统以及新近通过PCR扩增，已经分离并定性了不同类型的HPV。根据与清楚定性的牛乳头状瘤病毒Ⅰ(HPVⅠ)的比较，HPV基因组的分子组织已经确定。
虽然确实存在较小的变化，但所描述的所有的HPV基因组均至少有七个早期基因，E1到E7和两个晚期基因L1和L2。另外，一段上游调控区域隐蔽有调控序列，它显示出控制HPV基因组的大多数转录事件。
E1和E2基因分别与病毒的复制和转录控制有关，有被病毒整合打断的倾向。E6和E7与病毒的转化有关。此过程也涉及到E5。
在子宫颈癌所包括的HPV如HPV16和18中，致瘤过程发生在病毒DNA的整合之后。整合导致编码衣壳蛋白L1和L2的基因失活，E2的抑制作用丢失导致设置两种早期蛋白E6和E7持续过量表达的E6/E7开读框的反常，这将导致正常细胞分化功能的逐步丢失以及癌症的发展。E6和E7分别通过失活主要的肿瘤抑制蛋白，p53和pRB(成视网膜瘤基团产物)来克服正常的细胞周期。
宫颈癌普遍存在于妇女中，其通过一种癌症前的中间阶段发展成经常导致死亡的侵袭性的癌症。已知该疾病的中间阶段为子宫颈部上皮内瘤形成的阶段，以严重性的渐增分级为Ⅰ到Ⅲ(CINⅠ-Ⅲ)。
临床上，女性阴肛部位的HPV感染以子宫颈扁平温疣的形式显现，其特点是主要影响子宫颈鳞状上皮的表皮和中间细胞的中空细胞病。
中空细胞(Koilocytes)，是病毒引起细胞病变作用的结果，以具有清晰核周晕的多核细胞的形式显现。反常角质化引起的表皮增厚是形成多疣形式的损伤的原因。
当HPV16或18血清型阳性时，这种扁平湿疣是发展成子宫颈上皮内瘤形成(CIN)及原位癌(CIS)的高度危险的因素，这些症状本身被认为是侵入性的宫颈癌的前导损伤。
致癌的HPV感染的自然过程呈现三个连续的阶段，即(1)潜在感染阶段，(2)核内病毒复制阶段，产物为完整的病毒颗粒，其对应中空细胞*的出现。在这一阶段中，HPV产生其全部范围的蛋白，包括E2、E5、E6、E7、L1以及L2。
(3)病毒整合到细胞基因组的阶段，它引发了恶性转化的发作，相应于中空细胞渐进性消失的CINⅡ和CINⅢ/CIS。在这一阶段中，E2的表达被下调，E6和E7的表达增强。在CINⅡ/Ⅲ和CINⅢ/宫颈癌阶段之间，病毒DNA从在基细胞中的游离态转变成仅整合E6和E7基因(肿瘤细胞)。所有宫颈癌的85％是鳞状细胞癌，它们最主要与HPV16血清型相关。分别有10％和5％是腺癌和腺鳞细胞癌，这两种类型均主要与HPV18血清型相关。然而也存在其它的致癌HPV。
国际专利申请编号WO 96/19496公布了人乳突淋瘤病毒E6和E7蛋白的变体，尤其是在E6及E7蛋白上均有缺失的E6/E7的融合蛋白。据报道这些缺失型的融合蛋白具有免疫原性。
具免疫调节活性的寡聚核苷酸含有未被甲基化的CpG二核苷酸("CpG")并且已被知晓(WO 96/02555，EP 468520)。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸基序的缩写。历史上，据研究BCG的DNA片段具有抗肿瘤作用。进一步的研究显示来源于BCG基因序列的合成的寡聚核苷酸可以(在体内及体外)诱导免疫刺激效应。这些研究的作者们总结认为是这种含有中心CG基序的特定的回文序列具有这一活性。后来Krieg在出版物(自然374第546页，1995)中阐明了CG基序在免疫刺激中的中心作用。具体的分析显示CG基序必须存在于特定的序列环境中，同时也显示这些序列在细菌DNA中普遍存在，但在脊椎动物DNA中却罕见。
目前认为这种进化上的差异使得脊椎动物的免疫系统可以检测到细菌DNA的存在(如感染时所发生的)，从而导致免疫系统随后即被激活。Krieg将该免疫刺激序列定义为嘌呤嘌呤CG嘧啶嘧啶，其中CG基序未被甲基化。这六种核苷酸以特定的形式结合呈现出回文序列。这些基序中的几种，或者是一种基序的重复，或者是不同基序的结合，可以存在于同一寡聚核苷酸中。一种或几种这些含有寡聚核苷酸的免疫刺激序列中的的存在可以激活不同的免疫细胞亚群，包括自然杀伤细胞(它产生干扰素γ并具有溶解细胞活性)和巨噬细胞(Wooldrige等89卷(8期)，1977)。虽然其它含有未被甲基化的CpG的序列没有这种共有序列，但它们现在已经显示出具有免疫调节活性。
本发明所提供的组合物含有可选地连接有一种具有T细胞表位的免疫融合配偶体的E6或/和E7或E6/E7融合蛋白，同时用含有具免疫调节活性的CpG的寡聚核苷酸辅助。
在本发明的一个优选形式中，该免疫融合配偶体是来源于嗜血流感病毒B的蛋白D。优选的是含有蛋白D的大约前1/3部分的该蛋白的衍生物，尤其是大约N-端的前100-110个氨基酸。蛋白D可能脂质化(脂蛋白D)。其它的免疫融合配偶体包括来源于流感病毒的非结构性蛋白NS1(血凝素)。典型地，使用的是N端的81个氨基酸，虽然也可使用不同的片段，只要它们含有T辅助细胞的表位。
在另一个实施方案中，免疫融合配偶体是已知为LYTA的蛋白。优选地使用该分子的C端部分。Lyta来源于肺炎链球菌，肺炎链球菌合成一种N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，酰胺酶LYTA(由lytA基因编码{基因43(1986)265-272页})，它是一种自溶血素，特定地降解肽聚糖骨架中特定的键。LYTA蛋白的C端区域负责与胆碱或与一些胆碱的类似物如DEAE亲和性。这种性质已经被用于发展对表达融合蛋白有用的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。在氨基端含有C-LYTA片段的杂种蛋白的纯化已经被公布{生物技术10，(1992)第795-798页}。本说明书中所述的一个优选的实施例利用了Lyta分子中起始于第178位残基的C末端重复片段。一种特别优选的形式是包括第188-305位上的残基。
因此，本发明在优选的实施例中提供了包括一种具免疫调节活性的CpG寡聚核苷酸以及一种融合蛋白的组合物，融合蛋白包括-来源于HPV16的蛋白D-E6、来源于HPV16的蛋白D-E7、来源于HPV18的蛋白D-E7、来源于HPV18的蛋白D-E6、以及来源于HPV16和18的蛋白D-E6E7。优选的蛋白D的片段含有蛋白D的前1/3部分。可以理解用其它的E6和E7蛋白是来源于其它的HPV亚型。
本发明中所使用的蛋白优选地在大肠杆菌中表达。在一个优选的实施方案中，所表达的蛋白尾部含有5到9个组氨酸，优选的是6个组氨酸残基。这对于帮助纯化是有利的。
在一个优选的实施方案中，蛋白E7在rb(成视网膜瘤基团产物)的结合位点上带有一处或几处突变，因此排除了任何潜在的转化能力。对于HPV16 E7，优选的突变包括甘氨酸取代半胱氨酸24、或谷氨酰胺取代谷氨酸26。在一个优选的实施方案中，E7蛋白含有这两种突变。
HPV18 E7的优选的突变包括甘氨酸取代半胱氨酸27和/或谷氨酰胺取代谷氨酸29。优选的也是两种突变均存在。
一处或两处突变也可引入E6的p53区域以排除任何潜在的转化能力。
在本发明的另一个实施例中，提供了来源于HPV并且连接有一种免疫融合配偶体，以及一种具免疫调节活性的CpG寡聚核苷酸的E6E7融合蛋白。
本发明中的疫苗优选地诱导TH1型免疫应答。
两种主要类型的T辅助细胞已经被定性为TH1和TH2，它们的不同在于所分泌的细胞因子的类型。这些细胞因子可以被认为是产生2种不同类型的免疫应答的背后的驱动力量TH1型的免疫应答与细胞调节的效应机制相关，如T-淋巴细胞产生细胞因子INF-γ和IL-2。INF-γ可以依次激活其它细胞并诱导它们分泌其它重要的细胞因子和介质(INF-γ激活的NK细胞产生IL12)，IL-2激活的NK细胞转化成淋巴激活素激活的杀伤细胞(LAK)，INF-γ激活的巨噬细胞分泌炎症介质如TNFα、IL1、IL6以及释放一氧化氮，IL2可以为抗原特异性、组织适合抗原限制性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的分化提供帮助。在抗体水平上，小鼠中的Th1型免疫应答也与IgG2同型的抗体的产生相关(IgG2a在Balb/c小鼠中，IgG2b在C57BL/6小鼠中)。
Th2型的免疫应答与针对抗原的体液免疫应答相关，它通过产生诸如IL4、IL5、IL6、IL10的细胞因子，以及通过产生广范围的免疫球蛋白同型(在小鼠中包括IgG1、IgA、以及IgM)来完成。
在人体中，Th1和Th2型的免疫应答的区别不是绝对的。个体将支持一种主要为Th1或主要为Th2免疫应答。然而，人们经常简便地以Mosmann和Coffinan(Mosman T.R.和Coffinan，R.L.(1989)TH1和TH2细胞淋巴因子分泌的不同类型导致不同的功能特性，免疫学年评，7，第145-173页)在鼠CD4+ve T细胞克隆中所描述的观点来考虑细胞因子家族。
在人类，TH1类型的应答也与细胞因子(IFNg和IL2)的出现相关，最后与CT1和IgG2同型的出现相关，在小鼠中对应的为IgG1型抗体。
这种类型1的表型在防护抵御病毒和细胞内的细菌感染以及在癌症的治疗中具有特别的重要性。
为了通过重组技术生产本发明中所使用的蛋白，可以使用的表达策略包括E7、E6的融合物或E6/E7融合有来自嗜血流感病毒B的蛋白D的N端1/3部分(一种提供T辅助细胞的表位的免疫融合配偶体)。在融合蛋白的羧基末端设计一段具亲和力的聚组氨酸标志，以简化纯化方法。这种重组抗原在大肠杆菌中以不溶蛋白的形式过量表达。
本发明中的蛋白可与反式硫氧还原蛋白(TIT)共同表达。反式硫氧还原蛋白的共表达相对于顺式，在不需要蛋白酶的情况下保持硫氧还原蛋白不具抗原性是优选的。硫氧还原蛋白的共表达使本发明中的蛋白的溶解变得容易。硫氧还原蛋白的共表达对蛋白纯化产量和已纯化蛋白的溶解度和特性中也有重要影响。
依据本发明，可复制的表达载体的制备可以通过裂解一种适合于宿主细胞的载体以提供一段具有一个完整复制子的线性DNA片段，以及将上述线性片段与一种或几种DNA分子结合，在连接的条件下，该DNA分子与上述线性片段一起编码所需的产物，如编码本发明中的蛋白DNA聚合体或其衍生物。
因此，该DNA聚合体可以预先形成或在载体构建的过程中形成，依需要而定。
载体的选择一部分由宿主细胞决定，其可以为原核或真核生物，但优选的是大肠杆菌。合适的载体包括质粒、噬菌体、粘粒或重组病毒。
可复制的表达载体制备的进行，可以依惯例加入适当的酶以限制DNA的聚合及连接，通过此处所描述的程序进行，例如，以上所引用的Maniatis等。
依据本发明，重组体宿主细胞的制备是在转化条件下，将本发明中的可复制的表达载体转化宿主细胞。合适的转化条件是常规的及此处所描述的，例如，以上所引用的Maniatis等，或“DNA克隆”Vol.Ⅱ，D.M.Glover ed_IRL Press Ltd，1985。
转化条件的选择由宿主细胞决定。因此，细菌宿主如大肠杆菌可以用CaCl2溶液处理(Cohen等，美国国家科学院院报，1973，69，2110)，或者用含有RbCl、MnCl2醋酸钾和甘油混合物的溶液处理，然后用3-[N-吗啉]-丙烷-磺酸、RbCl和甘油处理。培养的哺乳动物细胞的转化可以通过载体DNA的钙共同沉淀反应进入细胞中。本发明也提供了一种经过本发明中的一种可复制的表达载体转化的宿主细胞。
在允许DNA聚合体表达的条件下培养已转化的宿主细胞采用的是常规方法，如此处所描述的，例如，以上所引用的Maniatis等以及“DNA克隆”。因此，优选的是细胞的营养供应充分，并在50℃以下培养。
产品的回收依据宿主细胞采用常规方法。因此，当宿主细胞是细菌，如大肠杆菌时，可能需要通过物理的、化学的或酶解的方法将该细胞溶解并从所得的裂解物中分离蛋白质产物。当宿主细胞是哺乳动物的细胞时，产物通常可从营养培养基或无细胞抽提液中分离。常规的蛋白分离技术包括选择沉淀、吸附层析和亲和层析(包括单克隆抗体亲和柱)。
当本发明中的蛋白质以带有组氨酸标志(His tag)的形式表达时。该蛋白的纯化可以简便地采用亲和层析，使用一种离子金属亲和层析柱(IMAC)进行。
层析的第二步骤，如Q-琼脂糖凝胶可以在IMAC柱之前或之后使用以得到高度纯化的蛋白。如果免疫融合蛋白是C-LYTA，可能可以利用CLYTA对胆碱和/或DEAE的亲和性来纯化该产物。含有C-LYTA及其组氨酸标签的产物可以简便有效地在两步过程内完成纯化，该过程含有不同的亲和层析。一步包括组氨酸标志对IMAC柱的亲和力，另一步包括LYTA的C端区域对胆碱或DEAE的亲和力。
一种优选的疫苗组合物至少包括来源于蛋白D-HPV16的E6或其衍生物以及蛋白D-HPV16的E7。可选择地，E6和E7可以以单个分子的形式存在，优选的是以蛋白D E6/E7融合物的形式存在。这种疫苗可以可选地含有来源于HPV18的E6或E7蛋白或二者均含有，优选的是以蛋白D-E6或蛋白D-E7的融合蛋白或蛋白D E6/E7的融合蛋白的形式存在。本发明中的疫苗可能含有来源于HPV16或18的其它HPV抗原。尤其是疫苗可能含有L1或L2抗原单体。可选择地，这种L1或L2抗原可以共同以病毒样颗粒形式存在，或者单独的L1蛋白以病毒样颗粒或壳粒结构的形式存在。这些抗原(病毒样颗粒和壳粒)本身是已知的。如见实施例WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792、以及WO93/02184。附加的早期蛋白可能包括如E2或优选的是，如E5。本发明中的疫苗还可包括来源于其它HPV株系的抗原，优选的是来源于HPV株系6、11、31或33。
疫苗的制备大致如疫苗设计-亚单位和佐剂方法(Powell andNewman编著)药用生物技术Vol.6 Plenum Press 1995中所述。Fullerton描述了包装在脂质体中的方法，见美国专利第4，235，877号。
优选的寡聚核苷酸优选地含有被六个或更多的核苷酸分隔开的两个或更多的CpG基序。本发明中的寡聚核苷酸典型地为脱氧核糖核苷酸。在一个优选的实施例中，该寡聚核苷酸中的核苷酸间是二硫代磷酸酯键，或者更优选的是硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯和其它核苷酸间的键也包括在本发明范围内，包括具有混合的核苷酸间连接的寡聚核苷酸。
优选的寡聚核苷酸具有以下序列该序列优选地含有所有硫代磷酸酯修饰的核苷酸间连接。
寡聚核苷酸1TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT寡聚核苷酸2TCT CCC AGC GTG CGC CAT寡聚核苷酸3ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG本发明中所使用的CpG寡聚核苷酸可以通过本领域任何已知的方法进行合成(如EP468520)。方便地，这种寡聚核苷酸可以使用一种自动合成仪进行合成。生产硫代磷酸酯寡聚核苷酸或二硫代磷酸酯的方法如US5，666，153、US5，278，302和WO95/26204中所描述。
本发明将通过参考以下实施例作进一步的描述实施例1一种表达的融合蛋白-D1/3-E7-His(HPV16)的大肠杆菌菌株的构建1)-表达质粒的构建a)-质粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(英国专利申请编号n°951 3261.9，公布号为WO97/01640)的衍生物，其中来源于流感的NS1编码区上的第4-81位密码子被另一段密码子取代，该密码子相应于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等，1991.传染和免疫，一月，第119-125页)的成熟蛋白D上的丝氨酸20→苏氨酸127残基。Prot-D 1/3的序列后跟随一段多克隆位点(11个残基)和一段编码C-末端组氨酸标志(6个组氨酸)的区域。这种质粒用于表达融合蛋白D1/3-E7-His。
b)-HPV基因的E6和E7序列型HPV16(见Dorf等，病毒学1985，145，第181-185页)从HPV16全长基因组中扩增，在pBR322中克隆(从Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)中获得，Referenzzentrumfür人病原乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)，并亚克隆到pUC19中以得到TCA301(=pRIT14462)。
质粒TCA308(=pRIT14501)的构建一种表达融合蛋白-D1/3-E7-His的质粒相应于E7蛋白第1→98位氨基酸的核苷序列从pRIT14462中进行扩增。在聚合酶链式反应中，在E7序列的5’和3’的末端构造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位点、以使其可以插入质粒PMGMCS Prot D1/3中相同的位点，以获得质粒TCA308(=pRIT14501)。对插入进行序列分析以确定在聚合酶链式反应中没有修饰产生。融合蛋白-D1/3-E7-His (HPV16)序列的描述在序列编号1，编码序列在序列编号2。
2)-AR58菌株的转化质粒pPIT14501导入大肠杆茵AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58为一种含有λpL启动子的热敏抑制子的缺陷型λ溶原性细菌。
3)-细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E7-His的表达通过质粒pRIT14501转化的AR58的细胞在含有50μgr/ml卡那霉素的100毫升LB培养基，30℃下生长。在细菌生长的对数期，将细茵转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白D1/3-E7-His的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌离心沉淀并在-20℃下保存。实施例Ⅱ一种表达融合蛋白-D1/3-E6-his/HPV16的大肠杆菌菌株的构建1．表达质粒的构建a)质粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(WO97/01640中所描述)的一种衍生物，其中来源于流感的NS1编码区上的第4-81位密码子被另一段密码子取代，该密码子相应于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等，1991.感染和免疫，Jan.第119-125页)的成熟蛋白D上的丝氨酸20→苏氨酸127残基。Prot-D 1/3的序列后跟随一段多克隆位点(11个残基)和一段编码C-末端组氨酸标志(6个组氨酸)的区域。这种质粒用于表达融合蛋白D1/3-E6-His。
b)-HPV基因的E6和E7序列型HPV16(见Dorf等，病毒学1985，145，第181-185页)从HPV16全长基因组中扩增，在pBR322中克隆(从Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)中获得，Referenzzentrumfür人病原乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)，并亚克隆到pUC19中以得到TCA301(=pRIT14462)。
质粒TCA 307(=pRIT14497)的构建一种表达融合蛋白-D1/3-E6-His/HPVI6的质粒相应于E6蛋白的第1→151位氨基酸的核苷酸序列从pRIT14462中进行扩增。在聚合酶链式反应中，在E6序列的5’和3’的末端构造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位点以使其可以插入质粒pMGMCS Prot D1/3中相同的位点，以获得质粒TCA307(=pRIT14497)。对插入进行序列分析以确定在聚合酶链式反应中没有修饰产生。融合蛋白-D1/3-E6-His的蛋白和编码序列描述在序列编号3和4。
2．AR58菌株的转化质粒pPIT14497导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国科学院院报，8288)中，AR58是一种含有λpL启动子的热敏抑制子的缺陷型λ溶原性细菌。
3．细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E6-His的表达通过质粒pRIT14497转化的AR58的细胞在100毫升添加50μgr/ml卡那霉素LB培养基，30℃下生长。在细菌生长的对数期，将细菌转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白D1/3-E6-His的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌沉淀并在-20℃下保存。
4．融合蛋白D1/3-E6-his(HPV16)性质的确定抽提物的制备溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的PBS缓冲液中。细胞在一台法国细胞压力机SLM Aminco上以20，000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下，以16，000g离心30分钟。
考马斯亮蓝-染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹的分析在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹对上清液和沉淀部分进行分析。
定位于沉淀部分、约32kDa的主要条带的显象是通过考马斯亮蓝染色的凝胶，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆抗-蛋白-D抗体以及通过Ni-NTA缀合物，Ni-NTA缀合物连接有牛小肠碱性磷酸酶(Qiagencat.n°345 10)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。表达水平代表总体蛋白的约5％。
5．与硫氧还原蛋白的共同表达在与来源于HPV18的蛋白D1/3 E7 His的表达相似的模式中(实施例Ⅸ)，用编码硫氧还原蛋白和蛋白D1/3 E7 His (HPV16)的质粒转化大肠杆菌菌株AR58。
实施例Ⅲ一种表达融合蛋白-D1/3-E6E7-his/HPV16的大肠杆菌菌株的构建1．表达质粒的构建a)质粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(上面所描述)的一种衍生物，其中来源于流感的NS1编码区上的第4-81位密码子被另一段密码子取代，该密码子相应于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等，1991.传染和免疫，1月第119-125页)的天然蛋白D上的丝氨酸20→苏氨酸127残基。Prot-D 1/3的序列后跟随一段多克隆位点(11个残基)和一段编码C-末端组氨酸标志(6个组氨酸)的区域。这种质粒用于表达融合蛋白D1/3-E6E7-his。
b)HPV基因的E6和E7序列型HPV16(见Dorf等，病毒学1985，145，第181-185页)从HPV16全长基因组中扩增，在pBR322中克隆(从Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)中获得，Referenzzentrumfür人病原乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)，并亚克隆到pUC 19中以得到TCA 301(=pRIT14462)。
c)在TCA301(=pRIT 14462)中编码E6和E7的序列通过一段合成的寡聚核苷酸接头(adaptor)(在AflⅢ and NsiⅠ位点之间插入)以使E6和E7基因间的5个核苷酸化被剔除，从而在质粒TCA309(=pRIT 14556)中除去E6的终止子和产生融合的E6和E7编码序列。
质粒TCA311(=pRIT14512)的构建一种表达融合蛋白-D1/3-E6E7-His/HPVI6的质粒相应于融合蛋白E6E7的第1→249位氨基酸残基的核苷酸序列从pRIT14556中进行扩增。在聚合酶链式反应中，在E6E7融合序列的5’和3’的末端构造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位点，以使其可以插入质粒PMGMCS Prot D1/3中相同的位点上，以获得质粒TCA311(=pRIT14512)。对插入序列进行序列分析以确保在聚合酶链式反应中没有修饰产生。融合蛋白-D1/3-E6E7 1/3-His的蛋白和编码序列的描述在序列编号5和6。
2．AR58菌株的转化质粒pPIT14512导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58为一种含有λpL启动子的热敏抑制子的缺陷型λ溶原性细菌。
3．细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E6E7-His的表达通过质粒pRIT14512转化的AR58的细胞在100毫升LB培养基，30℃下补充50μgr/ml卡那霉素。在细菌生长的对数期，将温度转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白D1/3-E6E7-his的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌沉淀并在-20℃下保存。
4．融合蛋白D1/3-E6E7-his性质的确定溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的磷酸缓冲液中。细胞在一台法国压力细胞压碎机SLM Aminco上以20，000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下以16，000g持续离心30分钟。
在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、约48kDa的主要条带的显象是通过考马斯亮蓝染色的凝胶，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆抗-蛋白-D以及Ni-NTA缀合物，Ni-NTA缀合物连接有牛小肠碱性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。表达水平占总体蛋白的约1％。实施例Ⅳ在一种相似的模式中，脂蛋白D1/3和来源于HPV16的E6-E7的融合蛋白在硫氧还原蛋白存在的情况下在大肠杆菌中表达。
在前蛋白(388个氨基酸)的N-端含有MDP残基，其后跟随有脂蛋白D(来源于流感嗜血菌)16个氨基酸的信号肽部分，其在体内被切除以得到成熟的蛋白质(370个氨基酸)。脂蛋白部分(第1到127位氨基酸)后跟有以融合物形式存在的蛋白E6和E7。该蛋白的C末端由TSGHHHHHH延伸。实施例Ⅴ表达融合蛋白D1/3-E7的大肠杆菌菌株B1002的构建突变型(cys24→gly，glu26→gln)的HPV161)-表达质粒的构建起始材料a)-质粒pRIT 14501(=TCA 308)，编码融合蛋白D1/3-E7-Hisb)-质粒LITMUS 28(New England Biolabs cat n°306-328)，由一种克隆载体pUC衍生而来。
c)-质粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT 14589)，一种pMG81(如上面所描述)的衍生物，其中来源于流感的NS1编码区上的第4-81位密码子被另一段密码子取代，该密码子相应于流感嗜血菌株系772、生物型2 (H.Janson等，1991.传染和免疫，1月第119-125页)的成熟蛋白D上的丝氨酸20→苏氨酸127残基。蛋白-D 1/3的序列后跟随一段多克隆位点(11个残基)和一段编码C-末端组氨酸标志(6个组氨酸)的区域。质粒pRIT 14733(=TCA347)的构建一种表达具有组氨酸标志突变型(cys24→gly，glu26→gln)的融合蛋白-D1/3-E7的质粒pRIT 14501(=TCA308)中的NcoⅠ-XbaⅠ片段带有HPV16中E7基因编码序列并由一段组氨酸标志延伸，它在一种有利于诱发突变得到PRIT14909(=TCA337)的中间载体Litmus28中进行亚克隆。选择双突变cys24→gly(Edmonds和Vousden病毒学杂志632650，1989)和glu26→gln(Phelps等病毒学杂志662418-27，1992)是为了减弱对成视网膜瘤基团(pRB)的抗肿瘤基因产物的结合。用定点诱变快速变化位点试剂盒(Stratagene cat n°200518)在E7基因中引入突变，以传递给质粒pRIT 14681(=TCA343)。在通过序列分析确定完整E7基因的突变和完整性的存在后，将突变的E7基因导入载体pRIT14589(=pMG MCS ProtD 1/3)中以得到质粒PRIT14733(=TCA347)的蛋白和编码序列。
融合蛋白-D1/3-E 7突变体(cys24→gly，glu26→gln)-His的序列描述在序列编号7和8中。
2)-表达蛋白D1/3-E7突变型(cys24→gly，glu26→gln)-His/HPV16的菌株B1002的构建质粒pRIT14733被导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58是一种含有γpL启动子的热敏抑制子的缺损的γ溶原性细菌，通过筛选抗卡那霉素的转化体以得到菌株B1002。
3)-细菌菌株B1002的生长和诱导-蛋白D1/3-E7突变体(cys24→gly，glu26→gln)-His/HPV16的表达通过质粒pRIT14733(B1002菌株)转化的AR58的细胞在100毫升LB培养基，30℃下补充50μgr/ml的卡那霉素下生长。在细菌生长的对数期，将温度转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白D1/3-E7突变体-His/HPV16的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌沉淀并在-20℃下保存。
4)-融合蛋白D1/3-E7突变体(cys24→gly，glu26→gln)-His型HPV16的性质的确定溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的磷酸缓冲液中。细胞在一台法国压力细胞压碎机SLM Aminco上以20，000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下以16，000g持续离心30分钟。
在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、约33kDa的主要条带的显象是通过考马斯亮蓝染色的凝胶，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆22J70抗-蛋白-D，通过来源于酵母的单克隆抗E7/HPV16以及通过Ni-NTA缀合物，Ni-NTA缀合物连接有牛小肠碱性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。表达水平代表总体蛋白的约3至5％。
B1002的细胞通过离心从培养液中分离出来。浓缩的B1002的细胞在-65℃下保存。
实施例Ⅵ一种表达融合物clyta-E6-his(HPV16)的大肠杆菌菌株的构建1．表达质粒的构建a)-质粒pRIT 14497(=TCA307)，其编码融合蛋白D1/3-E6-His/HPV16b)-质粒pRIT14661(=DVA2)，一种含有肺炎链球菌LytA的117个C-端密码子的编码序列。Lyta来源于肺炎链球菌，它合成一种N-乙酰L-丙氨酸酰胺酶，酰胺酶LYTA(由lytA基因编码{基因，43(1986)第265-272页})是一种自溶素，尤其可以降解肽聚糖主链上特定的键。LYTA蛋白的C-端区域负责与胆碱或与一些胆碱的类似物如DEAE的亲和力。
1．b质粒pRIT14634(=TCA332)的构建一种表达融合物clyta-E6-His/HPV16的质粒a)第一步是从质粒pRIT14497中纯化NcoⅠ-AflⅡ限制酶切大片段，以及从pRIT14661中纯化小的AflⅡ-AflⅢ限制酶切片段b)第二步是将clyta序列连接到E7-His序列中(Ncol和AFlⅢ是兼容的限制酶切位点)，从而得到质粒pRIT14634(=TCA332)，在pL启动子的控制下编码融合蛋白clyta-E6-His。
融合蛋白clyta-E6-His的蛋白和编码序列是所描述的序列编号9和10。
AR58菌株的转化质粒pRIT14634被导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58是一种含有γpL启动子的热敏抑制子的缺损的γ溶原性细菌中。
细菌菌株的生长和诱导-clyta-E6-His的表达通过质粒pRIT14634转化的AR58细胞在100毫升LB培养基，30℃下补充50μgr/ml的卡那霉素中培养。在细菌生长的对数期，将温度转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白clyta-E6-his的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌沉淀并在-20℃下保存。
4．融合物clyta-E6-his的性质的确定溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的磷酸缓冲液中。细胞在一台法国压力细胞压碎机SLM Aminco上以20，000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下以16，000g持续离心30分钟。在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、约33kDa的主要条带的显象是通过考马斯亮蓝染色的凝胶，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆抗-clyta-抗体以及通过Ni-NTA缀合物，Ni-NTA缀合物连接有牛小肠碱性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。表达水平代表总体蛋白的约3％。
实施例Ⅶ一种表达融合物clyta-E7-his (HPV16)的大肠杆菌菌株的构建1．表达质粒的构建1．a起始材料a)-质粒pRIT14501(=TCA308)，编码融合物Prot D 1/3-E7-his/HPV16b)-质粒pRIT14661(=DVA2)，一种含有来源于肺炎链球菌的LytA的117个C端密码子的编码序列。
1．b质粒pRIT14626(=TCA330)的构建一种表达融合物clyta-E7-his/HPV16的质粒a)第一步是从质粒pRIT14501中纯化大的NcoⅠ-AflⅡ限制酶切片段，以及pRIT14661中纯化小的AflⅡ-AflⅢ限制酶切片段b)第二步是将clyta序列连接到E7-His序列中(Ncol和AFlⅢ是兼容的限制酶切位点)，从而得到质粒pRIT14626(=TCA330)，在pL启动子的控制下编码融合蛋白clyta-E7-His。
融合蛋白clyta-E7-His的蛋白和编码序列的描述的在序列编号11和12中。
2．AR58菌株的转化质粒pRIT14626被导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58是一种含有γpL启动子的热敏抑制子的缺损的γ溶原性细菌。
3．细菌茵株的生长和诱导-clyta-E7-His的表达通过质粒pRIT14626转化的AR58的细胞在100毫升补充有50μgr/ml的卡那霉素的LB培养基，30℃下生长。在细菌生长的对数期，将温度转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白clyta-E7-his的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌沉淀并在-20℃下保存。
4．融合物clyta-E7-his的性质的确定溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的磷酸缓冲液中。细胞在一台法国压力细胞压碎机SLM Aminco上以20，000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下以16，000g持续离心30分钟。在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、约35kDa的主要条带的显象是通过考马斯亮蓝染色的凝胶，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆抗-clyta-抗体以及通过Ni-NTA缀合物，Ni-NTA缀合物连接有牛小肠碱性磷酸酶(Qiagen cat.n°345 10)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。表达水平代表总体蛋白的约5％。实施例Ⅷ一种表达融合物clyta-E6E7-his(HPV16)的大肠杆菌菌株的构建1．表达质粒的构建
1．a起始材料a)-质粒pRIT14512(=TCA311)，它编码融合蛋白D1/3-E6E7-His/HPV16b)-质粒pRIT14661(=DVA2)，一种含有来源于肺炎链球菌的LytA的117个C端密码子的编码序列。
1．b质粒pRIT14629(=TCA331)的构建一种表达融合物clyta-E6E7-his/HPV16的质粒a)第一步是从质粒pRIT14512中纯化大的NcoⅠ-AflⅡ限制酶切片段，以及pRIT14661中纯化小的AflⅠ-AflⅢ限制酶切片段b)第二步是将clyta序列连接到E7-His序列中(Ncol和AFlⅡ是合适的限制酶切位点)，从而得到质粒pRIT 14629(=TCA331)，在pL启动子的控制下编码融合蛋白clyta-E6E7-His。
融合蛋白clyta-E6E7-His的蛋白和编码序列是序列编号13和14。
2．AR58菌株的转化质粒pRIT14629被导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58是一种含有γpL启动子的热敏抑制子的缺损的γ溶原性细菌。
3．细菌菌株的生长和诱导-clyta-E6E7-His的表达通过质粒pRIT14629转化的AR58的细胞，在100毫升补充有50μgr/ml的卡那霉素的LB培养基，30℃下生长。在细菌生长的对数期，将温度转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白clyta-E6E7-his的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌沉淀并在-20℃下保存。
4．融合物clyta-E6E7-his的性质确定溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的磷酸缓冲液中。细胞在一台法国压力细胞压碎机SLM Aminco上以20，000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下以16，000g持续离心30分钟。
在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、约48kDa的主要条带的显象是通过考马斯亮蓝染色的凝胶，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆抗-clyta-抗体以及通过Ni-NTA缀合物，Ni-NTA缀合物连接有牛小肠碱性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。表达水平代表总体蛋白的约1％。实施例Ⅸ蛋白D1/3E7 his(HPV18)(大肠杆菌B1011)蛋白D1/3 E7 his HPV与反式硫氧还原蛋白共同表达(大肠杆菌B1012)1)-表达质粒的构建1).a.质粒TCA316(pRIT14532)的构建一种表达融合蛋白D1/3-E7-his/HPV18的质粒起始材料a)-质粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT14589)是pMG81(如英国专利申请编号n°951 3261.9中所描述，发表为WO97/01640)的一种衍生物，其中来源于流感的NS1编码区上的第4-81位密码子被另一段密码子取代，该密码子相应于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等，1991.传染和免疫，1月第119-125页)的成熟蛋白D上的丝氨酸20→苏氨酸127残基。蛋白-D1/3的序列后跟随一段多克隆位点(11个残基)和一段编码C-末端组氨酸标志(6个组氨酸)的区域。用该质粒表达融合蛋白D1/3-E7-hisb)HPV基因的E6和E7序列原型HPV18(Cole等，分子生物学杂志(1987)193，599-608)从HPV16全长基因组中扩增，在pBR322中克隆(从Deutsches Krebsforschungszentrum(DKFZ)中获得，Referenzzentrumfür人病原乳头瘤病毒-D69120-Heidelberg)，并亚克隆到pUC19中以得到TCA302(=pRIT14467)。
质粒TCA316(=pRIT14532)的构建相应于蛋白E7的第1→105位氨基酸的核苷酸序列从pRIT14467中进行扩增。在聚合酶链式反应中，在E7融合序列的5’和3’的末端构造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位点以使其可以插入质粒PMGMCS Prot D1/3中相同的位点上，以获得质粒TCA316(=pRIT14532)。对插入序列进行序列分析，鉴定出E7基因上存在相对于E7/HPV18原型序列的修饰(核苷酸128位上G→A)，由此引起一个甘氨酸被一个谷氨酸的取代(E7的第43位氨基酸，融合蛋白的第156位)。融合蛋白-D1/3-E7-His/HPV18的蛋白和编码序列的列于序列编号15和序列编号16。
1).b.质粒TCA313(=pRIT14523)的构建一种表达硫氧还原蛋白的质粒起始材料a)-质粒pBBRlMCS4(Antoine R.和C.Locht，分子微生物学1992，6，1785-1799；M.E.Kovach等生物技术16，(5)，800-802)，它可以与含有ColEⅠ或P15a复制起始点的质粒兼容。
b)-质粒pMG42(如WO93/04175中所描述)含有λ噬菌体的启动子pL的序列。
c)-质粒pTRX(Invitrogcn，kit Thiofusion K350-01)，带有跟随有AspA转录终止子的硫氧还原蛋白的编码序列。
质粒TCA313(=pRIT14523)的构建带有pL启动子的来源于pMG42的EcoRl-Ndel片段，和来源于PTRX、带有跟随有AspA终止子的硫氧还原蛋白的编码区的Ndel-HindⅢ片段，将二者纯化并连接到质粒载体pBBRlMCS4的EcoRⅠ和HindⅢ位点上以获得质粒TCA313(=pRIT14523)。
硫氧还原蛋白的编码序列的描述在序列编号17。
2)-AR58菌株的转化2).a.获得表达蛋白D1/3-E7-His/HPVI8的菌株B1011将质粒pRIT14532导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58为一种含有γpL启动子的热敏抑制子的缺损的γ溶原性细菌，通过抗卡那霉素筛选转化体。
2).b.表达ProtD1/3-E7-His/HPVI8和硫氧还原蛋白的菌株B1012的构建将质粒pRIT14532和pRIT14523导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58为一种含有γpL启动子的热敏抑制子的缺损的γ溶原性细菌，通过抗卡那霉素和氨苄青霉素双重筛选转化体。
3)细菌菌株B1011和B1012的生长和诱导-没有或有反式硫氧还原蛋白的蛋白D1/3-E7-His/HPV18的表达通过质粒pRIT14532转化的AR58的细胞(B1011株系)和通过质粒pRIT14532及pRIT14523转化的AR58的细胞(B1012株系)在30℃下100毫升LB培养基中生长，并对B1011株系补充50μgr/ml的卡那霉素，对B1012株系补充50μgr/ml的卡那霉素和100μgr/ml的氨苄青霉素。在细菌生长的对数期，将温度转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白D1/3-E7-his/HPV18及硫氧还原蛋白的合成。在39℃下的温育持续4小时。
融合蛋白D1/3-E7-his/HPV18的性质的确定抽提物的制备溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的磷酸缓冲液中。细胞在一台法国压力细胞压碎机SLM Aminco上以20.000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下以16，000g持续离心30分钟。
对考马斯亮蓝-染色的聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹的分析在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析所得到的上清液和沉淀部分。
融合蛋白D1/3-E7-His(约31kDa)通过考马斯亮蓝染色的凝胶进行显象，在微粒部分为菌株B1011和一部分(30％)定位于上清液中的为菌株B1012，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆抗-蛋白-D以及通过Ni-NTA缀合物，Ni-NTA缀合物连接有牛小肠碱性磷酸酶(Qiagencat.n°34510)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。当在考马斯亮蓝-染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上显示时，其表达水平代表总体蛋白的约1-3％。
对于菌株B1012的抽提物，硫氧还原蛋白(约12Kda)在上清液中，通过考马斯亮蓝染色凝胶对其进行显象，在蛋白质印迹中通过单克隆抗硫氧还原蛋白(Invitrogen R920-25)进行鉴定。实施例Ⅹ表达融合蛋白D1/3-E7的大肠杆菌菌株B1098的构建突变型(cys27→gly，glu29→gln)HPVl81)-表达质粒的构建起始材料a)-质粒pRIT 14532(=TCA316)，其编码融合蛋白D1/3-E7-Hisb)-质粒LITMUS28 (New England Biolabs cat n°306-28)，一种克隆载体pUC的衍生物c)-质粒pMG MCS ProtD1/3(pRIT 14589)，一种pMG81(如上面所述)的衍生物，其中来源于流感的NS1编码区上的第4-81位密码子被另一段密码子取代，该密码子相应于流感嗜血菌株系772、生物型2(H．Janson等，1991.传染和免疫，1月第119-125页)的成熟蛋白D上的丝氨酸20→苏氨酸127残基。Prot-D1/3的序列后跟随一段多克隆位点(11个残基)和一段编码C-末端组氨酸标志(6个组氨酸)的区域。质粒pRIT14831(=TCA355)的构建一种表达具有组氨酸标志的融合蛋白-D1/3-E7突变体(cys27→gly，glu29→gln)的质粒pRIT14532(=TCA 316)中的片段Ncol-XbaⅠ，带有HPV18中E7基因的编码序列，与一段组氨酸标志一起延伸，在对诱发突变有利的中间载体Litmus28中进行亚克隆，以获得pRIT14910(=TCA348)。通过E7/HPV16的诱变相似的方法，选择双重突变cys27→gly和glu29→gln以减弱对成视网膜瘤基团(pRB)的抗癌基因产物的结合。
在E7基因中引入突变是通过定点诱变快速变化试剂盒(Stratagene cat n°200518)实现的。由于对pRIT14532的序列分析，已经指出存在E7中43位上的谷氨酸代替了HPV18原型序列中的甘氨酸，第二轮的诱变循环已了解到是在43位上引入甘氨酸。我们获得了质粒pRIT14829(=TCA353)。在通过序列分析确定全部E7基因的突变以及完整性的存在之后，将突变的E7基因引入载体pRIT14589(=pMGMCS ProtD1/3)中以得到质粒pRIT14831(=TCA355)。
融合蛋白-D1/3-E7突变型(cys27→gly，glu29→gln)-His的蛋白和编码序列的描述在序列编号18和19。
2)．表达蛋白D1/3-E7突变型(cys27→gly，glu29→gln)-His/HPV18的菌株B1098的构建质粒pRIT14831被导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58是一种含有γpL启动子的热敏抑制子的缺损的γ溶原性细菌，通过筛选抗卡那霉素的转化体以得到菌株B1098。
3)．细菌菌株B1098的生长和诱导-蛋白D1/3-E7突变型(cys27→gly，glu29→gln)-His/HPV18的表达通过质粒pRIT14831(B1098菌株)转化的AR58的细胞在100毫升LB培养基，30℃下补充50μgr/ml的卡那霉素下生长。在细菌生长的对数期，将温度转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白D1/3-E7突变体-His/HPV18的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌沉淀并在-20℃下保存。
4)-融合蛋白D1/3-E7突变体(cys24→gly，glu26→gln)-His型HPVI6的性质的确定溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的磷酸缓冲液中。细胞在一台法国压力细胞压碎机SLM Aminco上以20，000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下以16，000 g持续离心30分钟。
对考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质印迹的分析在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析所得到的上清液和沉淀部分。定位于沉淀部分、约3lkDa的主要条带的显象是通过考马斯亮蓝染色的凝胶，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆22 J 70抗-蛋白D，以及通过单克隆Penta-His(Qiagen cat.n°34660)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。表达水平代表总体蛋白的约3％至5％。实施例Ⅺ一种表达融合蛋白-D1/3-E6-his/HPVI8的大肠杆菌菌株的构建1．表达质粒的构建a)质粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(如上面所描述)的衍生物，其中来源于流感的NS1编码区上的第4-81位密码子被另一段密码子取代，该密码子相应于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等，1991.传染和免疫，1月第119-125页)的成熟蛋白D上的丝氨酸20→苏氨酸127残基。蛋白-D 1/3的序列后跟随一段多克隆位点(11个残基)和一段编码C-末端组氨酸标志(6个组氨酸)的区域。该质粒用于表达融合蛋白D1/3-E6-his。
HPV基因组的E6和E7序列型HPV18(Cole等，分子生物学杂志.1987，193第599-608页)从HPV18全长基因组中进行扩增并在pBR322(由Deutsches Krebsforschungszentnun(DKFZ)中获得，Referenzzentnun für人病原乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)中克隆，并亚克隆到pUC19中以得到TCA302(=pRIT14467)。质粒TCA 314(=pRIT14526)的构建一种表达融合蛋白-D1/3-E6-His/HPV18的质粒相应于E6蛋白的第1→158位氨基酸残基的核苷酸序列从pRIT14467中进行扩增。在聚合酶链式反应中，在E6序列的5’和3’的末端构造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位点，以使其可以插入质粒PMGMCS Prot D1/3中相同的位点上，以获得质粒TCA314(=pRIT14526)。对插入序列进行序列分析以确保在聚合酶链式反应中没有修饰产生。关于融合蛋白-D1/3-E6-His的蛋白和编码序列的描述在序列编号20和21中。
AR58菌株的转化质粒PKIT 14526被导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)中，AR58是一种含有γpL启动子的热敏抑制子的缺损的γ溶原性细菌。
3．细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E6-His的表达通过质粒pRIT14526转化的AR58的细胞在100毫升LB培养基，30℃下补充50μgr/ml的卡那霉素下生长。在细菌生长的对数期，将温度转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白D1/3-E6-his的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌沉淀并在-20℃下保存。
4．融合蛋白D1/3-E6-his的性质的确定溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的磷酸缓冲液中。细胞在一台法国压力细胞压碎机SLM Aminco上以20，000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下以16，000g持续离心30分钟。在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、约32kDa的主要条带的显象是通过考马斯亮蓝染色的凝胶，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆抗-蛋白-D以及通过Ni-NTA缀合物，Ni-NTA缀合物连接有牛小肠碱性磷酸酶(Qiagen cat.n°34510)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。表达水平代表总体蛋白的约3-5％。实施例Ⅻ一种表达融合蛋白D1/3-E6E7-his/HPVI8的大肠杆菌菌株的构建1．表达质粒的构建a)质粒pMG MCS prot D1/3(=pRIT14589)是pMG81(如上面所描述)的衍生物，其中来源于流感的NS1编码区上的第4-81位密码子被另一段密码子取代，该密码子相应于流感嗜血菌株系772、生物型2(H.Janson等，1991.传染和免疫，1月第119-125页)的成熟蛋白D上的丝氨酸20→苏氨酸127残基。蛋白-D 1/3的序列后跟随一段多克隆位点(11个残基)和一段编码C-末端组氨酸标志(6个组氨酸)的区域。该质粒用于表达融合蛋白D1/3-E6E7-his。
b)HPV基因组的E6和E7序列型HPV18(Cole等分子生物学杂志，1987，193，599-608)从HPV18全长基因组中进行扩增并在pBR322(由Deutsches Krebsforschungszentnun (DKFZ)中获得，Referenzzentnun für人病原乳头瘤病毒-D 69120-Heidelberg)中克隆，并亚克隆到pUC19中以得到TCA 302(=pRIT14467)。
c)TCA302(=pRIT14467)中的E6和E7编码序列用一段合成的寡聚核苷酸接头(插入到HgaⅠ和NsiⅠ位点之间)进行修饰，导致E6和E7基因之间11个核苷酸丢失，从而去掉了E6的终止密码子和在质粒TCA320(=pRIT14618)中制造了融合的E6和E7编码序列。
质粒TCA328(=pRIT14567)的构建一种表达融合蛋白-D1/3-E6E7-His/HPV18的质粒相应于融合的E6E7蛋白的第1→263位氨基酸残基的核苷酸序列从pRIT14618中进行扩增。在聚合酶链式反应中，在E6E7融合序列的5’和3’的末端，构造NcoⅠ和SpeⅠ限制酶切位点，以使其可以插入质粒pMGMCS Prot D1/3中相同的位点上，以获得质粒TCA328(=pRIT14567)。对插入序列进行序列分析以确保在聚合酶链式反应中没有修饰产生。关于融合蛋白-D1/3-E6E7-His的蛋白和编码序列的描述在序列编号22和23。
2．AR58菌株的转化质粒pRIT14567被导入大肠杆菌AR58(Mott等，1985，美国国家科学院院报，8288)的一段含有γpL启动子的热敏抑制子的缺损的γ溶素原中。
3．细菌菌株的生长和诱导-Prot-D1/3-E6E7-His的表达通过质粒pRIT14512转化的AR58的细胞在100毫升LB培养基，30℃下补充50μgr/ml的卡那霉素下生长。在细菌生长的对数期，将细菌转为39℃以失活λ抑制子，打开蛋白D1/3-E6E7-his的合成。在39℃下的温育持续4小时。将细菌沉淀并在-20℃下保存。
4．融合蛋白D1/3-E6E7-his的性质描述溶解冰冻细胞并重悬在10毫升的磷酸缓冲液中。细胞在一台法国压力细胞压碎机SLM Aminco上以20，000磅/平方英寸(psi)(过三遍)进行破碎。抽提物在4℃下以16，000g持续离心30分钟。
在对以上所描述的抽提物进行离心之后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析所得到的上清液和沉淀部分。
定位于沉淀部分、约48kDa的主要条带的显象是通过考马斯亮蓝染色的凝胶，其鉴定是在蛋白质印迹上通过兔的多克隆抗-蛋白-D以及通过Ni-NTA缀合物，Ni-NTA缀合物连接有牛小肠碱性磷酸酶(Qiagen cat.n°345 10)，它可以检测易受影响的组氨酸标志。表达水平代表总体蛋白的约1％。实施例ⅩⅢ含有PD1/3E7融合蛋白和不同CpG寡聚核苷酸的疫苗，在治疗上的潜力在TCl(表达E7的肿瘤模型)中进行评估。
1．治疗试验方案10e6 TCl细胞，表达E7的肿瘤细胞皮下注射(200μl)入C57BL/6免疫活性小鼠的腰窝内。在肿瘤入侵的7天和14天后对小鼠进行预防接种，在不同佐剂存在的情况下，在脚垫间注射5微克ProtD 1/3 E7 HPV16(100μl∶50μl/脚垫)在第二次免疫的2周和4周后，解剖5只小鼠/组，取其脾脏或腘淋巴结进行免疫应答分析。
1．2结果小鼠的组别1)磷酸缓冲液2)蛋白D1/3 E7 HPV163)蛋白D1/3 E7 HPV 16+寡聚物11826(WD1001)TCC ATGACG TTC CTG ACG TT4)寡聚物15)蛋白D1/3 E7 HPV16+寡聚物2/1758(WD1002)TCT CCC AGCGTG CGC CAT6)寡聚物2肿瘤生长；每周两次通过测量个体的肿瘤进行监测
图1代表4周以上之后平均肿瘤生长(以mm2计)/组n=10。
·皮下注射10e6TC 1细胞引起100％的动物发生肿瘤·用蛋白D1/3E7或单独的佐剂接种100％的动物发生肿瘤·如图1和2中所示，在接受含有一种CpG寡聚核苷酸的抗原的小鼠中，平均肿瘤生长保持十分低，而且两组十分相似，由此反应肿瘤生长或者降低或者几种肿瘤被完全受排斥。
在最后一次接种的2周和4周之后，对每单个肿瘤的分析显示各群中的全部排斥为28天(n=10)42天(n=5)E7+寡聚物1(1826)40％40％寡聚物1 0％0％E7+寡聚物2(1758)70％40％寡聚物2 0％0％通过PD1/3E7+CpG寡聚物接种的小鼠，其平均肿瘤生长/组十分相似，对单个肿瘤生长的分析显示CpG寡聚物诱导延伸的完全肿瘤的抵制。
结论两种CpG均(寡聚物2＞寡聚物1)诱导完全的肿瘤衰退。
淋巴增生应答的分析是在第二次免疫(Ⅲ)的2周和4周之后，在体外通过用PD1/3E7、蛋白E7(Bollen)和PD(完整)和PD1/3(包被或不包在乳液微滴中)(10，1，0.1μg/ml)对脾脏或淋巴结细胞进行持续72小时的再次刺激。
·阳性对照(伴刀豆球蛋白A刺激)是阳性的。
·令人惊奇的是，在以脾脏细胞起始的第二次接种后的2或4周没有观察到E7特异性的和PD特异性的增生应答(可能由于技术问题数据未显示)·相反，在来源于接受CpG寡聚物1和2中的蛋白D1/3E7的小鼠的淋巴结细胞中，显示出非常好的E7特异性的增生应答，虽然即使是在最高的浓度100μg/ml下也几乎没有能观察到PD(完整)特异性的应答，即使包衣在乳液微滴中也没有观察到PD1/3特异性的应答。
相同的数据在第二次接种的4周后也获得。
血清学抗E7的抗体应答通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测定IgG总量和同型(IgG1、IgG2a、IgG2b、IgGTot)，使用了如材料和方法中所描述的包被抗原形式的E7蛋白。图3和4分别显示在第二次接种的2周和4周后，不同IgG同型在总的IgG中的相对百分率
·当单独注射PD1/3E7时，观察到寡聚物的影响仅微弱(寡聚2)或者连微弱的抗体应答(寡聚1)也完全没有·对于所有测试的制剂，占优势的E7特异性抗体亚型明显为IgG2b(总体IgG的80-90％)在第二次接种的4周后也获得相同的结果。抗E7应答(第二次接种之后，汇聚血清)的同型概况exp.97293
CTL分析当在最近接种的2周之后进行测定时，当细胞在体外被辐射过的TCl再次刺激时，当TCl或肽E7激活的EL4作为靶细胞时，当小鼠被PDl/3 E7+CpG寡聚物2＞1(25-40％特异性溶胞)而不是被单独的寡聚物免疫时，即可检测CTL应答。
·观察到TCl细胞中的溶胞强于肽酸E7激活的EL4细胞，但这主要是在经PDl/3 E7+CpG寡聚物(2＞1)接种的小鼠组群中观察到的。在这一实验中的其它制剂没有诱导CT1。
·使用E7激活的EL4细胞，当小鼠接受单独的蛋白或佐剂时没有观察到溶胞。
1．3材料和方法
1．3．1配制过程所有制剂均在注射当天配制含有寡聚物的制剂单独含有寡聚物而没有其它佐剂的制剂的配制，是在pH7.4的磷酸缓冲液里，加CpG到稀释过的PrtD 1/3-E7中。
没有抗原的佐剂对照的制备是用磷酸缓冲液代替该蛋白。
1．3．2小鼠和细胞系小鼠6-8周龄的C5781/6(Iffa Credo)小鼠用于这些试验中。
细胞系TCl(获自John Hopkin’s University)、EL4细胞在RPMI1640(Bjo Whittaker)中生长，RPMI 1640(Bio Whittaker)含有10％FCS和添加剂2mM L一谷氨酰胺、1％抗生素(10000U/ml青霉素、10000μg/ml链霉素)、1％非必需氨基酸100x、1％丙酮酸钠(Gibco)、5 10e-5M 2-巯基乙醇。在注射之前将TG1细胞用胰蛋白酶处理，并在无血清培养基中清洗。
1．3．3肿瘤生长
所有动物在0天时均注射肿瘤细胞，在7天时随机注射。随时间跟踪个体肿瘤的生长，每周两次用测径器测量2个主要直径(A，B)，AxB代表“肿瘤表面”，每组5个值的平均值随时间显示于图解中6周。
1．3．4 CMI读出体外淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖在个体脾脏和淋巴结汇聚中进行。将200000个脾脏细胞或腿弯部的淋巴结细胞一式三份涂于96孔微量反应板内，用含有1％标准小鼠血清和添加剂的RPMI培养基培养。使用不同剂量的PD1/3 E7(1，0.1，0.01μg/ml)或E7(10，1，0.1μg/ml)在体外进行再次刺激，72小时之后，去掉100μl的培养上清物，代之以含有1μCi 3H胸腺嘧啶(Amersham 5Ci/mmol)的新鲜培养基。16小时之后，将细胞收集到过滤板中。在一种β计数器中计数掺入的放射线。结果以CPM(三孔平均)表示，或者以刺激指数(有抗原的培养物中的平均CPM/无抗原的培养物中的平均CPM)表示。
1．3．5 CTL分析在伴刀豆球蛋白A补足物(sup)(2％)存在或不存在的情况下，将20 10e6脾脏细胞与2 10e6辐射的(18000r)TCl细胞(表达E7的肿瘤)共培养，持续7天。
用于估定细胞毒性的靶细胞为负载有(37℃，1小时)CrS1(DuPontNEN 37MBq/ml)的TCl细胞或E7激活EL4细胞(37℃下持续1小时**，在细胞负载Cr51的过程中，10μg/ml的E7衍生的肽段(49-57)(QCB))。相对于EL4细胞，对K562靶细胞进行NK依赖的溶胞估定。96孔平板(V bottom nunc 2-45128)中，2000个靶细胞/孔，100/l为最高效应物/靶比率。自发或最高Cr51释放的对照以六个一组进行，并在培养基或1.5％的triton中作为靶细胞。所有平板菌轻轻离心并在7％CO2、37℃下温育4小时。将50μl的上清液置于96w Lumaplate(Packard)let dry O/N中并在一台Top Count计数器中进行记数。数据以特异性溶胞百分率来表示，其从每分钟记数(c.p.m)中通过公式(试验释放-自发释放)/(最高释放-自发释放)X100来计算。
血清学抗E7抗体的定量是通过ELISA进行，E7以包被抗原的形式使用。抗原和抗体的溶液在每孔中用50μl。抗原在pH9.5的碳酸缓冲液中以终浓度为3μg/ml进行稀释，并在4℃下吸附到在96孔微量滴定板的孔内过夜(MaxiSorb Immuno-plate，Nunc，丹麦)。将该平板在含有1％牛血清白蛋白和0.1％Tween 20(饱和缓冲液)的磷酸缓冲液中，在37℃下温育1小时。在饱和缓冲液中，将稀释两倍的血清(起始为1/100的稀释液)加入到E7涂层的平板中并在37℃下温育1小时30分。将平板以PBS 0.1％Tween20冲洗3次，将在饱和缓冲液中稀释1/5000的偶联生物素抗小鼠IgG1、IgG2a或IgG2b或IgG总体(Amersham，UK)加入到每孔中，并在37℃下温育1小时30分。清洗一次之后，将在饱和缓冲液中稀释1/5000的链亲和素-生物素标记的过氧化物酶合成物在37℃下加入，保持30分钟。依以上方法清洗平板并与TMB(四甲基-对二氨基联苯)一起温育10分钟。该反应用4N的H2SO4终止并在450nm读数。中点稀释通过SoftmaxPro(采用四个参数的方程)计算。实施例ⅩⅣ在另一个实验中，测试本发明的疫苗以评估主链的显著性。
治疗实验方案·10e6 TCl细胞，表达E7的肿瘤细胞皮下注入(200μl)到具免疫活性的C57BL/6小鼠的腰窝处。
·两种疫苗，肿瘤侵入的7天和14天以后，含有5μg ProtD 1/3 E7HPV16，注射入足垫内(100μl50μl/足垫)+/-CpG寡聚；硫代磷酸酯修饰的寡聚1(WD1001)或相同的寡聚(WD1006)但它是磷酸二酯键的连接。
·5只动物/组肿瘤生长通过每周两次测量个体肿瘤来监测，每组5只动物的平均肿瘤生长如图5所示，图5显示硫代磷酸酯修饰的寡聚核苷酸可以有效地引起肿瘤衰退。
结论·所有接受10 e6 TCl肿瘤细胞的动物均形成了不断生长的肿瘤。
·单独PD1/3 E7 HPV16蛋白接种两次(间隔7天)的动物，100％形成肿瘤。
·在浓度测试中，接受PD1/3E7蛋白+寡聚WD1006的动物100％形成肿瘤。
·所有接受浓度变化为10到200微克的E7蛋白+CpG1001的组中的动物，均部分或完全(20-40％)显示肿瘤的衰退。
在第一个浓度下，这种在肿瘤衰退上的治疗效果的获得不完全，该浓度为E7+1微克CpG寡聚1001。实施例ⅩⅤ在第三系列的实验中，评估本发明中的疫苗在表达E7蛋白的转基因小鼠中的作用。
·该转基因小鼠株系的产生如M.Parmentier和C.Ledent在IRIBHN(ULB)中所述(参照PNAS(USA)1990，87；6176-6180)。
·由于该转基因小鼠负载E7 HPV16基因出生后就成活，所以认为它们对这种基因(来源于HPV16的E7基因)“耐受”，在这种情况下，E7被认做“自身抗原”。
·该转基因的表达是由甲状球蛋白启动子驱动。由于甲状球蛋白构成性地仅在甲状腺中表达，所以E7在甲状腺中表达。
·作为这一表达的结果，甲状腺细胞增生，小鼠形成甲状腺肿和小瘤，其在6个月到1年之后可以发展为入侵性的癌症。
实验的结果(图6)显示含有本说明书中所描述的CpG寡聚核苷酸和抗原的治疗性的疫苗，导致肿瘤生长的减少并且可以引起完全的肿瘤衰退。
材料和方法·10e6 TCl细胞，表达E7的肿瘤细胞皮下注入(200μl)雄性或雌性的C57BL/6转基因小鼠的腰窝内，·小鼠在肿瘤入侵7天和14天之后接种5微克ProtD1/3 E7HPV16，在CpG寡聚核苷酸TCT CCC AGC GTG CGC CAT和两种控制佐剂的存在下注射到脚垫内(100μl∶50μl/脚垫)，·10只动物/组第二次免疫的2周和4周之后解剖小鼠取其脾脏或腿弯部淋巴。
结论本发明中的疫苗在HPV诱导的肿瘤中，可以有效地引起肿瘤衰退。
序列清单(1)一般信息(ⅰ)申请者BRUCK，CLAUDINE(ⅱ)发明题目疫苗(ⅲ)序列数目23(ⅳ)通信地址(A)通信人SmithKline Beecham(B)街道2 New Horizons Court，Great West Road，B(C)城市Middx(D)州(E)国家英国(F)邮编TW 9EP(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型磁盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统DOS(D)软件FastSEO for Windows Version 2.0(ⅵ)本次申请数据(A)申请号码(B)存档日期(C)分类(ⅶ)上次申请数据(A)申请号码(B)存档日期(ⅷ)代理商信息(A)姓名Dalton，Marcus J
(B)注册号码(C)参考/记录号码B45124(ⅸ)通讯信息(A)电话0181 9756348(B)电传0181 9756177(C)电报(2)序列编号1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度220个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链的性质单链(D)拓扑学线性蛋白质D 1/3 E7 his(ⅱ)序列描述序列编号1Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys1 5 10 15Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro20 25 30Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp35 40 45Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val50 55 60Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe65 70 75 80Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met100 105 110Ala Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu115 120 125Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser130 135 140Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro145 150 155 160Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser165 170 175Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu180 185 190Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser195 200 205Gln Lys Pro Thr Ser Gly His His His His His His210 215 220(2)序列编号2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度663个碱基对(B)类型核酸(C)链的性质单链(D)拓扑学线性蛋白质D 1/3 E7 his(ⅹⅰ)序列描述序列编号2ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC60ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA120CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT180CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC240CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT300CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCCA TGCATGGAGA TACACCTACA360TTGCATGAAT ATATGTTAGA TTTGCAACCA GAGACAACTG ATCTCTACTG TTATGAGCAA420TTAAATGACA GCTCAGAGGA GGAGGATGAA ATAGATGGTC CAGCTGGACA AGCAGAACCG480GACAGAGCCC ATTACAATAT TGTAACCTTT TGTTGCAAGT GTGACTCTAC GCTTCGGTTG540TGCGTACAAA GCACACACGT AGACATTCGT ACTTTGGAAG ACCTGTTAAT GGGCACACTA600GGAATTGTGT GCCCCATCTG TTCTCAGAAA CCAACTAGTG GCCACCATCA CCATCACCAT660TAA663(2)序列编号3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度822个碱基对(B)类型核酸(C)链的性质单链(D)拓扑学线性蛋白质D 1/3 E6 His/HPV 16(ⅹⅰ)序列描述序列编号3ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC60ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA120CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT180CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC240CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT300CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCCA TGTTTCAGGA CCCACAGGAG360CGACCCAGAA AGTTACCACA GTTATGCACA GAGCTGCAAA CAACTATACA TGATATAATA420TTAGAATGTG TGTACTGCAA GCAACAGTTA CTGCGACGTG AGGTATATGA CTTTGCTTTT480CGGGATTTAT GCATAGTATA TAGAGATGGG AATCCATATG CTGTATGTGA TAAATGTTTA540AAGTTTTATT CTAAAATTAG TGAGTATAGA CATTATTGTT ATAGTTTGTA TGGAACAACA600TTAGAACAGC AATACAACAA ACCGTTGTGT GATTTGTTAA TTAGGTGTAT TAACTGTCAA660AAGCCACTGT GTCCTGAAGA AAAGCAAAGA CATCTGGACA AAAAGCAAAG ATTCCATAAT720ATAAGGGGTC GGTGGACCGG TCGATGTATG TCTTGTTGCA GATCATCAAG 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Arg His Tyr180 185 190Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly195 200 205Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn210 215 220Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg phe His Asn225 230 235 240Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala245 250 255Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Thr Ser Gly260 265 270His His His His His His275(2)序列编号22的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1152个碱基对(B)类型核酸(C)链的性质单链(D)拓扑学线性蛋白质D 1/3 E6 E7 His/HPV 18(ⅹⅰ)序列描述序列编号22ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC60ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA120CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT180CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC240CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT300CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCGC GCTTTGAGGA TCCAACACGG360CGACCCTACA AGCTACCTGA TCTGTGCACG GAACTGAACA CTTCACTGCA 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Met Lys1 5 10 15Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro20 25 30Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp35 40 45Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val50 55 60Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe65 70 75 80Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met100 105 110Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu115 120 125Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys Val130 135 140Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala Phe145 150 155 160Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala Cys165 170 175His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His Tyr180 185 190Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly195 200 205Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu Asn210 215 220Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His Asn225 230 235 240Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala245 250 255Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val Met His Gly260 265 270Pro Lys Ala Thr Leu Gln Asp Ile Val Leu His Leu Glu Pro Gln Asn275 280 285Glu Ile Pro Val Asp Leu Leu Cys His Glu Gln Leu Ser Asp Ser Glu290 295 300Glu Glu Asn Asp Glu Ile Asp Gly Val Asn His Gln His Leu Pro Ala305 310 315 320Arg Arg Ala Glu Pro Gln Arg His Thr Met Leu Cys Met Cys Cys Lys325 330 335Cys Glu Ala Arg Ile Glu Leu Val Val Glu Ser Ser Ala Asp Asp Leu340 345 350Arg Ala Phe Gln Gln Leu Phe Leu Asn Thr Leu Ser Phe Val Cys Pro355 360 365Trp Cys Ala Ser Gln Gln Thr Ser Gly His His His His His His370 375 380
权利要求
1．一种含有来源于HPV并可选地连接有一段免疫融合配偶体的E6或E7或E6/E7融合蛋白、以及一种免疫调节剂CpG寡聚核苷酸的组合物。
2．如权利要求1中所述的组合物，其中的融合蛋白选自以下的各组来源于流感嗜血菌B的蛋白D或其片段、来源于流感嗜血菌B的脂蛋白D或其片段、来源于流感病毒的NS1或其片段、以及来源于肺炎链球菌的LYTA或其片段。
3．如权利要求1或2中所述的组合物，其中的E6或E7蛋白衍生于HPV16或HPV18。
4．如权利要求1、2或3中所述的组合物，其中的E7蛋白是突变的。
5．如权利要求1、2或3中所述的组合物，其中的E6蛋白是突变的。
6．如权利要求1至5任一条中所述的组合物，这些组合物额外地含有一段至少4个组氨酸残基的组氨酸标志。
7．在本权利要求书中所要求保护的组合物，这些组合物含有附加的HPV抗原。
8．在本权利要求书中所要求保护的组合物，其中的免疫调节剂CpG寡聚核苷酸含有一个六聚体基序嘌呤嘌呤胞嘧啶鸟苷嘧啶嘧啶。
9．在本权利要求书中所要求保护的组合物，其中的免疫调节剂CpG寡聚核苷酸含有两个或更多的CpG基序。
10．在本权利要求书中所要求保护的组合物，其中的免疫调节剂CpG寡聚核苷酸含有一个硫代磷酸酯的核苷酸间连接。
11．在本权利要求书中所要求保护的组合物，其中的免疫调节剂CpG寡聚核苷酸是选自以下的组寡聚物1TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT寡聚物2TCT CCC AGC GTG CGC CAT寡聚物3ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
12．在本权利要求书中所要求保护的用于医药组合物。
13．一种诱导患者对HPV抗原的免疫应答的方法，包括施安全有效剂量的组合物。
14．一种阻止或治疗患者体内HPV诱导的肿瘤的方法，包括施用的安全有效剂量的组合物。
15．一种制备在本权利要求书中所要求保护的组合物的方法，包括混合可选地连接有一种免疫融合配偶体的E6、E7或E6/E7融合蛋白，以及免疫调节剂CpG寡聚核苷酸。
全文摘要
本发明提供了人乳头状瘤病毒融合蛋白,该蛋白连接有一种对HPV抗原提供T细胞辅助的表位的免疫融合配偶体。提供了在治疗或预防HPV诱导的肿瘤上有效的疫苗制剂配体。
文档编号A61P31/04GK1284884SQ98813794
公开日2001年2月21日 申请日期1998年12月18日 优先权日1997年12月24日
发明者W·L·J·达勒曼斯, C·M·G·格拉德 申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司