疫苗的制作方法

专利名称：疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的疫苗制剂，以及它们的生产方法和在医药中的应用。
含有没有甲基化的CpG二核苷酸(“CpG”)的免疫调控寡聚核苷酸是已知的(WO96/02555，Ep468520)。CpG是存在于DNA中的胞核嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸基序的缩写。在历史上，据观察BCG DNA片段可以发挥抗癌作用。进一步的研究显示，来源于BCG基因序列的合成寡聚核苷酸(在体内及体外)均可以诱导免疫刺激作用。这些研究的作者推断一些特定的回文序列，包括一个中心CG基序，具有这种活性(Tokunaga，T.等微生物免疫学Immunol.3655(1992))。后来Krieg对CG基序在免疫刺激中的重要作用进行了阐明(自然374 546页1995)。详细的分析显示CG基序所含有序列是微生物DNA中普遍存在的，但在脊椎动物DNA中却是罕见的。
最近认为，这种进化的区别使得脊椎动物的免疫系统可以检测到细菌DNA的存在(如发生于感染时)，从而导致免疫系统的刺激。已经发现小到仅含15个核苷碱基的序列都具有免疫刺激活性(Krieg，等自然374546(1995))，而且CpG基序必须是没有甲基化的。据假定，寡聚物可能是六体形式的嘌呤嘌呤CG嘧啶嘧啶，但这不是必须的。
肺炎链球菌是一种对人具病原性的革兰氏阳性细菌，它导致侵入性疾病，如肺炎、菌血症、髓膜炎，以及与建群有关的疾病，如急性中耳炎。人们对肺炎球菌传播到肺、脑脊液以及血液的机制知之甚少。细菌生长到达正常的肺泡是由肺泡的相对干燥以及肺泡巨噬细胞的噬菌活性所抑制的。这些协调防卫的任何解剖学或生理学的紊乱将增大肺感染的可能性。肺炎链球菌的细胞壁在肺泡产生炎症反应的过程中发挥着重要的作用(Gillespie等，I&I 653936)。细胞壁成分的释放是在肺炎链球菌的生活周期的末期通过自身分解发生的，这是N-乙酰基muramoyl-L-丙氨酸酰胺酶(lytA)合成的结果。在肺炎球菌自身分解时，DNA同时也释放到被感染的区域。
为了使有机体对入侵细菌具有有效的免疫应答，必须有一种机制可以对最可能停止感染的免疫应答类型进行协调。对于细胞内的病菌，这种协调发生于细胞介导的或体液的免疫应答之间，这些是受Th1和Th2型T-细胞控制的。然而，细胞外的细菌通常使用一种以胶囊或脂多糖的形式存在的多聚糖来保护其自身不受血清补体的影响，血清补体可以溶解细菌，或者使其易受食菌细胞如巨嗜细胞或嗜中性粒细胞的影响。
在这种情形中，免疫应答遵循另一条途径，即非T依赖性免疫应答。非T依赖性免疫应答还可以进一步分为Ⅰ型和Ⅱ型。非T依赖性的Ⅱ型抗原具有多糖类抗原的具体特征，包括分子量大，具有重复的抗原决定簇，能够激活补体级联，体内降解能力差，不能激活MHCⅡ型依赖的辅助T细胞(Mond等免疫学年评13655-92)。Ⅰ型抗原不同于多糖类，它对B细胞的丝裂原促进作用，是由脂多糖(LPS)组成的。非T依赖性Ⅱ型抗原不能刺激具有X-连接的免疫B细胞缺陷的新生小鼠或CBA/N小鼠(xid小鼠)的应答，而Ⅰ型抗原却可以。
与T依赖性抗原(如蛋白质)相比，Ⅱ型抗原诱导较弱的抗体反应。蛋白质可以通过被加工成多肽及在MHCⅡ型的存在下被呈递至B细胞表面而激活B-细胞并诱导抗体产生，使B细胞可以与T细胞相互作用并接受使B细胞达到最大增殖和成熟所需的附加信号。然而，在一些情况下寡聚糖与MHCⅡ型结合(Ishioka等免疫学杂志1482446-2451)，而脂质化的多聚糖显示出与淋巴细胞上的CD1结合，(Fairhurst，R.M.等今日免疫学19257(1998))。对Ⅱ型抗原呈递给T细胞的机制尚未了解。
然而，多糖聚合体抗原的多重复的特性可以引起B细胞表面受体的交联，从而通过一种不需要T细胞的机制激活B细胞。因此多聚糖是不依赖于T的抗原，它们在动物和人的婴儿内的特征是产生IgM抗体，而且缺乏增强和免疫记忆。只有成人可以产生大量的针对大多数(但不是全部)多聚糖抗原的IgG抗体。在婴儿或幼儿(1.5到2岁之间)的B细胞中，转换抗体同型像为IgG的能力与补体受体2(CR2)的出现同步，由此提供了B细胞活化和成熟所需要地方附加信号。
本发明一方面提供了一种可以增强对T非依赖性抗原的免疫应答的疫苗制剂。对于细菌的荚膜多糖，IgG的产生很重要，因为这种补体同型像在对细菌防护的基本机制、补体调节的溶胞和调理性吞噬中最有效(Maslanka等Clin Diag Lab Immunol 4156-67，及Romero-Steiner等Clin Diag Lab hmunol 4415-22)。
以多糖抗原为基础的疫苗在本领域已经了解得很多，已经有四种被特许用于人类，包括伤寒沙门菌的Vi多糖类、流感嗜血菌的PRP多糖类，四价的脑膜炎双球菌的疫苗包括的血清型为A、C、W135和Y型，23-价肺炎球菌疫苗包括的多聚糖所对应的血清型为1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33。
后三种疫苗用于保护机体免受一种可引起呼吸器官的感染而导致婴儿严重病态及死亡的细菌的感染，然而这些疫苗还没有被允许用于小于2岁的幼儿，因为它们在这一年龄段内产生的免疫原性很弱。
以上所列出的已被特许的多聚糖疫苗具有不同的已被证实的临床功效。Vi多聚糖疫苗对预防经培养证实的伤寒症的有效率估计为55％到77％(Plotkin和Cam，Arch Intern Med 1552293-99)。脑膜炎双球菌C多聚糖疫苗在流行病的状况下，其有效率显示为79％(De Wals P，等Bull World Health Organ.74407-411)。23-价肺炎球菌疫苗的临床有效率变化很大，从0％到81％(Fedson等Arch Intern Med.1542531-2535)。效率显示出与被免疫的危险人群相关，如老年、霍奇金氏病、脾脏切除、镰状细胞病和血中丙球蛋白贫乏(Fine等Arch InternMed.1542666-2677)，也与疾病的表现相关。肺炎球菌性肺炎和中耳炎为尚未证实是否可被23-价疫苗防护的疾病。普遍认为肺炎球菌疫苗的防护效率或多或少与接种疫苗所诱导的抗体浓度相关；事实上，该23多聚糖只是依赖于每种多聚糖组分的免疫原性而被授予许可证(Ed.Williams等纽约科学院1995，241-249页)。
为了提高对包括23-价疫苗的在内的肺炎球菌多聚糖的抗体应答，本发明者们尝试通过加入免疫刺激剂QS21 EP 362 279和dQS21 WO96/33739来促进应答，然而，在恒河猴中没有测到对多聚糖的抗体应答的增加。
Threadgill等疫苗1998 16(1)卷76页最近报道当具免疫刺激性的寡聚核苷酸CpG配入假单胞菌属铜绿菌多聚糖时，该寡聚核苷酸可以降低多糖特异性的抗体应答。
令人惊奇的是，本发明发现通过配入具免疫刺激性的寡聚核苷酸CpG，有可能佐剂化对肺炎球菌多聚糖疫苗的免疫应答，这种制剂提供的免疫应答可以产生明显水平的IgG抗体。
依据本发明，提供了一种含有一种有免疫刺激性的寡聚核苷酸佐剂化的多聚糖抗原的疫苗复合物。
多聚糖抗原可能未缀合或缀合有一种载体蛋白，从而提供了T-辅助细胞的抗原决定簇。
该寡聚核苷酸可以为DNA或RNA，但优选的为含有一个六聚体基序嘌呤嘌呤CpG嘧啶嘧啶。更优选的是核苷酸间键经过修饰以提高寡聚核苷酸的稳定性。优选的修饰是硫代磷酸酯联接。参与肺炎球菌细胞壁的接触降解的lytA蛋白在自分解的时候产生，它属于感受态诱导的操纵子的一部分(分子微生物学291125(1998))。根据定义，编码lytA的mRNA在lytA蛋白合成的过程中应大量存在。此外，lytA含有磷酰胆碱的结合区域，该区域含重复的DNA序列(Yother和Brites细菌学杂志174601(1992))，该序列在链球菌的许多其他胆碱结合蛋白中都有发现。以下的CpG序列是从lytA的磷酰胆碱结合区域和胆碱结合蛋白A中鉴定的(Rosenow等，分子微生物学25819-829(1997))。
寡聚1GCTACTGGTACG TACATTC AGACGGC TCTT(lytA)寡聚2ACTATCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCT(cbpA)可以用于本发明中。
以下的寡聚核苷酸的免疫刺激序列也构成了本发明的优选形式。
寡聚3TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT寡聚4TCT CCC AGC GTG CGC CATCpG及其侧翼序列下已被划线，其中有保守的ACGT、ACG和GCG基序。从肺炎球菌蛋白的胆碱结合区域中得到的序列具有两个相隔10或15个重复核苷酸碱基的CpG基序，以这种在两个CpG之间的核苷酸碱基的距离为基础的基序在lytA和CbpA蛋白中分别出现3次和5次。然而，以发表的序列中的两个CpG基序相隔7或2个核苷酸碱基。
在一种实施方案中，当与商业上购得的23价的多糖疫苗(Pneumovax，Pasteur Merieux)结合时，CpG佐剂在肌内施用时可明显增强免疫应答(IgG抗体)，尤其是对19F和14型多糖。
因此，有利的是，在本发明的一种实施方案中，增强商业上有用的肺炎球菌疫苗的效率是可能的。这对于高危人群特别重要，尤其是对多糖的抗体应答未达最佳的人群。这些人群可能包括，但不局限于，以下任何一种老年病人脾切除、无脾、脾功能减退、镰状细胞病、循环的嗜中性白血球减少症、药物诱导的嗜中性白血球减少症、无形的贫血症、先天血中丙球蛋白贫乏、低丙种球蛋白血症、选择性IgG亚类不足、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血球过多症、淋巴瘤、人类免疫缺陷病毒感染、多因素病情如糖皮质激素治疗、营养不良、肝硬化、肾脏功能不全、糖尿病、酗酒、慢性病、住院、疲劳、压力、着凉、呼吸器官感染、流行性感冒、哮喘，可能也包括健康的成人如健康工人、军队新兵、囚犯，或其他包括学校人员或旅行者，这些需要确保足够疫苗量的人群。
在优选的应用下，当作为增强剂用于6到24个月之间的小孩(已经接受多价肺炎球菌多糖蛋白缀合物的初次免疫)时，CpG佐剂用于增强对多糖疫苗的应答。当有CpG寡聚核苷酸作为佐剂时，这种疫苗用于初次免疫也是可能有效的。因此，在一种实施方案中，提供了一种免疫病人的方法，包括施用本发明中的有效剂量的疫苗。
在第二种实施方案中，本发明提供了一种增强以前对一种抗原易感的患者的免疫应答的方法，包括施用一种结合有CpG免疫刺激剂寡聚核苷酸的T依赖性抗原。依据本发明，CpG佐剂可用于以其它多糖和T非依赖性抗原为基础的疫苗。这些包括，但不局限于，伤寒沙门菌属的Vi多聚糖疫苗、四价脑膜炎球菌多聚糖疫苗(包括A、C、W135和Y型)、B组脑膜炎球菌的多糖和修饰过的多糖、金黄色葡萄球菌的多糖、无乳链球菌的多糖、分支杆菌如结核分支杆菌的多糖，如mannophosphoinisitides海藻糖、霉菌酸、甘露糖戴帽的阿拉伯树胶酸甘露聚糖、其胶囊及阿拉伯半乳聚糖、新型隐球菌的多糖、未定型的流感嗜血菌的脂多糖、莫拉杆菌属(Moraxella)catharralis的脂多糖、宋内志贺菌的脂多糖、克氏锥虫的脂肽磷多糖(LPPG)、与癌症相关的神经节苷酯GD3、GD2、与肿瘤相关的黏液素，尤其是T-F抗原、和多涎T-F抗原、以及与人免疫缺陷病毒相关的结构上与T-F抗原相关的多糖。其它T非依赖性抗原可能来源于沙门氏菌、霍乱、埃希氏杆菌、衣原体，非T依赖性抗原来源于疟原虫。
疫苗制备的大致描述在药学生物技术，第6卷中，疫苗设计-亚单位和佐剂途径(Vaccine Design-the subunit and adjuvantapproach)，Powell和Newman编著，Plenum Press，1995。如Fullerton，美国专利4235877号描述了包装在脂质体当中。如Likhite，美国专利4372945号和Armor等，美国专利4474757号公布了将蛋白与大分子缀合。
选择每种疫苗剂量中蛋白的剂量，使其可引起免疫防护应答，同时没有典型疫苗明显不利的副作用。该剂量因所选择的特定免疫原和该免疫原的呈递方式而异。通常，建议每份剂量含0.1-1000微克的多糖或多糖-蛋白缀合物，优选的是2-100微克，最优选的是4-40微克。对于一种特定疫苗的最佳剂量可以通过标准研究来确定，包括观察患者体内适当的免疫应答。在初次接种疫苗之后，患者可以以足够的时间间隔接受一种或几种增强免疫。
本发明中所使用的寡聚核苷酸典型的是脱氧核苷酸。在一种优选的实施方案中，寡聚核苷酸中核苷酸间的连接是二硫代磷酸酯*，或者更优选的是硫代磷酸酯键，虽然磷酸二酯键仅也在本发明的范围内。也可使用其它可以稳定寡聚核苷酸的核苷酸间的连接。
本发明中所使用的CpG寡聚核苷酸可以通过任何本领域已知的方法(如EP468520)来合成，方便的是，这种寡聚核苷酸可以通过使用一种自动化的合成仪来合成。生产硫代磷酸酯寡聚核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在US 5，663，153、US 5，278，302和WO95/26204中被描述。
实施例1-小鼠中23-价肺炎球菌多糖CpG佐剂化防御肺炎球菌感染是通过针对荚膜多糖的IgG抗体来介导的，同时伴随有补体沉积，该补体使细菌易于被嗜中性粒细胞通过调理吞噬作用消灭。因此疫苗的防御效率可单独地以IgG抗体的诱导为基础来进行判断。给每组10只小鼠的群体用一种商业上的23-价肺炎球菌多糖疫苗进行免疫，剂量为人剂量的1/10、1/50或1/250(总多糖量分别为57.7、11.5和2.3微克)，同时有CpG(50微克的寡聚物1)、CpG+明矾作为佐剂。免疫之后，通过酶联免疫吸附测定的方法测定血清中抗4种最重要的血清型多糖(6B、14、19F和23F)的IgG的浓度，每7天测定一次，持续4周。
材料与方法以下组被免疫。(每组10只balb/c小鼠)23价剂量为2.3、U.5和57.5微克(人剂量的1/250、1/50和1/10)23价+CpG(50微克)在相同的剂量范围23价+CpG+Al(OH)3在相同的剂量范围采用的组分
配制过程将Pneumovax在水和10倍浓缩的10mM PO4、150mM NaCl pH6.8中进行稀释，以获得每份剂量的抗原量为2.3、u.5或57.7毫克。CpG加入持续30分钟，对于含有Al(OH)3的组，该制剂在任一Al(OH)3(50微克)中吸附持续30分钟。硫柳汞(50微克/毫升)作为防腐剂加入。
酶联免疫吸附测定每组有10只动物，但由于采血是每隔一周进行一次，故每周仅有5只被采血。ELISA和调理吞噬作用在汇聚血清中进行。
使用ELISA以测定鼠IgG，采用世界卫生组织研讨会关于人血清中抗肺炎链球茵荚膜多糖的IgG抗体定量的ELISA过程的决议。大体上，纯化的荚膜多糖直接在微量滴度平板涂层。血清样品与细胞壁多糖一起预温育，该多糖为所有肺炎球菌所共有，它在依据EP7251381所公布的方法纯化的肺炎球菌多糖中约占O.5％。Jackson ImnunoLaboratoriesInc.的试剂被用于检测所吸附的鼠IgG。将滴度曲线作为logistic对数方程建立的内部标准(单克隆抗体)的参考。通过SoftMax Pro软件进行计算。这些结果的最大绝对误差估计在因数2以内。其相对误差小于30％。
结果发现IgG同型抗体抗血清型14和19G，但不抗6B和23F，血清型14的结果示于

图1。应答为剂量依赖性，人剂量的1/10所给出的应答最强，这暗示着IgG应答对多糖具特异性。这是例外的，因为小鼠通常仅生成IgM以抗肺炎球菌多糖。应答高峰在免疫14天之后，这不是例外的，因为非T依赖性抗原不诱导记忆性。
进行附加的个体分析以确定变化和统计上的重要性(数据未列出)。当有CpG单独作为佐剂时，对人剂量23-价的应答(统计学上)明显增加(对于19型，粒-巨噬细胞集落(GMC)0.8比3.7微克/毫升p=0.07；对于14型，粒-巨噬细胞集落1.9比3.4微克/毫升p=0.001)。当用于测定抗14型时，这对于1/50和1/250的剂量也是正确的。另外，当有CpG+Alum佐剂化时，对于14型的应答显著提高。
最高应答的诱导是当疫苗仅有CpG佐剂化时。
实施例2-CpG对幼年大鼠模型中四价肺炎球菌PS-PD缀合物免疫原性的佐剂化作用选择幼年大鼠模型是因为已发表的数据显示在人婴儿中，其4种肺炎球菌多糖蛋白缀合物的相关免疫原性与大鼠更为相似(与小鼠相比)。对于幼年大鼠为6B＜23F＜14＜19F。选择幼年大鼠是因为它们的免疫系统发育不成熟，这与人婴儿中所发现的相似。
用临床等级的各种四价肺炎球菌多糖-PD(a)缀合物以5倍的剂量范围、同时有佐剂CpG和AlPO4+CpG来免疫幼年大鼠。寡聚物1使用的剂量为100微克。当动物7天龄时进行第一次免疫，在14天和28天之后进行后继免疫。在第42天(第三次免疫后14天)和56天(第三次免疫后28天)对样本进行血清试验。
最佳的佐剂是单独的CpG它增加了IgG浓度的几何平均数*和6B、23F和19F的调理素滴度，然而对于血清型14，其滴度量可以与其它佐剂化试剂相比。仅含CpG的制剂也可以明显增加向6B-PD血清型进行血清转化的速度。
材料和方法疫苗组别疫苗批号DSPO401x含有四价的PS-PD临床等级批号D6BPJ208+D14PDJ202+D19PJ206+D23PDJ212。ESPL001含有四价的PS-LPD批号E6BL040P+E14L66P+E19FL033P+E23FL21P。 使用组分 配制过程非吸附的四价物这四种缀合物在水和10倍浓缩的NaCl 150mM中进行稀释。苯氧乙醇(500微克/毫升)作为防腐剂加入。
如果需要CpG，将该寡聚核苷酸加入非吸附的四价物中。当需要时，等渗度和稀释由NaCl来确保。
吸附的四价物在加入AlPO4补体之前，以水和10倍浓缩的150mM NaCl对这四种浓缩、吸附的单价物进行稀释。苯氧基乙醇(500μg/ml)作为防腐剂加入。
如果需要稀释，这些四价物在AlPO4中进行稀释，浓度为1毫克/毫升。这些稀释液在NaCl 150mM中进行制备。
如果需要CpG，将该寡聚核苷酸加入吸附的四价物中，等渗通过加入NaCl 1500mM来确保，如果需要稀释，在NaCl中加入浓度为1.3或1.8毫克/毫升的AlPO4稀释液。
所有制剂均在非硅化的玻璃器皿中制备。
免疫方法幼年大鼠随随机选自不同的母本，在7天龄时接受初次免疫。在14和28天之后接受后继的免疫。在第42天(第三次免疫后14天)和56天(第三次免疫后28天)时采血。所有疫苗均皮下注射，每个疫苗组中有10只大鼠。
酶联免疫吸附测定(ELISA)使用ELISA以测定大鼠IgG，采用的方法来源于世界卫生组织研讨会(WHO Workshop)关于“人血清中抗肺炎链球菌荚膜多糖的IgG抗体定量的ELISA过程”。大体上，纯化的荚膜多糖直接在微滴度平板上进行涂层。血清样品与细胞壁多糖一起预温育，该多糖为所有肺炎球菌所共有，它在纯化的肺炎球菌多糖中约占0.5％。采用JacksonImnunoLaboratories Inc.的试剂以检测所吸附的大鼠IgG。将滴度曲线作为logistic对数方程建立的参考血清滴度曲线的参考。通过SoftMax Pro软件进行计算。通过系列应答的方法校准标准血清，这些值被证明与基于免疫沉淀(参考21)所估计的Ig的浓度值一致。
调理吞噬作用调理吞噬作用分析的进行是依据CDC方法(采用分化的HL60细胞进行肺炎链球菌调理吞噬作用，版本1.1)。修饰包括使用内部的肺炎球菌的菌株，食茵细胞HL60被纯化的人多形核白细胞(PMN)取代。大鼠的多克隆血清作为阳性对照包括在内。
结果图2显示了由在材料和方法中所描述的四价组合物所诱导的抗6B血清型的IgG浓度的几何平均数。为了清楚，将轴线以佐剂和剂量分开。所获得的抗19F和23F血清型的结果与之类似，但14型对所有佐剂和剂量的应答较为一致。
通过调理吞噬作用测定从每种佐剂组别和剂量中获得的汇聚血清的生物活性。与IgG浓度相关的调理素的活性将给出抗血清功能活性的估计。如表1所示，数据显示所有佐剂诱导的抗体与opsonise pnemococci*具有类似功能。因此，CpG佐剂化特异性抗体的产生，抗体浓度的提高与防御效率的提高相关。
结论·AlPO4(与没有佐剂相比)明显提高血清转化速度、IgG浓度的几何平均数、调理素的活性和对四价PS-PD的免疫记忆。
对于AlPO4中血清型6B、19F和23F PS-PD的缀合物，0.1微克的剂量明显比0.5微克的剂量更具免疫原性。
·与AlPO4相比，当偶联物疫苗有CpG佐剂化时，抗6B、19F和23F的IgG浓度明显增加。这是通过血清转化速度的提高和调理吞噬作用滴度的提高来确定的。
表1．通过血清型和佐剂进行比较的相关调理素活性(杀灭50％肺炎球菌所需的IgG的浓度) 实施例3-在幼年大鼠模型中cpG对11价肺炎球菌PS-PD缀合物的佐剂化效应实施例2显示与传统佐剂(含铝)相比，有CpG在缀合物疫苗中作为佐剂的效应级数提高5到10倍。为了确定这些效应是否依赖于寡聚序列、剂量或配制方法，进行了进一步的试验。
选择CpG寡聚物2并使用较低剂量，即1和10微克。它也被Al(OH)3吸附，同时与缀合物疫苗结合。
另外，由于每种多糖的免疫特性不同，故测试了11种血清型。
材料和方法表2．肺炎球菌PS-PD批量的选择
配制为了检测不同的以上佐剂的作用，缀合物的剂量中含有每种多糖稳定的0.1微克，佐剂AlPO4、Al(OH)3和CpG以不同的剂量和结合配入其中。总共检测了10种不同的组合，包括完全没有佐剂。这些按编号列于表3中以供参考。
稀释液的制备在NaCl 150mM/phenoxy中制备两种稀释液AAlPO4为1毫克/毫升BCpG在Al(OH)3中分别为200和1000微克/毫升。质量比为CpG/Al(OH)3=1/5吸附的十一价物的制备将十一种浓缩的、吸附的PS-PD单价以正确的比例混合。加入补体AlPO4。如果需要，可加入CpG(CpG被Al(OH)3吸附)或稀释液。
非吸附的十一价物的制备将十一种PS-PD缀合物混合，并以正确的比例在NaCl 150mMpH6.1，phenoxy中稀释。如果需要，CpG以溶液(非吸附的)或吸附在Al(OH)3中的形式加入。
所有注射液的制剂均是在初次施用的18天前配制。
表3．幼年大鼠中经11-价肺炎球菌PS-PD检测的佐剂制剂简表 免疫方法幼年OPA大鼠随机选自不同的母本，在7天龄时接受初次免疫。在14天和28天之后对其进行两次附加的免疫。在56天时(第三次免疫后28天)采血。所有疫苗均皮下注射，每组疫苗10只大鼠。
酶联免疫吸附测定(ELISA)ELISA的进行如实施例2中所述。
调理吞噬作用调理吞噬作用分析是依据CDC方案(用分化的HL60细胞分析肺炎双球菌的调理吞噬作用，版本1.1)进行的。修饰包括使用内部的肺炎球菌的菌株，食茵细胞HL60被纯化的人多形核白细胞(PMN)取代。另外，在微滴度池中加入3mm的玻璃珠以促进混合，这允许了噬菌细胞细菌比例的减少，其建议量为400。
结果以下表4到7显示在经过一种有不同IgG寡聚2制剂佐剂化的11价肺炎球菌PS-蛋白D缀合物疫苗免疫之后，经对4种肺炎球菌血清型进行滴度确定所得到的IgG浓度几何平均数、血清转化速率和调理吞噬作用的算术平均数。与没有佐剂相比，对于所以血清型，10微克的CpG可以诱导IgG浓度明显升高。对于血清型1、6B、18C和19F，CpG诱导的IgG浓度高于AlPO4。
为了比较，包括在表中的是从实施例2中使用寡聚l得到的结果。当寡聚2的使用量为10微克时，由这两种寡聚序列所诱导的IgG应答没有明显不同。然而，寡聚2为1毫克时没有显示免疫刺激作用，因为其诱导的IgG浓度与无CpG时没有显著不同。
寡聚2吸附于Al(OH)3上免疫刺激作用降低，抗体的诱导量与AlPO4作为佐剂没有明显不同。
表4在第三次用使用不同佐剂的11价PS-PD免疫大鼠之后第28天，血清型6B的IgG浓度几何平均数、血清转化和平均调理素滴度(与四价物免疫相比，实施例2)
表5．在第三次用使用不同佐剂的11价PS-PD免疫大鼠之后第28天，血清型M的IgG浓度几何平均数、血清转化和平均调理素滴度(与四价物免疫相比，实施例2) 表6在第三次用使用不同佐剂的11价PS-PD免疫大鼠之后第28天，血清型19F的IgG浓度几何平均数、血清转化和平均调理素滴度(与四价免疫物相比，实施例2) 22表7在第三次用使用不同佐剂的11价PS-PD免疫大鼠之后第28天，血清型23F的IgG浓度几何平均数、血清转化和平均调理素滴度(与四价免疫物相比，实施例2) 实施例5CpG对经多糖-缀合物疫苗致敏之后用多糖加强和用多糖致敏的影响。
以上实施例已经证明了CpG佐剂化对非T依赖性抗原和伴随有蛋白载体的非T依赖性抗原的免疫应答的能力。剩下需考虑的是在经T依赖性抗原致敏之后，CpG是否可佐剂化促进经一种非T依赖抗原增强的记忆应答。进一步的兴趣是确定cpG是否可在一种非T依赖性抗原的激发发挥作用。
为了确定这些作用，使小鼠对肺炎球菌多糖、或印G佐剂化的肺炎球菌多糖、或蛋白D的肺炎球菌多糖易感。
免疫方法用以下所描述的疫苗制剂皮下免疫6到8周的成年bala/c小鼠。对于缀合和非缀合制剂每种多糖的剂量均为1微克。14天以后进行血液测试以测定IgG的浓度。56天以后，进行另一项血液测试，然后施用增强疫苗，最后的血液测试在14天以后进行，即在初次免疫的70天以后。 使用组分
配制过程配制4种浓缩、吸附的单价物(PS-PD缀合物)依据以上实施例2中所描述的过程制备浓缩、吸附的单价物。
制备四价物(PS-PD缀合物)以正确的比例(每价1微克/剂量)混合四种浓缩、吸附的单价物，并在NaClpH6.1中进行稀释。补体AlPO4(10微克/剂量)以1毫克/毫升作为稀释剂加入pH6.1、150mM、含有5毫克/毫升的苯氧乙醇的NaCl中。
制备非连接、非吸附、有或没有CpG的四价物(游离PS)以正确的比例(每价1微克/剂量)混合四种游离PS，并在NaClpH6.1中进行稀释。如果需要，可加入CpG(100微克/剂量)。作为防腐剂的苯氧乙醇的加入量为5毫克/毫升。
两种注射液的制剂均在初次施用的前6天、在非硅化的玻璃器皿中制备。
配制过程制备4种浓缩、吸附的单价物(PS-PD缀合物)依据以上所描述的过程制备这些浓缩、吸附的单价物。
制备四价物(PS-PD缀合物)以正确的比例(每价1微克/剂量)混合四种浓缩、吸附的单价物。补体AlPO4(10微克/剂量)以1毫克/毫升作为稀释剂加入pH6.1、150mM、含有5毫克/毫升的苯氧乙醇的NaCl中。
制备非连接、非吸附、有或没有CpG的四价物(游离PS)以正确的比例(每价1微克/剂量)混合四种游离PS，并在NaClpH6.1中进行稀释。如果需要，可加入CpG。作为防腐剂的苯氧乙醇的加入量为5毫克/毫升。
两种注射液的制剂均在初次施用的前6天、在非硅化的玻璃器皿中制备。
酶联免疫吸附测定(ELISA)ELISA的进行如实施例1中所述。
结果本试验的结果是使致敏和加强。致敏的结果与前面的研究(实施例1)中一致，即与简单的多聚糖相比，经有CpG佐剂化的多糖免疫的小鼠体内血清转化提高以及IgG浓度较高。如实施例1中所发现的，有CpG佐剂化的14型IgG浓度在统计学上明显高于单独的PS，19F型的增加接近明显。然而，有CpG佐剂化的IgG浓度没有如实施例l中那样高。解释这种不同，在这些试验中仅有两处不同，疫苗的效价(23价比4价)和免疫途径(肌肉内比皮下)。由于效价的降低并不认为会降低免疫原性，该证据暗示着免疫途径对于最理想的有CpG佐剂化的抗原很重要。这与最近的一项公布一致，其公布了尝试使用CpG佐剂化一种简单的多糖疫苗的失败。其采用的免疫途径是腹膜问(Thredgill等疫苗1998卷16(1)第76页)。
*p=0.001 Fisher’s exact testδp=0.11 Fisher’s exact testξp0.17 Fisher’s exact testωp＜0.001 Fisher’s exact test在本试验的第二部分，用PS、PS/CpG或缀合物疫苗中的一种使动物致敏，用PS、或用PS/CpG或用缀合物使动物加强。为使数据规范化以进行比较，在增强剂施用14天后确定IgG的增加级数，将呈现抗体浓度增加的动物作为应答者，计算其数目。
*P=0.09 Student’s t-testδp=0.12 Student’s t-testξp=0.03 Fisher’s exact test讨论本实施例确定了实施1中所提出的结果，但揭示了免疫模式对于最理想的免疫可能很重要。作为增强和记忆试验的扩展，本实施例证实了CpG佐剂的两个有趣的特性。第一个是用有CpG佐剂化的PS激发导致了在多糖增强的基础上较高的级数增加，有达到统计学意义的趋势。这将暗示着CpG能够诱导较好的记忆。第二个特性是在经缀合物疫苗致敏的动物中，CpG可以佐剂化由多糖诱导的记忆应答。
结论CpG能够小鼠中抗非缀合物多糖的抗体同型转换。有CpG的IgG应答数目较高。
权利要求
1．一种含有CpG寡聚核苷酸和非T依赖性的Ⅰ型或Ⅱ型抗原或多糖缀合抗原的制剂。
2．如权利要求1中所述的制剂，其中抗原选自非缀合的肺炎链球菌多糖、非缀合的脑膜炎球菌多糖、非缀合的沙门氏茵多糖、非缀合的A型或B型链状球菌多糖、分支杆菌多糖非缀合假单胞菌粘蛋白多糖或来自HIV的TF-抗原，或来自沙门菌、霍乱菌、埃希杆菌、奈瑟菌、衣原体、志贺菌、百日咳菌、嗜血菌或假单胞菌的脂多糖或灭活的脂多糖，或疟原虫中的非T依赖性抗原。
3．如权利要求1和2中所述的制剂，其中CpG脱氧核糖-或核糖-寡聚核苷酸具有核苷酸间连接，选自磷酸二酯键、二硫代磷酸酯键和硫代磷酸酯键。
4．一种含有如权利要求2所述的一种CpG脱氧核糖-或核糖-寡聚核苷酸序列的制剂，权利要求2中含有两个被7个或更多的核苷碱基对隔开的CpG序列。
5．如权利要求4中所述的一段脱氧核糖-或核糖-寡聚核苷酸，含有两个被10到15个核苷碱基对隔开的CpG序列。
6．如本说明书所述的制剂，其中CpG寡聚核苷酸是选自如下组GCTACTGGTACG TACATTC AGACGGC TCTTACTATCTAAACGCTAATGGTGCTATGGCGACAGGATGGCTTCC ATG ACG TTC CTG ACG TTTCT CCC AGC GTG CGC CAT
7．如本权利要求书要求保护用于医药的疫苗组合物。
8．一种诱导抗非T依赖性Ⅰ型或Ⅱ型抗原或多糖缀合抗原的方法，上述方法包括对患者施用如本权利要求书要求保护的安全有效剂量的制剂。
全文摘要
本发明提供了含有免疫刺激物CpG寡聚核苷酸佐剂化的非T依赖性的或多糖缀合的疫苗制剂。
文档编号A61P31/04GK1284885SQ98813795
公开日2001年2月21日 申请日期1998年12月18日 优先权日1997年12月24日
发明者W·L·J·达勒曼斯, C·A·J·拉菲里雷, J·P·普里尔斯 申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司